KR101437382B1

KR101437382B1 - 장건강 조성물 및 이의 제조방법

Info

Publication number: KR101437382B1
Application number: KR1020130055070A
Authority: KR
Inventors: 김영식; 고종호; 임영희
Original assignee: 상명대학교 천안산학협력단
Priority date: 2013-05-15
Filing date: 2013-05-15
Publication date: 2014-09-04

Abstract

본 발명은 장건강 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 좀 더 구체적으로는 토마토 주스 가공시 발생되는 씨를 포함한 토마토 케이크를 비스코자임-L을 이용한 효소처리 등에 의하여 가공한 토마토 식이섬유에 장 유익 세균인 락토바실러스 람노서스 및 비피도박테리움 비피덤을 살아있는 상태로 혼합하여 제조한 장건강 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, 장내 유익세균의 장내 전달효과를 높일 수 있을 뿐만 아니라, 장내 세포의 유익세균 부착을 촉진하고 유해세균의 부착을 저해하는 효과를 나타내게 된다.

Description

장건강 조성물 및 이의 제조방법 {composition for healthy intestine and the manufacturing method thereof}

본 발명은 장건강 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 좀 더 구체적으로는 토마토 주스 가공시 발생되는 씨를 포함한 토마토 케이크를 비스코자임-L을 이용한 효소처리 등에 의하여 가공한 토마토 식이섬유에 장 유익 세균인 락토바실러스 람노서스 및 비피도박테리움 비피덤을 살아있는 상태로 혼합하여 제조한 장건강 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

토마토는 체내 장건강에 매우 유익한 것으로 알려져 있으며, 토마토나 수박 등을 붉게 만드는데 관여하는 색소인 리코펜 (lycopene)은 비타민 C, 비타민 E, 카로틴 등과 함께 심혈관 질환을 예방하고, 항암 효과를 발휘하는 강력한 항산화제 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 특히, 토마토에 함유된 리코펜은 항산화 식품인 당근에 함유된 베타카로틴의 두 배에 달하는 항산화력을 보인다. 또한, 노화방지, 항암효과 (전립선암), 심혈관질환 예방 및 혈당저하 효과를 나타내기도 한다.

특히, 암세포 성장을 도모하는 주요 조절 인자인 IGF-1 (insulin-like growth factor)인자를 강력하게 억제하며, 단백질 43효소를 자극하여 세포 간 연락장치 (gap junction)를 발현시키는데, 세포간 연락장치의 발현은 암의 억제와 깊은 연관이 있다. 동물이나 암세포를 이용한 일부 실험에선 폐암, 간암, 위암, 유방암, 자궁경부암, 대장암, 방광암, 체장암 등에도 효과를 보였으며, 사람을 대상으로 한 임상 실험에서는 유방암, 전립선암에 대해 탁월한 방어기능을 갖는 것으로 보고되고 있으며, 특히 육종암과 전립선암에 효과가 있다고 알려져 있다.

리코펜은 열을 가할 경우 인체에 더 잘 흡수된다. 리코펜은 트랜스형과 시스형의 두 가지 이성질체를 갖는데, 열을 가할 경우 인체에 더 잘 흡수되는 시스형 이성질체로 변화해 체내 흡수율이 높아진다. 이와 관련하여, John Shi 등 (2002) Neutraceutical & Foods, 17:179-183을 보면, 100℃ 미만에서는 트랜스형이 시스형으로 구조가 전환되며, 총 리코펜 함량에는 큰 변화가 없지만, 190℃에서는 총 리코펜 함량이 상당히 감소하며, 트랜스형과 시스형 함량이 큰 폭으로 줄어드는 것을 알 수 있다.

또한, 이러한 리코펜 성분을 효율적으로 체내로 전달하는 수단이 요구되고 있다. 즉, 토마토를 단순히 식품으로 섭취하는 것이 아니라, 기타 장내 유익 세균과 함께 섭취할 수 있는 조성물을 제공하는 기술이 절실히 요구되고 있는 실정이다.

장내 유익세균 중 락토바실러스 람노서스 (Lactobacillus rhamnosus)는 프로바이오틱에 유용한 세균으로 알려져 있으며, 요구르트 등 기타 유류식품에 사용되기도 한다. 특히, 락토바실러스 람노서스는 로타바이러스에 의한 어린아이의 설사를 예방하는 효과가 있는 것으로 알려져 있으며, 기타 여러 종류의 성인 및 어린아이의 설사에 대하여 예방 및 치료효과가 있는 것으로 알려져 있다. 또한 락토바실러스 람노서스는 어린아이의 호흡기 질환 예방, 치료 및 아토피 피부염의 치료에도 탁월한 효과가 있는 것으로 알려져 있다.

한편 비피도박테리움 비피덤 (Bifidobacterium bifidum)은 편성 혐기성인 그람양성 박테리아이고 젖산균의 일종으로 간균이며, V 또는 Y자형으로 분기하여 다형성을 나타낸다. 특히, 비항산성, 무아포성, 비운동성, 이산화탄소 등의 가스 비생산성이다. 당을 발효하여 주로 아세트산과 젖산 등을 다량 생산하고 숙신산과 포름산을 근소량만 생산한다. 과거에는 비피도박테리움 비피덤을 락토바실러스 비피더스라고 칭하기도 하였다. 사람과 동물에 대한 병원성이 없는 것으로 알려져 있으며, 모유를 먹는 유아의 장에 많이 존재하고 인공 수유를 하는 유아나 성인의 장에는 적게 존재하는 것으로 알려져 있다. 비피도박테리움 비피덤은 장내 감염, 장내 부패 방지, 설사 예방 등에 작용하며, 장수노인의 장에 특히 많이 존재하는 것으로 밝혀지고 있다.

한편, 토마토 내 리코펜 성분을 추출하는 방법 및 장내 전달에 관한 국내외 특허출원을 살펴보면, 특허문헌 1에서는 과육 펄프를 펙틴분해효소 처리를 하고 필터 (0.3-0.7mm)로 고액분리를 하여 얻은 미세 펄프를 분리막 (10㎛ 이하)로 여과하여 얻은 농축 펄프를 회수하여 식재료로 사용하는 저점도 고함량 리코펜을 함유하는 식재료의 제조방법을 개시하고 있다. 그 밖에, 특허문헌 2 및 3에서는 토마토 껍질과 씨로부터 리코펜을 얻는 방법을 개시하고 있다.

그러나, 특허문헌 1은 토마토 주스를 제조하고 버리는 토마토 케이크를 이용하는 것이 아니라 토마토 과육 펄프를 이용함으로써 본 발명과 효소처리공정, 효소 및 처리조건과 다르며, 이를 식품소재로 한 제품은 단순한 1회분의 대용식으로서의 식품과 관련이 있고, 기타 장내 유익 세균과 함께 이들을 섭취할 수 있는 조성물을 개시하고 있지 않다. 또한, 특허문헌 2 및 3은 토마토 주스를 압착식 물리적 처리시 발생되는 토마토 껍질과 씨를 이용하지만, 효소의 처리 없이 용매 추출 및 증류와 같은 복잡한 과정을 거치므로 비경제적일 뿐만 아니라 리코펜의 수율이 떨어지는 단점이 있고, 역시 효율적인 체내 전달 수단을 개시하고 있지 않다.

특허문헌 1: 일본 특개평 제10-276707호

특허문헌 2: EP 1 676 888 A1

특허문헌 3: WO 2005/032712 A1

이에 본 발명에서는 토마토 주스의 제조를 위하여 압착식 물리적 처리에서 발생하는 씨를 포함한 토마토 케이크를 열에 의해 예비처리를 하고, 비스코자임-L을 이용하여 효소처리하여 수용성 식이섬유의 함량을 높이고, 당과 결합되어 있는 리코펜에서 당의 결합을 이완하거나 분해되도록 유도하여 체내흡수가 용이하게 되도록 가수분해된 건조분말을 제조한 후, 이러한 분말에 살아있는 장내 유익 세균인 락토바실러스 람노서스 및 비피도박테리움 비피덤을 혼합함으로써 장건강에 유익하며 장내 전달효율 등이 우수한 장건강 조성물을 제조할 수 있었고, 본 발명은 이에 기초하여 완성되었다.

따라서, 본 발명의 하나의 관점은 토마토 케이크를 분리하여 열처리하고 비스코자임-L을 이용하여 효소 처리한 후, 원심분리하여 얻은 고형분 및 여과액을 건조하여 분말을 얻고, 이러한 분말에 살아있는 락토바실러스 람노서스 및 비피도박테리움 비피덤을 혼합하여 장건강에 유익한 조성물을 제조하는 방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 관점은 본 발명에 따른 장건강 조성물의 제조방법에 따라 제조된 장건강 조성물을 제공하는 데 있다.

상기 하나의 관점을 달성하기 위한 본 발명에 따른 장건강 조성물의 제조방법 (이하 "제1 발명"이라 함)은 토마토의 과즙과 케이크를 분리하는 단계; 상기 토마토 케이크를 열처리하는 단계; 상기 열처리된 토마토 케이크에 비스코자임-L을 이용하여 효소 반응시키는 단계; 상기 효소 반응시킨 반응물을 원심분리하여 고형분과 여과액을 얻고, 상기 고형분과 여과액을 각각 건조시켜 분말을 얻는 단계; 및 상기 분말을 살아있는 락토바실러스 람노서스 (Lactobacillus rhamnosus) 및 비피도박테리움 비피덤 (Bifidobacterium bifidum)과 혼합하는 단계를 포함한다.

제1 발명에 있어서, 상기 방법은 토마토 과즙과 케이크를 분리하기 전에 토마토를 스팀으로 2 내지 10분간 가열하는 단계를 더욱 포함하는 것을 특징으로 한다.

제1 발명에 있어서, 상기 열처리 단계는 60 내지 80℃에서 10 내지 50분간 수행되는 것을 특징으로 한다.

제1 발명에 있어서, 상기 비스코자임-L은 증류수에 1(v/v)%로 희석된 것을 특징으로 한다.

제1 발명에 있어서, 상기 효소반응시키는 단계는 45 내지 55℃에서 2 내지 5시간 동안 수행되는 것을 특징으로 한다.

제1 발명에 있어서, 상기 효소반응시키는 단계는 50℃에서 4시간 동안 수행되는 것을 특징으로 한다.

제1 발명에 있어서, 상기 원심분리는 6,000 내지 10,000rpm에서 15 내지 25분간 수행하여 고형분과 여과액을 얻는 것을 특징으로 한다.

제1 발명에 있어서, 상기 여과액의 건조는 배출 온도 80 내지 85℃로 유지되는 분무 건조로 수행되고, 상기 고형분의 건조는 30 내지 50℃의 온도 범위에서 진공건조로 수행되는 것을 특징으로 한다.

제1 발명에 있어서, 상기 락토바실러스 람노서스 (Lactobacillus rhamnosus) 및 비피도박테리움 비피덤 (Bifidobacterium bifidum)의 세균수는 7:3인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 다른 관점을 달성하기 위한 장건강 조성물은 제1 발명을 포함한 상기 방법에 의하여 제조되는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 장건강 조성물 및 이의 제조방법에 따르면, 수용성 식이섬유의 함량이 높을 뿐만 아니라 토마토 케이크 중의 리코펜에서 당의 결합력을 이완시켜 리코펜의 체내 흡수율을 높일 뿐만 아니라, 살아 있는 장내 유익세균을 포함시킴으로써 유익세균을 직접 체내로 전달시킬 수 있고, 이러한 유익세균은 리코펜의 장내 전달효과를 촉진시키는 역할을 동시에 수행할 수 있다. 또한, 락토바실러스 람노서스와 비피도박테리움 비피덤의 혼합비율을 조절함으로써, 리코펜의 장내 전달 및 흡수율을 극대화시킬 수 있을 뿐만 아니라, 이러한 유익세균의 장내 부착 효과 또한 극대화시킬 수 있다. 아울러 락토바실러스 람노서스와 비피도박테리움 비피덤을 동시에 혼합함으로써 토마토 케이크로부터 얻은 식이섬유 및 리코펜의 소화 흡수율을 높이는 시너지 효과를 얻을 수 있었다.

도 1은 본 발명에 따른 장건강 조성물을 제조하는 방법을 나타내는 공정도이다.

본 발명을 좀 더 구체적으로 설명하기 전에, 본 명세서 및 청구범위에 사용된 용어나 단어는 통상적이거나 사전적인 의미로 한정되어서는 아니되며, 발명을 가장 최선의 방법으로 설명하기 위해 용어의 개념을 적절하게 정의할 수 있다는 원칙에 입각하여 본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야만 한다. 따라서, 본 명세서에 기재된 실시 예의 구성은 본 발명의 바람직한 하나의 예에 불과할 뿐이고, 본 발명의 기술적 사상을 모두 대변하는 것은 아니므로, 본 출원시점에 있어서 이들을 대체할 수 있는 다양한 균등물과 변형 예들이 있을 수 있음을 이해하여야 한다.

이하, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 본 발명을 용이하게 실시할 수 있도록, 본 발명의 바람직한 실시 예들을 상세히 설명한다. 아울러, 본 발명을 설명함에 있어서, 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있는 관련된 공지기술에 대한 상세한 설명은 생략한다.

이하, 본 발명에 따른 장건강 조성물을 제조하는 방법을 구체적으로 설명한다.

도 1은 본 발명에 따른 장건강 조성물을 제조하는 방법을 나타내는 공정도로서, 도 1을 참조하면, 본 발명에 따른 장건강 조성물을 제조하기 위하여 우선 토마토 과즙과 케이크를 분리한다. 여기에 사용되는 토마토는 보다 앞서 선별과정을 거치게 되는데, 선별단계에서는 완숙한 토마토를 구입하거나, 미숙한 토마토를 일정기간 보관하여 완숙된 토마토만을 선별하는 것이 가능하다. 그 다음, 토마토 꼭지 부분의 쓴맛을 제거하기 위하여 착즙 전에 꼭지를 제거한 후, 토마토를 세척하고, 표면의 수분이 제거되도록 원심력을 이용하여 탈수시킨다.

본 발명에 따르면, 선택적으로, 이와 같이 전처리된 토마토의 과피 외부에 존재할 수 있는 미생물을 제거하고, 착즙이 용이하도록 스팀으로 2 내지 10 분간, 바람직하게는 약 5분간 가열한다. 그 다음, 과즙과 케이크 분리단계에서는 과육 채취기 (pulper)를 이용하여 과육과 과씨, 과피, 씨 또는 단단한 부위와 분리되도록 분쇄하고, 과육을 이들과 분리한 다음, 여과기를 이용하여 과육으로만 형성된 주스 과육 펄프로 분리하고, 과피 또는 씨 등은 케이크로 분리한다.

그 후, 상기 분리된 토마토 케이크를 열처리하는 단계를 거치게 된다. 이와 같은 열처리 단계에서는 상기 케이크를 60 내지 80℃에서 약 10 내지 50분간 가열한다. 상기 열처리 온도가 60℃ 미만이면 단단한 식이섬유나 단단한 부위가 그대로 유지되어 후술할 비스코자임-L에 의한 효소반응이 원활하지 않게 되고, 80℃를 초과하면 리코펜 등 기능성분 및 영양성분의 손실이 높아지는 문제가 발생한다. 또한, 상기 가열 시간이 10분 미만이면 단단한 식이섬유나 단단한 부위가 물리적으로 단단하게 그대로 유지되어 효소반응이 원활하지 않으며, 50분을 초과하면 지나친 과 반응으로 리코펜 등 기능성분 및 영양성분의 손실이 높아지는 단점이 있다.

이와 같이 열처리된 케이크는 비스코자임-L (Viscozyme-L)을 이용하여 효소처리된다. 비스코자임-L은 증류수에 1(v/v)%로 희석하여 사용하는 것이 바람직하며, 미리 준비된 토마토 케이크 10g에 상기 1%로 희석된 비스코자임 1 내지 3ml를 첨가한다. 이러한 비스코자임-L의 처리는 45 내지 55℃에서 2 내지 5시간 동안 수행하는 것이 바람직하며, 50℃에서 4시간 동안 수행하는 것이 좀더 바람직하다. 상기 비스코자임-L의 처리 온도가 45℃ 미만인 경우, 효소의 작용이 저하되어 토마토 케이크로부터 리코펜 및 식이섬유의 분해가 효율적으로 이루어지지 않으며, 55℃를 초과하는 경우 효소의 활성이 급격히 저하되는 문제가 발생한다. 또한, 효소처리 시간이 2시간 미만인 경우, 토마토 케이크로부터 리코펜 및 식이섬유의 분해가 충분히 이루어지기 위한 시간이 부족하며, 5시간을 초과하는 경우는 효소의 과 반응으로 인하여 리코펜 및 식이섬유의 성질이 변화되는 문제가 발생하게 된다.

이와 같이 비스코자임-L을 이용한 효소처리를 마친 토마토 케이크는 원심분리과정을 거치게 된다. 이러한 원심분리는 6,000 내지 10,000rpm에서 15 내지 25분간 수행되며, 원심분리를 통하여 침전된 고형분과 상등액인 여과액을 얻게 된다. 6,000rpm 미만으로 원심분리시키는 경우, 고형분 및 여과액이 충분히 분리되지 않아 후술할 건조단계를 수월하게 수행할 수 없는 문제가 있으며, 10,000rpm을 초과하는 경우 고형분 및 여과액이 명확하게 분리되지 않는 문제가 발생한다. 한편 원심분리 시간이 15분 미만인 경우에는 고형분과 여과액의 분리가 충분히 이루어지지 않으며, 25분을 초과하는 경우는 비경제적이다.

상기 원심분리를 통하여 얻은 고형물과 여과액을 건조시켜 토마토 케이크 분말을 얻는다. 이때, 여과액의 건조는 배출온도 80 내지 85℃로 유지되는 분무 건조를 통하여 분말을 얻게 되며, 상기 고형물은 30 내지 50℃의 온도범위에서 진공건조를 통하여 건조 분말을 얻는다. 여과액의 건조온도가 80℃ 미만인 경우는 여과액의 건조가 이루어지지 않으며, 85℃를 초과하는 경우는 과 건조로 인하여 본 발명에 따른 장건강 조성물을 제조하기에 적합한 분말을 얻기가 어렵다. 또한 상기 고형물의 건조온도가 30℃ 미만인 경우는 효율적인 진공건조가 이루어지지 않으며, 50℃를 초과하는 경우는 과 건조로 인하여 본 발명에 따른 장건강 조성물을 제조하기에 적합한 분말을 얻기가 어려운 문제가 있다.

한편, 상기 과정을 통하여 준비된 분말에 살아있는 락토바실러스 람노서스 (Lactobacillus rhamnosus) 및 비피도박테리움 비피덤 (Bifidobacterium bifidum)을 혼합하는 과정을 거친다.

상기 락토바실러스 람노서스 및 비피도박테리움 비피덤은 혐기용기 (anaerobic sachet, Gaspak pouch, BD, USA)를 이용하여 혐기적으로 배양하는데 비피도박테리움 비피덤은 MRS 브로스 (Difco, USA)에 0.05% 시스테인 (Sigma Aldrich, USA)을 첨가한 배지를 사용하고, 락토바실러스 람노서스는 MRS 브로스에 시스테인을 첨가하지 않고 사용하였다. 본 발명에 따른 락토바실러스 람노서스 및 비피도박테리움 비피덤은 상기 배지에서 배양한 후, 3000rpm에서 10분간 원심분리하고 PBS로 3회 세척한 후 1 내지 5x10⁹ 세포/ml가 되도록 최소영양배지에 희석하여 준비해 둔다. 이와 같이 준비된 락토바실러스 람노서스 및 비피도박테리움 비피덤을 본 발명에 따른 상기 분말에 혼합한다. 유익세균의 혼합비율은 락토바실러스 람노서스:비피도박테리움 비피덤을 7:3으로 하는 것이 바람직하다. 이러한 비율은 후술할 유해 세균인 살모넬라 티피뮤리움 (Salmonella typhimurium)의 장내 부착을 억제하고 유익세균인 락토바실러스 람노서스 및 비피도박테리움 비피덤의 장내 부착을 촉진시키는 시너지 효과를 발휘하게 된다.

이하 실시 예를 통하여 본 발명을 좀 더 구체적으로 살펴보지만, 하기 예에 본 발명의 범주가 한정되는 것은 아니다.

실시 예 1

완숙된 토마토의 꼭지 부분을 제거한 다음 세척하고 표면의 수분이 제거되도록 탈수시켰다. 이와 같이 전처리된 토마토를 100℃에서 약 5분간 열처리한 다음, 과육 채취기로 과육이 과피, 씨, 또는 단단한 부위와 분리되도록 분쇄하고, 여과기를 이용하여 주스과육 펄프와 케이크를 얻었다. 이와 같이 준비된 토마토 케이크를 75℃에서 30분간 열처리를 수행한 다음, 건조한 후 분쇄기로 40 내지 80메쉬로 분쇄하였다. 상기 열처리된 케이크 20g에 증류수와 희석된 1(v/v)% 비스코자임-L 1ml를 50℃에서 4시간 동안 혼합하였다. 이와 같이 비스코자임-L이 처리된 토마토 케이크는 6,500rpm으로 20분간 원심분리를 수행하였으며, 침전된 고형분과 여과액을 따로 분리하여 건조를 수행하여 각각의 분말을 얻었다. 이와 같이 준비된 건조 분말 1g당 락토바실러스 람노서스 7x10⁵ 세포 및 비피도박테리움 비피덤 3x10⁵세포를 혼합하였다.

샘플	구성	기타
샘플 1	PBS 버퍼	음성대조군
샘플 2	생토마토+L
샘플 3	생토마토+B
샘플 4	생토마토+L+B
샘플 5	효소처리토마토+L
샘플 6	효소처리토마토+B
샘플 7	효소처리토마토+L+B	L:B = 9:1
샘플 8	효소처리토마토+L+B	L:B = 8:2
샘플 9	효소처리토마토+L+B	L:B = 7:3
샘플 10	효소처리토마토+L+B	L:B = 6:4
샘플 11	효소처리토마토+L+B	L:B = 5:5
샘플 12	효소처리토마토+L+B	L:B = 4:6
샘플 13	효소처리토마토+L+B	L:B = 3:7
샘플 14	효소처리토마토+L+B	L:B = 2:8
샘플 15	효소처리토마토+L+B	L:B = 1:9
샘플 16	L
샘플 17	B
샘플 18	L+B

상기 표 1을 참조하면, 본 발명에 따른 장건강 조성물의 효과를 평가하기 위하여 모두 18개의 샘플을 테스트하였다.

장건강 조성물의 장내 생균 전달효과

장건강에 유익한 락토바실러스 람노서스 (Lactobacillus rhamnosus) 및 비피도박테리움 비피덤 (Bifidobacterium bifidum)의 장내 전달효과를 측정하였다. 실험은 마우스를 이용하여 수행하였으며 상기 표 1에 나타난 샘플 1 내지 18을 각각 실험용 마우스 5마리씩에 30ml씩 경구 투여하였다. 샘플 경구투여 2시간 후에 마우스를 모두 안락사시킨 후, 마우스 소장에 존재하는 락토바실러스 람노서스 (Lactobacillus rhamnosus) 및 비피도박테리움 비피덤 (Bifidobacterium bifidum)의 개체수를 측정하였다. 세균의 개체수는 마우스의 소장 표피세포 1cm x 1cm 를 잘라낸 뒤 이들 세포를 분리시켜 현탁액을 제조하고 이와 같이 준비된 현탁액을 이용하여 측정하였다. 락토바실러스 람노서스 (Lactobacillus rhamnosus) 및 비피도박테리움 비피덤 (Bifidobacterium bifidum)은 총 세포수의 합이 1 x 10⁷ 세포/㎕가 되도록 하였다.

샘플	L. rhamnosus 세포수	B. bifidum 세포수
샘플 1	0	0
샘플 2	2.5 x 10²	0
샘플 3	0	2.5 x 10²
샘플 4	1.7 x 10²	1.8 x 10²
샘플 5	3.2 x 10²	0
샘플 6	0	3.7 x 10²
샘플 7	3.5 x 10⁵	3.4 x 10³
샘플 8	7.8 x 10⁴	1.2 x 10³
샘플 9	5.3 x 10⁶	1.5 x 10⁶
샘플 10	6.5 x 10⁴	1.2 x 10⁵
샘플 11	5.5 x 10⁴	2.5 x 10⁵
샘플 12	9.8 x 10³	5.4 x 10⁵
샘플 13	5.6 x 10³	7.9 x 10⁵
샘플 14	3.8 x 10³	1.2 x 10⁶
샘플 15	2.1 x 10³	2.5 x 10⁶
샘플 16	5.3 x 10²	0
샘플 17	0	6.2 x 10²
샘플 18	3.1 x 10²	2.8 x 10²

상기 표 2를 참고하면, 생토마토와 유익세균을 혼합하여 마우스에 경구투여한 샘플 2 내지 4는 총 투여 세포수 1 x 10⁷ 세포/㎕에 비하여 현저히 낮은 수치를 나타냄을 알 수 있으며, 장내 유익세균만을 경구투여한 샘플 16 내지 18의 경우도 마우스 장내로 전달된 세포수가 상당히 적음을 알 수 있다.

그러나, 본 발명에 따른 비스코자임-L을 이용하여 효소처리 등의 과정을 거친 분말을 유익세균과 혼합한 샘플 5 내지 15는 비교적 양호한 세균의 장내 부착효과를 보였으며, 특히 락토바실러스 람노서스와 비피도박테리움 비피덤의 혼합비를 7:3으로 하여 경구투여한 경우 (샘플 9)가 마우스 장내 유익세균 부착 효과가 가장 우수함을 알 수 있다.

장건강 조성물의 장내 유익세균 부착촉진 및 유해세균 부착억제 효과

본 발명에 따른 장건강 조성물의 장내 표피세포에 대한 유익세균의 부착촉진효과 및 유해세균의 부착억제효과를 살펴보기 위하여 직장암 세포 (Caco-2 cell)를 사용하였다. 직장암 세포를 최소 필수영양 배지 (MEM)에서 56℃에서 30분 동안 방치하여 불활성화시킨 소혈청 (FBS)을 15% 첨가하고 1% 페니실린/스트렙토마이신 (각각 100IU/ml와 100㎍/ml), 1%소듐 피루베이트 (1.0 mM)를 추가로 첨가하여 사용하였다. 세포는 96-웰 플레이트에서 배양할 때는 1.5 x 10³ 세포/웰로, 24-웰 플레이트에서 배양할 때는 2 x 10⁴ 세포/웰로 접종하였고, 37℃, 5% 이산화탄소 인큐베이터에서 14일 동안 배양하고 실험에 사용하였다. 세균 부착 평가에 사용하는 플레이트는 마지막 두 번 배지교환시 항생제등을 첨가하지 않은 배지를 사용하였다.

장관 병원성 세균의 장관 내 부착을 억제시키면서 프로바이오틱의 부착은 증대시키는 본 발명에 따른 장건강 조성물의 효과를 검증하기 위하여 살모넬라 티피뮤리엄 (Salmonella typhimurium), 락토바실러스 람노서스, 및 비피도박테리움 비피덤을 각각 10㎕씩 상기 직장암 세포가 있는 웰에 넣는다. 각각의 세균수는 1 x 10⁶ 세포/㎕가 되도록 하였다.

이와 같이 준비된 웰에 상기 표 1에 나타난 샘플 1 내지 18을 마이크로 피펫을 이용하여 10㎕씩 투여하였다.

상기 샘플 1 내지 18이 투여된 각 시료를 37℃에서 2시간 배양 후, 세포를 예온한 (pre-warmed) PBS로 세척하여 부착하지 못한 세균을 제거한다. 그 후 1% 트리톤 X-100으로 37℃에서 10분간 세포분해시킨다. 그 후, 세포에 부착했거나, 안으로 들어간 세포가 얼마나 되는지 측정하였으며, 세포분해시킨 현탁액을 연속희석법 및 평판법을 이용하였다. 즉, 살모넬라 티피뮤리움은 TSB에 1.5% 아가로스 (Bacto^TM agar, BD,USA)를 포함하여 만든 고체배지 평판 (agar plate)에 도말하여 37℃에서 16시간 동안 배양하고, 락토바실러스 람노서스 및 비피도박테리움 비피덤은 각각 MRS에 1.5% 아가로스를 포함시킨 고체배지 평판에 도말하여 37℃에서 5% 이산화탄소처리하에 2일간 배양하였다. 평판에 생성된 콜로니 수를 측정하여 부착생균수 (vialbe adherent bacteria)의 수를 계산하였다.

[수학식 1]

VAB = (cfu1 /cfu2) x 100

VAB : 부착생균수

cfu1 : 샘플로 처리된 세포로부터 형성된 cfu

cfu2 : 미처리 대조군에서 형성된 cfu

샘플	L. rhamnosus 세포수	B. bifidum 세포수	S. typhimurium
샘플1	1 x 10⁷	1 x 10⁷	1 x 10⁷
샘플2	2 x 10⁷	1 x 10⁷	1 x 10⁷
샘플3	1 x 10⁷	2 x 10⁷	1 x 10⁷
샘플4	1.5 x 10⁷	1.5 x 10⁷	1 x 10⁷
샘플5	2 x 10⁷	1 x 10⁷	1 x 10⁷
샘플6	1 x 10⁷	2 x 10⁷	1 x 10⁷
샘플7	1.9 x 10⁷	1.1 x 10⁷	1 x 10⁷
샘플8	1.8 x 10⁷	1.2 x 10⁷	1 x 10⁷
샘플9	1.7 x 10⁷	1.3 x 10⁷	1 x 10⁷
샘플10	1.6 x 10⁷	1.4 x 10⁷	1 x 10⁷
샘플11	1.5 x 10⁷	1.5 x 10⁷	1 x 10⁷
샘플12	1.4 x 10⁷	1.6 x 10⁷	1 x 10⁷
샘플13	1.3 x 10⁷	1.7 x 10⁷	1 x 10⁷
샘플14	1.2 x 10⁷	1.8 x 10⁷	1 x 10⁷
샘플15	1.1 x 10⁷	1.9 x 10⁷	1 x 10⁷
샘플16	2 x 10⁷	1 x 10⁷	1 x 10⁷
샘플17	1 x 10⁷	2 x 10⁷	1 x 10⁷
샘플18	1.5 x 10⁷	1.5 x 10⁷	1 x 10⁷

상기 표 3은 상기 실험에 의하여 각 웰에 들어간 초기 세포 수를 나타낸 것이다.

샘플	L. rhamnosus 세포수	B. bifidum 세포수	S. typhimurium
샘플1	1.2 x 10²	1.1 x 10²	5.2 x 10²
샘플2	2.5 x 10²	2.1 x 10²	1.2 x 10²
샘플3	1.8 x 10²	2.8 x 10²	2.5 x 10²
샘플4	5.1 x 10³	4.8 x 10³	1.8 x 10²
샘플5	2.1 x 10⁴	3.1 x 10²	3.2 x 10²
샘플6	3.2 x 10⁴	2.2 x 10⁴	4.2 x 10²
샘플7	8.9 x 10⁵	5.8 x 10⁵	9.7 x 10
샘플8	6.5 x 10⁵	9.6 x 10⁵	3.2 x 10
샘플9	7.8 x 10⁶	3.5 x 10⁶	0.2 x 10
샘플10	5.3 x 10⁵	6.5 x 10⁵	5.7 x 10
샘플11	6.4 x 10⁵	8.6 x 10⁵	6.4 x 10
샘플12	3.2 x 10⁵	5.5 x 10⁵	8.3 x 10
샘플13	2.7 x 10⁵	6.5 x 10⁵	8.5 x 10
샘플14	8.5 x 10⁵	8.5 x 10⁵	6.4 x 10
샘플15	6.5 x 10⁵	9.0 x 10⁵	9.3 x 10
샘플16	7.5 x 10²	1.5 x 10²	2.5 x 10²
샘플17	1.5 x 10²	6.5 x 10²	3.2 x 10²
샘플18	1.6 x 10²	4.5 x 10²	1.5 x 10²

상기 표 4는 세포부착 실험을 거친 후에 세포에 부착되어 남아 있는 세포 수를 평가한 결과이다. 표 4를 참조하면, 락토바실러스 람노서스 및 비피도박테리움 비피덤을 7:3의 비율로 혼합한 본 발명에 따른 장건강 조성물 (샘플 9)을 웰에 투여한 경우 장내 유익세균은 초기에 웰에 존재하던 수치에 근접하게 부착되었음을 알 수 있으며, 장내 유해세균인 살모넬라 티피뮤리움은 거의 부착되어 있지 않음을 알 수 있다. 본 발명에 따른 장건강 조성물을 사용하되, 락토바실러스 람노서스 및 비피도박테리움 비피덤의 비율을 달리한 샘플 7, 8, 및 10 내지 15의 경우에는 샘플 5 및 6에 비하여 유익세균의 부착수는 많고 유해세균의 부착수는 적은 것을 관찰할 수 있으며, 이를 통하여 락토바실러스 람노서스 및 비피도박테리움 비피덤을 상호작용에 의한 시너지 효과를 확인할 수 있다.

Claims

토마토의 과즙과 케이크를 분리하는 단계;
상기 토마토 케이크를 열처리하는 단계;
상기 열처리된 토마토 케이크에 비스코자임-L을 이용하여 효소 반응시키는 단계;
상기 효소 반응시킨 반응물을 원심분리하여 고형분과 여과액을 얻고, 상기 고형분과 여과액을 각각 건조시켜 분말을 얻는 단계; 및
상기 분말을 살아있는 락토바실러스 람노서스 (Lactobacillus rhamnosus) 및 비피도박테리움 비피덤 (Bifidobacterium bifidum)과 혼합하는 단계를 포함하는 장건강 조성물의 제조방법.
청구항 1에 있어서,
상기 방법은 토마토 과즙과 케이크를 분리하기 전에 토마토를 스팀으로 2 내지 10분간 가열하는 단계를 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 장건강 조성물의 제조방법.
청구항 1에 있어서,
상기 열처리 단계는 60 내지 80℃에서 10 내지 50분간 수행되는 것을 특징으로 하는 장건강 조성물의 제조방법.
청구항 1에 있어서,
상기 비스코자임-L은 증류수에 1(v/v)%로 희석된 것을 특징으로 하는 장건강 조성물의 제조방법.
청구항 1에 있어서,
상기 효소반응시키는 단계는 45 내지 55℃에서 2 내지 5시간 동안 수행되는 것을 특징으로 하는 장건강 조성물의 제조방법.
청구항 5에 있어서,
상기 효소반응시키는 단계는 50℃에서 4시간 동안 수행되는 것을 특징으로 하는 장건강 조성물의 제조방법.
청구항 1에 있어서,
상기 원심분리는 6,000 내지 10,000rpm에서 15 내지 25분간 수행하여 고형분과 여과액을 얻는 것을 특징으로 하는 장건강 조성물의 제조방법.
청구항 7에 있어서,
상기 여과액의 건조는 배출 온도 80 내지 85℃로 유지되는 분무 건조로 수행되고, 상기 고형분의 건조는 30 내지 50℃의 온도 범위에서 진공건조로 수행되는 것을 특징으로 하는 장건강 조성물의 제조방법.
청구항 1있어서,
상기 락토바실러스 람노서스 (Lactobacillus rhamnosus) 및 비피도박테리움 비피덤 (Bifidobacterium bifidum)의 세균수는 7:3인 것을 특징으로 하는 장건강 조성물의 제조방법.
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