KR101448360B1 - DNA aptamer specifically binding to Salmonella Typhymurium and uses thereof - Google Patents
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Abstract
본 발명은 식중독균에 특이적으로 단일가닥 DNA에 관한 것으로서, 서열번호 4 내지 서열번호 8로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 염기서열을 포함하는 살모넬라 티피뮤리엄(Salmonella Typhymurium) 검출용 단일가닥 DNA 앱타머를 제공한다. 본 발명의 단일가닥 DNA 앱타머는 구조적으로 안정하고 인공적이 합성이 용이하며 각 염기서열 위치에 화학적으로 용이한 변형이 가능하여, 식중독균인 살모넬라 티피뮤리엄에 대한 신규한 차세대 진단 탐침으로서 유용하게 이용될 수 있다.The present invention is specifically to sikjungdokgyun ever relates to a single-stranded DNA, Salmonella typhimurium (Salmonella Typhymurium) detecting single-stranded DNA comprising any one or more nucleotide sequences selected from the group consisting of SEQ ID NO: 4 to SEQ ID NO: 8 Provides app tamer. The single-stranded DNA aptamer of the present invention is structurally stable, artificial, easy to synthesize, chemically easily modified at each base sequence position, and is useful as a new next-generation diagnostic probe for Salmonella typhimurium, a food poisoning bacterium .
Description
본 발명은 식중독균인 살모넬라 티피뮤리엄에 특이적으로 결합하는 살모넬라 티피뮤리엄 검출용 단일가닥 DNA 앱타머 및 이를 포함하는 식중독균 검출용 키트에 관한 것이다.The present invention relates to a single strand DNA aptamer for detecting Salmonella typhimurium which specifically binds to Salmonella typhimurium, a food poisoning bacterium, and a kit for the detection of food poisoning bacteria comprising the same.
식중독은 병원성 세균, 병원성 세균에서 발현되는 독소, 바이러스 및 자연계에 존재하는 독소에 의해 발병하는 질병으로서, 식중독의 원인균으로서 알려진 병원균도 많지만 불명의 원인도 다수 존재하는 질병이다. 국내의 식중독균에 의한 발병 통계에 의하면, 특히 병원성 대장균 및 살모넬라균에 의한 발병 건수 및 환자수가 각각 나란히 1위 및 2위를 차지하고 있다(표 1 참조).Food poisoning is a disease caused by pathogenic bacteria, toxins expressed in pathogenic bacterium, viruses and toxins present in the natural environment, and many pathogens known as causative bacteria of food poisoning are also present. According to the statistics of onset by food poisoning bacteria in Korea, the number of cases and the number of cases caused by pathogenic Escherichia coli and Salmonella spp. Are respectively 1 and 2 (see Table 1).
한편, 현재 대부분의 살모넬라 및 병원성 대장균 등의 식중독균을 검출하는 방법으로, 전통적인 세포 배양법과 이외에 유전자분석법(PCR) 및 면역분석법(ELISA) 등이 사용되고 있다. 또한 일부 회사에서는 항체를 이용한 진단 키트 등을 개발하여 시판하고 있다. 진단 대상체를 진단하기 위한 가장 보편적인 방법은 PCR로써 진단 대상체의 고유한 유전자를 인지 후, 이를 시험관 내(in vitro)에서 증폭함으로써 소량의 대상체를 분석하는 방법이다. 유전자가 지니는 고유한 염기서열을 이용하여 진단 대상체만의 고유한 염기서열을 대상으로 하고, 또한 근래의 인간 게놈 프로젝트 등을 통한 광범위한 유전자 정보 데이터베이스 확보를 통하여 그 활용 범위를 확대시켜나가고 있다. 또한, 식중독균 진단에 사용되는 기술은 위의 PCR 방법 외에 ELISA 분석을 토대로 이루어진다. ELISA 기술은 특정 단백질에 대한 특이적 결합을 하는 항체를 인식용 지표물질로 사용하며 농수산식품 등의 검체로부터 진단 대상체를 분리하고 이를 효소 결합 항체를 이용하여 검출함으로써 다양한 검체를 처리할 수 있으며 항체가 갖는 특이적 결합을 보이는 장점이 있다. 그러나 ELISA의 경우 PCR 진단법에 비해 비교적 낮은 수준의 민감도를 가지므로 이를 극복하기 위한 많은 연구가 진행중이다.On the other hand, genetic analysis (PCR) and immunoassay (ELISA) are used in addition to a conventional cell culture method as a method for detecting food poisoning bacteria such as Salmonella and pathogenic Escherichia coli at present. In addition, some companies have developed and marketed diagnostic kits using antibodies. The most common method for diagnosing a diagnostic object is a method of analyzing a small amount of target object by amplifying the inherent gene of the diagnostic object by PCR and amplifying it in vitro . The unique base sequence of the gene is used to target the unique base sequence of the diagnostic target and the application range is expanded by securing a wide range of genetic information database through the recent human genome project. In addition, the technology used for the diagnosis of food poisoning bacteria is based on ELISA analysis in addition to the PCR method described above. ELISA technology uses an antibody that specifically binds to a specific protein as an indicator for recognition. It can treat a variety of specimens by detecting a diagnostic target from a sample such as agricultural or fish food and detecting it using an enzyme-linked antibody. And the like. However, ELISA has a relatively low sensitivity compared to PCR diagnosis, and many studies are in progress to overcome this.
이러한 종래의 방법들은 자체적으로 높은 민감도와 특이성을 제안하는 방법들이지만 검출시간이 길고 목표 분자의 분리 정제가 필요하며, 때로는 고가의 검출 장비가 필요하다는 단점이 있다. 이러한 종래의 진단 방법으로는 보다 편리하게 식중독균을 조기 검출할 수 없는 실정이므로, 초정밀 검역을 위하여 높은 감도와 신속성을 지닌 검출 방법의 개발이 필수적이다. 따라서 현재 식중독 발병 원인균 1, 2위를 차지하는 살모넬라 및 병원성 대장균들 검체 대상으로 하여 식중독을 조기에 진단하여 검출할 수 있는 기술 개발이 무엇보다 필요하다.These conventional methods are ones that propose high sensitivity and specificity in themselves, but they have a disadvantage in that detection time is long and separation and purification of target molecules are required, and sometimes expensive detecting equipment is required. Since such conventional diagnostic methods can not detect food poisoning bacteria more conveniently than before, it is essential to develop a detection method having high sensitivity and promptness for ultra-precise quarantine. Therefore, it is necessary to develop a technology to diagnose and detect food poisoning early on the basis of the specimens of salmonella and pathogenic Escherichia coli which occupy the first and second place of pathogen-causing bacteria.
아울러, 최근 정부의 다양한 국가와의 FTA 협상이 진행됨에 따라 세계 각국의 농수산물들이 대규모로 수입되고 있으며 수입될 전망이다. 농수산식품을 대규모로 수입하고 관리하면 관리 소홀로 인한 식중독의 발생 가능성이 높아진다. 살모넬라 티피뮤리엄균이 식품의 표면에 존재하게 되면 식품 섭취에 의해 체내로 유입되고 균은 수일(72시간) 내로 많은 양의 개체수가 증폭되어 식중독을 유발한다. 따라서, 식품에 존재하는 살모넬라 티피뮤리엄균을 조기에 진단하는 것이 식중독 예방에 매우 중요하므로, 상기와 같은 전통적인 진단방법을 대체할 차세대 진단기술개발이 시급한 실정이다.
In addition, with the progress of the FTA negotiations with various governments in recent years, agricultural and marine products of the world are expected to be imported and imported on a large scale. Importing and managing agricultural and fishery foods on a large scale increases the likelihood of food poisoning caused by negligent management. When Salmonella typhimurium is present on the surface of food, it enters the body by ingesting food, and bacteria are amplified in large numbers within a few days (72 hours), causing food poisoning. Therefore, early diagnosis of Salmonella typhimurium bacteria present in foods is very important for the prevention of food poisoning, and it is urgent to develop a next-generation diagnosis technology to replace the conventional diagnostic methods described above.
본 발명의 목적은 살모넬라 티피뮤리엄에 특이적으로 결합하는 단일가닥 DNA 앱타머 및 이의 용도를 제공하기 위한 것이다.It is an object of the present invention to provide single-stranded DNA aptamers which specifically bind to Salmonella typhimurium and uses thereof.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 측면은 서열번호 4 내지 서열번호 8로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 염기서열을 포함하는 살모넬라 티피뮤리엄(Salmonella Typhymurium) 검출용 단일가닥 DNA 앱타머를 제공한다.In order to achieve the above object, one aspect of the invention is SEQ ID NO: 4 to SEQ ID NO: Single-stranded DNA app for Salmonella typhimurium (Salmonella Typhymurium) detection, including any one or more nucleotide sequences selected from a group consisting of 8 Tamer Lt; / RTI >
또한, 상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 다른 측면은 상기 단일가닥 DNA 앱타머를 포함하는 살모넬라 티피뮤리엄 검출용 조성물을 제공한다.According to another aspect of the present invention, there is provided a composition for detecting Salmonella typhimurium comprising the single stranded DNA aptamer.
아울러, 상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 또 다른 측면은 상기 단일가닥 DNA 앱타머를 포함하는 식중독균 검출용 키트를 제공한다.According to another aspect of the present invention, there is provided a kit for detecting food poisoning bacteria comprising the single stranded DNA aptamer.
본 발명의 단일가닥 DNA 앱타머는 구조적으로 안정하고 인공적이 합성이 용이하며, 각 염기서열 위치에 화학적으로 용이한 변형이 가능하여 신규한 차세대 진단 탐침으로서 가능성을 제시한다. 또한, 본 발명의 단일가닥 DNA 앱타머는 기존이 진단 시스템이 갖는 안정성 및 민감도를 크게 향상시킬 수 있는 바, 살모넬라 티피뮤리엄 식중독균의 조기 진단에 효과적으로 활용될 수 있다.The single stranded DNA aptamer of the present invention is structurally stable, artificially easy to synthesize, and chemically easily modified at each base sequence position, thus presenting a possibility as a novel next generation diagnostic probe. In addition, the single stranded DNA aptamer of the present invention can greatly improve the stability and sensitivity of the existing diagnostic system, and thus can be effectively utilized for the early diagnosis of Salmonella typhimurium poisoning bacteria.
다만, 본 발명의 효과는 상기에서 언급한 효과로 제한되지 아니하며, 언급되지 않은 또 다른 효과들은 하기의 기재로부터 당업자에게 명확히 이해될 수 있을 것이다.
However, the effects of the present invention are not limited to the above-mentioned effects, and other effects not mentioned can be clearly understood by those skilled in the art from the following description.
도 1은 본 발명의 서열번호 4의 단일가닥 DNA 앱타머의 해리상수(KD)를 분석한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 2는 본 발명의 서열번호 4의 단일가닥 DNA 앱타머의 살모넬라 티피뮤리엄균에 대한 결합 특이성을 확인한 결과를 나타내는 그래프로서, (a)는 살모넬라 티피뮤리엄 KCCM 11806과 E.coli DH5a 및 슈도모나스 애루지노사의 결합 특이성을 비교한 결과이고, (b)는 살모넬라 티피뮤리엄 KCCM 11806과 살모넬라 엔테리티디스 KCCM 12021의 결합 특이성을 비교한 결과이다.1 is a graph showing the dissociation constant (K D ) of single stranded DNA aptamer of SEQ ID NO: 4 of the present invention.
2 is a graph showing the binding specificity of the single stranded DNA aptamer of SEQ ID NO: 4 of the present invention to Salmonella typhimurium bacteria, wherein (a) is a graph showing the binding specificity of Salmonella typhimurium KCCM 11806, E. coli DH5a and Pseudomonas (B) is the result of comparing the binding specificities of Salmonella typhimurium KCCM 11806 and Salmonella enteritidis KCCM 12021. Fig.
먼저, 본 발명의 명세서에서 이용된 용어를 설명한다.First, terms used in the specification of the present invention will be described.
본 발명에서 사용하는 용어 "DNA 앱타머(aptamer)"는 특정 분자에 고친화성 및 특이성으로 결합할 수 있는 DNA 핵산 분자를 의미하는 것으로서, 단일 가닥인 DNA 핵산 분자를 의미한다.
As used herein, the term "aptamer" refers to a DNA nucleic acid molecule capable of binding to a specific molecule with high affinity and specificity, and refers to a single-stranded DNA nucleic acid molecule.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
1. One. 살모넬라 티피뮤리엄(Salmonella typhimurium ( Salmonella TyphymuriumSalmonella Typhymurium ) 검출용 단일가닥 DNA 앱타머) Single strand DNA aptamer for detection
본 발명의 일 측면은 살모넬라 티피뮤리엄 검출용 단일가닥 DNA 앱타머를 제공한다.One aspect of the invention provides a single stranded DNA aptamer for detection of Salmonella typhimurium.
본 발명의 상기 단일가닥 DNA 앱타머는 서열번호 4 내지 서열번호 8로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 염기서열을 포함한다.The single stranded DNA aptamer of the present invention comprises any one or more nucleotide sequences selected from the group consisting of SEQ ID NOS: 4 to 8.
상기 단일가닥 DNA 앱타머는 살모넬라 티피뮤리엄(Salmonella Typhymurium), 보다 바람직하게는 살모넬라 티피뮤리엄 KCCM 11806에 특이적 및 선택적으로 결합한다. 특히, 상기 단일가닥 DNA 앱타머는 살모넬라 티피뮤리엄 KCCM 11806 이외에 다른 비살모넬라 박테리아에는 결합하지 않으므로 환경에 존재하는 살모넬라 티피뮤리엄 KCCM 11806을 선택적으로 검출할 수 있다.The single-stranded DNA aepta dimmer Salmonella typhimurium to (Salmonella Typhymurium), more preferably specifically and selectively bind to Salmonella typhimurium KCCM 11806. In particular, the single stranded DNA aptamer does not bind to Salmonella typhimurium KCCM 11806 other than Salmonella typhimurium KCCM 11806 because it does not bind to other Salmonella bacteria.
상기 단일가닥 DNA 앱타머는 특히, 서열번호 4의 염기서열로 구성되는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 아니한다. The single-stranded DNA aptamer is preferably, but is not limited to, the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4.
상기 단일가닥 DNA 앱타머는 서열번호 4 내지 서열번호 8로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 염기서열이, 이들 염기서열을 구성하는 개별 뉴클레오티드 중 어느 하나 이상이 화학적 또는 물리적으로 변형(modification)된 형태로 포함될 수도 있다. 예를 들어, 상기 서열번호 4 내지 서열번호 8로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 염기서열을 구성하는 개별 뉴클레오티드 중 어느 하나 이상이 포스포로티오에이트 DNA, 포스포로디티오에이트 DNA, 포스포로아미데이트 DNA, 아마이드-연결된 DNA, MMI-연결된 DNA, 2'-O-메틸 RNA, 알파-DNA 및 메틸포스포네이트 DNA, 당 변형된 뉴클레오타이드 예컨대, 2'-O-메틸 RNA, 2'-플루오로 RNA, 2'-아미노 RNA, 2'-O-알킬 DNA, 2'-O-알릴 DNA, 2'-O-알카이닐 DNA, 헥소스 DNA, 피라노실 RNA 및 안히드로헥시톨 DNA, 및 염기 변형을 갖는 뉴클레오타이드 예컨대, C-5 치환된 피리미딘 (치환기는 플루오로-, 브로모-, 클로로-, 아이오도-, 메틸-, 에틸-, 비닐-, 포르밀-, 에티틸-, 프로피닐-, 알카이닐-, 티아조릴-, 이미다조릴-, 피리딜- 포함), C-7 치환기를 갖는 7-데아자퓨린 (치환기는 플루오로-, 브로모-, 클로로-, 아이오도-, 메틸-, 에틸-, 비닐-, 포르밀-, 알카이닐-, 알켄일-, 티아조릴-, 이미다조릴-, 피리딜-), 이노신 또는 디아미노퓨린 등으로 구성될 수 있다.Wherein the single stranded DNA aptamer is a DNA strand having at least one nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 4 to SEQ ID NO: 8 in which at least one of the individual nucleotides constituting the nucleotide sequence is chemically or physically modified . For example, any one or more of the individual nucleotides constituting any one or more of the nucleotide sequences selected from the group consisting of SEQ ID NOS: 4 to 8 may be selected from the group consisting of phosphorothioate DNA, phosphorodithioate DNA, DNA, amide-linked DNA, MMI-linked DNA, 2'-O-methyl RNA, alpha-DNA and methylphosphonate DNA, sugar modified nucleotides such as 2'-O-methyl RNA, 2'-fluoro 2'-O-alkyl DNA, 2'-O-allyl DNA, 2'-O-alkynyl DNA, hexose DNA, pyranosyl RNA and anhydrohexitol DNA, and a base Nucleotides with modifications such as C-5 substituted pyrimidines wherein the substituents are fluoro, bromo, chloro, iodo-, methyl-, ethyl-, vinyl-, formyl-, ethytyl-, propynyl -, alkenyl-, thioglyl-, imidazolyl-, pyridyl-), 7-deazapurines with C-7 substituents (substituents being fluoro-, Bromo, chloro, iodo-, methyl-, ethyl-, vinyl-, formyl-, alkynyl-, alkenyl-, thiazolyl-, imidazolyl-, pyridyl-, inosine or diamino Purine, and the like.
또한, 상기 단일가닥 DNA 앱타머는 서열번호 4 내지 서열번호 8로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 염기서열들의 변이체를 포함할 수 있다. 상기 변이체는 상기 서열번호 4 내지 서열번호 8로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 염기서열들과 서열은 상이하지만, 상기 염기서열들과 유사한 기능적 특성을 갖는 염기 서열로서, 상기 서열번호 4 내지 서열번호 8의 염기서열과 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성(homology)을 가지는 염기서열일 수 있다.In addition, the single-stranded DNA aptamer may comprise a variant of any one or more of the nucleotide sequences selected from the group consisting of SEQ ID NOS: 4 to 8. The mutant is a nucleotide sequence having a sequence similar to that of any one or more nucleotide sequences selected from the group consisting of SEQ ID NO: 4 to SEQ ID NO: 8, but having functional similar to the nucleotide sequences of SEQ ID NO: May be a base sequence having a sequence homology of at least 70%, preferably at least 80%, more preferably at least 90%, and most preferably at least 95% with the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 8.
상기 단일가닥 DNA 앱타머는 검출 가능한 검출체로 표지될 수 있다. 상기 검출체는 살모넬라 티피뮤리엄에 상기 단일가닥 DNA 앱타머가 결합하였는지 여부를 용이하게 확인, 검출 및 정량하기 위한 것으로서, 발색효소(퍼옥시다제(peroxidase), 알칼라인 포스파타제(alkaline phosphatase) 등), 형광물질(FITC, RITC, 로다민(rhodamine), 텍사스레드(Texas Red), 플로레신(fluorescein), 피코에리트린(phycoerythrin), 퀀텀닷(quantum dots)), 크로모포어(chromophore) 및 방사성 동위원소(124I, 125I, 111In, 99mTc, 32P, 35S 등)로 구성된 군에서 선택되는 적어도 어느 하나일 수 있다. 상기 검출체가 상기 단일가닥 DNA 앱타머에 태깅되는 경우, 상기 검출체는 상기 단일가닥 DNA 앱타머에서 표적에 대한 특이성 또는 선택성에 영향이 없도록 부착되는 것이 바람직하고, 이를 위하여 상기 단일가닥 DNA 앱타머에 링크(공유결합 또는 가교)되어 제공될 수 있다. 상기와 같은 검출체의 태깅 위치는 당업자가 반복 실험을 통하여 용이하게 결정할 수 있고, 특히 상기 검출체의 태깅 위치는 상기 단일가닥 DNA 앱타머의 5'-말단일 수 있다.The single stranded DNA aptamer may be labeled with a detectable detector. The detector is for easily identifying, detecting and quantifying whether the single-stranded DNA aptamer is bound to Salmonella typhimurium. It is used for detecting chromosomal enzymes such as chromogenic enzymes (peroxidase, alkaline phosphatase, etc.) (FITC, RITC, rhodamine, Texas Red, fluorescein, phycoerythrin, quantum dots), chromophore and radioactive isotopes ( 124 I, 125 I, 111 In, 99m Tc, 32 P, 35 S, etc.). When the detector is tagged with the single-stranded DNA aptamer, it is preferable that the detector is attached so that the single-stranded DNA aptamer does not affect the specificity or selectivity for the target. To this end, Link (covalent bonding or crosslinking). The tagging position of the detector can be easily determined by a person skilled in the art through repeated experiments. In particular, the tagging position of the detector can be a 5'-terminal single stranded DNA aptamer.
상기 단일가닥 DNA 앱타머의 길이는 특별히 한정되지 않고, 30 내지 200 뉴클레오티드일 수 있으며, 약 100 뉴클레오티드 이하인 것이 바람직하고, 약 80 뉴클레오티드 이하인 것이 더욱 바람직하며, 보다 효율적인 30 내지 40 뉴클레오티드 길이인 것이 가장 바람직하다. 상기 단일가닥 DNA 앱타머를 이루는 총 뉴클레오티드수가 적을수록 화학 합성 및 대량 생산이 보다 용이하고 경제적이며, 생체내 안정성도 높고 독성이 낮을 수 있다.The length of the single stranded DNA aptamer is not particularly limited and may be 30 to 200 nucleotides, preferably about 100 nucleotides or less, more preferably about 80 nucleotides or less, and most preferably 30 to 40 nucleotides Do. The smaller the total number of nucleotides constituting the single-stranded DNA aptamer, the easier and economical the chemical synthesis and the mass production, the higher the in-vivo stability and the lower the toxicity.
전형적으로, 상기 단일가닥 DNA 앱타머는 표적인 살모넬라 티피뮤리엄의 결합에 대한 시험관내 선택법에 의해 수득될 수 있으며, 표적에 특이적으로 결합하는 앱타머를 선택하는 방법은 본 발명의 기술분야에서 공지되어 있다. 특히, 앱타머의 선별은 SELEX(Systematic Evolution of Ligand by Exponential enrichment) 방법으로 공지된 시험관내 또는 생체내 선택 기술을 이용할 수 있다(Ellington et al., Nature 346, 818-22, 1990; 및 Tuerk et al., Science 249, 505-10, 1990). 상기 SELEX 방법에서, 반복 회수를 늘리거나 경합 물질을 사용함으로써, 표적 물질에 대하여 보다 결합력이 강한 앱타머를 농축 및 선별할 수 있다. 따라서, 상기 SELEX 빙밥에서 반복 회수를 조절하거나 경합 상태를 변화시킴으로써 결합력이 상이한 앱타머, 결합 형태가 상이한 앱타머, 결합력이나 결합 형태는 동일하지만 염기 서열이 상이한 앱타머를 얻을 수 있다. 또한, 상기 SELEX 방법에는 PCR에 의한 증폭 과정이 포함되지만 그 과정에서 망간 이온을 사용하는 등으로 변이를 부여함으로써 보다 다양성이 풍부한 SELEX를 행하는 것이 가능해진다.Typically, the single-stranded DNA aptamer can be obtained by in vitro selection for binding of the target Salmonella typhimurium, and a method for selecting an aptamer specifically binding to a target is disclosed in the art . In particular, the screening of aptamers can utilize in vitro or in vivo selection techniques known in the SELEX (Systematic Evolution of Ligand by Exponential Enrichment) method (Ellington et al., Nature 346, 818-22, 1990; and Tuerk et al., Science 249, 505-10, 1990). In the SELEX method, by increasing the number of repetitions or using a competitive material, aptamer having a stronger binding property to the target substance can be concentrated and selected. Therefore, the aptamers having different binding strengths, the aptamers having different binding forms, and the aptamers having the same binding but binding forms but different base sequences can be obtained by controlling the number of repetitions or changing the contention state in the SELEX Bingbap. In addition, the SELEX method includes an amplification process by PCR, but mutation can be imparted by using manganese ions in the process, thereby making it possible to perform SELEX with a richer variety.
특히, 상기 단일가닥 DNA 앱타머는 1) PCR 및 비대칭(asymmetric) PCR 기법을 이용하여 DNA 앱타머를 증폭하고, 단일가닥 앱타머를 선별하는 단계; 및 2) SELEX 기법을 통해 살모넬라 티피뮤리엄에 결합하는 DNA 앱타머를 선별하는 단계를 포함하는 방법에 의해 선별될 수 있다.In particular, the single stranded DNA aptamer can be prepared by 1) amplifying a DNA aptamer using PCR and asymmetric PCR techniques, and selecting a single strand aptamer; And 2) selecting a DNA aptamer that binds to Salmonella typhimurium via the SELEX technique.
상기 단계 1)의 단일가닥 DNA 앱타머 선별에 있어서, PCR을 이용하여 증폭한 이중가닥 DNA 중 단일가닥 DNA만을 증폭하기 위해 비대칭 PCR을 수행할 수 있다. 비대칭 PCR은 정방향 프라이머와 역방향 프라이머 중 하나의 프라이머, 예를 들면, 정방향 프라이머만을 이용하여 PCR을 수행함으로써 단일가닥 DNA를 수득할 수 있게 된다.In the single-stranded DNA aptamer screening of step 1), asymmetric PCR can be performed to amplify only single-stranded DNA among double-stranded DNA amplified by PCR. Asymmetric PCR allows the single-stranded DNA to be obtained by performing PCR using only one of the forward primer and the reverse primer, for example, a forward primer.
상기 단계 2)는 최적 친화성을 갖는 SELEX 라운드에서 살모넬라 티피뮤리엄 결합 DNA 앱타머 후보군 선별을 위한 PCR 및 클로닝 단계; 및 선별된 살모넬라 티피뮤리엄 결합 DNA 앱타머 후보군의 DNA 서열 결정 단계로 이루어지질 수 있다.Step 2) comprises a PCR and cloning step for selection of the Salmonella typhimurium-binding DNA aptamer candidate group in the SELEX round with optimal affinity; And DNA sequencing of selected Salmonella typhimurium-bound DNA aptamer candidates.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 식중독균에 대한 신규한 진단 탐침을 발굴하기 위하여, 식중독균인 살모넬라 티피뮤리엄에 특이적으로 결합하는 단일가닥 DNA 앱타머를 선별하였다. 먼저, 화학적으로 합성된 단일가닥 DNA 라이브러리로부터 살모넬라 티피뮤리엄 KCCM 11806에 대해 CELL-SELEX 방법을 이용하여 앱타머 후보 단일가닥 DNA를 선별하였다. 상기 CELL-SELEX 방법은 배양된 세포를 목표 분자로 이용하기 때문에 특정 분자의 분리, 정제 단계가 생략되며 세포표면의 분자의 구조가 원형으로 보존이 되기 때문에 차후 임상에 적용시 진단이 가능한 장점이 있다. 이와 같이 선별된 앱타머 후보 단일가닥 DNA의 염기서열을 분석한 후, 살모넬라 티피뮤리엄에 대해 특이적으로 결합하고 서열 유사성을 갖는 7 종류의 단일가닥 DNA 앱타머를 선별하였다(표 4 참조).In a specific embodiment of the present invention, we have selected single-stranded DNA aptamers that specifically bind to Salmonella typhimurium, a food poisoning bacterium, in order to uncover novel diagnostic probes for food poisoning bacteria. First, the aptamer candidate single-stranded DNA was screened for Salmonella typhimurium KCCM 11806 from a chemically synthesized single-stranded DNA library using the CELL-SELEX method. Since the CELL-SELEX method uses cultured cells as target molecules, the separation and purification steps of specific molecules are omitted, and the structure of the molecules on the cell surface is preserved in a circular form, so that it is advantageous in diagnosis in a subsequent clinical application . After analyzing the nucleotide sequences of the selected aptamer candidate single-stranded DNAs, seven kinds of single-stranded DNA aptamers having specificity for the Salmonella typhimurium and having sequence similarity were selected (see Table 4).
또한 본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 상기와 같이 선별된 단일가닥 DNA 앱타머의 결합 능력을 확인하기 위하여, FAM 형광물질로 태깅된 단일가닥 DNA 앱타머를 이용하여 살모넬라 티피뮤리엄에 대한 결합력을 측정한 결과, 서열번호 4의 염기서열을 갖는 단일가닥 DNA 앱타머의 결합 정도가 유의적으로 높은 것을 확인할 수 있었다(도 1 참조). 또한, 상기 단일가닥 DNA 앱타머는 살모넬라균, 특히 살모넬라 티피뮤리엄균, 보다 바람직하게는 살모넬라 티피뮤리엄 KCCM 11806에 대한 결합에 있어서 특이성을 갖는 것을 확인할 수 있었다(도 2 참조).Also, in a specific embodiment of the present invention, in order to confirm the binding ability of the single-stranded DNA aptamer selected as described above, the present inventors used single-stranded DNA aptamers tagged with FAM fluorescent substance to identify the binding ability of Salmonella typhimurium As a result of the measurement of the binding force, it was confirmed that the degree of binding of the single stranded DNA aptamer having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4 was significantly higher (see FIG. 1). In addition, it was confirmed that the single-stranded DNA aptamer has specificity for binding to Salmonella, especially Salmonella typhimurium, more preferably Salmonella typhimurium KCCM 11806 (see Fig. 2).
따라서, 상기 서열번호 4 내지 서열번호 8의 염기서열로 이루어진 단일가닥 DNA 앱타머는 식중독균 특히 살모넬라 티피뮤리엄 KCCM 11806에 대한 신규 탐침으로서 유용하다.
Therefore, the single-stranded DNA aptamer consisting of the nucleotide sequences of SEQ ID NOS: 4 to 8 is useful as a new probe against food poisoning bacteria, particularly Salmonella typhimurium KCCM 11806.
2. 살모넬라 티피뮤리엄 검출용 조성물2. Composition for detecting Salmonella typhimurium
본 발명의 다른 측면은 살모넬라 티피뮤리엄 검출용 조성물 및 이를 이용한 살모넬라 티피뮤리엄의 검출 방법을 제공한다.Another aspect of the present invention provides a composition for detecting Salmonella typhimurium and a method for detecting Salmonella typhimurium using the same.
본 발명의 상기 조성물은 서열번호 4 내지 서열번호 8로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 염기서열을 포함하는 단일가닥 DNA 앱타머를 포함한다.The composition of the present invention comprises a single-stranded DNA aptamer comprising any one or more base sequences selected from the group consisting of SEQ ID NOS: 4 to 8.
본 발명의 상기 검출 방법은 1) 살모넬라 티피뮤리엄이 존재하는 것으로 의심되는 시료와 상기 조성물을 접촉시키는 단계; 및 2) 살모넬라 티피뮤리엄과 상기 DNA 앱타머의 결합 여부를 확인하는 단계를 포함하는 살모넬라 티피뮤리엄의 검출 방법을 제공한다.The detection method of the present invention comprises the steps of 1) contacting the composition with a sample suspected of being Salmonella typhimurium; And 2) confirming whether the Salmonella typhimurium and the DNA aptamer are bound to each other.
상기 단일가닥 DNA 앱타머에 관해서는 상기 "1. 살모넬라 티피뮤리엄(Salmonella Typhymurium) 검출용 단일가닥 DNA 앱타머 " 항목에서 설명한 바와 동일하다. 따라서 이에 관해서는 상기 "1. 살모넬라 티피뮤리엄(Salmonella Typhymurium) 검출용 단일가닥 DNA 앱타머 " 항목의 설명을 원용하여 상세한 설명은 생략하도록 하고, 이하에서는 상기 검출용 조성물 또는 검출 방법에 특이적인 구성에 대해서만 설명한다.As for the single-stranded DNA aptamers are the same as described in the above "1. Salmonella typhimurium (Salmonella Typhymurium) detecting single-stranded DNA aptamer for the" item. Thus this regard the "1 Salmonella typhimurium (Salmonella Typhymurium) detecting single-stranded DNA aptamer for" using the original description of the item and the detailed description thereof will be omitted, in the following specific configuration to the sensing composition or a method for detecting .
상기 단계 1)의 시료는 관심 있는 표적 물질 즉, 식중독균인 살모넬라 티피뮤리엄이 존재하거나 또는 존재하고 있는 것으로 추정되어 분석이 행해질 대상으로서, 액체, 토양, 공기, 식품, 사료, 폐기물 및 동식물 중 어느 하나 이상에서 채취된 것일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 이때, 상기 액체는 물, 혈액, 소변, 눈물, 땀, 타액, 림프 및 뇌척수액 등일 수 있으며, 상기 물은 강수(江水), 해수(海水), 호수(湖水) 및 우수(雨水) 등을 포함하고, 상기 폐기물은 하수, 폐수 등을 포함하며, 상기 동식물은 인체를 포함한다. 또한, 상기 동식물은 식품이나 동식물의 사료 등으로 이용될 수 있는 조직을 제공하는 것이면 특별히 제한되지 아니한다.The sample of step 1) is a target to be analyzed in which the target substance of interest, that is, Salmonella typhimurium, which is a food poisoning bacteria, is presumed to be present or exists and is a liquid, soil, air, food, feed, waste, It may be, but is not limited to, one or more samples. At this time, the liquid may be water, blood, urine, tears, sweat, saliva, lymph and cerebrospinal fluid, and the water may include rain water, seawater, lake water, , The waste includes sewage, wastewater and the like, and the animal or plant includes a human body. In addition, the animal or plant animal is not particularly limited as long as it provides a tissue that can be used for food, feed for plants and animals, and the like.
상기 단계 2)의 결합은 상기 DNA 앱타머와 연결자로 연결된 센서를 이용하여 검출할 수 있으며, 상기 DNA 앱타머에 부착된 검출체의 반응을 통해 검출할 수도 있다. 이때, 검출체의 분석은 일반적으로 알려진 검출체 분석방법에 의하여 이루어질 수 있다. 예를 들어, 형광 물질을 상기 검출체로서 사용한 경우, 시료 내에 존재하는 살모넬라 티피뮤리엄이 상기 형광 물질에 의하여 표지되므로, 상기 형광 물질의 발광 또는 색변화를 측정함으로써 살모넬라 티피뮤리엄을 검출할 수 있다.
The binding of step 2) may be detected using a sensor connected to the DNA aptamer and a linker, or may be detected through reaction of a detector attached to the DNA aptamer. At this time, analysis of the detection body can be performed by a generally known detection body analysis method. For example, when a fluorescent substance is used as the detecting substance, Salmonella typhimurium present in the sample is labeled with the fluorescent substance. Therefore, Salmonella typhimurium can be detected by measuring the luminescence or color change of the fluorescent substance have.
3. 식중독균 검출용 키트3. Kit for detecting food poisoning bacteria
본 발명의 또 다른 측면은 식중독균 검출용 키트를 제공한다.Yet another aspect of the present invention provides a kit for detecting food poisoning bacteria.
본 발명의 상기 식중독균 검출용 키트는 서열번호 4 내지 서열번호 8로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 염기서열을 포함하는 단일가닥 DNA 앱타머를 포함한다.The kit for detecting food poisoning bacteria of the present invention comprises a single stranded DNA aptamer comprising any one or more nucleotide sequences selected from the group consisting of SEQ ID NOS: 4 to 8.
상기 단일가닥 DNA 앱타머에 관해서는 상기 "1. 살모넬라 티피뮤리엄(Salmonella Typhymurium) 검출용 단일가닥 DNA 앱타머 " 항목에서 설명한 바와 동일하다. 따라서 이에 관해서는 상기 "1. 살모넬라 티피뮤리엄(Salmonella Typhymurium) 검출용 단일가닥 DNA 앱타머 " 항목의 설명을 원용하여 상세한 설명은 생략하도록 하고, 이하에서는 상기 식중독균 검출용 키트에 특이적인 구성에 대해서만 설명한다.As for the single-stranded DNA aptamers are the same as described in the above "1. Salmonella typhimurium (Salmonella Typhymurium) detecting single-stranded DNA aptamer for the" item. Therefore, a detailed description thereof will be omitted because of the description of the item " 1. Single-stranded DNA aptamer for detection of Salmonella typhimurium & quot ;, and a detailed description thereof will be omitted. Hereinafter, Explain.
상기 식중독균 검출용 키트의 검출대상이 되는 식중독균은 살모넬라일 수 있고, 상기 식중독균은 살모넬라 티피뮤리엄인 것이 더욱 바람직하고, 상기 식중독균은 살모넬라 티피뮤리엄 KCCM 11806인 것이 가장 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 상기 식중독균 검출용 키트에 포함되는 상기 단일가닥 DNA 앱타머는 상기 살모넬라 티피뮤리엄과 같은 식중독균 이외에 다른 비살모넬라 박테리아에는 결합하지 않으므로 식품, 환경 시료 또는 생체 시료 중에 오염된 식중독균을 선택적으로 검출할 수 있다.The food poisoning bacteria to be detected by the kit for detecting food poisoning bacteria may be Salmonella, and the food poisoning bacteria are more preferably Salmonella typhimurium, and the food poisoning bacteria are most preferably Salmonella typhimurium KCCM 11806, but are not limited thereto. The single-stranded DNA aptamer contained in the kit for detecting food poisoning bacteria does not bind to other non-Salmonella bacteria other than food poisoning bacteria such as Salmonella typhimurium, and thus it is possible to selectively detect food poisoning bacteria contaminated in foods, environmental samples or biological samples.
상기 식중독균 검출용 키트는 혼성화 반응에 필요한 시약을 추가적으로 포함할 수 있다. 상기 혼성화 반응에 필요한 시약은 본 기술분야에 통상적으로 이용되는 것들을 이용할 수 있으며, 특별히 제한되는 것은 아니다. 추가로 상기 키트는 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용자 설명서를 포함할 수 있다.The kit for detecting food poisoning bacteria may further include reagents necessary for the hybridization reaction. The reagents necessary for the hybridization reaction may be those routinely used in the art, and are not particularly limited. In addition, the kit may include a user's manual describing optimal reaction performance conditions.
상기 식중독균 검출용 키트는 병, 통(tub), 작은 봉지(sachet), 봉투(envelope), 튜브, 앰플(ampoule) 등과 같은 형태를 취할 수 있으며, 이들은 부분적으로 또는 전체적으로 플라스틱, 유리, 종이, 호일, 왁스 등으로부터 형성될 수 있다. 용기는 그 일부이거나 또는 기계적, 접착성 또는 기타 수단에 의해 용기에 부착될 수 있는 완전히 또는 부분적으로 분리가 가능한 마개를 장착할 수 있다. 또한 용기는 주사바늘에 의해 내용물에 접근할 수 있는 스토퍼가 장착될 수 있다.
The food-borne disease detection kit may take the form of a bottle, a tub, a sachet, an envelope, a tube, an ampoule, and the like, which may be partially or wholly made of plastic, , Wax, and the like. The container may be part of it or may be fitted with a fully or partially detachable cap which may be attached to the container by mechanical, adhesive or other means. The container may also be equipped with a stopper accessible to the contents by the injection needle.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail by the following examples.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
However, the following examples are illustrative of the present invention, and the contents of the present invention are not limited by the following examples.
살모넬라 티피뮤리엄(Salmonella typhimurium ( Salmonella TyphymuriumSalmonella Typhymurium ) KCCM 11806에 특이적인 앱타머의 선별) Selection of apt tamer specific to KCCM 11806
<1-1> <1-1> PCR을 통한 단일가닥 DNA 라이브러리의 합성Synthesis of Single Stranded DNA Library by PCR
먼저, 하기 서열번호 1의 염기서열로 표현되는 60 mer 길이의 단일가닥 DNA들의 라이브러리를 준비하였다. 상기 단일가닥 DNA 라이브러리는 (주)바이오니아(한국)에서 주문 제작하였다.First, a library of 60-mer long single-stranded DNAs represented by the nucleotide sequence of SEQ ID No. 1 below was prepared. The single-stranded DNA library was custom-made on Bioneer (Korea).
[서열번호 1][SEQ ID NO: 1]
5'-GCGCGGATCCCGCGC-(N)30-CGCGCGAAGCTTGCG-3'5'- GCGCGGATCCCGCGC - (N) 30 - CGCGCGAAGCTTGCG -3 '
상기 서열번호 1에서 밑줄 친 부분은 PCR 수행시 프라이머가 결합하는 부분으로서 고정된 서열이며, 상기 (N)30 부분은 A, G, C, T 염기가 임의로 배열되는 부분이다. 염기가 임의로 배열되는 부분에 의해, 분리되는 앱타머 분자의 서열이 결정된다.The underlined portion in SEQ ID NO: 1 is a sequence that is fixed as a portion to which a primer binds when PCR is performed, and the (N) 30 portion is a portion where A, G, C and T bases are arbitrarily arranged. The sequence at which the bases are arbitrarily arranged determines the sequence of the aptamer molecules to be separated.
상기와 같이 주문 제작한 단일가닥 DNA 라이브러리를 주형으로, 비대칭 PCR을 수행하여 상기 DNA 라이브러리를 증폭하였다.Asymmetric PCR was performed using the single-stranded DNA library prepared as described above as a template to amplify the DNA library.
상기 PCR 수행시 사용된 프라이머의 서열은 하기와 표 2와 같다. 여기에서 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머 서열의 밑줄 친 부분은 차후 유전자 재조합을 위하여 제한효소자리(BamH1 및 HindⅢ)를 삽입하여 이용하였다.The sequences of the primers used in the PCR are shown in Table 2 and Table 2 below. Herein, the underlined portions of the forward primer and the reverse primer sequence were used by inserting restriction enzyme sites ( BamH1 and HindIII ) for further gene recombination.
상기 비대칭 PCR은, 사용한 프라이머의 농도를 달리하여 PCR을 수행함으로써 단일가닥 DNA의 생성을 유도하는 것으로서, 정방향 프라이머를 역방향 프라이머 보다 10배 더 많이 첨가하여 상기 비대칭 PCR을 수행하였다.The asymmetric PCR was carried out by performing PCR with different concentrations of the used primers to induce the production of single strand DNA. The asymmetric PCR was performed by adding a
상기와 같이 증폭시킨 PCR 산물은 2.5% 아가로즈 겔에 전기영동 하여 육안으로 확인하였다.The amplified PCR product was electrophoresed on 2.5% agarose gel and visually confirmed.
<1-2> <1-2> 단일가닥 DNA 라이브러리의 추출Extraction of single-stranded DNA library
상기 실시예 <1-1>에서 증폭시킨 단일가닥 DNA 라이브러리를 Crush and Soak 방법으로 분리하였다. 상기 실시예 <1-1>에서 수득한 PCR 산물을 12 % 아크릴아마이드젤에 전기영동하여 이중가닥과 단일가닥 DNA를 분리하였다. 전기영동 후 EtBr로 핵산을 염색한 후 단일가닥 DNA 밴드를 절단하였다. 절단된 겔을 Crush and Soak 버퍼(500 mM NH4OAc, 0.1% SDS, 0.1 mM EDTA)에 분쇄하여 단일가닥 DNA를 추출하였다. 추출물을 원심분리하여 고형젤을 분리한 후, 에탄올 침전 등을 통하여 단일가닥 DNA를 정제함으로써, 단일가닥 DNA 라이브러리를 추출하였다.The single stranded DNA library amplified in Example <1-1> was isolated by the Crush and Soak method. The PCR product obtained in Example <1-1> was electrophoresed on a 12% acrylamide gel to separate double strand and single strand DNA. After electrophoresis, the single strand DNA band was cut after staining the nucleic acid with EtBr. The digested gel was pulverized into Crush and Soak buffer (500 mM NH 4 OAc, 0.1% SDS, 0.1 mM EDTA) to extract single-stranded DNA. The extract was centrifuged to separate the solid gel, and single strand DNA was purified through ethanol precipitation or the like to extract a single strand DNA library.
상기와 같이 추출된 단일가닥 DNA 라이브러리는 UV/Vis 분광광도계를 사용하여 정량하여 Cell-SELEX에 이용하였다.The single stranded DNA library thus extracted was quantified using a UV / Vis spectrophotometer and used in Cell-SELEX.
<1-3> <1-3> 살모넬라 티피뮤리엄 KCCM 11806에 결합하는 앱타머의 선별Selection of aptamers binding to Salmonella typhimurium KCCM 11806
상기 실시예 <1-2>에서 추출한 단일가닥 DNA 라이브러리를 하기 표 3에 기재된 조건으로 살모넬라 티피뮤리엄 KCCM 11806과 반응시키는 Cell-SELEX를 10회 수행하였다. 상기 Cell-SELEX의 매회 마지막 단계에서 원심분리를 수행하고, 세척버퍼(50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 5 mM KCl, 1 mM MgCl2)로 3회 세척함으로써 상기 살모넬라 티피뮤리엄 KCCM 11806에 결합되지 않은 DNA 앱타머를 제거하고, 상기 살모넬라 티피뮤리엄 KCCM 11806에 결합된 DNA 앱타머만을 분리하였다.The single-stranded DNA library extracted in Example <1-2> was subjected to Cell-
선별된 단일가닥 DNA 앱타머 서열 분석 및 특이적 결합 분석Selected single-stranded DNA aptamer sequencing and specific binding assays
<2-1> <2-1> 앱타머의 서열 분석Sequence analysis of aptamers
유전자 재조합을 실시하여 상기 실시예 1에서 선별된 단일가닥 DNA 앱타머들의 핵산 서열을 분석하였다. 먼저, 상기 실시예 <1-3>과 같이 총 10회의 선별 실험에서 선별된 핵산 앱타머에 미리 지정한 제한효소를 처리하여 대장균용 플라스미드 벡터인 T-벡터에 삽입하여 접합을 유도하였다. 접합이 완료된 플라스미드 벡터를 대장균에 형질전환시켜 증폭시켰고, 상기 증폭된 플라스미드 벡터를 멤브레인으로 분리정제한 후, 삽입된 DNA 앱타머들의 서열을 분석하였다.And the nucleic acid sequences of single stranded DNA aptamers selected in Example 1 were analyzed by performing genetic recombination. First, the nucleic acid aptamer selected in the 10-times screening experiment as described in the above Example <1-3> was treated with a restriction enzyme designated in advance and inserted into a T-vector as a plasmid vector for E. coli to induce the junction. The ligated plasmid vector was transformed into E. coli and amplified. After the amplified plasmid vector was separated and purified, the sequence of inserted DNA aptamers was analyzed.
그 결과, 하기 표 4와 같이, 최종적으로 살모넬라 티피뮤리엄 KCCM 11806에 특이적으로 결합하는 5개의 신규 앱타머 서열이 확인되었으며, 상기 5개의 앱타머 서열에서 (A/T)GGG(C/A) 서열이 공통적으로 확인되었다.As a result, five new aptamer sequences specifically binding to Salmonella typhimurium KCCM 11806 were identified as shown in Table 4 below. In the five aptamer sequences, (A / T) GGG (C / A ) Sequences were commonly identified.
<2-2> <2-2> 앱타머의 결합력 측정Measuring the bond strength of an aptamer
상기 실시예 <2-1>에서 확인한 신규 앱타머 서열 5개 중에서, 대표적으로 서열번호 4의 앱타머에 FITC 계열의 형형광표지 물질인 FAM(carboxyfluorescein)을 5'-말단에 연결하고, 결합버퍼(50 nM HEPES, 50 mM NaCl)에 농도 별(0 μM, 1 μM, 3 μM, 5 μM, 8 μM, 11 μM 및 14 μM)로 첨가하였다. 상기와 같이 서로 다른 농도의 앱타머가 첨가된 결합버퍼에 1.0x108 개의 살모넬라 티피뮤리엄 KCCM 11806을 현탁시키고, 1시간 동안 배양한 다음, 각 농도에서의 상기 서열번호 4의 앱타머의 형광발산 신호를 수집하여 해리상수(KD)를 분석함으로써, 살모넬라 티피뮤리엄 KCCM 11806에 대한 상기 서열번호 4의 앱타머의 결합력을 확인하였다.Of the five new aptamer sequences identified in Example <2-1>, FAM (carboxyfluorescein), which is a FITC-based fluorescent labeling substance, is typically attached to the 5'-terminal of the aptamer of SEQ ID NO: (0 μM, 1 μM, 3 μM, 5 μM, 8 μM, 11 μM and 14 μM) in a buffer solution (50 nM HEPES, 50 mM NaCl) 1.0x10 8 Salmonella typhimurium KCCM 11806 was suspended in the binding buffer to which different concentrations of aptamers were added and cultured for 1 hour. Then, the fluorescence emission signal of the aptamer of SEQ ID NO: 4 at each concentration And the dissociation constant (K D ) was analyzed to confirm the binding ability of the aptamer of SEQ ID NO: 4 to Salmonella typhimurium KCCM 11806.
그 결과, 서열번호 4의 앱타머는 KD 값이 0.53±0.11 μM로 측정되어, 상기 서열번호 4의 앱타머가 마이크로몰 농도(μM) 수준의 결합력을 갖는 것을 확인하였다(도 1).As a result, it was confirmed that the aptamer of SEQ ID NO: 4 had a K D value of 0.53 ± 0.11 μM, and that the aptamer of SEQ ID NO: 4 had a binding force of micromolar concentration (μM) (FIG.
<2-3> <2-3> 앱타머의 특이적 결합력 확인Identify the specific cohesion of the aptamer
상기 서열번호 4의 앱타머의 살모넬라 티피뮤리엄 KCCM 11806에 대한 특이적 결합(specificity)을 확인하기 위하여, 같은 그램음성 세균인 대장균(Escherichia coli DH5α), 슈도모나스 애루지노사(Pseudomonsa Aeruginosa) 및 살모넬라 엔테리티디스(Salmonella Enteritidis) KCCM 12021과의 교차반응을 통하여 앱타머의 결합 여부를 확인하였다. In order to confirm the specificity of Salmonella typhimurium KCCM 11806 of the aptamer of SEQ ID NO: 4, Escherichia coli DH5α, Pseudomonas aeruginosa , and Salmonella enteric bacteria, which are the same gram negative bacterium, Salmonella Enteritidis KCCM 12021 was cross-reacted to confirm the binding of aptamers.
구체적으로, 상기 서열번호4의 앱타머에 FITC 계열의 형형광표지 물질인 FAM(carboxyfluorescein)을 5'-말단에 연결하고, 결합버퍼(50 nM HEPES, 50 mM NaCl)에 농도 별(0 μM, 4 μM 및 8 μM)로 첨가하였다. 상기와 같이 서로 다른 농도의 앱타머가 첨가된 결합버퍼에 각각 1.0x108 개의 살모넬라 티피뮤리엄 KCCM 11806, E.coli DH5a, 슈도모나스 애루지노사 및 살모넬라 엔테리티디스를 현탁시키고, 1시간 동안 배양한 다음, 각 농도에서의 상기 서열번호 4의 앱타머의 형광발산 신호를 수집하여 해리상수(KD)를 분석함으로써, 살모넬라 티피뮤리엄 KCCM 11806에 대한 상기 서열번호 4의 앱타머의 결합특이성을 확인하였다.Concretely, FAM (carboxyfluorescein) of the FITC series was attached to the 5'-terminal of the aptamer of SEQ ID NO: 4, and the binding buffer (50 nM HEPES, 50 mM NaCl) 4 [mu] M and 8 [mu] M). 1.0 × 10 8 Salmonella typhimurium KCCM 11806, E. coli DH5a, Pseudomonas aeruginosa and Salmonella enteritidis were suspended in the binding buffer to which different concentrations of aptamers were added as described above, followed by incubation for 1 hour , The fluorescence emission signal of the aptamer of SEQ ID NO: 4 at each concentration was collected and the dissociation constant (K D ) was analyzed to confirm the binding specificity of the aptamer of SEQ ID NO: 4 to Salmonella typhimurium KCCM 11806 .
그 결과, 동일 농도를 처리한 실험군에서 서열번호 4의 앱타머가 살모넬라 티피뮤리엄 KCCM 11806에서 가장 높은 형광발산 신호가 수집되었다(도 2).As a result, the highest fluorescence emission signal of Salmonella typhimurium KCCM 11806 of the aptamer of SEQ ID NO: 4 was collected in the experiment group treated with the same concentration (Fig. 2).
상기와 같은 결과로부터, Cell-SELEX에 의해 선별된 본 발명의 서열번호 4 내지 서열번호 8의 DNA 앱타머들은 살모넬라 티피뮤리엄 KCCM 11806 균의 표면에 특이적으로 결합함을 알 수 있다.
From the above results, it can be seen that the DNA aptamers of SEQ ID NOS: 4 to 8 of the present invention selected by Cell-SELEX specifically bind to the surface of Salmonella typhimurium KCCM 11806.
상기에서는 본 발명의 바람직한 실시예를 예시적으로 설명하였으나, 본 발명의 범위는 상기와 같은 특정 실시예에만 한정되지 아니하며, 해당 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 본 발명의 특허청구범위에 기재된 범주 내에서 적절하게 변경이 가능할 것이다.
While the present invention has been particularly shown and described with reference to exemplary embodiments thereof, it is to be understood that the scope of the invention is not limited to the disclosed exemplary embodiments. It will be possible to change it appropriately.
<110> Industry-University Cooperation Foundation Hanyang University <120> DNA aptamer specifically binding to Salmonella Typhymurium and uses thereof <130> HY120089N <160> 8 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ssDNA library template sequence <400> 1 gcgcggatcc cgcgcnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnncgcgc gaagcttgcg 60 60 <210> 2 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for the library amplification <400> 2 gcgcggatcc cgcgc 15 <210> 3 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for the library amplification <400> 3 gcgcaagctt cgcgc 15 <210> 4 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Aptamer 1 <400> 4 ccgatgtccg ttagggctcc tccatagatc 30 <210> 5 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Aptamer 2 <400> 5 cgcactgaag tgggataccg cctaaacggg 30 <210> 6 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Aptamer 3 <400> 6 cagaccgtaa gggatgccgc ctattcaccg 30 <210> 7 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Aptamer 4 <400> 7 cgcactgaag tgggataccg ccggaacgg 29 <210> 8 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Aptamer 5 <400> 8 cagaccgtaa gggatgccgc gacaacacc 29 <110> Industry-University Cooperation Foundation Hanyang University <120> DNA aptamer specifically binding to Salmonella Typhimurium and uses thereof <130> HY120089N <160> 8 <170> Kopatentin 1.71 <210> 1 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ssDNA library template sequence <400> 1 gcgcggatcc cgcgcnnnnn nnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnncgcgc gaagcttgcg 60 60 <210> 2 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for the library amplification <400> 2 gcgcggatcc cgcgc 15 <210> 3 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for the library amplification <400> 3 gcgcaagctt cgcgc 15 <210> 4 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Aptamer 1 <400> 4 ccgatgtccg ttagggctcc tccatagatc 30 <210> 5 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Aptamer 2 <400> 5 cgcactgaag tgggataccg cctaaacggg 30 <210> 6 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Aptamer 3 <400> 6 cagaccgtaa gggatgccgc ctattcaccg 30 <210> 7 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Aptamer 4 <400> 7 cgcactgaag tgggataccg ccggaacgg 29 <210> 8 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Aptamer 5 <400> 8 cagaccgtaa gggatgccgc gacaacacc 29
Claims (9)
상기 살모넬라 티피뮤리엄 KCCM 11806과 상기 단일가닥 DNA 앱타머의 결합 여부를 확인하는 단계를 포함하는 살모넬라 티피뮤리엄의 검출 방법.
Contacting a sample suspected of having Salmonella typhimurium KCCM 11806 with the single stranded DNA aptamer of claim 1; And
And confirming whether the Salmonella typhimurium KCCM 11806 binds to the single stranded DNA aptamer.
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KR20120050540A (en) * | 2010-11-10 | 2012-05-21 | 건국대학교 산학협력단 | Aptamer specific s.enteritidis and use of the same |
KR20120068231A (en) * | 2010-12-17 | 2012-06-27 | 한국식품연구원 | Rna aptamers for salmonella typhimirium ompc proteins |
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