KR101434740B1 - Novel Lactobacillus yonginsis THK-V8 and method for lowering molecular weight in saponin - Google Patents

Novel Lactobacillus yonginsis THK-V8 and method for lowering molecular weight in saponin Download PDF

Info

Publication number
KR101434740B1
KR101434740B1 KR1020120096417A KR20120096417A KR101434740B1 KR 101434740 B1 KR101434740 B1 KR 101434740B1 KR 1020120096417 A KR1020120096417 A KR 1020120096417A KR 20120096417 A KR20120096417 A KR 20120096417A KR 101434740 B1 KR101434740 B1 KR 101434740B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
ginseng
thk
lactobacillus
yonginsis
saponin
Prior art date
Application number
KR1020120096417A
Other languages
Korean (ko)
Other versions
KR20140029934A (en
Inventor
이태후
국무창
이정민
이은지
양정은
신헌섭
박상용
박용진
Original Assignee
경희대학교 산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 경희대학교 산학협력단 filed Critical 경희대학교 산학협력단
Priority to KR1020120096417A priority Critical patent/KR101434740B1/en
Publication of KR20140029934A publication Critical patent/KR20140029934A/en
Application granted granted Critical
Publication of KR101434740B1 publication Critical patent/KR101434740B1/en

Links

Images

Classifications

    • AHUMAN NECESSITIES
    • A23FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23LFOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L33/00Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
    • A23L33/105Plant extracts, their artificial duplicates or their derivatives
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20Bacteria; Culture media therefor
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205Bacterial isolates
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A23FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23LFOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L3/00Preservation of foods or foodstuffs, in general, e.g. pasteurising, sterilising, specially adapted for foods or foodstuffs
    • A23L3/40Preservation of foods or foodstuffs, in general, e.g. pasteurising, sterilising, specially adapted for foods or foodstuffs by drying or kilning; Subsequent reconstitution
    • A23L3/44Freeze-drying
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A23FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23VINDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2002/00Food compositions, function of food ingredients or processes for food or foodstuffs
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A23FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23VINDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2250/00Food ingredients
    • A23V2250/20Natural extracts
    • A23V2250/21Plant extracts
    • A23V2250/2124Ginseng
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A23FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23VINDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2300/00Processes
    • A23V2300/14Extraction
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12RINDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/225Lactobacillus

Abstract

본 발명은 락토바실러스 용인시스 THK-V8T (Lactobacillus yonginsis THK-V8T) KACC 16236 균주 및 이를 이용한 사포닌의 저분자화 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 락토바실러스 용인시스 THK-V8T (Lactobacillus yonginsis THK-V8T) KACC 16236 균주은 기존의 균주보다 뛰어난 사포닌의 저분자화 효과를 보이고 이를 통해 저분자 진세노사이드를 효과적으로 생산할 수 있다.
The present invention relates to Lactobacillus herbaceous THK-V8 T ( Lactobacillus yonginsis THK-V8 T ) KACC 16236 strain and saponin using the same.
Can produce Lactobacillus Yongin's THK-V8 T (Lactobacillus yonginsis THK -V8 T) KACC 16236 gyunjueun than conventional strain showing the effect of excellent low-molecular screen through which the low molecular weight saponin binary ginsenosides according to the present invention effectively.

Description

신규한 유산균 용인시스 THK-V8 및 이를 이용한 사포닌의 저분자화 방법 {Novel Lactobacillus yonginsis THK-V8 and method for lowering molecular weight in saponin}(Novel Lactobacillus yonginsis THK-V8 and method for lowering molecular weight in saponin) < RTI ID = 0.0 >

본 발명은 신규한 유산균 용인시스 THK-V8T 및 이를 이용한 체내 흡수가 용이한 형태의 진세노사이드를 다량 함유할 수 있는 사포닌의 저분자화 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a novel low-molecular-weight saponin compound capable of containing a large amount of lactic acid bacteria INSIS THK-V8 T and ginsenosides which are easily absorbed into the body using the same.

인삼은 식물 분류학상 오가과 인삼속에 속하는 다년생 숙근초로서 지구상에 약11종이 알려져 있으며, 대표적인 종으로는 고려 인삼(Panax ginseng C. A. Meyer), 미국삼(Panax quinquefolium L.), 전칠삼(Panaxnotoginseng F. H. Chen), 죽절삼(Panax japonicus C. A. Meyer) 등이 있다. 고려 인삼(Panax ginseng C. A.Meyer)은 아시아 극동 지역(북위 33 ~ 48도 한국, 북만주, 러시아 일부)에 자생하며, 약효가 매우 우수하다. 미국삼(Panax quinquefolium L.)은 미국, 캐나다에 자생 및 재배되며, 전칠삼(Panax notoginseng F. H. Chen)은 중국 운남성 동남부로부터 광서성 서남부 지역에서 야생 또는 재배된다. 또한 죽절삼(Panax japonicusPanax ginseng CA Meyer, Panax quinquefolium L., Panaxnotoginseng FH Chen, and Panaxnotoginseng FH Chen are the most common species of ginseng. And Panax japonicus CA Meyer. Korean ginseng (Panax ginseng C. A. Meyer) is native to Asia Far East (33 ~ 48 latitude latitude in Korea, northern Manchuria, part of Russia) and has excellent efficacy. Panax notoginseng F. H. Chen is wild or cultivated in the southwest part of Guangxi province from the southeastern part of Yunnan province in China. In addition, Panax japonicus

C. A. Meyer)은 일본, 중국 서남부, 네팔에 이르기까지 분포한다.C. A. Meyer) are distributed throughout Japan, Southwest China, and Nepal.

이는 수 천년 간 동양의학에 의해 사용되어 온 대표적인 약용식물이며 현재까지도 다양한 형태로 널리 활용되고 있다. 최근에는 인삼의 오랜 임상적 경험에 근거하여 규명된 효능에 대해 서양 의학적 접근에 의한 약리성분의 분석 및 기전연구 등이 이루어지고 있다. 인삼의 주요성분으로 잘 알려진 인삼사포닌 진세노사이드(ginsenoside)는 면역기능 조절작용, 항암, 항 당뇨, 해독 작용 및 용혈 작용 등의 우수한 활성을 보이는 것으로 보고되고 있다. 이러한 사포닌은 당과 비당이 결합한 형태인 배당체화합물의 일종으로, 크게 프로토파낙사다이올(PPD), 프로토파낙사트라이올(PPT) 및 올레아네인 계열로 구분되어 진다. 일반적으로 인삼사포닌은 경구 투여할 때, 고분자로 흡수되어 장내 세균총에 의한 생물학적 이용에 의해 체내에 흡수되게 되는데, 수율이 크게 떨어져 우수한 효능을 보이지 못한다. 이에 따라 저분자 진세노사이드를 만들기 위한 노력의 일환으로 화학적 산처리 및 염기처리, 열을 이용한 물리적 처리 등의 방법이 과거 주로 연구되어 졌으며, 최근 기질 특이적 전환이 가능한 미생물 발효에 대한 연구도 이루어지고 있다.It is a representative medicinal plant that has been used by oriental medicine for thousands of years and is widely used in various forms to this day. In recent years, research on the pharmacological effects of ginseng has been carried out by Western medicine. Ginseng saponin ginsenoside, which is well known as a major component of ginseng, has been reported to exhibit excellent activities such as immune function control, anti-cancer, anti-diabetic, detoxification and hemolysis. These saponins are a kind of glycoside compound in which sugar and non-sugar are combined, and they are classified into protopanaxadiol (PPD), protopanaxatriol (PPT) and oleanine. In general, when administered orally, ginseng saponin is absorbed as a polymer and is absorbed into the body by bioavailability by intestinal flora. As a result, chemical acid treatments, base treatments, and physical treatments using heat have been studied as a part of efforts to produce low molecular weight ginsenosides. Recently, microbial fermentation that can be substrate specific have.

김치는 삼국사기에 기록 될 정도로 오래 전부터 한국에서 전해 내려오는 전통발효 식품으로 항산화, 항암, 항균 작용 등의 다양한 기능성을 가지고 있는 것으로 알려져 있다. 또한 김치는 다양한 박테리아 원으로서 발효시기에 따라 다량의 락토바실러스(Lactobacillus), 락토코커스(Lactococcus), 류코노스톡(Leuconostoc), 페디오코커스(Pediococcus), 스트렙토코커스(streptococcus) 및 웨이셀라(Weissella)속의 유산균을 함유하고 있는 것으로 알려져 있다. 락토바실러스(Lactobacillus)속의 유산균은 그람양성, 카탈라아제 음성이며 구아닌 시토신 함량이 32-55%이다. 생육 적정온도는 25~35℃이며 생육과정에서 젖산을 분비하여 pH를 낮추는 특징이 있다. 최근 국내 연구자들에 의해 김치에서 분리한 락토바실러스 속의 신규한 유산균들이 다수 발견되었으며, 이들을 이용한 유산균 발효식품 및 화장품 개발에 관한 연구를 지속적으로 진행하여 국내 소유권이 없는 균들을 이용한 각종 기능성 제품과 차별화 된 토종 기능성 미생물을 개발하고자 박차를 가하고 있다.Kimchi is traditionally fermented food that has been handed down from Korea for a long time to be recorded in Samguksagi, and it is known that it has various functions such as antioxidation, anti - cancer and antibacterial function. In addition, kimchi is a variety of bacterial sources, and depending on the fermentation period, a large amount of Lactobacillus , Lactococcus , Leuconostoc , Pediococcus , streptococcus and Weissella , It is known to contain lactic acid bacteria in the genus. Lactobacillus bacteria (Lactobacillus) in the lactic acid bacterium is a gram positive, catalase negative, and the guanine cytosine content of 32-55%. The optimum temperature for growth is 25 ~ 35 ℃, and lactic acid is secreted during the growing process to lower the pH. Recently, a number of novel Lactobacillus strains of Lactobacillus species isolated from kimchi have been discovered by domestic researchers. We have continued research on the development of fermented foods and cosmetics using lactic acid bacteria using them, And is spurring efforts to develop native functional microorganisms.

대한민국 특허등록 제479,803호, 제497,895호, 제517,899호, 제618,171호 등은 인삼 또는 인삼 추출액을 유산균 또는 장내 세균으로 발효시켜, 체내 흡수가 용이한 형태의 진세노사이드 저분자 물질의 함량이 높은 발효 인삼(즉, 인삼 추출물) 및 그의 제조방법을 개시한 바 있다.Korean Patent No. 479,803, No. 497,895, No. 517,899, No. 618,171, etc. discloses a method of fermenting ginseng or ginseng extract with lactic acid bacteria or intestinal bacteria to produce a fermented product having a high content of ginsenoside low molecular weight substance Ginseng (i.e., ginseng extract) and a method for producing the same.

하지만, 대한민국 특허등록 제479,803호, 제497,895호, 제517,899호, 제618,171호 등에 개시된 신규 미생물인 페디오코거스 속 (Pediococcus Sp.) 균주 및 루코노스톡 속(Leuconostoc Sp.) 균주, 락토바실러스 알리멘타리우스 (Lactobacillus alimentarius) M-2 균주(KCTC 11054 BP), 류코노스톡 멘센테로이드스(Leuconostocmensenteroides) M-3 균주(KCTC 11055 BP), 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) M2 균주 (KCTC11390BP) 및 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) P2 균주(KCTC11391BP) 등으로 상기 종래의 제조방법에 따라 인삼을 발효시키더라도, 그 저분자화에 대한 효과는 여전히 만족스럽지 못하다.However, the new microorganisms Pediococcus Sp., Leuconostoc Sp., And Lactobacillus al., Which are disclosed in Korean Patent Registration Nos. 479,803, 497,895, 517,899 and 618,171, The strain Lactobacillus alimentarius M-2 (KCTC 11054 BP), the strain Leuconostocmensenteroides M-3 (KCTC 11055 BP), the strain Lactobacillus brevis M2 (KCTC11390BP) Even if ginseng is fermented according to the above-described conventional method using Lactobacillus plantarum strain P2 (KCTC11391BP), the effect on low molecular weight thereof is still unsatisfactory.

KR 10-2010-0027688, 2010.03.29KR 10-2010-0027688, March 29, 2010 KR 10-2009-0032163, 2009.04.14KR 10-2009-0032163, April 14, 2009

본 발명은 체내 흡수가 용이한 형태의 진세노사이드를 다량 함유할 수 있도록 사포닌의 저분자화에 현저한 효과를 갖는 신규한 유산균 락토바실러스 용인시스 THK-V8T 을 제공하는 것을 목적으로 한다.The object of the present invention is to provide a novel Lactobacillus lactobacillus intolerance THK-V8 T which has a remarkable effect on low molecular weight saponin so that it can contain a large amount of ginsenoside easily absorbed in the body.

또한, 본 발명은 상기 유산균을 이용한 사포닌의 저분자화 방법 및 이를 통한 인삼 발효 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다. It is another object of the present invention to provide a low molecular weight saponin using the above-mentioned lactic acid bacteria and a ginseng fermentation method therefor.

본 발명자들은 인삼 발효물을 생성할 수 있도록 인삼 사포닌을 해당 처리하여 저분자화하는 효과가 큰 미생물을 광범위하게 탐색하였다. 그 결과, 수십 종의 유산균을 분리하였으며, 이 중 락토바실러스(Lactobacillus) 속에 속하는 1 종의 균주가 체내 흡수가 용이한 형태의 진세노사이드를 다량 함유할 수 있는 저분자화 효과를 가지는 것을 확인하고 본 발명을 완성하였다. The present inventors have extensively searched for microorganisms having a large effect of treating ginseng saponin with low molecular weight so as to produce ginseng fermented product. As a result, several dozen lactic acid bacteria were isolated, and it was confirmed that one strain belonging to the genus Lactobacillus had a low-molecular-weight effect capable of containing a large amount of ginsenoside, Thereby completing the invention.

진세노사이드의 저분자화에 대해서는 도 1에 제시하였다. The low molecular weight of ginsenoside is shown in Fig.

도 1에 나타낸 바와 같이, Rb1이 Rd로 전환되며, Rd는 각각 F2 또는 Rg3으로 전환된다. 마지막으로 F2는 compound K로 전환되며, Rg3은 Rh2로 전환되게 된다. 이러한 저분자화에 의하여 체내 흡수가 용이한 형태의 진세노사이드 변형되게 되는 것이다. 본 발명은 사포닌의 저분자화에 현저한 효과를 갖는 신규한 락토바실러스 용인시스 THK-V8 을 제공하는 것을 목적으로 한다.As shown in Fig. 1, Rb1 is converted to Rd, and Rd is converted to F2 or Rg3, respectively. Finally, F2 is converted to compound K and Rg3 is converted to Rh2. This low molecular weight makes the ginsenoside of the form easily absorbed into the body. It is an object of the present invention to provide a novel Lactobacillus intolinis THK-V8 having a remarkable effect on low molecular weight saponin.

본 발명자들은 김치에서 분리한 98종의 균주에서 베타글루코시다아제 활성을 가지는 22종을 우선적으로 선별하고 이를 분리용 배지(MRS-BCP 배지)를 사용하여 단일 집락을 형성하는 균주들로 분리하였다. 이중 사포닌의 저분자화 효과를 가지는 균주들을 선별하고 특히, 사포닌의 저분자화 효과가 현저한 1종의 유산균을 선별하고 락토바실러스 용인시스 THK-V8T로 명명하였다. 분리된 유산균의 16S rRNA 유전자 서열을 분석한 결과, 서열번호 3의 염기서열을 갖는다는 것이 밝혀졌고, 이를 BLAST를 사용하여 상동성을 비교하고 균주의 특성을 분석한 결과, 각각 락토바실러스속(Lactobacillus) 에 속하는 새로운 균주로 판명되었다. 상기 균주 즉, 락토바실러스 용인시스 THK-V8T를 농촌진흥청 농업생명공학연구원 부설 한국농업미생물보존센터(KACC)에 기탁하여, 2011년 8월 19일 수탁번호 KACC 16236을 부여받았다.The present inventors preferentially selected 22 species having β-glucosidase activity in 98 strains isolated from kimchi and isolated them as strains which form a single colony using a separation medium (MRS-BCP medium). One of the lactic acid bacteria having a low molecular weight effect of saponin was selected and named as Lactobacillus intansis THK-V8 T. As a result of analysis of the 16S rRNA gene sequence of the isolated lactic acid bacteria, it was found that it has the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3. The homology was compared using BLAST and the characteristics of the strains were analyzed. As a result, Lactobacillus ). The above strain, Lactobacillus herbaceus THK-V8 T , was deposited with the Korean Agricultural Microbiology Research Center (KACC), attached to the Institute of Agricultural Biotechnology, RDA, on August 19, 2011 under accession number KACC 16236.

본 발명은 또한 락토바실러스 용인시스(Lactobacillus yonginsis) 균주를 인삼에 접종하고, 배양하는 단계를 포함하는 인삼 발효물의 제조방법을 제공한다. The present invention also relates to the use of Lactobacillus < RTI ID = 0.0 > The present invention also provides a method for producing a ginseng fermented product comprising the steps of:

상기한 바와 같이, 본 발명에 의해 새롭게 분리된 락토바실러스 용인시스(Lactobacillus yonginsis)는 우수한 사포닌의 저분자화 효과를 가지며, 특히, 이를 이용하여 인삼을 발효시킬 경우 Rd, Compound K, F2 등 저분자성 진세노사이드의 함량이 높은 인삼 발효물을 얻을 수 있다.As described above, the newly isolated Lactobacillus < RTI ID = 0.0 > ( Lactobacillus & yonginsis ) has a low molecular weight effect of excellent saponin. In particular, when ginseng is fermented by using it, a ginseng fermented product having a high content of low molecular weight ginsenosides such as Rd, Compound K and F2 can be obtained.

본 발명의 제조방법에서 상기 균주의 기질로서 사용하는 인삼은 특별히 한정된 것은 아니며, 인삼 그 자체 및 인삼 가공물을 모두 사용할 수 있으며, 예를 들어, 수삼, 홍삼, 홍미삼, 백삼, 미삼, 인삼 열매, 인삼 잎 등을 사용하거나 인삼 추출액 및 인삼 분말 등을 사용할 수 있다. 상기 인삼의 원산지는 제한되지 아니하며, 예를 들어 고려인삼, 삼칠인삼, 미국인삼, 죽절인삼, 히말라야인삼, 베트남인삼 등을 제한 없이 사용할 수 있다. 또한, 상기 인삼은 필요에 따라 통상의 방법으로 멸균시켜 사용할 수도 있다.The ginseng used as a substrate of the strain of the present invention is not particularly limited and any of ginseng itself and ginseng processed materials can be used. Examples of the ginseng include ginseng, red ginseng, red ginseng, white ginseng, Leaf, etc., or ginseng extract and ginseng powder can be used. The origin of the ginseng is not limited. For example, Korean ginseng, Korean ginseng, American ginseng, Panax ginseng, Himalayan ginseng, Vietnamese ginseng and the like can be used without limitation. The ginseng may be sterilized by a conventional method if necessary.

또한, 건조 분말 형태의 인삼, 산 처리 인삼, 고온처리 인삼 및 가압처리 인삼 등도 사용할 수도 있다. 그러나, 산 처리를 할 경우 배양액의 pH가 낮아져 균주의 활성이 낮아질 수 있으며, 고온으로 처리할 경우 열처리 과정에서 HMF 등의 발암물질이 생성될 수 있으므로, 인삼 또는 인삼 분말을 그대로 사용하는 것이 바람직하다. 상기 인삼 분말은 적어도 100 메쉬 이상의 입자크기를 갖는 분말이 인삼의 표면적을 증가시켜 미생물의 발효 속도를 높일 수 있다.In addition, ginseng in the form of a dry powder, acid-treated ginseng, high-temperature treated ginseng, and pressure-treated ginseng may also be used. However, when the acid treatment is performed, the pH of the culture medium may be lowered and the activity of the strain may be lowered. In the case of treatment at a high temperature, carcinogenic substances such as HMF may be generated during the heat treatment process. Therefore, it is preferable to use ginseng or ginseng powder as it is . The powder of the ginseng powder having a particle size of at least 100 mesh can increase the surface area of ginseng to increase the fermentation speed of the microorganism.

인삼을 발효시키는 방법은 예를 들어, 인삼 분말 또는 인삼의 추출액(예를 들어, 알콜 또는 알콜 수용액 추출액, 열수 추출액 등)을 물에 현탁하여 상기한 균주를 넣고, 20 ∼ 50 ℃에서, 1 일 ∼ 30 일, 바람직하게 10 시간 ∼ 20 일 동안 배양함으로써 수행할 수 있다.The method of fermenting ginseng includes, for example, suspending ginseng powder or an extract of ginseng (for example, alcohol or aqueous alcohol solution, hot water extract, etc.) in water, adding the above-mentioned strain, To 30 days, preferably 10 hours to 20 days.

상기와 같은 발효 과정을 거침으로써, 인삼 원재료에 함유된 고분자 물질을 당화과정을 거쳐 체내 흡수가 용이한 형태의 진세노사이드를 다량 함유할 수 있는저분자 물질로 바꿀 수 있다.By performing the fermentation process as described above, the polymer substance contained in the raw material of ginseng can be converted into a low-molecular substance capable of containing a large amount of ginsenoside in a form that is easy to be absorbed into the body through saccharification.

본 발명의 제조방법은 상기 배양 후 얻어진 배양액을 80 ∼ 95 ℃에서 12 ∼ 48 시간 동안 숙성시키는 단계("숙성 단계")를 추가로 포함할 수 있다. 상기와 같은 조건에서 숙성 단계를 수행하게 되면, 숙성과 동시에 멸균도 함께 이루어지게 되며, 또한 저분자 물질의 함량을 더욱 늘릴 수 있다.The production method of the present invention may further include a step of aging the obtained culture broth at 80 to 95 ° C for 12 to 48 hours ("aging step"). When the aging step is carried out under the above-mentioned conditions, the sterilization is performed at the same time as the fermentation, and the content of the low molecular substance can be further increased.

본 발명의 제조방법에 따라 얻어지는 인삼 발효물은 별도의 정제를 통하지 않고 직접 식품으로서의 사용이 가능하다. 즉, 본 발명의 제조방법에 따라 얻어진 인삼 발효물은 통상의 방법에 따라 농축시키거나 동결건조하여 분말화하여 그대로 식품에 적용할 수 있다. 즉, 숙성과정을 통하여 얻어진 숙성액을 농축 또는 동결건조한 것을 그대로 식품에 적용 수 있으며, 또는 상기 숙성액을 원심분리하여 취한 상등액을 농축 또는 동결건조하는 단계를 거쳐 얻어진 것을 그대로 식품에 적용할 수도 있다.The fermented product of ginseng obtained according to the production method of the present invention can be used directly as a food without passing through another tablet. That is, the ginseng fermented product obtained according to the production method of the present invention can be concentrated or lyophilized in a conventional manner and powdered to be directly applied to foods. That is, the aged solution obtained through the aging process can be directly applied to the food by concentrating or lyophilizing the dried solution, or the supernatant obtained by centrifuging the aged solution may be concentrated or lyophilized to be directly applied to the food .

본 발명에 의해 새롭게 분리된 락토바실러스 속 미생물 즉, 락토바실러스 용인시스 THK-V8T (Lactobacillus yonginsis THK-V8T) KACC 16236은 우수한 사포닌의 저분자화 효과를 갖는다. 특히, 상기 미생물을 수삼, 백삼, 홍삼 등의 인삼에 접종하고 배양할 경우, Rd, Compound K, F2 등의 함량이 높은 인삼 발효물을 얻을 수 있다.The Lactobacillus sp. Microorganism newly isolated by the present invention, that is, Lactobacillus herbaceus THK-V8 T ( Lactobacillus yonginsis THK-V8 T ) KACC 16236 has a low-molecular-weight effect of excellent saponin. In particular, when the microorganisms are inoculated and cultured in ginseng such as fresh ginseng, white ginseng and red ginseng, ginseng fermented products having a high content of Rd, Compound K and F2 can be obtained.

도 1은 진세노사이드의 저분자화 과정을 나타낸 도이다.
도 2은 Lactobacillus yonginsis THK-V8T의 염기서열을 기초로 한 다른 세균과의 계통 발생론적 관계를 나타낸 도이다.
도 3는 Lactobacillus yonginsis THK-V8T에 의한 인삼사포닌 Rb1, Rc, Rd 혼합물의 일차별 변화 TLC 분석결과를 나타낸 도이다.
도 4은 Lactobacillus yonginsis THK-V8T 조효소 추출물에 의한 진세노사이드 Rb1 반응물의 TLC 분석결과를 나타낸 도이다.
도 5는 Lactobacillus yonginsis THK-V8T 조효소 추출물에 의한 진세노사이드 Rb1 반응물의 HPLC 분석결과를 나타낸 도이다.
Brief Description of the Drawings Fig. 1 is a diagram showing a low molecular weight process of ginsenosides. Fig.
Figure 2 is a graphical representation of Lactobacillus yonginsis THK-V8 T with other bacteria based on the nucleotide sequence.
Figure 3 is a graph yonginsis THK-V8 T shows the results of TLC analysis of the first-order change of the mixture of ginsenoside Rb1, Rc and Rd.
FIG. 4 is a graph showing the results of TLC analysis of the reaction product of ginsenoside Rb1 with Lactobacillus yonginsis THK-V8 T co - enzyme extract. FIG.
FIG. 5 is a graph showing the results of HPLC analysis of the reaction product of ginsenoside Rb1 with Lactobacillus yonginsis THK-V8 T co - enzyme extract. FIG.

본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 상세하게 후술되어있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하고, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.Advantages and features of the present invention and methods of achieving them will become apparent with reference to the embodiments described in detail below. The present invention may, however, be embodied in many different forms and should not be construed as being limited to the embodiments set forth herein. Rather, these embodiments are provided so that this disclosure will be thorough and complete, and will fully convey the scope of the invention to those skilled in the art. Is provided to fully convey the scope of the invention to those skilled in the art, and the invention is only defined by the scope of the claims.

<< 실시예Example 1>  1> 유산균주의Lactic acid bacteria 동정 Sympathy

1-1. 1-1. 유산균주의Lactic acid bacteria 분리 detach

경기도에서 수집한 배추김치를 분쇄하여 무게 1g을 측정한 후 9mL의 멸균 생리 식염수(NaCl 0.85%)에 희석하여 단계별 10배수 희석하였다. 이를 BCP배지에 도말하고, 30℃에서 2일간 배양한 다음, 노란 환을 형성한 균주를 잠정적으로 유산균으로 확인하여 분리하였다. 분리한 균주는 MRS 배지에서 생육하였다. BCP배지와 MRS배지의 조성은 표 1과 표 2에 각각 나타냈다.The cabbage kimchi collected in Gyeonggi province was crushed and weighed 1 g. Then, it was diluted with 9 mL of sterilized physiological saline (NaCl 0.85%) and diluted 10 times with each step. This strain was plated on BCP medium, cultured at 30 ° C. for 2 days, and then the strain having a yellow circle was temporarily identified as lactic acid bacteria. The isolated strains were grown on MRS medium. The composition of the BCP medium and the MRS medium are shown in Table 1 and Table 2, respectively.

[표 1] MRS 배지의 조성[Table 1] Composition of MRS medium

Figure 112012070510112-pat00001
Figure 112012070510112-pat00001

[표 2] BCP 한천배지의 조성[Table 2] Composition of BCP agar medium

Figure 112012070510112-pat00002
Figure 112012070510112-pat00002

1-2. 베타 1-2. beta 글루코시다아제Glucosidase 생성 미생물의 스크리닝 Screening of producing microorganisms

사포닌을 저분자화 하기 위해서는 사포닌의 비당부분에 베타결합을 하고 있는 당을 분해하는 과정이 필수적이므로 실시예 1-1에서 분리한 유산균주를 대상으로 베타글루코시다아제 생성 미생물을 스크리닝하였다. 베타 글루코시다아제 활성은 에스쿨린(6,7-디하이드록시쿠마린 6-글루코시드, C15H16O9*H2O)이 베타글루코시다아제에 의해 가수분해 되어 생산한 에스쿨레틴(6,7-디히드록시쿠마린)이 철염과 결합하여 갈색 혹은 흑색의 화합물을 생성하는 원리를 이용하였다. MRS 한천배지에 1% 에스쿨린과 0.5% 구연산철을 첨가한 배지에서 갈색 혹은 흑색 환을 생성하는 베타글루코시다아제 활성균주 22종을 선발하였다. In order to lower the saponin to low molecular weight, it is essential to decompose the sugar having a beta bond to the non-sugar portion of the saponin. Therefore, the microorganism producing beta glucosidase was screened for the lactic acid bacteria isolated in Example 1-1. The beta glucosidase activity was determined by measuring the activity of escululin (6,7-dihydroxy coumarin 6-glucoside, C 15 H 16 O 9 * H 2 O) produced by hydrolysis of beta glucosidase , 7-dihydroxy coumarin) were combined with iron salts to produce brown or black compounds. Twenty - two β - glucosidase - producing strains producing brown or black rings were selected on MRS agar media supplemented with 1% esculin and 0.5% citric acid.

1-3. 유산균의 순수배양 및 동결 보존1-3. Pure culture of lactic acid bacteria and cryopreservation

실시예 1-2에서 선별된 균은 MRS 액체 배지에 접종하여 30℃에서 이틀 간 배양 한 후 25%(v/v) 글리세롤 스톡(glycerol stock)을 제조하여 -70℃에서 보관하여 사용하였다.The bacteria selected in Example 1-2 were inoculated into the MRS liquid medium, cultured at 30 ° C. for two days, and 25% (v / v) glycerol stock was prepared and stored at -70 ° C.

1-4. 균주의 염기서열 분석1-4. Sequence analysis of strains

이후 MRS 플레이트에 계대하여 48시간 호기조건으로 배양한 후, (주)제노텍에 의뢰하여 이 균주의 16s rDNA 염기서열을 분석했다. 사용한 프라이머의 염기서열은 표 3(서열번호 1, 2)에 표기했다. Thereafter, the cells were cultured on an MRS plate under an aerobic condition for 48 hours, and then submitted to Genentech Co., Ltd. to analyze the 16s rDNA nucleotide sequence of this strain. The nucleotide sequences of the primers used are shown in Table 3 (SEQ ID NOS: 1 and 2).

[표 3] 16s rDNA 염기서열 분석에 사용한 프라이머[Table 3] Primers used for 16s rDNA sequencing

Figure 112012070510112-pat00003
Figure 112012070510112-pat00003

동정결과 표준균주와의 염기서열 유사도가 99% 이하인 균주 THK-V8T을 신균주 등록 예정균주로 선정하였다. THK-V8T의 염기서열 분석결과 서열번호 3의 DNA를 가지는 본 발명의 균주와 유사한 유산균들을 확인할 수 있었으며 이를 표 4에 나타내었다. As a result of the identification, strain THK-V8 T with a sequence similarity of 99% or less with the standard strain was selected as a strain to be registered as a new strain. As a result of the nucleotide sequence analysis of THK-V8 T , lactic acid bacteria similar to the strain of the present invention having the DNA of SEQ ID NO: 3 were identified and shown in Table 4.

[표 4] 16s rRNA DNA 염기서열 비교[Table 4] Sequence comparison of 16s rRNA DNA

Figure 112012070510112-pat00004
Figure 112012070510112-pat00004

표 4에 나타낸 바와 같이, 95% 이상 동정성을 가지는 유산균을 10여종 찾을 수 있었으며, 가장 유사한 유산균으로는 Lactobacillus koreensis(유사도, 98.8%)을 확인하였다. As shown in Table 4, 10 kinds of lactic acid bacteria having homology of 95% or more were found, and the most similar lactic acid bacteria were Lactobacillus koreensis (similarity, 98.8%).

마지막으로 동정한, 상기 균주를 Lactobacillus yonginsis THK-V8T으로 명명하고, 농촌진흥청 농업생명공학연구원 부설 한국농업미생물보존센터(KACC)에 기탁하여, 2011년 8월 19일 수탁번호 KACC 16236을 부여받았다.The strain, which was finally identified, was transformed with Lactobacillus yonginsis THK-V8 T , deposited with KACC, Korea Research Institute of Agricultural Biotechnology, RDA, and granted KACC 16236 on August 19, 2011.

<< 실시예Example 2>  2> THKTHK -- V8V8 TT 의 생화학적 특성 확인Biochemical characterization of

2-1. 2-1. THKTHK -- V8V8 TT 의 생리학적 특성Physiological characteristics of

<실시예 1>에서 분리된 유산균 용인시스 THK-V8T의 현미경 상 이미지 및 콜로니의 모양과 색을 관찰하였고, 그람염색과 카탈라아제 시험 등을 거쳐 표 5에 THK-V8T의 생리학적 특성을 나타내었다. The shape and color of the image and colony of the lactic acid bacteria THK-V8 T isolated in Example 1 were observed, and the physiological characteristics of THK-V8 T were shown in Table 5 through Gram stain and catalase test .

[표 5] Lactobacillus yonginsis THK-V8T의 생리학적 특성[Table 5] Lactobacillus Physiological characteristics of yonginsis THK-V8 T

Figure 112012070510112-pat00005

Figure 112012070510112-pat00005

상기 표 5에 나타낸 바와 같이, Lactobacillus yonginsis THK-V8T는 간균 형태를 띄고 있으며 그람 염색에 대하여 양성 반응을 보이며, 운동성, 포자형성 카탈라아제 시험에서 음성을 보이는 바, 일반적인 유산균의 특성을 확인할 수 있었다. As shown in Table 5, Lactobacillus yonginsis THK-V8 T has a bacterium-like form, shows a positive response to Gram stain, and shows negative effects on mobility and spore formation catalase test.

또한, 당 이용성을 API kit(50CHL, Zym, Biomrieux Co., France)를 통하여 확인하였다. 본 발명의 신규한 균주인 Lactobacillus yonginsis THK-V8T과 대비하여 기존에 알려진 유산균 균종으로 Lactobacillus koreensis DCY50T, Lactobacillus parabrevis LMG11984T, Lactobacillus brevis LMG11494T, Lactobacillus hammesii TMW 1.1236T Lactobacillus senmaizukei L13T를 비교하였다. 그 결과를 하기 표 6에 나타내었다.The glucose availability was also confirmed by API kit (50CHL, Zym, Biomrieux Co., France). The novel strain of the present invention, Lactobacillus yonginsis In contrast to THK-V8 T , Lactobacillus koreensis DCY50 T , Lactobacillus parabrevis LMG11984 T , Lactobacillus brevis LMG11494 T , Lactobacillus hammesii TMW 1.1236 T and Lactobacillus senmaizukei L13 T was compared. The results are shown in Table 6 below.

[표 6] Lactobacillus yonginsis THK-V8T 및 관련 균주의 당 이용성 검정을 통한 생리학적 특성[Table 6] Lactobacillus yonginsis THK-V8 T And physiological characteristics by assaying the sugar availability of related strains

Figure 112012070510112-pat00006
Figure 112012070510112-pat00006

표 6에 나타낸 바와 같이, API 50CHL을 통한 당이용성 검정 결과 모든 균주에서 양성을 보인 기질은 L-arabinose, D-glucose, D-fructose 그리고 gluconate가 있었다. 반면, Esculin ferric citrate와 Salicin에 대해서는 Lactobacillus yonginsis THK-V8T 균주와 Lactobacillus senmaizukei L13만이 양성을 보였다.As shown in Table 6, as a result of the assay of glucose availability through API 50CHL, all of the strains were positive for L-arabinose, D-glucose, D-fructose and gluconate. On the other hand, for Esculin ferric citrate and Salicin, Lactobacillus yonginsis THK-V8 T The strain and Lactobacillus senmaizukei Only L13 showed positive.

2-2. 구아닌 시토신(G+C) 함량 분석2-2. Content analysis of guanine cytosine (G + C)

MRS배지 30℃ 조건하에서 12시간(대수증식기 도입) 배양한 배양액을 원심분리하여 균주를 수득하였다. 수득된 균주의 DNA를 페놀 추출법에 의하여 추출하였다. 추출된 DNA는 50uL 멸균 증류수에 용해하여 100℃에서 5분간 가열한 뒤 얼음용액에서 빠르게 냉각하였다. 냉각한 DNA용액에 50uL 뉴크레아제(neuclease; 200U/mL pH 5.3) P1를 처리한 후 37℃에서 한 시간 배양하였다. 이후 글라이신 완충용액(pH 10)을 50uL 첨가하고, 50uL 알카라인 포스파타제를 처리하여 37℃에서 3시간 배양한 뒤 -70℃에서 보관하였다. HPLC 장치는 LC-4A 액상 크로마토그래피, Z-MODULE에 탑재된 RADIAL-PACK C 카트리지, Lamb do-Max 모델 481형 LC 분광광도계 및 데이터 분석기 크로마토팩 C-R2AX로 구성된 것을 사용하였다. 뉴클레오시드는 0.6M NHHPO(pH 4.0) 및 아세토나이트릴 (20:1, v/v) 혼합물에 대해 25℃에서 1mL/분의 유량으로 용출 시켰다. 흡광도는 270nm의 UV에서 측정하였으며, 표준 DNA로 E. coli DNA를 사용하였다.실험 결과, THK-V8T 균주의 G +C 함량은 47.835(mol%)가 나온 것을 확인하였다.The MRS medium was cultured under the condition of 30 캜 for 12 hours (introduction of a logarithmic growth phase), and the culture was centrifuged to obtain a strain. The DNA of the obtained strain was extracted by phenol extraction. The extracted DNA was dissolved in 50 uL sterile distilled water, heated at 100 ° C for 5 minutes, and rapidly cooled in an ice solution. The cooled DNA solution was treated with 50 μL of neu- lease (200 U / mL of pH 5.3) P1 and incubated at 37 ° C for one hour. Then, 50 uL of glycine buffer solution (pH 10) was added, and 50 uL alkaline phosphatase was treated and incubated at 37 캜 for 3 hours and then stored at -70 캜. The HPLC apparatus was composed of LC-4A liquid chromatography, RADIAL-PACK C cartridge mounted on Z-MODULE, Lamb do-Max model 481 LC spectrophotometer and data analyzer chromatography pack C-R2AX. The nucleoside was eluted at a flow rate of 1 mL / min at 25 DEG C for a mixture of 0.6M NHHPO (pH 4.0) and acetonitrile (20: 1, v / v). The absorbance was measured at 270 nm UV and E. coli DNA was used as the standard DNA. As a result, it was confirmed that the G + C content of the THK-V8 T strain was 47.835 (mol%).

2-3. 2-3. DNADNA -- DNADNA 교잡 분석 Hybridization analysis

실시예 2-2에서 추출한 균주 DNA로 유사도가 높은 각 균주간의 DNA 유사도를 검정하였다. DNA-DNA 교잡분석은 Ezaki 등(1989)이 고안한 방법을 이용하였다. 음성 대조군으로 E. coli DNA를 사용했으며, THK-V8T과 높은 유사도를 보인 균주 L. koreensis DCY50T L. parabrevis LMG11984T간의 DNA-DNA 교잡을 분석하였으며 그 결과는 표 7과 같다.DNA similarity between each strain having high similarity with the strain DNA extracted in Example 2-2 was tested. DNA-DNA hybridization analysis was performed by the method devised by Ezaki et al. (1989). E. coli DNA was used as negative control, and strain L. koreensis DCY50 T , which showed high similarity to THK-V8 T DNA-DNA hybridization between L. parabrevis LMG11984 T was analyzed and the results are shown in Table 7.

[표 7] Lactobacillus yonginsis THK-V8T과 비교균주 간의 DNA-DNA 교잡분석 결과[Table 7] Analysis of DNA-DNA hybridization between Lactobacillus yonginsis THK-V8T and comparative strains

Figure 112012070510112-pat00007
Figure 112012070510112-pat00007

표 7에 제시된 바와 같이, 유사할 것으로 판단되었던 두 균주와 비교하여 DNA-DNA 유사도는 각각 46%, 10%가 나왔으며 유사도가 다소 상이한 것을 확인할 수 있었다. As shown in Table 7, DNA-DNA similarity was 46% and 10%, respectively, and the similarities were slightly different compared with the two strains which were judged to be similar.

2-4. 16s 2-4. 16s rDNArDNA 서열화 및 분류계통도 작성 Sequencing and classification

THK-V8T의 DNA염기서열을 바탕으로 동속근연관계의 균주들 간의 분류계통학적 거리를 알아보기 위해 분류계통도를 작성하였다. NCBI 유전자 데이터베이스를 바탕으로, Lactobacillus속에 속한 표준 균주의 16s rDNA 유전자 염기서열을 수집하여 Clustal X 프로그램을 이용하여 염기서열을 정렬하였다. 정렬된 염기서열은 Bioedit 프로그램을 이용하여 각각의 길이를 맞추어 편집한 후 MEGA 프로그램을 이용하여 분류계통도를 작성하였다.Based on the DNA sequence of THK-V8 T , a classification scheme was developed to identify the classification systematic distances between homologous strains. Based on the NCBI gene database, 16s rDNA nucleotide sequences of the standard strains belonging to the genus Lactobacillus were collected and sequenced using the Clustal X program. Aligned sequences were compiled by Bioedit program for each length and then classified by MEGA program.

그 결과를 도 2에 나타내었다. The results are shown in Fig.

도 2에 나타낸 바와 같이, Lactobacillus yonginsis THK-V8T의 염기서열을 기초로 한 다른 세균과의 계통 발생론적 관계를 나타낸 Lactobacillus koreensis DCY50TLactobacillus parabrevis LMG11984T의 사이에 위치할 수 있는 것으로 판단된다.As shown in Figure 2, Lactobacillus yonginsis Lactobacillus showing phylogenetic relationships with other bacteria based on the nucleotide sequence of THK-V8 T koreensis DCY50 T and Lactobacillus parabrevis It believes that may be located between the T LMG11984.

<실시예 3> THK - V8 T 을 이용한 인삼 사포닌의 저분자물질로 생물학적 전환 Example 3 Biological Conversion of Ginseng Saponin into Low Molecular Mass Using THK - V8 T

3-1. 발효를 통한 3-1. Through fermentation 인삼사포닌의Of ginseng saponin 전환 transform

인삼사포닌의 생물학적 전환을 위해 중국 대련에서 진세노사이드 Rb1, Rc, Rd를 수급하여 본 발명의 시험에 사용하였다.For the biological conversion of ginseng saponin, ginsenosides Rb1, Rc and Rd were supplied and used in the test of the present invention in Dalian, China.

발효에 의한 인삼사포닌 전환양상을 확인하기 위하여, 진세노사이드 Rb1, Rc, Rd가 혼합된 프로토파낙사다이올(protopanaxadiol;PPD)계열의 사포닌을 200ppm이 되게 혼합한 MRS 액체배지를 반응배지로 사용하였다. 30℃에서 12시간 동안 정치배양한 균주를 반응배지에 1%(v/v) 접종하여 30℃에서 3일 내지 20일간 정치 배양하였다. In order to confirm the transformation of ginseng saponin by fermentation, 200ppm of protopanaxadiol (PPD) saponin mixed with ginsenosides Rb 1 , Rc and Rd was mixed with MRS liquid medium Respectively. The strains cultivated at 30 DEG C for 12 hours were inoculated in a reaction medium at 1% (v / v) and cultured at 30 DEG C for 3 to 20 days.

전환 양상은 박층크로마토그래피를 이용하여 분석하였다. Conversion patterns were analyzed using thin layer chromatography.

박층크로마토그래피(TLC)는 하기의 방법으로 수행하였다.Thin layer chromatography (TLC) was performed by the following method.

사포닌 전환물을 에펜돌프 튜브에 100uL씩 채취한 후 동량의 수포화 부탄올을 첨가하여 혼합한다. 혼합물을 3500rpm의 속도로 1분간 원심분리하여 상층액을 취한 후 모세관을 이용하여 50uL를 TLC 판에 점적한다. 전개용매는 클로로포름: 메탄올: 물= 65: 35: 10를 사용하였으며, 10% 황산용액을 분무한 후 열을 가하여 발색하였다.Saponin conversion is obtained in an Eppendorf tube in an amount of 100 μL, and an equal volume of butanol saturated with water is added. The mixture is centrifuged at a speed of 3500 rpm for 1 minute to take the supernatant, and then 50 μL is dispensed onto the TLC plate using a capillary tube. The developing solvent was chloroform: methanol: water = 65: 35: 10, and 10% sulfuric acid solution was sprayed and heat was applied to develop color.

발효에 의한 THK-V8T의 인삼사포닌 전환결과는 도 3에 나타냈다.Ginsenoside conversion result of THK-V8 T by fermentation are shown in Fig.

도 3에 나타낸 바와 같이, 인삼사포닌 Rb1, Rc, Rd 혼합물의 일차별 변화를 확인할 수 있었다. control은 인삼사포닌 Rb1, Rc, Rd 혼합물에 균을 처리하지 않은 것이며, 시간에 따른 Rb1, Rb2, Rd, F2 및 compound-K의 변화를 확인하였다. 12일 이후 compound-K로의 전환이 보였고, 20일에는 Rb1이 저분자 물질로 대부분 전환되는 양상을 보였다.As shown in FIG. 3, it was confirmed that the ginseng saponin Rb1, Rc, and Rd mixtures were differentially changed. control showed that the ginseng saponin Rb1, Rc, and Rd mixture was not treated with bacteria and that the changes of Rb1, Rb2, Rd, F2 and compound-K over time were observed. After 12 days, conversion to compound-K was observed, and on the 20th day, Rb1 was mostly converted to low-molecular substance.

3-2. 3-2. 인삼사포닌Ginseng saponin 전환을 위한 조효소 추출 Extract coenzyme for conversion

MRS 배지 조건 아래 30℃에서 정치 배양하여 대수 증식기까지 배양한 균을 원심분리하여 상층액을 취한다. 상층액을 4배 부피의 아세톤에 혼합하여 30분 동안 4℃에서 단백질을 침전시킨 후 아세톤을 완전히 휘발시킨다. 침전물을 0.1M 포타슘포스페이트 완충용액(pH 7)을 용해시킨 후 인삼사포닌 Rb1에 접종하여 30℃에서 120rpm의 속도로 진탕 배양하였다. 인삼사포닌과 THK-V8T의 조효소 반응은 TLC와 HPLC를 이용하여 확인하였다. TLC는 상기 3-1과 동일한 방법으로 수행하였다. The cells are cultured at 30 ° C under MRS culture conditions and centrifuged to obtain a supernatant. The supernatant is mixed with 4 volumes of acetone, the protein is precipitated at 4 ° C for 30 minutes, and the acetone is completely volatilized. The precipitate was dissolved in 0.1 M potassium phosphate buffer solution (pH 7), then inoculated onto ginsenoside Rb1 and cultured at 30 ° C with shaking at 120 rpm. The coenzyme reaction of ginseng saponin and THK-V8 T was confirmed by TLC and HPLC. TLC was performed in the same manner as in 3-1 above.

HPLC는 하기의 방법으로 수행하였다. 사포닌 전환물을 에펜돌프 튜브에 1mL씩 채취한 후 동량의 수포화 부탄올을 첨가하여 혼합한다. 원심분리하여 상층액을 취하고, 감압농축하여 부탄올을 완전히 날린다. 50% 메탄올을 이용하여 1000ppm의 농도가 되게 시료를 녹인다. Sep-pak(C18)으로 여과한 후 여과액을 물과 아세토나이트릴을 1.2mL/분의 유속으로 농도구배를 주어 분석하였다. 흡광도는 203nm의 UV에서 측정하였다.HPLC was performed in the following manner. The saponin conversion is sampled in an Eppendorf tube in an amount of 1 mL, and an equal volume of saturated butanol is added thereto. The supernatant is collected by centrifugation, and concentrated under reduced pressure to completely blow off the butanol. Dissolve the sample to a concentration of 1000 ppm using 50% methanol. After filtration with Sep-pak (C18), the filtrate was analyzed with a gradient of water and acetonitrile at a flow rate of 1.2 mL / min. Absorbance was measured at UV of 203 nm.

인삼사포닌과 THK-V8T의 조효소 반응의 결과는 도 4와 도 5에 나타냈다.The results of the coenzyme reaction of ginseng saponin and THK-V8 T are shown in FIG. 4 and FIG.

도 4는 TLC로 확인한 결과이며, Lactobacillus yonginsis THK-V8T 조효소 추출물에 의한 진세노사이드 Rb1반응물의 상당량이 Rd로 전환된 것을 확인할 수 있었다. FIG. 4 shows the result obtained by TLC, and Lactobacillus A significant amount of the ginsenoside Rb1 reactant was converted to Rd by the yonginsis THK-V8 T co - enzyme extract.

도 5는 HPLC로 확인한 결과이며, 마친가지로 Rd가 생성된 것을 확인할 수 있었다. FIG. 5 shows the result of HPLC analysis, and it was confirmed that Rd was generated at the end.

즉, 상기 실험 결과를 통해서, 신규 균주인 Lactobacillus yonginsis THK-V8T에 의하여 저분자성 진세노사이드를 효과적으로 생산할 수 있는 것을 확인할 수 있었다. Namely, through the above-mentioned experimental results, it was confirmed that a new strain, Lactobacillus It was confirmed that yonginsis THK-V8 T can efficiently produce low-molecular ginsenoside.

<제조예> 인삼 사포닌 발효물 제제의 제조&Lt; Preparation Example > Preparation of ginseng saponin fermented product preparation

Lactobacillus yonginsis THK-V8T을 이용한 혼합 발효물 제제의 제조를 위해 다음 공정을 수행하였다. 먼저 수세한 인삼 및 홍삼을 잘게 분쇄하여 20배수의 70%(w/v) 에탄올로 상온에서 100rpm으로 진탕 추출한다. 추출과정을 2회 반복하여 여과한 후 50℃ 이하로 감압 농축한 분말을 인삼 및 홍삼 추출물로 한다. 위의 인삼 및 홍삼 추출물 0.5%와 효모 추출물(yeast extract) 1%를 혼합한 용액을 사포닌 발효 배지로 설정하였다. Lactobacillus The following process was carried out for the preparation of the mixed fermentation product using yonginsis THK-V8 T. First, washed ginseng and red ginseng are finely pulverized and shaken out with 20 times of 70% (w / v) ethanol at 100 rpm at room temperature. The extraction process is repeated twice, filtered and concentrated under reduced pressure to 50 ℃ or lower. A solution of 0.5% of ginseng and red ginseng extract and 1% of yeast extract was set as the saponin fermentation medium.

MRS 배지 조건 아래 30℃에서 정치 배양하여 대수 증식기까지 배양한 균을 원심분리하여 하층의 균체를 취한다. 배지와 같은 부피의 0.85% 생리 식염수를 넣어 잘 섞은 후 다시 원심 분리하여 균체를 취하여 여액을 씻어 낸다. 위의 과정을 두 번 반복한다. 균체를 배양 배지와 같은 부피의 사포닌 발효배지에 접종하여 30℃에서 15일간 발효시킨다. 배양을 마친 배양액은 초음파 분쇄기로 균체를 파쇄하여 생육을 정지 시키고 동결건조하여 인삼 및 홍삼발효물 제제를 제조하였다.The cells are cultured at 30 ° C under MRS culture conditions, and the bacteria that have been cultured up to the logarithmic growth phase are centrifuged to take the cells of the lower layer. Add the same volume of 0.85% physiological saline as the medium, mix well and centrifuge again to remove the cells and wash the filtrate. Repeat the above procedure twice. The cells are inoculated into the same volume of saponin fermentation medium as the culture medium and fermented at 30 DEG C for 15 days. After the cultivation, the culture broth was disrupted with an ultrasonic grinder to stop the growth and lyophilized to prepare a fermented product of ginseng and red ginseng.

농업생명공학연구원Agricultural Biotechnology Research Institute KACC16236KACC16236 2011081920110819

<110> University-Industry Cooperation Group of Kyung Hee University <120> Novel Lactobacillus yonginsis THK-V8T and method for lowering molecular weight in saponin <130> p12-065-KHU <160> 3 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> THK-V8 forward primer <400> 1 agagtttgat cctggctcag 20 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> THK-V8 reverse primer <400> 2 ggttaccttg ttacgactt 19 <210> 3 <211> 1451 <212> DNA <213> Lactobacillus yonginsis THK-V8 <400> 3 ccagcgcgct aactgcagtc gacgagcttc cgttgattga cgtgcttgca ctgatttcaa 60 cattgaagcg agtggcgaac tggtgagtaa cacgtgggaa atctgcccag aagcagggga 120 taacacttgg aaacaggtgc taataccgta taacaacaaa aaccgcatgg tttttgtttg 180 aaaggtggct tcggctatca cttctggatg atcccgcggc gtattagtta gttggtgagg 240 taaaggccca ccaagacaat gatacgtagc cgacctgaga gggtaatcgg ccacattggg 300 actgagacac ggcccaaact cctacgggag gcagcagtag ggaatcttcc acaatggacg 360 aaagtctgat ggagcaatgc cgcgtgagtg aagaagggtt tcggctcgta aaactctgtt 420 gttaaagaag aacacttctg agagtaactg ttcagaagtt gacggtattt aaccagaaag 480 ccacggctaa ctacgtgcca gcagccgcgg taatacgtag gtggcaagcg ttgtccggat 540 ttattgggcg taaagcgagc gcaggcggtt ttttaagtct gatgtgaaag ccttcggctt 600 aaccggagaa gtgcatcgga aactgggaaa cttgagtgca gaagaggaca gtggaactcc 660 atgtgtagcg gtggaatgcg tagatatatg gaagaacacc agtggcgaag gcggctgtct 720 agtctgtaac tgacgctgag gctcgaaagc atgggtagcg aacaggatta gataccctgg 780 tagtccatgc cgtaaacgat gagtgctagg tgttggaggg tttccgccct tcagtgccgc 840 agctaacgca ttaagcactc cgcctgggga gtacgaccgc aaggttgaaa ctcaaaggaa 900 ttgacggggg cccgcacaag cggtggagca tgtggtttaa ttcgaagcta cgcgaagaac 960 cttaccaggt cttgacatac tatgcaaatc ttagagataa gacgttccct tcggggacat 1020 ggatacaggt ggtgcatggt tgtcgtcagc tcgtgtcgtg agatgttggg ttaagtcccg 1080 caacgagcgc aacccttatt atcagttgcc agcattaagt tgggcactct ggtgagactg 1140 ccggtgacaa accggaggaa ggtggggatg acgtcaaatc atcatgcccc ttatgacctg 1200 ggctacacac gtgctacaat ggacggtaca acgagttgcg aagtcgtgag gctaagctaa 1260 tctcttaaag ccgttctcag ttcggattgt aggctgcaac tcgcctacat gaagttggaa 1320 tcgctagtaa tcgcggatca gcatgccgcg gtgaatacgt tcccgggcct tgtacacacc 1380 gcccgtcaca ccatgagagt tgtaacaccc aaagccggtg agaaacttcg ggatcagcct 1440 caaggcgatg g 1451 <110> University-Industry Cooperation Group of Kyung Hee University <120> Novel Lactobacillus yonginsis THK-V8T and method for lowering          molecular weight in saponin <130> p12-065-KHU <160> 3 <170> Kopatentin 2.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> THK-V8 forward primer <400> 1 agagtttgat cctggctcag 20 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> THK-V8 reverse primer <400> 2 ggttaccttg ttacgactt 19 <210> 3 <211> 1451 <212> DNA <213> Lactobacillus yonginsis THK-V8 <400> 3 ccagcgcgct aactgcagtc gacgagcttc cgttgattga cgtgcttgca ctgatttcaa 60 cattgaagcg agtggcgaac tggtgagtaa cacgtgggaa atctgcccag aagcagggga 120 taacacttgg aaacaggtgc taataccgta taacaacaaa aaccgcatgg tttttgtttg 180 aaaggtggct tcggctatca cttctggatg atcccgcggc gtattagtta gttggtgagg 240 taaaggccca ccaagacaat gatacgtagc cgacctgaga gggtaatcgg ccacattggg 300 actgagacac ggcccaaact cctacgggag gcagcagtag ggaatcttcc acaatggacg 360 aaagtctgat ggagcaatgc cgcgtgagtg aagaagggtt tcggctcgta aaactctgtt 420 gttaaagaag aacacttctg agagtaactg ttcagaagtt gacggtattt aaccagaaag 480 ccacggctaa ctacgtgcca gcagccgcgg taatacgtag gtggcaagcg ttgtccggat 540 ttattgggcg taaagcgagc gcaggcggtt ttttaagtct gatgtgaaag ccttcggctt 600 aaccggagaa gtgcatggga aactgggaaa cttgagtgca gaagaggaca gtggaactcc 660 atgtgtagcg gtggaatgcg tagatatatg gaagaacacc agtggcgaag gcggctgtct 720 agtctgtaac tgacgctgag gctcgaaagc atgggtagcg aacaggatta gataccctgg 780 tagtccatgc cgtaaacgat gagtgctagg tgttggaggg tttccgccct tcagtgccgc 840 agctaacgca ttaagcactc cgcctgggga gtacgaccgc aaggttgaaa ctcaaaggaa 900 ttgacggggg cccgcacaag cggtggagca tgtggtttaa ttcgaagcta cgcgaagaac 960 cttaccaggt cttgacatac tatgcaaatc ttagagataa gacgttccct tcggggacat 1020 ggatacaggt ggtgcatggt tgtcgtcagc tcgtgtcgtg agatgttggg ttaagtcccg 1080 caacgagcgc aacccttatt atcagttgcc agcattaagt tgggcactct ggtgagactg 1140 ccggtgacaa accggaggaa ggtggggatg acgtcaaatc atcatgcccc ttatgacctg 1200 ggctacacac gtgctacaat ggacggtaca acgagttgcg aagtcgtgag gctaagctaa 1260 tctcttaaag ccgttctcag ttcggattgt aggctgcaac tcgcctacat gaagttggaa 1320 tcgctagtaa tcgcggatca gcatgccgcg gtgaatacgt tcccgggcct tgtacacacc 1380 gcccgtcaca ccatgagagt tgtaacaccc aaagccggtg agaaacttcg ggatcagcct 1440 caaggcgatg g 1451

Claims (7)

사포닌을 진세노사이드 Rd, 진세노사이드 F2 또는 Compound K로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 진세노사이드 저분자 화합물로 전환하는 락토바실러스 용인시스 THK-V8 (Lactobacillus yonginsis THK-V8) KACC 16236.Lactobacillus yonginsis THK-V8 (Lactobacillus yonginsis THK-V8) KACC 16236 which converts saponin to at least one ginsenoside low molecular compound selected from the group consisting of ginsenoside Rd, ginsenoside F2 or Compound K. 삭제delete 락토바실러스 용인시스 THK-V8 (Lactobacillus yonginsis THK-V8) KACC 16236 균주를 인삼에 접종하고, 배양하는 단계를 포함하는 발효 인삼의 제조방법.Lactobacillus yonginsis THK-V8 KACC 16236 strain is inoculated into ginseng and cultured. 제3항에 있어서,
상기 인삼이 수삼, 백삼, 홍삼, 산양삼, 산삼 또는 산삼배양근인 발효 인삼의 제조방법.
The method of claim 3,
Wherein the ginseng is ginseng, white ginseng, red ginseng, goat ginseng, wild ginseng or wild ginseng culture root.
제3항 있어서,
상기 배양은 25~40℃에서 1일~30일 동안 발효시키는 단계를 포함하는 발효 인삼의 제조방법.
4. The method of claim 3,
Wherein the culturing comprises fermenting at 25 to 40 DEG C for 1 to 30 days.
제5항에 있어서,
숙성된 배양액을 원심분리하여 취한 상등액을 농축 또는 동결건조하는 단계를 더 포함하는 발효 인삼의 제조방법.
6. The method of claim 5,
Further comprising centrifuging the aged culture broth to concentrate or freeze-dry the supernatant.
락토바실러스 용인시스 THK-V8 (Lactobacillus yonginsis THK-V8) KACC 16236을 이용하여 사포닌을 진세노사이드 Rd, 진세노사이드 F2 또는 Compound K 로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 진세노사이드 저분자 화합물로 전환시키는 방법.
Method of converting saponin into at least one ginsenoside low molecular compound selected from the group consisting of ginsenoside Rd, ginsenoside F2 or Compound K using Lactobacillus yonginsis THK-V8 (KACC 16236) .
KR1020120096417A 2012-08-31 2012-08-31 Novel Lactobacillus yonginsis THK-V8 and method for lowering molecular weight in saponin KR101434740B1 (en)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020120096417A KR101434740B1 (en) 2012-08-31 2012-08-31 Novel Lactobacillus yonginsis THK-V8 and method for lowering molecular weight in saponin

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020120096417A KR101434740B1 (en) 2012-08-31 2012-08-31 Novel Lactobacillus yonginsis THK-V8 and method for lowering molecular weight in saponin

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20140029934A KR20140029934A (en) 2014-03-11
KR101434740B1 true KR101434740B1 (en) 2014-08-29

Family

ID=50642716

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020120096417A KR101434740B1 (en) 2012-08-31 2012-08-31 Novel Lactobacillus yonginsis THK-V8 and method for lowering molecular weight in saponin

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR101434740B1 (en)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20180039539A (en) * 2016-10-10 2018-04-18 경성대학교 산학협력단 Producing Method of Ginseng Saponin

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20060001834A (en) * 2005-10-07 2006-01-06 (주)예당바이오 Preparation method of fermented ginseng or fermented red ginseng using probiotics from kimchi
KR20090109760A (en) * 2008-04-16 2009-10-21 주식회사 엔유씨전자 Red Ginseng Fermented with Lactobacillus fermentum NUC-C1 KCCM10929P and Producing Method thereof
KR20110123311A (en) * 2010-05-07 2011-11-15 주식회사 바이오랜드 A method for preparing fermented ginseng extract and compositions comprising thereof

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20060001834A (en) * 2005-10-07 2006-01-06 (주)예당바이오 Preparation method of fermented ginseng or fermented red ginseng using probiotics from kimchi
KR20090109760A (en) * 2008-04-16 2009-10-21 주식회사 엔유씨전자 Red Ginseng Fermented with Lactobacillus fermentum NUC-C1 KCCM10929P and Producing Method thereof
KR20110123311A (en) * 2010-05-07 2011-11-15 주식회사 바이오랜드 A method for preparing fermented ginseng extract and compositions comprising thereof

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
미생물 기탁과 가용성에 대한 증명서(KACC 16236)(2011.08.19.) *
미생물 기탁과 가용성에 대한 증명서(KACC 16236)(2011.08.19.)*

Also Published As

Publication number Publication date
KR20140029934A (en) 2014-03-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR100997998B1 (en) Korean intestine-derived microorganisms having saponin-biotransforming activity and processes for preparing fermented ginseng using the same
KR100752154B1 (en) lactic-acid fermented ginseng composite and their manufacturing method
KR101832387B1 (en) Method for producing fermented korean cultivated wild ginseng with enhanced specific ginsenoside content using lactic acid bacteria
KR100856790B1 (en) Methods for Preparing Fermented Ginseng or Red Ginseng
KR101671435B1 (en) Strain having ginsenoside bioconversion activity and manufacturing method of fermented red ginseng extract using the same
KR101017378B1 (en) Manufacturing method of fermentative ginseng, fermentative red ginseng and novel microorganism bacillus subtilis from fermented soybeans thereof
KR101343410B1 (en) Novel Lactobacillus plantarum CRNB-22 (KCTC 11931 BP) strain capable of fermenting ginseng and method of transforming saponin using thereof
KR101285681B1 (en) Saponin-biotransforming activity and processes for preparing fermented ginseng using the same
KR20090083505A (en) A method for preparing fermented ginseng of ginseng extract using lactobacillus fermentum bljh101
KR101647631B1 (en) Composition for ginsenoside bioconversion comprising Lactobacillus plantarum WIKIM18
KR101980450B1 (en) Composition of active wild-cultivated ginseng having increased ginsenoside Rd and compound K, chlorgenic acid and quercetin, and preparation method thereof
KR20130107940A (en) Method of producing fermented red ginseng
KR102258788B1 (en) Novel Aspergillus niger C2-2 isolated from Nu-ruk producing ginsenoside compound K biotransformation enzyme and use thereof
KR101434740B1 (en) Novel Lactobacillus yonginsis THK-V8 and method for lowering molecular weight in saponin
KR101898513B1 (en) Novel Bacillus subtilis 4-1-1 and method for fermented ginseng using the same
JP6450878B1 (en) Method for producing fermented product
CN113181086B (en) Application of saussurea involucrata fermentation product in inhibiting tyrosinase activity and melanin generation
KR101771488B1 (en) Novel Bacillus coagulans NRR1207, fermented ginseng using the same and probiotic composition containing the same
KR102248398B1 (en) Lactobacillus pentosus NGI01 with beta-glucosidase and alpha-rhamnosidase activities and use thereof
KR20190069794A (en) Lactobacillus plantarum MBE/L2990 strain having excellent alpha-rhamnosidase activity and bioconversion activity from ginsenoside Re and Rb1 to ginsenoside Rg1 and Rg5
KR101343434B1 (en) Novel Enterococcus faecalis CRNB-A3 (KCTC 11930 BP) strain capable of fermenting ginseng and method of transforming saponin using thereof
KR101962294B1 (en) Novel Lactobacillus plantarum K105 with Antioxidant and GABA-producing ability, composition comprising a fermented product of Dendropanax Morbifera extract using the same and manufacturing method therof
Lee et al. Biotransformation of ginsenosides by eoyukjang-derived lactic acid bacteria in mountain-cultivated ginseng
KR101540634B1 (en) Ralstonia pickettii LSA71 and a Method for bioconverting ginsenoside Rb1 to ginsenoside F2 using the strain
KR101549633B1 (en) Novel Lactobacillus brevis K203 and gamma amino butyric acid(GABA) production with high yield using the same

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20170627

Year of fee payment: 4

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20190625

Year of fee payment: 6