KR101429522B1

KR101429522B1 - 태반유래 세포외기질의 추출방법 및 그 추출물을 이용한 피부 치유용 지지체

Info

Publication number: KR101429522B1
Application number: KR1020110119025A
Authority: KR
Inventors: 조용우; 윤현수; 김재동; 최지숙
Original assignee: 한양대학교 산학협력단; 한양대학교 에리카산학협력단
Priority date: 2011-11-15
Filing date: 2011-11-15
Publication date: 2014-09-25
Also published as: KR20130053609A

Abstract

태반유래 세포외기질의 추출방법 및 그 추출물을 이용한 피부 치유용 지지체가 개시된다. 본 발명의 태반유래 세포외기질의 추출방법은, 인체 또는 동물체로부터 태반조직을 채취하는 단계; 채취된 태반조직을 분쇄하는 단계; 분쇄된 태반조직을 원심분리하여 혈액성분을 포함하는 상등액을 분리하고 세포외기질을 포함하는 침전물을 수득하는 단계; 및 세포외기질을 포함하는 침전물을 계면활성제로 처리하여 세포성분을 제거하는 단계;를 포함한다. 이에 의하여, 추출공정에서 비용, 시간을 절감할 수 있고, 그 추출물은 양막과 태반을 분리하지 않은 전체 조직을 이용하므로 추출물의 공급량을 확보할 수 있으며, 이를 이용해 제조된 피부 치유용 지지체는 생체적합성을 가질 뿐 아니라 세포성분이 제외되어 있으므로 면역반응을 최소화할 수 있고, 이에 포함된 성장인자로 인하여 피부 치유와 재생 효과를 극대화할 수 있다.

Description

태반유래 세포외기질의 추출방법 및 그 추출물을 이용한 피부 치유용 지지체{METHOD FOR EXTRACTING EXTRACELLUAR MATRIX FROM PLACENTA AND SCAFFOLD FOR SKIN WOUND TREATMENT USING MATERIAL EXTRACTED BY THE SAME}

본 발명의 태반유래 물질의 추출방법 및 그 추출물을 이용한 피부치유용 지지체에 관한 것으로, 보다 상세하게는 인체 또는 동물의 태반 물질 중 혈액성분을 제외한 양막을 포함한 세포외기질을 포함하는 물질을 추출하고, 그 추출물을 이용하여 생체적합성이 우수하고, 면역반응을 최소화할 수 있는 피부 치유용 지지체에 관한 것이다.

피부란 인체를 외부 자극으로부터 보호하며 수분의 손실을 막아주고 체온조절, 세균침입 방지 등 중요한 생명보호기능을 수행하는 장기의 하나이다. 따라서 화상, 창상 등 각종 외상에 의해 손상되면 수분손실, 외부로부터의 세균 감염 및 이차적인 기능장애 등 부작용들을 초래할 수 있으므로, 무엇보다 신속한 치료가 중요하며, 치료와 회복에 있어서의 부작용을 최소화하기 위해서 적절한 드레싱재를 이용할 필요가 있다.

외상에 의한 피부치유에 관여하는 주요 인자로는 습윤환경, 감염, 이물과 괴사조직, 온도, 산소농도, pH 등을 들 수 있다. 따라서 이상적인 드레싱재 조건은 상처와의 접촉면에서 적당한 습기의 유지, 삼출물의 흡수, 상처에 대한 부착과 제거의 용이성, 외부와의 통기성, 단열성, 박테리아의 침입에 대한 방어, 인체에 대한 무독성, 우수한 기계적 물성, 경제성 등을 들 수 있다.

현재 종래의 거즈형 드레싱제의 문제점을 개선한 다양한 폐쇄성 드레싱재가 개발되어 사용되고 있다. 예를 들면, 생분해성 고분자인 폴리에스터계, 폴리우레탄계과 같은 합성 고분자, 콜라겐, 키토산과 같은 생체 고분자를 들 수 있다. 그러나 합성 고분자는 유독성의 유기용매에 녹여 사용하므로 인체에 독성을 나타낼 수 있을 뿐 아니라, 생분해 과정에서 2차적인 독성물질을 발생시킬 수 있다.

또한, 이와 같은 문제점을 해결한 생체고분자로 이루어진 진피대체물은 환부에 적용하여 높은 재생능력을 나타낼 수 있으나, 동물의 장기로부터 추출, 정제하는 과정을 거치는 것이므로 이종에 대한 거부반응을 일으킬 수 있고, 인간의 사체로부터 추출하는 경우에는 원료공급에 여러 문제가 발생할 수 있다. 상기 진피대체물과 관련한 기술은 국내 출원공개공보 제2000-0013701호, 제2000-0007983호 등을 참조할 수 있다.

따라서 상술한 문제점을 야기하지 않는 인체의 태반조직으로부터 분리된 양막 또는 태반 추출물을 이용한 드레싱재를 도입하기에 이르렀다. 양막은 피부 이식 및 안구 표면 질환을 포함하는 다양한 외과적 처치에 사용되어온 것으로, 양막낭, 태반, 태줄 및 이에 함유되는 세포 및 체액으로 정의되며, 인간 출산 조직으로부터 얻어진다. 이러한 물질은 우수한 상처 보호작용을 제공하고, 통증을 줄일 수 있으며, 상처 탈수를 감소시킬 수 있으며, 항염증 및 항균 효과를 제공한다. 양막은 태반막의 최내 층으로, 일반적으로 두께가 20~500㎛인 반투명 박막이며, 콜라겐 I, 콜라겐 III, 콜라겐 IV, 라미닌(lamini) 및 피브로넥틴(fibronectin)으로 이루어진 막에 부착된 외배엽 유래 원주 상피 세포의 단일 층을 포함하고, 이는 결합 조직 층에 부착된다.

인간 양막 조직을 처리하여 물리적 특성을 증진시키고 용이한 사용을 위해 저장될 수 있는 형태의 물질을 제공하기 위한 여러 공정이 알려져 있다. 이에 대한 내용은 미국 특허 제4,361,552호, "Cross-linking of Human Amniotic Membrane by Gluteraldehyde"(Opthalmic Research, 2004, 36:71-77) 등을 참조할 수 있다.

그러나 양막의 경우 태반에서 얻을 수 있는 양에 한계가 있고, 핸들링이 어려우며, 특히, 그 형태를 변형할 수 없다. 따라서 양막의 추출물을 액체 상태로 상처에 바르는 형태로 사용되고 있으며, 그 사용 범위도 한정되어 있다. 또한, 여러 가지 외상에 의한 상처를 치료하는데 사용하기 위한 개선된 특성을 갖는 물질을 제조하기 위해 인간 양막 물질을 처리하는 방법의 개선이 여전히 필요한 실정이다.

본 발명의 목적은 태반유래 물질을 이용한 피부 치유용 지지체를 제조함에 있어서, 세포성분을 제외한 양막과 태반을 분리하지 않은 세포외기질을 추출하여 사용함으로써 생체적합성이 높을 뿐 아니라, 태반 내 성장인자를 그대로 포함함하여 적용 환부의 세포의 이동 및 재생에 효과적인 피부 치유용 물질 및 지지체를 제공하는 데 있다.

상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 태반유래 세포외기질의 추출방법은, 인체 또는 동물체로부터 태반조직을 채취하는 단계(단계 a); 상기 채취된 태반조직을 분쇄하는 단계(단계 b); 상기 분쇄된 태반조직을 원심분리하여 혈액성분을 포함하는 상등액을 분리하고 세포외기질을 포함하는 침전물을 수득하는 단계(단계 c); 및 상기 세포외기질을 포함하는 침전물을 계면활성제로 처리하여 세포성분을 제거하는 단계(단계 d);를 포함한다.

상기 단계 b는, 상기 태반조직과 증류수를 혼합하여 분쇄하며, 태반조직:증류수 = 1:1~1:2의 부피비로 혼합할 수 있다.

상기 단계 c의 원심분리는, 4~10℃의 온도에서 수행할 수 있다.

상기 단계 c 이후, 상기 수득된 침전물을 증류수로 세척하여 잔존하는 혈액성분을 제거하는 단계를 더 포함할 수 있다.

상기 계면활성제는, SDS(Sodium Dodecyl Sulfate) 일 수 있다.

상기 단계 d는, 4~25℃에서 10~30 분간 처리할 수 있다.

상기 단계 d 이후, 상기 세포성분이 제거된 세포외기질을 증류수로 세척하는 단계를 더 포함할 수 있다.

상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 태반유래 세포외기질 추출물은, 인체 또는 동물체의 태반조직에서 유래하고, 세포성분이 제거되며, 태반조직 유래 성장인자를 함유하는, 세포외기질을 포함하는 침전물이며, 상기 세포외기질을 포함하는 침전물은 상기 태반조직의 분쇄물을 원심분리하여 혈액성분이 포함된 상등액을 분리, 제거하여 수득된 것일 수 있다.

상기 태반유래 세포외기질 추출물은, 타조직의 성장인자 및 기능성 입자 중 적어도 어느 하나를 더 포함할 수 있다.

상기 태반유래 세포외기질 추출물은, 연고제로 이용될 수 있다.

상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 태반유래 세포외기질 추출물을 이용한 피부 치유용 지지체의 제조방법은, 상기 방법으로 추출된 태반유래 세포외기질 추출물 및 소정의 몰드가 형성된 성형틀을 준비하는 단계; 상기 성형틀에 상기 태반유래 세포외기질 추출물을 넣고 동결건조시켜 성형하는 단계; 및 상기 동결건조된 태반유래 세포외기질 추출물을 성형틀로부터 분리하는 단계;를 포함한다.

상기 몰드는, 시트형, 필름형, 파이프형, 환약형, 육면체형 및 불규칙형 중 어느 하나의 형태를 갖는 피부 치유용 지지체의 형태에 부합하는 형태로 이루어질 수 있다.

상기 태반유래 세포외기질 추출물은, 성형 전 타조직에서 분리한 성장인자 및 기능성 입자 중 적어도 어느 하나를 더 첨가하여 준비할 수 있다.

상기 단계들을 거친 지지체에는, 다공성 구조에 줄기세포를 담지하는 단계를 더 포함할 수 있다.

상기 줄기세포 혼합하는 단계 이후, 체외 배양하는 단계를 더 포함할 수 있다.

상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 태반유래 세포외기질 추출물을 이용한 피부 치유용 지지체는, 태반유래 세포외기질 추출물이 동결건조되어 소정의 형상으로 성형된 것이며, 상기 태반유래 세포외기질 추출물은, 인체 또는 동물체의 태반조직에서 유래하고, 세포성분이 제거되며, 태반조직 유래 성장인자를 함유하는, 세포외기질을 포함하는 침전물이고, 상기 세포외기질을 포함하는 침전물은 상기 태반조직의 분쇄물을 원심분리하여 혈액성분이 포함된 상등액을 분리, 제거하여 수득된 것일 수 있다.

상기 피부 치유용 지지체는, 타조직의 성장인자, 기능성 입자 및 줄기세포 중 적어도 어느 하나를 함유할 수 있다.

상기 피부 치유용 지지체는, 직경 10~100㎛ 범위의 포어가 다수 형성된 미세 다공성 구조일 수 있다.

상기 피부 치유용 지지체는, 시트형, 필름형, 파이프형, 환약형, 육면체형 및 불규칙형 중 어느 하나일 수 있다.

본 발명의 태반유래 세포외기질의 추출방법은 물리적인 간단한 방법으로 수행할 수 있어 추출공정에서의 비용 및 시간을 절감할 수 있을 뿐 아니라, 그 추출물은 양막과 태반을 분리하지 않은 전체 조직을 이용하므로 추출물의 공급량을 확보할 수 있으며, 이를 이용해 제조된 피부 치유용 지지체는 생체적합성을 가질 뿐 아니라 세포성분이 제외되어 있으므로 면역반응을 최소화할 수 있고, 이에 포함된 성장인자로 인하여 피부 치유와 재생 효과를 극대화할 수 있다.

도 1은 본 발명의 태반유래 세포외기질의 추출방법을 순차적으로 나타낸 흐름도이다.
도 2는 본 발명의 태반유래 세포외기질을 이용한 피부 치유용 지지체를 제조하는 방법에 대한 개략적인 공정도이다.
도 3은 실시예 1에 따라 분리된 인체 태반조직 세포외기질의 사진이다.
도 4는 실시예 2에 따라 제조된 피부 치유용 지지체의 사진(a) 및 표면 SEM 이미지(b)이다.
도 5는 상기 실시예 1에 따라 분리된 인체 태반유래 세포외기질의 성분을 분석한 그래프이다.
도 6은 실시예 1에 따라 분리된 인체 태반유래 세포외기질에 함유된 성장인자를 분석하여 원료인 인체 태반과 비교한 그래프이다.
도 7은 지지체 내에서 시간의 경과에 따른 지방유래 줄기세포의 세포수의 변화를 나타낸 그래프이다.
도 8은 지지체 내에서 시간 경과에 따른 지방유래 줄기세포의 증식모습을 나타낸 SEM이미지이다.
도 9는 실험예 4에 따른 쥐의 전층 피부손상의 시간경과에 따른 환부 면적의 변화를 나타낸 그래프이다.
도 10은 실험예 4에 따른 쥐의 전층 피부손상의 시간경과에 따른 환부 면적의 변화를 촬영한 사진이다.
도 11은 실험예 4에서의 환부 조직 절편의 측면 현미경 사진이다.
도 12는 실험예 4에서의 환부 조직 절편의 표면 현미경 사진이다.
도 13은 실험예 4에서 손상조직의 신생혈관 생성 정도를 살펴보기 위해 형광물질을 처리한 사진이다.

도 1을 참조하여 본 발명의 태반유래 세포외기질의 추출방법을 설명하도록 한다.

먼저, 출산 후의 인체 또는 동물체에서 태반조직을 채취하여 준비한다(단계 a).

이때, 채취한 태반조직을 제공하는 인체 또는 동물체는 특정한 질병을 가지고 있지 않은 건강한 개체로 선택하며, 인체의 경우 제공자의 동의를 요하는 것은 당연하다. 여기서, 상기 동물체는 태반을 갖는 포유동물이라면 널리 적용할 수 있으나, 더욱 바람직하게는, 돼지, 소 등의 동물체의 태반을 적용할 수 있다. 본 발명의 물질은 세포외기질을 이용하므로 면역작용에 의한 거부반응이 최소화될 수 있으므로 다양한 동물체로부터 태반조직을 제공받을 수 있는 이점이 있다.

다음으로, 상기 준비된 태반조직을 분쇄한다(단계 b).

상기 분쇄는 상기 태반조직을 증류수와 혼합한 상태로 수행하며, 이때, 태반조직과 증류수 혼합물은 태반조직:증류수 = 1:1~1:2의 부피비로 혼합하여 준비하는 것이 바람직하다.

이후, 상기 태반조직과 증류수 혼합물을 원심분리한다(단계 c).

상기 원심분리는 4~10℃의 온도에서 수행하는 것이 바람직하다. 이에 따라 원심분리된 혼합물은 혈액성분이 포함된 상등액과 세포외기질이 포함된 젤 상태의 침전물로 분리된다. 여기서, 상기 혈액성분이 포함된 상등액은 제거하고 침전물을 회수한다.

상기 회수된 침전물은 증류수로 세척하여 잔존하는 혈액성분을 제거한다.

마지막으로, 상기 분리된 세포외기질이 포함된 침전물을 탈세포화한다(단계 d).

상기 탈세포화는 계면활성제인 SDS(Sodium Dodecyl Sulfate)를 가하여 4~25 ℃에서 10~30 분간 처리하는 방법으로 수행할 수 있다.

이와 같이 탈세포화된 세포외기질은 증류수를 가하여 세척함으로써 잔존 물질을 완전히 제거할 수 있다.

이에 따라, 상기 침전물에 포함되어 있던 세포성분 즉, 인체에 적용시 면역반응을 일으킬 수 있는 면역성분이 제거될 수 있다. 이때, 상기 탈세포화 처리는 단시간 내에 처리하여 세포외기질의 구조에 영향을 미치는 것을 최소화하는 것이 바람직하다.

이와 같이 탈세포화된 세포외기질은 경우에 따라 원료 외 타조직에서 분리된 성장인자(Bone Morphogenic Protein (BMP)-4, Nerve Growth Factor (NGF), Insulin-like Growth Factor (IGF)-1 등) 또는 항균 작용을 하는 은(Ag) 나노입자 등의 기능성 입자를 첨가할 수 있다.

이상의 방법에 의해 젤 상태의 인체 또는 동물체의 태반유래 세포외기질을 분리해 낼 수 있다. 상기 분리된 태반유래 세포외기질은, 양막과 태반을 분리하지 않은 전체 조직을 포함하는 것으로서, 채취된 원료인 전체 태반조직에서 약 50% 정도의 양을 차지하여 수율이 매우 높다.

본 발명은 상기 추출방법에 따라 분리된 태반유래 세포외기질을 제공한다.

상기 태반유래 세포외기질은 젤 상태로 이루어져 있으므로, 피부의 환부에 직접 도포할 수 있는 연고제로 이용할 수 있다. 경우에 따라, 원료에 포함되지 않은 타조직에서 유래한 성장인자 즉, 생체활성물질을 혼합하여 연고제의 기능성을 높일 수 있다.

상기 태반유래 세포외기질은 콜라겐, 엘라스틴, 글라이코사미노글라이칸, 라미닌 등의 유효한 단백질의 복합체이다. 따라서 기존 단일 성분으로 구성된 피부 치료용 지지체에 비해 월등한 생체 내 환경을 제공할 수 있다. 또한, 세포와의 친화력이 높고, TGF-beta, basic FGF, EGF, VEGF와 같은 다양한 태반유래 성장인자를 함유하여 상처 치유 및 재생 시간이 단축될 수 있다.

본 발명의 태반유래 세포외기질을 이용한 피부 치유용 지지체를 제조하는 방법에 대한 개략적인 공정을 도 2에 나타내었다.

도 2을 참조하여 본 발명의 태반유래 세포외기질을 이용한 피부 치유용 지지체를 제조하는 방법에 대해 설명하도록 한다.

먼저, 상술한 방법에 따라 분리한 인체 또는 동물체의 태반유래 세포외기질 및 성형틀을 준비한다.

본 발명의 피부 치유용 지지체는 사용 형태 즉, 적용할 환부의 범위 및 위치에 따라 다양한 형태가 가능하다. 여기서, 환부는 피부뿐 아니라, 피부 내부에 불규칙한 형태로 발생한 손상부위일 수 있다. 따라서 상기 성형틀은 제조할 피부 치유용 지지체의 형태에 따라 다양한 몰드를 구비한 것으로 준비할 수 있다. 예를 들면, 시트나 필름형, 파이프 형, 환약형, 육면체형, 불규칙형 등으로 제작할 수 있다.

이때, 상기 태반유래 세포외기질은 경우에 따라, 원료 외 물질, 즉, 타조직에서 분리한 성장인자, 기능성 입자 등을 첨가하여 준비할 수 있다.

다음으로, 상기 성형틀에 상기 준비된 태반유래 세포외기질을 넣고 동결건조시켜 피부 치유용 지지체를 성형하고, 성형틀을 분리한다.

이에 따라 제조된 피부 치유용 지지체는 직경 10~100㎛ 범위의 포어가 다수 형성된 미세 다공성 구조를 가지며, 이와 같은 다공구조로 인하여 고투습, 고흡수의 기능을 발휘하면서 외부 박테리아의 침입을 막을 수 있다. 이에 따라, 경한 창상에서부터 삼출액이 다량 발생하는 욕창, 화상 등에 이르기까지 다양한 손상부위에 적용할 수 있다.

경우에 따라, 상기 미세 다공구조에 줄기세포를 담지하여 피부 재생효과를 증진시킬 수 있다. 나아가, 줄기세포가 담지된 지지체는 일정기간 체외 배양한 형태로 손상조직에 적용함으로써 피부조직의 재생을 극대화시킬 수 있다.

본 발명의 상기 제조방법에 따라 제조된 태반유래 세포외기질을 이용한 피부 치유용 지지체를 제공한다.

이하, 바람직한 실시예를 들어 설명하도록 한다.

산모로부터 인체 태반조직을 채취하고, 상기 태반조직과 증류수를 1:1의 부피비로 혼합하여 분쇄하였다. 이후, 4℃에서, 4000rpm으로 5분간 원심분리하여 세포외기질이 포함된 침전물과 혈액성분이 포함된 상등액을 분리하고, 상등액을 제거하였다.

다음으로, 회수된 침전물에 증류수를 가하여 세척하여 잔존하는 혈액성분을 제거하고, SDS를 가하여 4℃에서 10분간 처리한 후 마지막으로 증류수로 세척하여 인체 태반조직 세포외기질을 분리하였다.

실시예 1에 따라 분리된 인체 태반조직 세포외기질의 사진을 도 3에 나타내었다.

다양한 형태의 몰드를 갖는 성형틀을 준비하고, 여기에 상기 실시예 1의 방법으로 제조한 인체 태반조직 유래 세포외기질을 넣어 성형하고, -90℃에서 48시간 이상 동결건조기(OPR-FDU-7003, 오페론 사)를 사용하여 동결 건조한 후, 성형틀을 분리하여 피부 치유용 지지체를 제작하였다.

실시예 2에 따라 제조된 피부 치유용 지지체의 사진(a) 및 표면 SEM 이미지(b)를 도 4에 나타내었다.

도 4에 따르면, 실시예 2에 따라 제조된 피부 치유용 지지체는 세포의 유입에 영향을 주는 미세한 다공성의 구조인 것을 확인할 수 있었다. 상세하게는, 하나의 포어(pore) 크기 약 61.21㎛이며, 99.54%의 다공성을 나타내었다. 또한, 52.60 kPa의 인장강도(tensile strength)를 나타내어 굴곡성(flexiability)이 우수하여 불규칙한 형태의 손상조직에 용이하게 적용할 수 있는 특성을 갖는다.

실험예 1: 태반유래 세포외기질 추출물의 성분분석

상기 실시예 1에 따라 분리된 인체 태반유래 세포외기질(ECM, Extracellular Matrix) 물질의 성분을 분석하였다. 분석결과를 하기 표 1과 도 5에 그래프로 나타내었다.

상기 표 1 및 도 5에 따르면, 본 발명의 실시예 1에 따라 분리된 세포외기질의 주요성분은 콜라겐, 엘라스틴, 글라이코사미노글라이칸으로 나타났다.

실험예 2: 태반유래 세포외기질 추출물에 함유된 성장인자 분석

실시예 1에 따라 분리된 인체 태반유래 세포외기질에 함유된 성장인자를 분석하여, 원료인 인체 태반에 포함되어 있는 성장인자의 비율과 비교하였다.

그 분석결과를 하기 표 2와 도 6에 나타내었다.

상기 표 2 및 도 6에 따르면, 본 발명의 세포외기질 추출물은 원료인 태반에 포함되어 있는 성장인자의 상당량을 그대로 포함하고 있었다. 특히, 피부 재생에 관여하는 TGF-β1(transforming growth factor-β1), bFGF(basic fibroblast growth factor), EGF(epidermal growth factor), PDGF-BB(platelet-derived growth factor-BB), IGF-1(insulin-like growth factor-1), VEGF(vascular endothelial growth factor)가 다량 함유된 것을 확인할 수 있었다.

따라서 이를 이용한 연고제 또는 성형된 지지체를 손상된 피부 조직에 사용하였을 경우, 상기 여러 종류의 성장인자가 방출되어 피부재생을 극대화시킬 수 있음을 간접적으로 확인할 수 있다.

실험예 3: 세포실험 _ 태반유래 세포외기질을 이용한 피부 치유용 지지체의 세포적합성 및 부착, 증식력 분석

상기 실시예 2에 따라 제조된 피부 치유용 지지체에 인간 지방조직에서 추출한 지방유래 줄기세포를 주입하여 배양하였다. 이때, 배양액은 DMEM 배지 + 10% FBS + 1% 페니실린/스트렙토마이신(penicillin/streptomycin)으로 이루어진 것을 사용하였고, 상기 지지체에 지방유래 줄기세포가 잘 분산된 배양액을 흡수시킨 다음 7일간 배양기(37℃, CO₂ 5%)에서 배양하였다. 이와 같이 배양을 하면서 지지체의 다공성 구조의 포어 내에서 줄기세포가 증식하는 것을 관찰하였다.

시간의 경과에 따른 지방유래 줄기세포의 세포수의 변화 그래프를 도 7에 나타내었고, 시간 경과에 따른 지방유래 줄기세포의 증식모습을 SEM이미지로 도 8에 나타내었다. 여기서, 도 8의 A, B, C 사진은 지방유래 줄기세포의 증식 결과를 명확히 관찰하기 위하여 형광 염색(분석시 약명: Live and Dead assay kit, 제조회사: Invitrogen, 녹색형광: calcein AM (live cell image), 적색형광: ethidium homodimer-1 (dead cell image))하였다.

도 7 및 도 8에 따르면, 본 발명의 태반유래 세포외기질을 이용한 피부 치유용 지지체에서 줄기세포가 시간의 경과에 따라 배양이 성공적으로 이루어져 7일 후에는 지지체 조직의 포어 내에서 줄기세포의 밀도가 매우 높아진 것을 확인할 수 있었다. 이에 따라, 본 발명의 피부 치유용 지지체는 세포적합성 및 부착, 증식력이 우수한 것을 확인할 수 있었다.

실험예 4: 동물실험 _ 태반유래 세포외기질을 이용한 피부 치유용 지지체의 치유효능 분석

전층 창상 및 화상 피부손상 쥐(성별: 암컷, 모델: Sprague-Dawley rat, 무게: 80-120g, 공급업체: 하나바이오) 모델을 만들어 태반유래 세포외기질을 이용한 피부 치유용 지지체의 피부 치유, 재생 효능을 알아보았다. 상세하게는, 쥐의 피부에 전층 피부손상을 유발하고, 여기에 실시예 2에 따라 제조된 두께 1~2mm의 시트형 피부 치유용 지지체를 부착한 것을 실험군으로 하여 4주간 환부의 변화를 관찰하고, 환부에 아무런 처리도 하지 않은 대조군과 비교 분석하였다.

실험예 4에 따른 쥐의 전층 피부손상에 대한 시간경과에 따른 환부 면적의 변화에 대한 그래프를 도 9에 나타내었으며, 이에 따른, 환부의 사진을 도 10에 나타내었다.

도 9 및 도 10에 따르면, 대조군에서는 초기 환부의 수축현상이 심하게 나타나 4주 후에는 세로로 길게 상처가 남은 것을 확인할 수 있었다. 반면에, 실험군에서는 초기 환부의 수축이 억제되고, 상처를 남기지 않고 환부가 치유되는 것을 확인할 수 있었다.

또한, 상기 대조군과 실험군의 피부재생(skin regeneration) 정도를 확인하기 위하여 환부 조직 절편을 H&E염색법(Haematoxylin-Erosion staining)으로 염색하여 피부조직을 현미경으로 관찰하였다. 이때, 피부조직의 측면의 모습을 도 11에 나타내고, 피부조직 표면의 모습을 도 12에 나타내었다.

도 11 및 도 12에 따르면, 대조군에서는 상처부위의 수축이 심하게 일어나고, 진피층이 제대로 형성되지 않은 것을 확인할 수 있다. 이에 반해, 실험군에서는 환부의 수축이 억제되고, 진피층의 재생이 잘 이루어진 것을 확인할 수 있다.

또한, 환부에 처리된 본 발명의 피부 치유용 지지체는 시간의 경과에 따라 서서히 분해되어 28일 후에는 거의 분해된 것을 확인할 수 있었다. 이는 빠른 시간 내에 쥐의 피부 세포가 상기 지지체의 내로 유입되어 조직의 재생을 유도한 것으로 볼 수 있다.

한편, 본 발명의 태반유래 세포외기질을 이용한 피부 치유용 지지체에 함유되는 태반유래 혈관내피 성장인자인 VGEF에 의한 손상조직에 신생혈관이 생성촉진 정도를 알아보기 위하여 혈관내피세포의 CD31 지표를 확인할 수 있는 형광물질을 채취한 조직의 단면에 처리하여 형광현미경을 통해 형광 사진을 촬영하였다. 이에 따른 신생혈관 생성 모습을 나타낸 조직절편의 이미지를 도 13에 나타내었다.

도 13에 따르면, 14일이 경과한 후, 실험군에 확연하게 신생혈관이 생성된 것을 확인할 수 있었다.

이상, 본 발명의 바람직한 실시예를 들어 상세하게 설명하였으나, 본 발명은 상기 실시예에 한정되지 않으며, 본 발명의 기술적 사상의 범위 내에서 당 분야에 통상의 지식을 가진 자에 의하여 여러 가지 변형이 가능하다.

Claims

인체 또는 동물체로부터 채취된 태반조직을 분쇄하는 단계(단계 a);
상기 분쇄된 태반조직을 원심분리하여 혈액성분을 포함하는 상등액을 분리하고 세포외기질을 포함하는 침전물을 수득하는 단계(단계 b); 및
상기 세포외기질을 포함하는 침전물을 계면활성제로 처리하여 세포성분을 제거하는 단계(단계 c);를 포함하는 태반유래 세포외기질의 추출방법.
청구항 1에 있어서,
상기 단계 a는,
상기 태반조직과 증류수를 혼합하여 분쇄하며, 태반조직:증류수 = 1:1 ~ 1:2의 부피비로 혼합하는 것을 특징으로 하는 태반유래 세포외기질의 추출방법.
청구항 1에 있어서,
상기 단계 b의 원심분리는,
4~10℃의 온도에서 수행하는 것을 특징으로 하는 태반유래 세포외기질의 추출방법.
청구항 1에 있어서,
상기 단계 b 이후,
상기 수득된 침전물을 증류수로 세척하여 잔존하는 혈액성분을 제거하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 태반유래 세포외기질의 추출방법.
청구항 1에 있어서,
상기 계면활성제는,
SDS(Sodium Dodecyl Sulfate) 인 것을 특징으로 하는 태반유래 세포외기질의 추출방법.
청구항 1에 있어서,
상기 단계 c는,
4~25℃에서 10~30분간 처리하는 것을 특징으로 하는 태반유래 세포외기질의 추출방법.
청구항 1에 있어서,
상기 단계 c 이후,
상기 세포성분이 제거된 세포외기질을 증류수로 세척하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 태반유래 세포외기질의 추출방법.
인체 또는 동물체의 태반조직에서 유래하고, 세포성분이 제거되며, 태반조직 유래 성장인자를 함유하는, 세포외기질을 포함하는 침전물이며,
상기 세포외기질을 포함하는 침전물은 상기 태반조직의 분쇄물을 원심분리하여 혈액성분이 포함된 상등액을 분리, 제거하여 수득된 것이고,
상기 태반조직 유래 성장인자는 형질전환 성장인자-베타, 섬유아세포 성장인자, 상피세포 성장인자, 혈관 내피세포 성장인자 또는 혈소판 유래 성장인자-BB인 것을 특징으로 하는 태반유래 세포외기질 추출물.
청구항 8에 있어서,
상기 태반유래 세포외기질 추출물은,
타조직의 성장인자 및 기능성 입자 중 적어도 어느 하나를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 태반유래 세포외기질 추출물.
청구항 8에 있어서,
상기 태반유래 세포외기질 추출물은,
연고제로 이용되는 것을 특징으로 하는 태반유래 세포외기질 추출물.
청구항 1의 방법으로 추출된 태반유래 세포외기질 추출물 및 소정의 몰드가 형성된 성형틀을 준비하는 단계;
상기 성형틀에 상기 태반유래 세포외기질 추출물을 넣고 동결건조시켜 성형하는 단계; 및
상기 동결건조된 태반유래 세포외기질 추출물을 성형틀로부터 분리하는 단계;를 포함하고,
상기 태반유래 세포외기질 추출물은,
인체 또는 동물체로부터 채취된 태반조직을 분쇄하는 단계;
상기 분쇄된 태반조직을 원심분리하여 혈액성분을 포함하는 상등액을 분리하고 세포외기질을 포함하는 침전물을 수득하는 단계; 및
상기 세포외기질을 포함하는 침전물을 계면활성제로 처리하여 세포성분을 제거하는 단계;로 추출되는 것을 특징으로 하는 태반유래 세포외기질 추출물을 이용한 피부 상처 치유용 지지체의 제조방법.
청구항 11에 있어서,
상기 몰드는,
시트형, 필름형, 파이프형, 환약형, 육면체형 및 불규칙형 중 어느 하나의 형태를 갖는 피부 치유용 지지체의 형태에 부합하는 형태로 이루어진 것을 특징으로 하는 태반유래 세포외기질 추출물을 이용한 피부 상처 치유용 지지체의 제조방법.
청구항 11에 있어서,
상기 태반유래 세포외기질 추출물은,
성형 전 타조직에서 분리한 성장인자 및 기능성 입자 중 적어도 어느 하나를 더 첨가하여 준비하는 것을 특징으로 하는 태반유래 세포외기질 추출물을 이용한 피부 상처 치유용 지지체의 제조방법.
청구항 11에 있어서,
상기 단계들을 거친 지지체의,
다공성 구조에 줄기세포를 담지하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 태반유래 세포외기질 추출물을 이용한 피부 상처 치유용 지지체의 제조방법.
청구항 14에 있어서,
상기 줄기세포 혼합하는 단계 이후,
체외 배양하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 태반유래 세포외기질 추출물을 이용한 피부 상처 치유용 지지체의 제조방법.
태반유래 세포외기질 추출물이 동결건조되어 소정의 형상으로 성형된 것이며,
상기 태반유래 세포외기질 추출물은, 인체 또는 동물체의 태반조직에서 유래하고, 세포성분이 제거되며, 태반조직 유래 성장인자를 함유하는, 세포외기질을 포함하는 침전물이고,
상기 세포외기질을 포함하는 침전물은 상기 태반조직의 분쇄물을 원심분리하여 혈액성분이 포함된 상등액을 분리, 제거하여 수득된 것을 특징으로 하는 태반유래 세포외기질 추출물을 이용한 피부 상처 치유용 지지체.
청구항 16에 있어서,
상기 피부 상처 치유용 지지체는,
타조직의 성장인자, 기능성 입자 및 줄기세포 중 적어도 어느 하나를 함유하는 것을 특징으로 하는 태반유래 세포외기질 추출물을 이용한 피부 상처 치유용 지지체.
청구항 16에 있어서,
상기 피부 상처 치유용 지지체는,
직경 10~100㎛ 범위의 포어가 다수 형성된 미세 다공성 구조인 것을 특징으로 하는 태반유래 세포외기질 추출물을 이용한 피부 상처 치유용 지지체.
청구항 16에 있어서,
상기 피부 상처 치유용 지지체는,
시트형, 필름형, 파이프형, 환약형, 육면체형 및 불규칙형 중 어느 하나인 것을 특징으로 하는 태반유래 세포외기질 추출물을 이용한 피부 상처 치유용 지지체.