KR101438994B1 - 바이오부탄올 분리정제 공정 폐액을 이용한 바이오부탄올 생산 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 부탄올 생산능이 있는 제1미생물로 바이오매스를 발효시켜 부탄올을 생산하는 단계; 부탄올 선택도가 60% 이상인 발효물로부터 부탄올을 분리 및 정제하는 단계; 상기 분리 및 정제 단계로부터 생성되는 폐액을 회수하는 단계; 상기 폐액을 포함하는 배지를 준비하는 단계;및 상기 배지에서 제2미생물을 배양하는 단계를 포함하는 바이오물질의 제조 방법에 대한 것이다.
Description
바이오부탄올 분리정제 공정 폐액을 이용한 바이오부탄올 생산 방법에 대한 것이다.
부탄올은 탄소 4개로 구성된 알코올로서 대표적인 산업용제이다. 일반적으로 부탄올은 옥소 공정(Oxo-process)이라는 케미컬 공정 또는 클로스트리디움 아세토부틸리쿰(Clostridium acetobutylicum)으로 대표되는 부탄올 생산 미생물의 발효를 통한 바이오 공정을 통하여 생산할 수 있다. 바이오 공정을 통한 부탄올 생산은 석유화학산업이 본격화 되기 이전까지 전세계적으로 널리 이용되었다. 그러나 2차 세계대전 이후 케미컬 공정을 통한 부탄올을 생산하는 기술 대비 경쟁력을 잃으면서 바이오부탄올에 대한 생산 및 연구가 줄어들었지만 2000년대 초반부터 미국 등의 선진국을 중심으로 친환경 저탄소 바이오연료 및 바이오화학물질 생산에 대한 연구가 활발해지면서 바이오부탄올 연구 역시 국가적인 지원 하에 활발히 진행되고 있다.
바이오부탄올 생산 미생물은 글루코오스와 같은 당분을 이용하여 일차적으로 아세트산, 부틸릭산 등과 같은 산을 생산하는 Acidogenesis 과정과 상기 생산된 산 및 그 중간산물들을 부탄올, 에탄올, 아세톤 등과 같은 바이오 알코올 또는 용제로 전환 시키는 Solventogenesis 과정을 거쳐 ABE 발효공정 (ABE Fermentation)을 수행하게 된다. 이러한 바이오부탄올 생산 공정은 낮은 수율, 선택도, 생산성 및 높은 분리정제 에너지 등의 기술적 문제로 상업화의 어려움을 겪고 있다.
바이오부탄올의 생산을 높이기 위한 방법으로 부티르산(butyric acid) 또는 아세트산(acetic acid)을 배양액에 연속적으로 첨가하여 부탄올과 아세톤의 생산을 높인 연구(Ghassan M. et. Al, Biochimie, 69, 1987, pp 109-115)가 수행이 되었으나, 실제 상업공정을 위해서 효과적으로 부티르산 또는 아세트산을 공급할 수 있는 방법에 대한 논의는 되지 않았다. 만약 부티르산 또는 아세트산을 bulk chemical로 구입하여 배지에 공급할 경우 공급되는 부티르산 또는 아세트산 톤(ton) 당 약 400-500 달러의 비용이 추가로 소요된다.
바이오부탄올 연구에 있어서 또 하나의 이슈로 알코올 선택도의 문제가 있다. 일반적인 ABE 발효공정에서는 바이오부탄올 생산 균주의 특성상 당분을 이용하여 부탄올 뿐만 아니라 에탄올과 아세톤을 동시에 생산한다. 부탄올과 에탄올과는 달리 아세톤은 연료로 사용할 수 없고 유입시 자동차 내 고무성분을 변형시키거나 금속 성분을 부식시킬 우려가 있다. 따라서 바이오연료를 생산하는 공정을 최대화 하기 위하여 연료로 사용할 수 없는 용제인 아세톤의 생산을 줄이고 연료로 사용이 가능한 알코올인 부탄올과 에탄올의 생산을 높이려는 연구가 활발하게 진행되고 있다. 아세톤의 생산을 줄이고 알코올의 선택도를 높이기 위한 대부분의 연구는 균주의 개량의 접근을 통해 이루어 진다. 하지만 아세톤, 에탄올, 부탄올은 케미컬로도 사용될 수 있으므로 시장 상황에 따라 유연하게 그 생산성을 변화시킬 수 있어야 한다. 또한 연속식 발효공정의 경우 한 번 투입하여 안정화 된 균주를 교체하는 것은 쉽지가 않고 다시 안정화 시키는데 상대적으로 많은 시간과 비용이 소요되며 기존 균주로 인한 오염이 문제가 된다.
본 발명자들은 이러한 문제들을 해결하고자 연구를 하던 중 부탄올 발효물로부터 ABE를 분리하고 얻은 특정 조성의 폐액을 이용할 경우, 아세트산 및 부티르산을 효과적으로 공급하여, 부탄올, 에탄올, 아세톤을 모두 생산할 수 있으면서도, 부탄올의 함량이 많을 뿐 아니라, 에탄올 및 아세톤 생산량을 조절할 수 있는 것을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 부탄올, 에탄올, 아세톤을 모두 생산할 수 있으면서도, 부탄올의 함량이 많을 뿐 아니라, 에탄올 및 아세톤 생산량을 조절할 수 있는 생물학적 제조 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 부탄올 생산능이 있는 제1미생물로 바이오매스를 발효시켜 부탄올을 생산하는 단계; 부탄올 선택도가 60% 이상인 발효물로부터 부탄올을 분리 및 정제하는 단계; 상기 분리 및 정제 단계로부터 생성되는 폐액을 회수하는 단계; 상기 폐액을 포함하는 배지를 준비하는 단계; 및 상기 배지에서 제2미생물을 배양하는 단계를 포함하는 바이오물질의 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 제조 방법은 ABE 발효를 연속발효 하여 분리정제하여 생성되는 폐액을 활용함으로써 폐액 처리 비용을 절감하는 동시에, 균주 교체 없이 공정 운전 변경으로 부탄올 생산성을 유지하면서 에탄올 또는 아세톤의 생산성을 높이거나 낮출 수 있다.
도 1은 본 발명의 바이오물질의 제조 방법을 나타낸다.
도 2는 서열번호 3의 염기서열이다.
도 3은 pGS1-E1AB-HCB 벡터이다.
도 4는 pGS1-HCB 벡터이다.
도 5는 pGS1-E1AB 벡터이다.
도 6은 pGS1-MCS 벡터이다.
도 7은 pGS1-AdhE1 벡터이다.
도 8은 부탄올 발효 폐액을 이용하여 회분식 배양을 수행한 결과 배양액 내 ABE 농도(A) 및 ABE 생산 수율(B)을 나타낸다.
도 9는 부탄올 발효 폐액을 이용하여 유가식 배양을 수행한 결과 배양액 내 ABE 농도(A) 및 ABE 생산 수율(B)을 나타낸다.
도 10은 제1미생물의 균체 제거 여부에 따른 ABE 생산성 변화를 나타낸다.
도 11은 제1미생물의 균체 제거 여부에 따른 부탄올 생산성 변화를 나타낸다.
도 12는 제1미생물의 균체 제거 여부에 따른 에탄올 생산성 변화를 나타낸다.
도 13은 제1미생물의 균체 제거 여부에 따른 아세톤 생산성 변화를 나타낸다.
도 2는 서열번호 3의 염기서열이다.
도 3은 pGS1-E1AB-HCB 벡터이다.
도 4는 pGS1-HCB 벡터이다.
도 5는 pGS1-E1AB 벡터이다.
도 6은 pGS1-MCS 벡터이다.
도 7은 pGS1-AdhE1 벡터이다.
도 8은 부탄올 발효 폐액을 이용하여 회분식 배양을 수행한 결과 배양액 내 ABE 농도(A) 및 ABE 생산 수율(B)을 나타낸다.
도 9는 부탄올 발효 폐액을 이용하여 유가식 배양을 수행한 결과 배양액 내 ABE 농도(A) 및 ABE 생산 수율(B)을 나타낸다.
도 10은 제1미생물의 균체 제거 여부에 따른 ABE 생산성 변화를 나타낸다.
도 11은 제1미생물의 균체 제거 여부에 따른 부탄올 생산성 변화를 나타낸다.
도 12는 제1미생물의 균체 제거 여부에 따른 에탄올 생산성 변화를 나타낸다.
도 13은 제1미생물의 균체 제거 여부에 따른 아세톤 생산성 변화를 나타낸다.
본 발명은,
부탄올 생산능이 있는 제1미생물로 바이오매스를 발효시켜 부탄올을 생산하는 단계;
부탄올 선택도가 60% 이상인 발효물로부터 부탄올을 분리 및 정제하는 단계;
상기 분리 및 정제 단계로부터 생성되는 폐액을 회수하는 단계;
상기 폐액을 포함하는 배지를 준비하는 단계; 및
상기 배지에서 제2미생물을 배양하는 단계를 포함하는 바이오물질의 제조 방법에 대한 것이다(도 1).
이하, 본 발명을 자세히 설명한다.
부탄올 생산능이 있는 제1미생물
본 발명의 제1미생물은 부탄올 생산능을 갖는 미생물이다. 바람직하게는 상기 제1미생물은 부탄올 및 에탄올을 생산할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 부탄올, 에탄올 및 아세톤을 모두 생산할 수 있다. 가장 바람직하게는 본 발명의 부탄올 생산능이 있는 제1미생물은 클로스트리디움 아세토부틸리쿰 등 클로스트리디움이다. 그러나 야생형 효모 및 바이오에탄올 생산에 일반적으로 사용되는 효모는 부탄올 및 아세톤 생산능이 없거나 매우 낮으므로, 본 발명의 제1미생물에 해당하지 않는다.
바이오매스
본 발명의 바이오매스는 바이오알코올 생산에 사용되는 일반적인 바이오매스이다. 예컨대, 본 발명의 바이오매스는 옥수수, 사탕수수, 고구마 등이 될 수 있으며 특별히 제한되지 않는다.
발효물
본 발명의 발효물은 부탄올 선택도가 60% 이상이다. 바람직하게는 본 발명이 발효물은 부탄올 선택도가 60% 이상 95% 이하이다.
본 발명의 발효물은 에탄올 및 아세톤 역시 포함하는데, 에탄올 선택도 및 아세톤 선택도의 합은 5% 이상 40% 이하이며, 에탄올 선택도가 아세톤 선택도보다 크다.
그러므로 상기 발효물 내 ABE 함량은 부탄올 > 에탄올 > 아세톤이라 할 수 있다.
제1미생물의 제거
본 발명의 발효물로부터 제1미생물을 제거한 후, 하기 부탄올 분리 정제 공정을 수행할 수도 있다. 상기 제1미생물의 제거 여부에 따라 제2미생물을 배양한 배양물 내 바이오 물질의 조성이 달라지게 된다.
제1미생물을 제거한 폐액을 이용할 경우, 부탄올 생산성에는 유의한 변화가 없는 반면, 에탄올 생산성이 낮아지고, 아세톤 생산성이 높아진다.
그러므로 본 발명에서는 연료로 사용할 수 있는 알코올인 부탄올과 에탄올 가격이 용제 케미컬인 아세톤 가격 시장보다 좋을 경우, 제1미생물의 제거 공정을 거치지 않은 폐액을 이용한다. 또한 용제 케미컬인 아세톤의 생산성을 높이고 싶을 경우 제1미생물의 제거 공정을 거친 폐액을 이용한다.
이로써 본 발명은 연속 공정 중에서도 오염이나 세척문제 없이 용이하게 에탄올 및 아세톤의 생산성을 조절할 수 있다.
부탄올의 분리 및 정제
상기 발효물로부터 생성된 부탄올을 분리하고, 이 과정에서 폐액이 생성된다. 이 때, 에탄올 및 아세톤도 부탄올과 함께 분리할 수 있다. 상기 알코올 및 용제의 분리 및 정제는 일반적인 방법으로 이루어지며, 특별히 제한되는 것은 아니다. 그러나 증류에 의하여 알코올 및 용제를 1차적으로 분리정제하는 것이 경제적이며 제일 간편하므로 바람직하다.
폐액
본 발명은 부탄올 생산능이 있는 제1미생물을 발효한 발효물로부터 부탄올을 분리, 정제하고, 이 과정에서 생성되는 폐액을 회수하게 된다. 상기 폐액은 온도가 90℃ 이상이며 추가의 멸균공정 없이 발효공정에 투입될 수 있으나, 당 또는 다른 추가적인 배지성분들과 함께 재멸균하여 사용할 수 있다.
상기 폐액은 부티르산 및 아세트산, 무기염과 아미노산 등을 포함한다. 상기 폐액을 이용함으로써 본 발명은 부티르산, 아세트산, 무기염, 아미노산을 바이오물질 제조 시 재공급하게 된다.
본 발명의 폐액에는 부티르산이 0.2 ~ 1.1 g/L 포함되며, 아세트산이 0.3 ~ 1.0 g/L 포함된다. 폐액에 부티르산이 0.2 g/L 미만으로 포함되거나 아세트산이 0.3 g/L 미만으로 포함될 경우, 부티르산 및 아세트산을 제2미생물의 배양 시 별도로 배지에 첨가하여주어야 하는데, 그 경우 비용이 증가하게 된다.
본 발명의 폐액은 아세톤을 소량 포함하게 되는데, 바람직하게는 아세톤을 0.1 g/L 이하로 포함하여, 미생물의 성장에 지장이 없도록 한다.
폐액을 포함하는 배지
본 발명은 상기 폐액을 배지에 첨가하여, 제2미생물의 배양에 이용하게 된다. 상기 배지는 상기 폐액을 유의한 양으로 포함한다. 즉, 상기 배지는 본 발명의 폐액을 5 내지 100 부피% 포함하며, ABE 수율을 고려하면, 폐액을 25 내지 100 부피% 포함하는 것이 바람직하다. 그러나 상기 폐액의 포함 비율은 배양 방식에 따라 당업자가 변형할 수 있다.
즉, 제2미생물을 회분식으로 배양하는 경우, 상기 배지는 폐액을 15 ~ 100 부피% 포함하는 것이 바람직하고, 특히 ABE 수율 및 경제성을 고려하면 50 ~ 100 부피% 포함하는 것이 좋다.
또한 제2미생물을 유가식으로 배양하는 경우, 상기 배지는 폐액을 45 ~ 100 부피% 포함하는 것이 바람직하고, 특히 ABE 수율에 중점을 둔다면 50 ~ 90 부피% 포함시키는 것이 좋다.
상기 폐액을 배지에 포함하는 양에 비례하여, 바이오물질의 생산 원가가 절감되게 된다. 예컨대, 75 부피%의 폐액을 재활용한다면 바이오물질의 생산을 위한 미생물배양 시 공급되어야 하는 배지, 용수의 비용이 75% 절감되며, 그와 동시에 그만큼의 폐액 처리 비용 역시 절감하게 된다. ABE(아세톤, 부탄올, 에탄올)의 생산 원가에는 배지 원료 비용이 가장 큰 비중을 차지하는바, 폐액을 재활용함으로써 ABE 생산 원가를 크게 감소시킬 수 있다.
제2미생물
상기 폐액을 포함하는 배지에 제2미생물을 접종, 배양하여 바이오물질을 제조한다. 상기 제2미생물은 부탄올 생산능을 가지며, 바람직하게는 ABE 생산능을 갖는다. 또한 상기 제2미생물은 상기 제1미생물과 동일한 미생물일 수 있다. 바람직하게는 상기 제2미생물은 클로스트리디움 아세토부틸리쿰 등 클로스트리디움이다. 그러나 야생형 효모 및 바이오에탄올 생산에 일반적으로 사용되는 효모는 부탄올 및 아세톤 생산능이 없거나 매우 낮으므로, 본 발명의 제2미생물에 해당하지 않는다.
바이오물질
본 발명의 바이오물질은 부탄올, 아세톤 및 에탄올이다. 본 발명의 제2미생물이 배양된 배양물 내 바이오물질은 부탄올 선택도가 60% 이상이며, 바람직하게는 부탄올 선택도가 60% 이상 95% 이하이다. 이 때, 에탄올 선택도는 아세톤 선택도보다 높다.
본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 첨부되는 도면과 함께 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나, 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.
<재료 및 방법>
바이오부탄올 생산 배지
수도물 또는 증류수에 NaCl, FeSO4, MnSO4, 1 ~ 10 g/L의 효모 추출물(Yeast Extract) 또는 5 ~ 50 g/L의 옥수수침지액 (Corn Steep Liquor)를 첨가하였다. 효모 추출물과 옥수수침지액은 수율과 배지가격을 고려하였을 때 각각 2 ~ 5 g/L, 10 ~ 30 g/L로 첨가하는 것이 바람직하다. 배지의 pH는 암모니아수 또는 NaOH 수용액으로 4.8 이상 6.8 미만으로 조절하였다. 바람직하게는 5.5 ~ 6.5 사이를 유지하도록 하였다. 회분식 발효의 경우 배지 내 탄소원은 60 ~ 100 g/L를 투입하고 유가식 발효의 경우 150 ~ 350 g/L 농도의 탄소원을 투입하였다.
클로스트리디움 균주 배양
바이오알코올 폐액을 포함하는 배지에 부탄올 생산 미생물인 클로스트리디움 아세토부틸리쿰 ATCC824 개량 균주를 접종, 배양하였다. 상기 클로스트리디움 아세토부틸리쿰 ATCC824 개량 균주는 주식회사 지에스칼텍스에서 보관 중인 부탄올 생산 균주로, 클로스트리디움 아세토부틸리쿰 ATCC824에 있어, 포스포트랜스아세틸라제를 코드하는 유전자인 pta 유전자 및 부티레이트 키나아제를 코드하는 유전자인 buk 유전자가 결실되고, E1AB(알코올/알데히드 탈수소 효소를 코드하는 유전자인 AdhE1(서열번호 1) 및 코에이트랜스퍼라아제를 코드하는 유전자인 ctfAB(서열번호 2) 및 hbd-crt-bcd 오페론을 코드하는 유전자 (서열번호 3, 도 2)가 도입된 개량 균주이다. 상기 개량 균주는 한국특허출원 10-2012-0131850호에 기재된 균주로, 클로스트리디움 아세토부틸리쿰 ATCC824 pta buk에 pGS1-E1AB-HCB플라스미드를 도입하여 제조한 것이다.
상기 클로스트리디움 아세토부틸리쿰 ATCC824 pta buk는 WO2011/037415에 기재된 방법으로 제작하였다. 또한 상기 pGS1-E1AB-HCB 플라스미드(도 3)는 프라이머 pThl-UP-SalI (서열번호 4) 및 pGS-R4 (서열번호 5)을 사용하여 pGS1-HCB(도 4)를 주형으로 hbd-crt-bcd 오페론을 코드하는 유전자 (서열번호 3), 프로모터 및 터미네이터 영역을 증폭하고, 증폭한 유전자를 정제한 후 SalI, XmaI제한효소로 DNA 단편을 절단하고 동일한 제한효소로 절단한 pGS1-E1AB 벡터(도 5)에 라이게이션 하여 제작하였다.
상기 pGS1-HCB는 HCB-UP-PstI (서열번호 6) 및 HCB-DN-XhoI 프라이머 (서열번호 7)를 이용하여 클로스트리디움 아세토부틸리쿰 ATCC 824 균주의 hbd-crt-bcd 오페론을 코드하는 유전자(서열번호 3)를 증폭하고, 이를 정제한 후 PstI, XhoI제한효소로 DNA 단편을 절단하고 pGS1-MCS벡터(도 6)에 라이게이션 하여 제작한 것이다.
상기 pGS1-E1AB 벡터는 하기와 같이 제작하였다. 먼저, 클로스트리디움 아세토부틸리쿰 ATCC824로부터 분리된 염색체를 주형으로 하고, 프라이머 AdhE1-UP-PstI (서열번호 8) 및 AdhE1-DN-XhoI(서열번호 9)을 사용하여 adhE1 유전자(서열번호 10)를 증폭한 후, 이를 정제하고, PstI, XhoI제한효소로 DNA 단편을 절단하고 동일한 제한효소로 절단한 pGS1-MCS 벡터에 라이게이션 하여 pGS1-AdhE1(도 7)을 제작하였다. 그리고 프라이머 CtfAB-UP-XhoI(서열번호 11) 와 E1AB-DN-SalI(서열번호 12)을 사용하여 상기 분리한 클로스트리디움 아세토부틸리쿰 ATCC824 염색체를 주형으로 하여 ctfAB 유전자(서열번호 13)를 증폭한 후 이를 정제하고, XhoI, SalI제한효소로 DNA 단편을 절단하고 동일한 제한효소로 절단한 pGS1-AdhE1 벡터에 라이게이션 하여 pGS1-E1AB를 제작하였다(표 1).
본 발명에서는 전술한 바와 같이, 클로스트리디움 아세토부틸리쿰 ATCC824 개량 균주를 사용하여, 하기 실험예 1 내지 6들을 수행하였으나, 본 발명의 제1미생물 및 제2미생물이 이에 제한되는 것은 아니며, 상기 개량 균주는 부탄올 생성능이 있는 클로스트리디움 아세토부틸리쿰의 예로서 이용된 것으로 보아야 할 것이다.
상기 클로스트리디움 아세토부틸리쿰 ATCC824 개량 균주를 배양하기 위하여 준비된 배양액은 121℃에서 15분간 멸균하여 37℃의 혐기챔버 (N2 90%, CO2 5%, H2 5%)에 보관하여 24시간 이상 혐기화하였다. 60 g/L 글루코스 농도의 CGM 배지(표 2) 30 mL가 담겨있는 튜브에 클로스트리디움 아세토부틸리쿰 ATCC824 개량 균주 콜로니를 접종하여 37℃의 혐기챔버에서 배양하였다. 배양액의 OD(Optical Density)가 1 ~ 3까지 자랐을 때 5 ~ 20% 부피로 플라스크에 접종하였다. 발효기에 접종 시에는 플라스크 배양액의 OD가 1 ~ 3 일 때 발효기 내의 발효액 부피의 5 ~ 20% 를 접종하였다.
클로스트리디움 생산 배지 (CGM)
제1미생물의 균체 제거
바이오부탄올 생산 배지에 클로스트리디움 아세토부틸리쿰 ATCC824 개량 균주를 접종, 배양하여 바이오부탄올을 생산하였다. 원심분리기 또는 막여과 공정 등을 통하여 상기 바이오부탄올 발효액으로부터 제1미생물의 균체를 제거하였다. 원심분리기를 이용시 4℃, 8,000 rpm에서 30분간 원심분리한 후 상등액을 증류 공정으로 이송하였다. 막여과 공정 이용시 0.4 m PVDF 재질의 중공사막 (Hollow fiber membrane)을 이용하여 10 ~ 20 cmHg 운전압력으로 균체를 제거한 후 여과액을 증류 공정으로 이송하였다.
부탄올 분리정제
상기 균체를 제거한 바이오부탄올 발효액은 증류 공정으로 이동시켰다. 증류 칼럼에 유입되는 발효액의 온도는 25 ~ 30℃의 온도였다. 유입된 원료는 130℃ 리보일러 증기(Reboiler Steam)을 주입하여 칼럼 하단(Column Bottom) 온도 95℃, 칼럼상단(Column Top) 온도 100℃가 되도록 운전하였다. 정상 운전시 칼럼오버해드 증기(Column Overhead Vapor) 온도는 102 ~ 105℃로 유지되며 이 때 압력은 0.2 ~ 0.3 kg/cm2 이다. 정상 운전시 리보일러 하단(Reboiler Bottom)에서 채취한 액체 시료가 분리정제 폐액이다.
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분석방법
OD를 제외한 모든 분석방법을 수행하기 이전에 4℃, 12,000 RPM에서 5분간 원심분리한 후 상등액을 분석에 사용하였다. 배양액의 OD는 UV-VIS Spectrophotometer를 이용하여 600 λm 파장에서 측정하였다. 배지, 배양액, 폐액내 존재하는 글루코스는 고압액체 크로마토그래피(High Pressure Liquid Chromatography; HPLC)를 이용하여 분석하였다. HPLC 분석조건은 표 3과 같다. 배지, 배양액, 폐액 내 존재하는 부탄올, 에탄올, 아세톤, 부티르산, 아세트산의 농도는 가스 크로마토그래피(Gas Chromatography, GC)를 이용하여 분석하였으며, 분석조건은 표 4와 같다.
ABE 수율은 하기 식 1과 같이 계산하였다.
<식 1>
-수율(%): ABE 생산량(g)/탄소원(g) 100
-ABE 생산성(g/L/h): 단위 시간, 단위 부피당 생산되는 ABE의 양
(이 때, 회분식 및 유가식 방법에서 ABE 생산성은 exponential phase 기준이며, 연속배양에서는 전체 phase에서 생산된 누적 ABE량을 기준으로 계산함)
-아세톤 생산성(g/L/h): 단위 시간, 단위 부피당 생산되는 아세톤의 양
-부탄올 생산성(g/L/h): 단위 시간, 단위 부피당 생산되는 부탄올의 양
-에탄올 생산성(g/L/h): 단위 시간, 단위 부피당 생산되는 에탄올의 양
-아세톤 선택도(%): 아세톤 생산량(g)/ABE 생산량(g) × 100
-부탄올 선택도(%): 부탄올 생산량(g)/ABE 생산량(g) × 100
-에탄올 선택도(%): 에탄올 생산량(g)/ABE 생산량(g) × 100
HPLC 분석조건
GC 분석조건
바이오에탄올 폐액
바이오에탄올을 산업적 규모로 생산하는 업체(㈜창해에탄올)로부터 바이오에탄올 생산 배지로부터 바이오에탄올을 분리정제하고 남은 폐액을 공급받아, 하기 시험에 이용하였다. 상기 바이오에탄올 폐액은 바이오에탄올의 분리정제 전 균체를 제거한 것이다.
<실험예 1> 폐액 성분 분석
바이오부탄올 폐액 및 바이오에탄올 폐액의 성분을 분석하였다. 그 결과, 바이오부탄올 폐액의 경우 바이오에탄올 폐액보다 단백질 및 질소 함량이 높은 것으로 확인되었다. 또한 바이오부탄올 폐액이 부티르산을 상당량 함유하는 반면, 바이오에탄올 폐액에서는 부티르산이 검출되지 않았다. 또한 바이오에탄올 폐액에서는 부탄올이 검출되지 않았다. 반면, 바이오부탄올 폐액 및 바이오에탄올 폐액 모두 아세톤이 검출되지 않았다(표 5). 이로 보아 산업적 규모로 바이오부탄올 및 바이오에탄올을 생산하는 경우, 각각의 생산 공정에서 배출되는 바이오부탄올 폐액 및 바이오에탄올 폐액은 그 성분이 상당히 상이한 것으로 판단되었다.
분리정제 폐액의 성상
<실험예 2> 바이오알코올 폐액에 따른 발효 수율
바이오부탄올 폐액 및 바이오에탄올 폐액을 이용하여 배지를 준비하고, 배지 성분에 따른 발효산물의 생산량 및 구성성분에 대하여 평가하였다.
상기 균체를 제거한 바이오부탄올 폐액 및 균체를 제거한 바이오에탄올 폐액을 준비하였다. 전체 배양액 부피 100 mL 중 폐액이 75 부피%가 되도록 각각의 폐액을 첨가하고, 전체 배양액의 부피가 100 mL가 되도록 증류수를 첨가하였다. 준비된 배지를 1 g의 CaCO3 가 함유된 250 mL 플라스크에 넣고, 클로스트리디움 아세토부틸리쿰 ATCC824 개량 균주의 튜브 배양액을 5 mL 접종하여 혐기챔버 (N2 90%, CO2 5%, H2 5%)에서 37℃에서 72 시간 동안 정체하여 회분식 발효를 수행하였다.
분리정제 폐액을 활용한 배지와 대조 배지는 80 g/L의 동일한 글루코스를 함유하도록 하였다. 대조배지로는 클로스트리디움 배양 배지인 상기 CGM 배지를 사용하였다. 분리정제 폐액을 활용한 배지에는 분리정제 폐액, 필요시 추가되는 물과 글루코스 이외의 다른 어떠한 성분도 첨가하지 않았다.
그 결과, 바이오부탄올 폐액을 사용한 경우, 바이오에탄올 폐액을 사용한 때보다 ABE 생산 수율이 높았으며, 그 차이는 산업적 규모로 ABE를 생산하는 경우 상당히 유의한 수치였다(표 6).
<실험예 3> 바이오부탄올 폐액을 이용한 회분식 발효
바이오부탄올 생산 발효액으로부터 균체를 제거하고, 바이오부탄올을 분리정제하였다. 이 때, 발생한 폐액을 전체 배양액 부피 100 mL 중 25 부피%, 50 부피%, 75 부피%, 100 부피%를 각각 첨가하여 준비하고, 전체 배양액의 부피가 100 mL가 되도록 증류수를 첨가하였다. 준비된 배지를 1 g의 CaCO3 가 함유된 250 mL 플라스크에 넣고, 클로스트리디움 아세토부틸리쿰 ATCC824 개량 균주의 튜브 배양액 5 mL 접종하여 혐기챔버(N2 90%, CO2 5%, H2 5%)에서 37℃에서 72 시간 동안 정체하여 회분식 발효를 수행 하였다. 분리정제 폐액을 활용한 배지와 대조 배지는 80 g/L의 동일한 글루코스를 함유하도록 하였다. 대조배지로는 전술한 CGM 배지를 사용하였다. 분리정제 폐액을 활용한 배지에는 분리정제 폐액, 필요시 추가되는 물과 포도당 이외의 다른 어떠한 성분도 첨가하지 않았다.
그 결과, 전체 배지 부피의 75 부피%의 폐액을 혼합하였을 때 가장 효과적으로 ABE를 생산하였다. 75 부피%의 부탄올 발효 폐액을 혼합한 경우 대조배지와 동등 수준의 20 g/L의 ABE를 생성하면서도(도 8A) ABE 수율은 대조배지가 34%인 것에 비하여 부탄올 발효 폐액은 42%로 27% 이상 수율이 향상되었다(도 8B).
<실험예 4> 바이오부탄올 폐액을 이용한 유가식 발효
유가식 바이오부탄올 발효의 경우, 6.6 L의 부피를 가지는 발효기(BIOFLO310, NBS, 미국)에 2 L의 배지와 200 g의 흡착제를 추가하여 121℃에서 20분 동안 멸균 후 질소가스로 퍼지하면서 혐기화하였다. 1000 mL 광구병에 60 g/L CGM 액체배지 400 mL을 넣고 OD가 1 이상이 되도록 정체 배양한 종균(클로스트리디움 아세토부틸리쿰 ATCC824 개량 균주)을 발효기에 접종하였다. 접종 후 2시간 마다 샘플을 채취하여 ABE 농도와 글루코스 농도를 분석하였다. 상기 발효기 내 배지의 분리정제 폐액의 혼합 비율은 전체 발효액 부피의 0 ~ 100% 사이로 정했으며, 각 실험에서 폐액 혼합량을 뺀 나머지 발효액은 CSL 배지의 성분으로 대체하였다. 배양 시 부탄올 분리정제 폐액에 글루코스와 CSL을 첨가하여 멸균 후 질소로 혐기화하여 준비한 200 g/L 당농도의 피딩 용액(feeding solution)을 발효기에 투입하여 발효기 내의 당농도를 20 g/L ± 5 g/L로 유지하였으며, 당을 더 이상 소모하지 않았을 때 유가식 발효를 중단하였다. 이 때, 피딩 용액의 당농도는 글루코스에 의한 것이다.
대조배지로는 CSL 배지를 사용하였고, 배양시 CSL 배지를 계속 공급하여 배양액 중의 당농도를 20 g/L ± 5 g/L로 유지하였다.
CSL 배지의 조성 및 피딩 용액의 조성은 각각 하기 표 7 및 표 8과 같다.
CSL 배지
피딩 용액
그 결과, 분리정제 공정에서 생성된 바이오부탄올 폐액을 사용하여 유가식으로 바이오부탄올을 생산할 경우, CSL 대조 배지를 사용한 때보다 대체로 높은 ABE 농도와 수율을 보였다. 그 중에서도 전체 배지 부피의 60 부피%의 폐액을 혼합하였을 때 가장 효과적으로 ABE를 생산하였다. 대조 배지에서는 발효 종료 후 84.9 g/L의 ABE 농도와 35.6%의 ABE 생산 수율을 보였다. 60 부피%의 부탄올 발효 폐액을 혼합한 경우 대조 배지보다 약간 높은 86 g/L의 ABE를 생성하면서도 수율은 39.2%로 기존 수율 보다 4% 이상 향상되었다. 또한 생산성 역시 기존의 대조배지를 활용하였을 경우보다 10% 이상 생산성을 향상시킬 수 있었다(도 9, 표 9). 따라서 본 폐액을 바이오부탄올의 유가식 배양에 활용할 경우 배양시 투입되어야 하는 용수의 양과 분리정제 후 발생하는 폐액의 양을 60% 줄일 뿐만 아니라 ABE 수율 및 생산성을 높일 수 있는 것으로 확인되었다.
<실험예 5> 바이오부탄올 폐액을 이용한 연속식 발효
3 L의 부피를 가지는 흡착탑의 위아래로 흡착제가 용출돼 유실되는 것을 방지하고자 약 150 m 정도의 필터를 장착한 후에 교반기를 장착하고 흡착제 200 g을 충진한 칼럼 2개(각각 A, B 칼럼)를 구성하였다. 이를 4 L 부피의 발효기에 실리콘 튜브로 연결하고 펌프를 장착하여 발효액이 흡착탑과 발효기를 연속적으로 순환할 수 있도록 하였다. 칼럼의 inlet과 outlet은 4-way 밸브를 장착하여 배양 과정에서 칼럼내의 흡착제가 부탄올 및 혼합용매로 포화될 때 150℃의 스팀을 흘려 실시간으로 탈착하여 재생할 수 있도록 하였으며, 재생시 발효액은 두 번째 칼럼으로 순환시켜 배양액의 흐름은 연속적으로 이루어질 수 있도록 제작하였다.
상기와 같이 제작한 상기 연속식 바이오부탄올 발효기로 부탄올 생산균주를 연속식(Continuous) 배양하였다. 3.2 L의 CSL 액체배지가 포함된 발효기를 준비하고 질소가스를 이용해 혐기화하였다. 1000 mL CGM 액체배지에서 혐기 배양한 800 mL의 종균(클로스트리디움 아세토부틸리쿰 ATCC824 개량 균주)을 OD 1이 되었을 때 접종하였다. 배양 시작 후 부탄올 농도가 약 7~8g/L가 되면 펌프를 통해 50 mL/min 속도로 배양액을 흡착탑으로 통과시키며 순환시켰다. A칼럼으로 배양액이 통과하면서 흡착제가 배양액에 현탁되어 묽은 슬러리상을 형성하면서 배양액의 흐름이 cell flock에 의해 막히지 않고 칼럼을 통과하였으며 칼럼 통과 직전과 통과 직후의 배양액 시료를 채취하여 부탄올 농도가 8 g/L 이하가 되도록 유지하였다. 부탄올 및 혼합용매의 농도는 가스 크로마토그래피를 통하여 분석하였다. 연속발효 동안 글루코스 농도를 HPLC 및 당분석기를 이용하여 글루코스의 농도를 모니터링 하였다. 부탄올 분리정제 폐액에 글루코스를 첨가하여 멸균 후 질소로 혐기화하여 준비한 200 g/L 글루코스 농도의 피딩 용액을 발효기에 투입하여 발효기 내의 글루코스 농도를 20 g/L ± 5 g/L로 유지하였다. 피딩 용액의 주입에 따라 증가되는 발효액의 부피만큼은 흡착탑의 재생 전 Drain을 통하여 발효액 전체의 부피가 일정하도록 유지하였다. 상기 CSL 배지 및 피딩 용액의 조성은 상기 실험예 4의 유가식 배양에서 사용한 것과 동일하였다.
그 결과, 부탄올 분리정제 폐액을 사용하여 연속식으로 바이오부탄올을 생산할 경우, 기존 배지 사용 시와 비슷한 수율을 보였다. 피딩 용액에 부탄올 분리정제 폐액의 농도를 기존 배지 대비 아래와 같이 피딩 용액과 부탄올 분리정제 폐액의 합계에 대하여 20 부피%, 60 부피%, 100 부피% 비율로 섞어 제조하였고, 이를 연속발효기에 주입하였다. 연속식 발효 결과, 각각 82 ~ 83시간 내 발효가 종료되었고, CSL 대조 배지 대비 분리정제 폐액을 100 부피%를 사용했을 때, 수율이 37.7%에서 38.1%로 증가 시킬 수 있었으며, 알코올 선택도도 93%에서 95%로 증가 시킬 수 있었다. 60 부피%의 분리정제 폐액을 사용한 경우 수율이 CSL배지 보다 감소하였으나 알코올 선택도(ABE 중 에탄올 및 부탄올의 비율)를 96%까지 높일 수 있었다(표 10).
<실험예 6> 균체 제거 여부에 따른 생산성 변화
3 L의 부피를 갖는 흡착탑의 위아래로 흡착제가 용출돼 유실되는 것을 방지하고자 약 150 m 정도의 필터를 장착한 후에 교반기를 장착하고 흡착제 200 g을 충진한 칼럼 2개(각각 A, B 칼럼)를 구성하였다. 이를 4 L 부피의 발효기에 실리콘 튜브로 연결하고 펌프를 장착하여 발효액이 흡착탑과 발효기를 연속적으로 순환할 수 있도록 하였다. 칼럼의 inlet과 outlet은 4-way 밸브를 장착하여 배양 과정에서 칼럼내의 흡착제가 부탄올 및 혼합용매로 포화될 때 150℃의 스팀을 흘려 실시간으로 탈착하여 재생할 수 있도록 하였으며, 재생시 발효액은 두 번째 칼럼으로 순환시켜 배양액의 흐름은 연속적으로 이루어질 수 있도록 제작하였다.
상기와 같이 제작한 상기 연속식 바이오부탄올 발효기로 부탄올 생산균주를 배양하였다. 3.2 L의 CSL 액체배지가 포함된 발효기를 준비하고 질소가스를 이용해 혐기화하였다. 1000 mL CGM 액체배지에서 혐기 배양한 800 mL의 종균(클로스트리디움 아세토부틸리쿰 ATCC824 개량 균주)이 OD 1이 되었을 때 접종하였다. 배양 시작 후 부탄올 농도가 약 7 ~ 8 g/L가 되면 펌프를 통해 50 mL/min 속도로 배양액을 흡착탑으로 통과시키며 순환시켰다. A칼럼으로 배양액이 통과하면서 흡착제가 배양액에 현탁되어 묽은 슬러리상을 형성하면서 배양액의 흐름이 cell flock에 의해 막히지 않고 칼럼을 통과하였으며 칼럼 통과 직전과 통과 직후의 배양액 시료를 채취하여 부탄올 농도가 8 g/L 이하가 되도록 유지하였다. 부탄올 및 혼합용매의 농도는 가스 크로마토그래피를 통하여 분석하였다. 연속발효 동안 글루코스 농도를 HPLC 및 당분석기를 이용하여 글루코스의 농도를 모니터링 하였다. 분리정제 폐액은 증류공정만 거친 폐액과 증류공정 사전에 원심분리 또는 미세막여과공정을 이용하여 균체 제거 공정을 거친 폐액을 각각 준비하였다. 전체 피딩 용액 중 60 부피%에 해당하는 만큼 각각의 부탄올 분리정제 폐액을 투입하고. 여기에 글루코스를 첨가하여 멸균한 후 질소로 혐기화하여 준비한 200 g/L 글루코스 농도의 피딩 용액을 준비하였다. 준비된 피딩 용액을 발효기에 투입하여 발효기 내의 글루코스 농도를 20 g/L ± 5 g/L로 유지하였다. 피딩 용액의 주입에 따라 증가되는 발효액의 부피만큼은 흡착탑의 재생 전 Drain을 통하여 발효액 전체의 부피가 일정하도록 유지하였다. 상기 CSL 배지 및 피딩 용액의 조성은 상기 실험예 4의 유가식 배양에서 사용한 것과 동일하였다.
그 결과, 총 ABE 생산성 및 부탄올의 생산성은 증류 공정을 단독으로 수행하였을 때와 균체 제거 공정과 함께 하였을 때가 거의 유사하였다. 한편, 증류공정 단독으로 처리한 경우 에탄올의 생산성을 높이고 아세톤의 생산성을 낮출 수 있었다. 반면, 균체 제거 공정과 증류 공정을 모두 수행한 폐액의 경우, 에탄올의 생산성을 낮추고 아세톤의 생산성을 높일 수 있었다(도 10 내지 도 13).
그러므로 에탄올 및 아세톤의 시장 가격 및 필요 등에 따라 균체 제거 공정의 수행 여부를 결정함으로써 발효산물 내 에탄올 및 아세톤의 생산성을 조절할 수 있을 것으로 판단되었다.
<110> GS CALTEX
<120> PRODUCTION METHOD OF BIOBUTANOL USING WASTEWATER OBTAINED FROM
BIOBUTANOL SEPARATION PROCESS
<130> GSP120501
<160> 13
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 2589
<212> DNA
<213> Clostridium acetobutylicum
<400> 1
atgaaagtca caacagtaaa ggaattagat gaaaaactca aggtaattaa agaagctcaa 60
aaaaaattct cttgttactc gcaagaaatg gttgatgaaa tctttagaaa tgcagcaatg 120
gcagcaatcg acgcaaggat agagctagca aaagcagctg ttttggaaac cggtatgggc 180
ttagttgaag acaaggttat aaaaaatcat tttgcaggcg aatacatcta taacaaatat 240
aaggatgaaa aaacctgcgg tataattgaa cgaaatgaac cctacggaat tacaaaaata 300
gcagaaccta taggagttgt agctgctata atccctgtaa caaaccccac atcaacaaca 360
atatttaaat ccttaatatc ccttaaaact agaaatggaa ttttcttttc gcctcaccca 420
agggcaaaaa aatccacaat actagcagct aaaacaatac ttgatgcagc cgttaagagt 480
ggtgccccgg aaaatataat aggttggata gatgaacctt caattgaact aactcaatat 540
ttaatgcaaa aagcagatat aacccttgca actggtggtc cctcactagt taaatctgct 600
tattcttccg gaaaaccagc aataggtgtt ggtccgggta acaccccagt aataattgat 660
gaatctgctc atataaaaat ggcagtaagt tcaattatat tatccaaaac ctatgataat 720
ggtgttatat gtgcttctga acaatctgta atagtcttaa aatccatata taacaaggta 780
aaagatgagt tccaagaaag aggagcttat ataataaaga aaaacgaatt ggataaagtc 840
cgtgaagtga tttttaaaga tggatccgta aaccctaaaa tagtcggaca gtcagcttat 900
actatagcag ctatggctgg cataaaagta cctaaaacca caagaatatt aataggagaa 960
gttacctcct taggtgaaga agaacctttt gcccacgaaa aactatctcc tgttttggct 1020
atgtatgagg ctgacaattt tgatgatgct ttaaaaaaag cagtaactct aataaactta 1080
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gatagattta gtagtgccat gaaaaccgta agaacctttg taaatatccc aacctcacaa 1200
ggtgcaagtg gagatctata taattttaga ataccacctt ctttcacgct tggctgcgga 1260
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aagttcggtt gtcttcaatt tgctttaaaa gatttaaaag atctaaagaa aaaaagagcc 1440
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gaagtaaaat ttgaagatct tgcaataaaa tttatggaca taagaaagag aatatatact 1740
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tttaaatatt tgcctgaggc ttacaaaaac ggaagaacca atgaaaaagc aagagagaaa 2100
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cattccatgg caataaaatt aagttcagaa cacaatattc ctagtggcat tgccaatgca 2220
ttactaatag aagaagtaat aaaatttaac gcagttgata atcctgtaaa acaagcccct 2280
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ggtgaaattg aaaatgatag cgaagtactt gcagtaattt taactggagc aggagaaaaa 180
tcatttgtag caggagcaga tatttctgag atgaaggaaa tgaataccat tgaaggtaga 240
aaattcggga tacttggaaa taaagtgttt agaagattag aacttcttga aaagcctgta 300
atagcagctg ttaatggttt tgctttagga ggcggatgcg aaatagctat gtcttgtgat 360
ataagaatag cttcaagcaa cgcaagattt ggtcaaccag aagtaggtct cggaataaca 420
cctggttttg gtggtacaca aagactttca agattagttg gaatgggcat ggcaaagcag 480
cttatattta ctgcacaaaa tataaaggca gatgaagcat taagaatcgg acttgtaaat 540
aaggtagtag aacctagtga attaatgaat acagcaaaag aaattgcaaa caaaattgtg 600
agcaatgctc cagtagctgt taagttaagc aaacaggcta ttaatagagg aatgcagtgt 660
gatattgata ctgctttagc atttgaatca gaagcatttg gagaatgctt ttcaacagag 720
gatcaaaagg atgcaatgac agctttcata gagaaaagaa aaattgaagg cttcaaaaat 780
agataggagg taagtttata tggattttaa tttaacaaga gaacaagaat tagtaagaca 840
gatggttaga gaatttgctg aaaatgaagt taaacctata gcagcagaaa ttgatgaaac 900
agaaagattt ccaatggaaa atgtaaagaa aatgggtcag tatggtatga tgggaattcc 960
attttcaaaa gagtatggtg gcgcaggtgg agatgtatta tcttatataa tcgccgttga 1020
ggaattatca aaggtttgcg gtactacagg agttattctt tcagcacata catcactttg 1080
tgcttcatta ataaatgaac atggtacaga agaacaaaaa caaaaatatt tagtaccttt 1140
agctaaaggt gaaaaaatag gtgcttatgg attgactgag ccaaatgcag gaacagattc 1200
tggagcacaa caaacagtag ctgtacttga aggagatcat tatgtaatta atggttcaaa 1260
aatattcata actaatggag gagttgcaga tacttttgtt atatttgcaa tgactgacag 1320
aactaaagga acaaaaggta tatcagcatt tataatagaa aaaggcttca aaggtttctc 1380
tattggtaaa gttgaacaaa agcttggaat aagagcttca tcaacaactg aacttgtatt 1440
tgaagatatg atagtaccag tagaaaacat gattggtaaa gaaggaaaag gcttccctat 1500
agcaatgaaa actcttgatg gaggaagaat tggtatagca gctcaagctt taggtatagc 1560
tgaaggtgct ttcaacgaag caagagctta catgaaggag agaaaacaat ttggaagaag 1620
ccttgacaaa ttccaaggtc ttgcatggat gatggcagat atggatgtag ctatagaatc 1680
agctagatat ttagtatata aagcagcata tcttaaacaa gcaggacttc catacacagt 1740
tgatgctgca agagctaagc ttcatgctgc aaatgtagca atggatgtaa caactaaggc 1800
agtacaatta tttggtggat acggatatac aaaagattat ccagttgaaa gaatgatgag 1860
agatgctaag ataactgaaa tatatgaagg aacttcagaa gttcagaaat tagttatttc 1920
aggaaaaatt tttagataat ttaaggaggt taagaggatg aatatagttg tttgtttaaa 1980
acaagttcca gatacagcgg aagttagaat agatccagtt aagggaacac ttataagaga 2040
aggagttcca tcaataataa atccagatga taaaaacgca cttgaggaag ctttagtatt 2100
aaaagataat tatggtgcac atgtaacagt tataagtatg ggacctccac aagctaaaaa 2160
tgctttagta gaagctttgg ctatgggtgc tgatgaagct gtacttttaa cagatagagc 2220
atttggagga gcagatacac ttgcgacttc acatacaatt gcagcaggaa ttaagaagct 2280
aaaatatgat atagtttttg ctggaaggca ggctatagat ggagatacag ctcaggttgg 2340
accagaaata gctgagcatc ttggaatacc tcaagtaact tatgttgaga aagttgaagt 2400
tgatggagat actttaaaga ttagaaaagc ttgggaagat ggatatgaag ttgttgaagt 2460
taagacacca gttcttttaa cagcaattaa agaattaaat gttccaagat atatgagtgt 2520
agaaaaaata ttcggagcat ttgataaaga agtaaaaatg tggactgccg atgatataga 2580
tgtagataag gctaatttag gtcttaaagg ttcaccaact aaagttaaga agtcatcaac 2640
taaagaagtt aaaggacagg gagaagttat tgataagcct gttaaggaag cagctgatat 2700
gttgtctcaa aattaaaaga agaacacata tttaagttag gagggatttt tcaatgaata 2760
aagcagatta caagggcgta tgggtgtttg ctgaacaaag agacggagaa ttacaaaagg 2820
tatcattgga attattaggt aaaggtaagg aaatggctga gaaattaggc gttgaattaa 2880
cagctgtttt acttggacat aatactgaaa aaatgtcaaa ggatttatta tctcatggag 2940
cagataaggt tttagcagca gataatgaac ttttagcaca tttttcaaca gatggatatg 3000
ctaaagttat atgtgattta gttaatgaaa gaaagccaga aatattattc ataggagcta 3060
ctttcatagg aagagattta ggaccaagaa tagcagcaag actttctact ggtttaactg 3120
ctgattgtac atcacttgac atagatgtag aaaatagaga tttattggct acaagaccag 3180
cgtttggtgg aaatttgata gctacaatag tttgttcaga ccacagacca caaatggcta 3240
cagtaagacc tggtgtgttt tttgaaaaat tacctgttaa tgatgcaaat gtttctgatg 3300
ataaaataga aaaagttgca attaaattaa cagcatcaga cataagaaca aaagtttcaa 3360
aagttgttaa gcttgctaaa gatattgcag atatcggaga agctaaggta ttagttgctg 3420
gtggtagagg agttggaagc aaagaaaact ttgaaaaact tgaagagtta gcaagtttac 3480
ttggtggaac aatagccgct tcaagagcag caatagaaaa agaatgggtt gataaggacc 3540
ttcaagtagg tcaaactggt aaaactgtaa gaccaactct ttatattgca tgtggtatat 3600
caggagctat ccagcattta gcaggtatgc aagattcaga ttacataatt gctataaata 3660
aagatgtaga agccccaata atgaaggtag cagatttggc tatagttggt gatgtaaata 3720
aagttgtacc agaattaata gctcaagtta aagctgctaa taattaagat aaataaaaag 3780
aattatttaa agcttattat gccaaaatac ttatatagta ttttggtgta aatgcattga 3840
tagtttcttt aaatttaggg aggtctgttt aatgcattga tagttcttta aatttaggga 3900
ggtctgttta atgaaaaagg tatgtgttat aggtgcaggt actatgggtt caggaattgc 3960
tcaggcattt gcagctaaag gatttgaagt agtattaaga gatattaaag atgaatttgt 4020
tgatagagga ttagatttta tcaataaaaa tctttctaaa ttagttaaaa aaggaaagat 4080
agaagaagct actaaagttg aaatcttaac tagaatttcc ggaacagttg accttaatat 4140
ggcagctgat tgcgatttag ttatagaagc agctgttgaa agaatggata ttaaaaagca 4200
gatttttgct gacttagaca atatatgcaa gccagaaaca attcttgcat caaatacatc 4260
atcactttca ataacagaag tggcatcagc aactaaaact aatgataagg ttataggtat 4320
gcatttcttt aatccagctc ctgttatgaa gcttgtagag gtaataagag gaatagctac 4380
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agaagtagca gaagcaccag gatttgttgt aaatagaata ttaataccaa tgattaatga 4500
agcagttggt atattagcag aaggaatagc ttcagtagaa gacatagata aagctatgaa 4560
acttggagct aatcacccaa tgggaccatt agaattaggt gattttatag gtcttgatat 4620
atgtcttgct ataatggatg ttttatactc agaaactgga gattctaagt atagaccaca 4680
tacattactt aagaagtatg taagagcagg atggcttgga agaaaatcag gaaaaggttt 4740
ctacgattat tcaaaataa 4759
<210> 4
<211> 48
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer pThl-UP-SalI
<400> 4
atagtcgaca tgaagtttct tatgcacaag tattttttat tacattaa 48
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pGS-R4
<400> 5
taagttgggt aacgccaggg 20
<210> 6
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HCB-UP-PstI
<400> 6
atactgcaga tggaactaaa caatgtcatc cttgaaaagg aagg 44
<210> 7
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HCB-DN-XhoI primer
<400> 7
atactcgagt tattttgaat aatcgtagaa accttttcct g 41
<210> 8
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer AdhE1-UP-PstI
<400> 8
cacctgcaga tgaaagtcac aacagtaaag gaattagat 39
<210> 9
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> AdhE1-DN-XhoI
<400> 9
cacctcgagt taaggttgtt ttttaaaaca atttatatac a 41
<210> 10
<211> 2589
<212> DNA
<213> Clostridium acetobutylicum
<400> 10
atgaaagtca caacagtaaa ggaattagat gaaaaactca aggtaattaa agaagctcaa 60
aaaaaattct cttgttactc gcaagaaatg gttgatgaaa tctttagaaa tgcagcaatg 120
gcagcaatcg acgcaaggat agagctagca aaagcagctg ttttggaaac cggtatgggc 180
ttagttgaag acaaggttat aaaaaatcat tttgcaggcg aatacatcta taacaaatat 240
aaggatgaaa aaacctgcgg tataattgaa cgaaatgaac cctacggaat tacaaaaata 300
gcagaaccta taggagttgt agctgctata atccctgtaa caaaccccac atcaacaaca 360
atatttaaat ccttaatatc ccttaaaact agaaatggaa ttttcttttc gcctcaccca 420
agggcaaaaa aatccacaat actagcagct aaaacaatac ttgatgcagc cgttaagagt 480
ggtgccccgg aaaatataat aggttggata gatgaacctt caattgaact aactcaatat 540
ttaatgcaaa aagcagatat aacccttgca actggtggtc cctcactagt taaatctgct 600
tattcttccg gaaaaccagc aataggtgtt ggtccgggta acaccccagt aataattgat 660
gaatctgctc atataaaaat ggcagtaagt tcaattatat tatccaaaac ctatgataat 720
ggtgttatat gtgcttctga acaatctgta atagtcttaa aatccatata taacaaggta 780
aaagatgagt tccaagaaag aggagcttat ataataaaga aaaacgaatt ggataaagtc 840
cgtgaagtga tttttaaaga tggatccgta aaccctaaaa tagtcggaca gtcagcttat 900
actatagcag ctatggctgg cataaaagta cctaaaacca caagaatatt aataggagaa 960
gttacctcct taggtgaaga agaacctttt gcccacgaaa aactatctcc tgttttggct 1020
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ggaggcctcg gccatacctc aggaatatat gcagatgaaa taaaagcacg agataaaata 1140
gatagattta gtagtgccat gaaaaccgta agaacctttg taaatatccc aacctcacaa 1200
ggtgcaagtg gagatctata taattttaga ataccacctt ctttcacgct tggctgcgga 1260
ttttggggag gaaattctgt ttccgagaat gttggtccaa aacatctttt gaatattaaa 1320
accgtagctg aaaggagaga aaacatgctt tggtttagag ttccacataa agtatatttt 1380
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tttatagtta ctgatagtga cccctataat ttaaactatg ttgattcaat aataaaaata 1500
cttgagcacc tagatattga ttttaaagta tttaataagg ttggaagaga agctgatctt 1560
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ttaggtggta cccctgaaat gagctctgca aagctaatgt gggtactata tgaacatcca 1680
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tctgaggtta ctccttttgc tttagtaact gacaataaca ctggaaataa gtacatgtta 1860
gcagattatg aaatgacacc aaatatggca attgtagatg cagaacttat gatgaaaatg 1920
ccaaagggat taaccgctta ttcaggtata gatgcactag taaatagtat agaagcatac 1980
acatccgtat atgcttcaga atacacaaac ggactagcac tagaggcaat acgattaata 2040
tttaaatatt tgcctgaggc ttacaaaaac ggaagaacca atgaaaaagc aagagagaaa 2100
atggctcacg cttcaactat ggcaggtatg gcatccgcta atgcatttct aggtctatgt 2160
cattccatgg caataaaatt aagttcagaa cacaatattc ctagtggcat tgccaatgca 2220
ttactaatag aagaagtaat aaaatttaac gcagttgata atcctgtaaa acaagcccct 2280
tgcccacaat ataagtatcc aaacaccata tttagatatg ctcgaattgc agattatata 2340
aagcttggag gaaatactga tgaggaaaag gtagatctct taattaacaa aatacatgaa 2400
ctaaaaaaag ctttaaatat accaacttca ataaaggatg caggtgtttt ggaggaaaac 2460
ttctattcct cccttgatag aatatctgaa cttgcactag atgatcaatg cacaggcgct 2520
aatcctagat ttcctcttac aagtgagata aaagaaatgt atataaattg ttttaaaaaa 2580
caaccttaa 2589
<210> 11
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer CtfAB-UP-XhoI
<400> 11
cacctcgaga ccttcatatt tcaactactt tttat 35
<210> 12
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> E1AB-DN-SalI
<400> 12
tacgcgtcga cgccagtaaa agagattgtt tctagc 36
<210> 13
<211> 1537
<212> DNA
<213> Clostridium acetobutylicum
<400> 13
accttcatat ttcaactact ttttataatt ttaataaaga atttaaaagg agggattaaa 60
atgaactcta aaataattag atttgaaaat ttaaggtcat tctttaaaga tgggatgaca 120
attatgattg gaggtttttt aaactgtggc actccaacca aattaattga ttttttagtt 180
aatttaaata taaagaattt aacgattata agtaatgata catgttatcc taatacaggt 240
attggtaagt taatatcaaa taatcaagta aaaaagctta ttgcttcata tataggcagc 300
aacccagata ctggcaaaaa actttttaat aatgaacttg aagtagagct ctctccccaa 360
ggaactctag tggaaagaat acgtgcaggc ggatctggct taggtggtgt actaactaaa 420
acaggtttag gaactttgat tgaaaaagga aagaaaaaaa tatctataaa tggaacggaa 480
tatttgttag agctacctct tacagccgat gtagcattaa ttaaaggtag tattgtagat 540
gaggccggaa acaccttcta taaaggtact actaaaaact ttaatcccta tatggcaatg 600
gcagctaaaa ccgtaatagt tgaagctgaa aatttagtta gctgtgaaaa actagaaaag 660
gaaaaagcaa tgacccccgg agttcttata aattatatag taaaggagcc tgcataaaat 720
gattaatgat aaaaacctag cgaaagaaat aatagccaaa agagttgcaa gagaattaaa 780
aaatggtcaa cttgtaaact taggtgtagg tcttcctacc atggttgcag attatatacc 840
aaaaaatttc aaaattactt tccaatcaga aaacggaata gttggaatgg gcgctagtcc 900
taaaataaat gaggcagata aagatgtagt aaatgcagga ggagactata caacagtact 960
tcctgacggc acatttttcg atagctcagt ttcgttttca ctaatccgtg gtggtcacgt 1020
agatgttact gttttagggg ctctccaggt agatgaaaag ggtaatatag ccaattggat 1080
tgttcctgga aaaatgctct ctggtatggg tggagctatg gatttagtaa atggagctaa 1140
gaaagtaata attgcaatga gacatacaaa taaaggtcaa cctaaaattt taaaaaaatg 1200
tacacttccc ctcacggcaa agtctcaagc aaatctaatt gtaacagaac ttggagtaat 1260
tgaggttatt aatgatggtt tacttctcac tgaaattaat aaaaacacaa ccattgatga 1320
aataaggtct ttaactgctg cagatttact catatccaat gaacttagac ccatggctgt 1380
ttagaaagaa atactatgaa acaatattaa aaaaataaga gttaccattt aaggtaactc 1440
ttatttttat tacttaagat aatcatatat aacttcagct ctaggcaata ttatatctgc 1500
aagaatgtga gagctagaaa caatctcttt tactggc 1537
Claims (14)
- 제1미생물로서, 부탄올, 아세톤 및 에탄올의 생산능이 있는 클로스트리디움으로 바이오매스를 발효시켜 부탄올을 생산하는 단계;
부탄올 선택도가 에탄올 선택도보다 크며, 에탄올 선택도가 아세톤 선택도보다 큰 발효물로부터 부탄올을 분리 및 정제하는 단계;
상기 분리 및 정제 단계로부터 생성되는 폐액을 회수하는 단계;
상기 폐액을 포함하는 배지를 준비하는 단계;및
상기 배지에서 제2미생물인, 부탄올, 아세톤 및 에탄올의 생산능이 있는 클로스트리디움을 배양하는 단계를 포함하는 바이오물질의 제조 방법으로,
상기 바이오물질은 부탄올, 아세톤 및 에탄올을 포함하는 바이오물질의 제조 방법.
- 제 1항에 있어서,
상기 발효물은 부탄올 선택도가 에탄올 선택도 및 아세톤 선택도의 합보다 큰 것을 특징으로 하는 제조 방법.
- 제 1항에 있어서,
상기 폐액은 부티르산을 0.2 ~ 1.1 g/L 포함하는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
- 제 1항에 있어서,
상기 폐액은 부탄올을 포함하는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
- 제 1항에 있어서,
상기 부탄올은 증류에 의하여 분리 및 정제되는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
- 제 1항에 있어서,
상기 배지는 상기 폐액을 5 내지 100 부피% 포함하는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
- 제 1항에 있어서,
상기 배지는 상기 폐액을 15 ~ 100 부피% 포함하고,
상기 제2미생물을 회분식 배양하는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
- 제 1항에 있어서,
상기 배지는 상기 폐액을 45 ~100 부피% 포함하고,
상기 제2미생물을 유가식 배양하는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
- 제 1항에 있어서,
상기 제1미생물은 클로스트리디움 아세토부틸리쿰인 것을 특징으로 하는 제조 방법.
- 제 1항에 있어서,
상기 제2미생물은 클로스트리디움 아세토부틸리쿰인 것을 특징으로 하는 제조 방법.
- 제 1항에 있어서,
상기 바이오물질은 부탄올 선택도가 에탄올 선택도보다 크며, 에탄올 선택도가 아세톤 선택도보다 큰 것을 특징으로 하는 제조 방법.
- 제 1항에 있어서,
상기 바이오물질의 부탄올 선택도가 에탄올 선택도 및 아세톤 선택도의 합보다 큰 것을 특징으로 하는 제조 방법.
- 제 1항에 있어서,
상기 바이오물질의 에탄올 선택도는 아세톤 선택도보다 높은 것을 특징으로 하는 제조 방법.
- 제 1항에 있어서,
상기 발효물로부터 상기 제1미생물을 제거한 후 상기 부탄올의 분리 정제를 수행하는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
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KR1020130001746A KR101438994B1 (ko) | 2013-01-07 | 2013-01-07 | 바이오부탄올 분리정제 공정 폐액을 이용한 바이오부탄올 생산 방법 |
Country Status (1)
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KR (1) | KR101438994B1 (ko) |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR20110027021A (ko) * | 2009-09-09 | 2011-03-16 | 경북대학교 산학협력단 | 맥주발효 폐 상등액의 동시당화 발효공정에 의한 바이오 에탄올의 생산방법 |
-
2013
- 2013-01-07 KR KR1020130001746A patent/KR101438994B1/ko active IP Right Grant
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR20110027021A (ko) * | 2009-09-09 | 2011-03-16 | 경북대학교 산학협력단 | 맥주발효 폐 상등액의 동시당화 발효공정에 의한 바이오 에탄올의 생산방법 |
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