KR101418619B1

KR101418619B1 - 단백질 키나아제 억제제로서 유용한 피라졸로(1,5-ａ)(1,3,5)트리아진 및 피라졸로(1,5-ａ)피리미딘 유도체

Info

Publication number: KR101418619B1
Application number: KR1020097005501A
Authority: KR
Inventors: 샤오송 추; 제 니에; 카린 엘. 페레타; 필립 유진 에릭손
Original assignee: 폴라리스 그룹
Priority date: 2006-09-18
Filing date: 2007-09-18
Publication date: 2014-07-14
Also published as: TW200837065A; US20080070893A1; CN101522683A; TWI472530B; CN101522683B; EP2064214B1; KR20090083889A; CA2663791C; HK1135688A1; US20090247501A1; US7517882B2; JP5232786B2; CA2663791A1; ES2400450T3; AU2007297675A1; AU2007297675B2; WO2008036277A1; EP2064214A1; BRPI0718459A2; JP2010503690A

Abstract

본 발명은, 예를 들면 암, 신경계 장애, 자가면역 장애, 및 기타 질병을 치료하기 위한 단백질 키나아제 억제제로서 유용한, 화학식 I을 갖는 피리미딘계 및 트리아진계 화합물, 및 상기 화합물의 사용 방법에 관한 것이다.

<화학식 I>

단백질 키나아제 억제제, CK2, 피리미딘계 및 트리아진계 화합물.

Description

단백질 키나아제 억제제로서 유용한 피라졸로(1,5-Ａ)(1,3,5)트리아진 및 피라졸로(1,5-Ａ)피리미딘 유도체 {PYRAZOLO(1,5-A)(1,3,5)TRIAZINE AND PYRAZOLO(1,5-A)PYRIMIDINE DERIVATIVES USEFUL AS PROTEIN KINASE INHIBITORS}

관련 출원에 대한 상호 참조

본 출원은 35 U.S.C.§119(e) 하에서 2006년 9월 18일에 출원된 미국가특허출원 제60/845,314호 및 2007년 9월 17일에 출원된 미국특허출원 제11/856,476호의 우선권을 주장한다.

상기에 인용된 특허출원의 내용 전부가 본 명세서에 참고로 도입되어 있다.

본 발명은, 예를 들면 암, 신경계 장애, 자가 면역 장애, 및 다른 질병을 치료하기 위한 단백질 키나아제 억제제로서 유용한 화합물, 및 상기 화합물의 사용 방법에 관한 것이다.

세포 증식 및 분화와 같은 활동을 조정하기 위해 항상성은 세포들 사이의 신호를 필요로 한다. 부적절한 신호는 면역 체계의 병리, 예컨대 알레르기, 자가 면역 질병, 및 염증 뿐만 아니라 신경계 및 심혈관계 질환을 야기하거나 또는 악화시킬 수 있다. 특히, 세포의 증식이 조절되지 않는 암은 정상적인 세포 신호의 붕괴와 높은 관련성을 갖는다. 단백질 상의 세린, 트레오닌, 및 티로신 잔기로의 포스 포릴기의 촉매 전이 및 단백질 상의 세린, 트레오닌, 및 티로신 잔기로부터의 포스포릴기의 촉매 전이가 신호 전달의 일부로서 신호에 때때로 관여하는데, 이 단계는 단백질 키나아제로 불리우는 효소에 의해 촉매된다. 이러한 이유로, 암 및 기타 질병을 치료하기 위한 노력으로 단백질 키나아제의 억제가 관심을 받고 있다.

최근까지 필수 세린/트레오닌 단백질 키나아제인 CK2는 암의 화학요법에 있어서 가능한 표적으로서 고려되지 않았지만, 광범위한 각종 암은 종양 성장의 공격성과 관련성이 있는 CK2의 활성의 정도가 증가되는 것을 보인다. 또한, 작은 분자의 사용을 통해 CK2 활성을 감소시키는 것, 키나아제 불활성 돌연변이의 지배적 음성 과잉발현 (dominant negative overexpression), 안티-센스(anti-sense) 방법, 또는 작은 간섭 RNA(small interfering RNA)는 세포 증식을 감소시키고, 암 세포의 자멸사의 정도를 증가시키고, 종양을 갖고 있는 마우스로부터 PC3 인간 전립선 암 세포를 박멸한다. 그러나 존재하는 C2 억제제, 예컨대 에모딘, 쿠마린, TBB (트리아졸), 퀴나졸린, DRB 및 퀘르세틴은 실험실 연구에 있어서는 유용한 반면, 임상학적으로 유용한 화학요법제의 품질에는 못 미친다.

따라서, 상기 단백질 키나아제에 의해 촉매된 포스포릴화와 관련되는 병리를 치료하기 위한 CK2 활성의 억제 화합물에 대한 요구가 남아있다.

발명의 요약

본 발명의 한 측면은 거대 고리 피라졸로[1,5-a][1,3,5]트리아진 및 피라졸로[1,5-a]피리미딘 화합물에 기초한 새로운 군의 단백질 키나아제 억제제, 그들의 사용 방법, 그의 제약상 허용가능한 전구 약물, 제약상 활성인 대사물질, 및 제약 상 허용가능한 염을 제공한다. 상기 화합물, 그의 전구 약물, 대사물질, 다형체, 및 제약상 허용가능한 염은 총칭하여 "제제"로 불리운다.

또한, 본 발명은 하나 이상의 제약상 허용가능한 담체와 함께 유효량의 제제를 포함하는 제약 조성물에 관한 것이다.

따라서, 본 발명의 제제 및 상기 제제를 함유하는 제약 조성물은 조절되지 않거나 또는 원치 않는 세포 증식, 예컨대 암, 자가 면역 질병, 바이러스성 질병, 진균성 질병, 신경변환 장애 및 심혈관 질병과 관련된 질병을 포함하는 (그러나, 이에 한정되지 않음) 각종 질병을 치료하는데 있어서 유용하다.

바람직한 제제는 CK2 단백질 키나아제의 활성을 조정 및/또는 억제한다. 따라서, 상기 제제를 함유하는 제약 조성물은 키나아제 활성에 매개된 질병, 예컨대 암을 치료하는데 있어서 유용하다.

개괄적으로, 본 발명은 하기 화학식 I의 화합물 뿐만 아니라 그의 전구 약물, 제약상 활성인 대사물질, 다형체, 및 제약상 허용가능한 염에 관한 것이다.

(식 중에서,

R1은 알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 또는 헤테로아릴이고,

R2는 수소, 알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 또는 헤테로아릴이고,

R3기는 독립적으로 수소, 임의로 치환된 알킬, 알케닐, 알키닐,아릴, 헤테로아릴, 또는 할로이고,

(C)는 임의로 치환된 알킬, 알케닐 및 알키닐로부터 선택된 기이고, 여기서 n = 2-6이고,

X는 CH 또는 N임)

또한, 본 발명은, 치료를 위해서 유효량의 본 발명의 제제를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 증식성 질병, 예컨대 암, 자가 면역 질병, 바이러스성 질병, 진균성 질병, 신경변환 장애 및 심혈관 질병을 치료하는 방법에 관한 것이다.

또한, 본 발명은, 화학식 I의 화합물 또는 상기 화합물의 제약상 허용가능한 염, 제약상 허용가능한 전구 약물, 또는 제약상 허용가능한 염 또는 그의 대사물질을 투여하여 CK2의 단백질 키나아제 활성을 조정 및/또는 억제하는 방법에 관한 것이다.

달리 언급되지 않는 한, 본 명세서의 기술적인 용어들은 그들의 통상적인 의미, 특히 문헌[McGraw-Hill Dictionary of Scientific and Technical Terms, 6th edition]에 특정되어 있는 의미를 갖는다.

"알킬"은 1 내지 8 탄소 원자를 함유하는 직쇄 또는 분지쇄 탄화수소를 일컫는 한편, "알킬렌" 및 "알키닐"은 각각 이중- 또는 삼중 결합을 갖는 상응하는 쇄를 일컫는다. 알킬, 알킬렌, 및 알키닐기는 머캅토, 니트로, 시아노, 아지도 및 할로로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 치환체로 임의로 치환될 수 있다.

"헤테로아릴"은 독립적으로 N, O, 및 S로부터 독립적으로 선택된 하나 이상의 헤테로원자를 갖는 5- 및 6-원 방향족 고리를 일컫는다.

본 발명의 바람직한 실시태양에 있어서, R1은 아릴, 바람직하게는 치환된 아릴, 더욱 바람직하게는 치환된 페닐이다. R1이 N-알킬-N-알킬피롤리디닐-카르보닐-페닐 (예를 들면, N-메틸-N-(1-메틸-피롤리디닐)-카르보닐)-페닐 (화합물 11g과 같음)) 또는 N-알킬-N-알킬아미노알킬 (예를 들면, N-메틸-N-에틸아미노에틸, (화합물 11s와 같음))인 화합물이 특히 유용한 화합물인 것으로 밝혀졌다. 특정 바람직한 화합물에서, R2 및 R3 기 각각은 수소이고, (C)는 알킬이고, n = 4이고/이거나 X는 N이다.
또한, 본 발명의 바람직한 실시태양에 있어서, R1은 C1-6 알킬, C3-6 시클로알킬, 피리디닐 또는 페닐이며, 상기 페닐은 비치환되거나 또는 C1-4 알콕시 또는 -C(=O)(R4)로 치환되고, R2 및 R3은 수소이고; R4는 C1-6 알콕시, 비치환된 피페라지닐, 또는 C1-6 알킬로 치환된 피페라지닐, 비치환된 피롤리디닐, 또는 C1-6 알킬 또는 N,N-C1-6 알킬아미노로 치환된 피롤리디닐, 비치환된 아제티디닐, 또는 히드록실, C1-6 알킬 또는 N,N-C1-6 알킬아미노로 치환된 아제티디닐, 또는 아미노이며, 상기 아미노는 비치환되거나 또는 하나 이상의 C1-6 알킬, N,N-C1-6 알킬-아미노-C1-6 알킬, 비치환된 아제티디닐, 또는 C1-6 알킬 또는 N,N-C1-6 알킬아미노로 치환된 아제티디닐, 비치환된 피롤리디닐, 또는 C1-6 알킬로 치환된 피롤리디닐, 또는 비치환된 피페리디닐, 또는 C1-6 알킬로 치환된 피페리디닐로 치환되고; n = 2-6이고; X는 CH 또는 N이다.

단백질 키나아제의 활성에 영향을 주기 위해서는, 예를 들면 화학식 I의 피리미딘계 (X = C) 및 트리아진계 (X = N) 화합물이 유용하다. 더욱 구체적으로, 화합물은 항증식제로서 유용하고, 이에 따라 단백질 키나아제에 의해 매개된 세포 증식과 관련된 암 또는 기타 질병의 치료를 제공한다.

본 발명의 제제는 하기의 합성 반응식에 의해 제조될 수 있다. 예를 들면 화학식 I의 트리아진계 화합물은 반응식 1에 따라 제조될 수 있다:

상기 화합물의 합성은 디시아노 화합물 (1)로부터 출발한다. NaH 다음에 에틸포르메이트로 처리하여 중간체인 2-포름일-디니트릴 유도체를 얻고, 이를 히드라진으로 처리하여 고리화함으로써 4-치환 아미노 피라졸 (2)를 얻는다. 그 다음, 화합물 (2)를 에톡시카르보닐이소티오시아네이트로 처리하여, 염기성 조건하에서 자발적으로 고리화하여 화합물 (3)을 제공하는 티오우레아 중간체를 형성한다.

화합물 (3)을 벤질화한 후에 염소화하여 상응하는 화합물 (4) 및 (5)를 얻는다. 그 다음, 부드러운 조건하에서 화합물 (5)의 염소기를 1차 아민에 의해 치환하여 (6)을 얻는다. 화합물 (6)을 mCPBA로 처리하여 벤질술파닐기를 상응하는 벤질술포닐기 (7)로 산화시킨다. 그 다음, 화합물 (7)의 활성 벤질술포닐기는 페닐 디아민에 의해 치환되어 화합물 (8)을 형성한다.

메탄올 중 HCl 가스로 화합물 (8)을 처리하여 화합물 (9)를 얻고, 이를 염기 성 조건하에서 가수분해하여 화합물 (10)을 얻는다. 커플링 시약으로 화합물 (10)을 처리하여 원하는 거대 고리 화합물 (11)을 얻는다.

유사한 방식으로 화학식 I의 피리미딘계 (X = CH) 화합물은 반응식 2에 따라 제조된다:

우선, 4-치환 아미노 피라졸 (2)를 클로로카르보닐-아세트산 에틸 에스테르로 처리하여 디아실화 중간체를 얻은 후, 이를 염기의 존재하에 화합물 (12)로 고리화한다. 이염소화로 화합물 (13)을 얻은 후, 아민으로 치환하여 화합물 (14 및 15)를 얻는다. 메탄올 중 HCl 가스로 화합물 (15)를 처리하고, 메탄올 중에서 환류하여 화합물 (16)을 얻는다. 알칼리성 가수분해로 화합물 (17)을 얻고, 거대 고리화하여 최종 생성물 (18)을 얻는다.

또한, 본 발명의 화합물의 제약상 허용가능한 염 및/또는 용매화물이 사용될 수 있다. 상기 염은, 예를 들면 염산, 브롬화수소산, 황산, 인산, 질산, 푸마르산, 아세트산, 프로피온산, 숙신산, 글리콜산, 말레산, 타르타르산, 시트르산, 말 론산, 및 메탄술폰산으로부터 형성된 것을 포함한다.

특정 화합물은 에난티오머 뿐만 아니라 상응하는 라세미체가 본 발명에 포함되는 경우에 키랄 중심을 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은, 목적하는 투여 방식에 관계 없이, 본 발명의 화합물을 포함하는 제약 제형에 관한 것이다.

본 발명의 화합물의 치료 투여량은 당업계에서 잘 알려진 방법에 의해 용이하게 측정될 수 있다.

달리 언급되지 않으면, 하기의 실시예에 있어서, 모든 부 및 퍼센트는 중량부 및 중량퍼센트이다. 시약을 알드리치 케미칼 컴패니(Aldrich Chemical Company) 또는 랑케스터 신써시즈(Lancaster Syntheis)와 같은 상업적 공급자로부터 구매하고, 달리 언급되지 않으면 추가의 정제 없이 사용하였다.

일반적으로, 하기에 제시된 반응은 질소의 양압하에서 또는 건조 튜브로 (달리 언급되지 않으면) 상온에서 무수 용매 중에서 수행하고, 주사기를 통해 기질 및 시약을 주입하기 위해 반응 플라스크에 고무 격막을 끼웠다. 반응을 TLC, HPLC, LC/MS 또는 NMR로 분석하고, 출발 물질의 소모에 따라 판단하여 반응을 종결시켰다.

실시예 1

5-(5-아미노-1H-피라졸-4-일)-펜탄니트릴 (2)

건조 디에틸 에테르 (200 mL) 중 에틸 포르메이트 (20 mL, 250 mmol) 및 1,5-디시아노펜탄 (1) (6.5 mL, 50 mmol)의 용액에 수소화 나트륨 (60%, 4 g. 100 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 4시간 동안 환류하고, 실온으로 냉각하고, 여과하고, 에테르로 세정하고 건조시켰다. 80% 에탄올/물 중 상기에서 얻어진 백색 고체의 용액에 히드라진 히드로클로라이드 (6.29 g. 61 mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 진한 HCl로 pH 3으로 조절한 후 2시간 동안 환류하고, 실온으로 냉각하고, NaHCO₃로 중화시켰다. 감압하에서 용매를 제거하고, 진공하에서 잔류물을 건조시켰다. 에탄올 중에 잔류물을 현탁하고, 여과하였다. 여액을 농축하고, 5% MeOH/CH₂Cl₂에 용해하고, 짧은 실리카겔 칼럼을 통해 여과하고, 5% MeOH/CH₂Cl₂로 세 정하고 농축하여 5-(5-아미노-1H-피라졸-4-일)-펜탄니트릴 (2)를 오일로서 얻었다. LCMS(API-ES) m/z: 164.2, 165.1 [M+H+]; 163.1 [M-H+].

실시예 2

5-(4-히드록시-2-머캅토-피라졸로[1,5-A][1,3,5]트리아진-8-일)-펜탄니트릴 (3)

EtOAc (50 mL) 중 화합물 (2) (4.6 g. 14 mmol)의 용액에 에톡시카르보닐이소티오시아네이트 (1.69 mL, 15 mmol)를 상온에서 교반하면서 적가하였다. 반응 혼합물을 2시간 동안 환류하고, 실온으로 냉각시켰다. 수산화암모늄 (10 mL)를 첨가하고, 20시간 동안 실온에서 반응 혼합물을 교반하였다. 반응 혼합물을 1M NaOH로 두 차례 추출하고, 수성 추출액을 합치고, 진한 HCl로 산화하고, EtOAC로 두 차례 추출하였다. 합쳐진 유기 추출액을 무수 Na₂SO₄로 건조시키고, 농축하여 5-(4-히드록시-2-머캅토-피라졸로[1,5-a][1,3,5]트리아진-8-일)-펜탄니트릴 (3)을 백색 고체로 얻었다 (2.5 g, 67%). LCMS(API-ES) m/z: 249.3, 249.9 [M+H+]; 247.9 [M-H+].

실시예 3

5-(2-벤질술파닐-4-히드록시-피라졸로[1,5-A][1,3,5]트리아진-8-일)-펜탄니트릴 (4)

N-메틸피롤리디논 (30 mL) 중 화합물 (3) (5.3 g, 21.3 mmol)의 용액을 진공 중에서 5분 동안 탈기하였다. 브롬화벤질 (2.28 mL, 19.1 mmol) 및 DIEA (4.4 mL, 25 mmol)를 첨가하고, 반응 혼합물을 실온에서 진공하에서 30분 동안 교반하였다. 감압하에서 용매를 제거하고, 잔류물을 EtOAc로 희석하였다. 아세테이트 용액을 1M HCl로 세척한 후, 염수로 세척하였다. 유기 추출액을 무수 Na₂SO₄에서 건조시키고, 여과하고, 농축하였다. 잔류물을 헥산, 에테르 및 EtOAc의 혼합물 용매에서 연화처리하고, 여과하여 5-(2-벤질술파닐-4-히드록시-피라졸로[1,5-a][1,3,5]트리아진-8-일)-펜탄니트릴 (4)를 고체로서 얻었다 (6.0 g. 93%). LCMS(API-ES) m/z: 339.4, 340.0 [M+H+]; 338.0 [M-H+].

실시예 4

5-(2-벤질술파닐-4-클로로-피라졸로[1,5-A][1,3,5]트리아진-8-일)-펜탄니트릴 (5)

옥시염화 인 (20 mL) 중 N,N-디메틸아닐린 (2.24 mL, 17.7 mmol) 및 화합물 (4) (6.0 g, 17.7 mmol)의 용액을 가열하여 밀봉된 튜브에서 1시간 동안 환류시켰다. 용매를 제거하고, 잔류물을 EtOAc (200 ml)로 희석하고, 포화 수성 NaHCO₃, 묽은 HCl로 세척한 후, 염수로 세척하고, 무수 Na₂SO₄에서 건조시키고 여과하고, 농축하여 다음 단계에서 바로 사용되는 5-(2-벤질술파닐-4-클로로-피라졸로[1,5-a][1,3,5]트리아진-8-일)-펜탄니트릴 (5)를 얻었다. LCMS(API-ES) m/z: 357.8. 358.0. 360.0 [M+H+].

실시예 5

5-(2-벤질술파닐-4-시클로프로필아미노-피라졸로-[1,5-A][1,3,5]트리아진-8- 일)-펜탄니트릴 (6A)

무수 에탄올 (10 mL) 중 시클로프로필아민 (1.2 g. 17.7 mmol) 및 화합물 (5)의 용액을 상온에서 0.5시간 동안 교반하였다. 그 다음, 혼합물을 EtOAc (200 ml)로 희석하고, 포화 수성 NaHCO₃ 및 염수로 세척하고, 무수 Na₂SO₄에서 건조시켰다. 용매를 제거하여 5-(2-벤질술파닐-4-시클로프로필아미노-피라졸로[1,5-a][1,3,5]트리아진-8-일)-펜탄니트릴 (6)을 얻었다 (4.3 g. 65% (2단계)). LCMS(API-ES) m/z: 378: 379 [M+H+].

실시예 6

5-(4-시클로프로필아미노-2-페닐메탄술포닐-피라졸로[1,5-A][1,3,5]트리아진-8-일)-펜탄니트릴 (7A)

CH₂C1₂ (200 mL) 중 화합물 (6a) (3.78 g, 10 mmol)의 용액에 mCPBA (5.5 g, 22 mmol, 77%)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 2시간 동안 교반하고, 여과하였다. 여액을 포화 NaHCO₃로 세척한 후, 염수로 세척하고, 무수 Na₂SO₄에서 건조시켰다. 용매를 제거하여 5-(4-시클로프로필아미노-2-페닐메탄술포닐-피라졸로[1,5-a][1,3,5]트리아진-8-일)-펜탄니트릴 (7a)를 고체로 얻었다 (3.5 g, 85%). LCMS(API-ES) m/z: 410.15. 411.0[M+H+]; 409.0[M-H+]

실시예 7

5-[2-(3-아미노-페닐아미노)-4-시클로프로필아미노-피라졸로[1,5-A][1,3,5]트리아진-8-일)-펜탄니트릴 (8A)

50 mL의 AcOH 중 벤젠-1,3-디아민 (2.16 g. 20 mmol) 및 화합물 (7a) (0.41 g. 1 mmol)의 혼합물을 70℃에서 2시간 동안 가열하였다. 그 다음, 혼합물을 농축하고, 잔류물을 NaHCO₃로 중화하고, EtOAc로 추출하였다. 그 다음, 아세테이트 용액을 시트르산 (10%)로 세척한 후, 염수로 세척하고, Na₂SO₄에서 건조시키고 농축하여 3-[2-(3-아미노-페닐아미노)-8-(4-시아노-부틸)-피라졸로[1,5-a][1,3,5]트리아진-4-일아미노]-벤조산 에틸 에스테르 (8)을 짙은 오일로 얻었다 (0.22 g, 60%). LCMS(API-ES) m/z: 362.2. 363.0 [M+H+]; 361.0 [M-H+].

실시예 8

5-[2-(3-아미노-페닐아미노)-4-시클로프로필아미노-피라졸로[1,5-A][1,3,5]트리아진-8-일]-펜탄산 메틸 에스테르 (9A)

30 mL의 MeOH 중 화합물 (8a) (0.18 g. 0.5 mmol)의 용액에 HCl 가스를 0℃에서 5분 동안 기포로 통과시켰다. 반응 혼합물을 밀봉하고, 실온에서 20시간 동안 교반하였다. 에스테르 및 이민의 혼합물을 얻고, 이를 2시간 동안 환류시킬 때 메틸 에스테르만을 얻는다. 그 다음, 혼합물을 농축하고, 잔류물을 EtOAc에 용해하고, NaHC0₃로 세척한 후, 염수로 세척하였다. 유기 추출액을 건조시키고, 농축하고, 플래쉬 크로마토그래피 (CH₂Cl₂/EtOAc 2:1)로 정제하여 5-[2-(3-아미노-페닐아미노)-4-시클로프로필아미노-피라졸로[1,5-a][1,3,5]트리아진-8-일]-펜탄산 메틸 에스테르 (9a)를 얻었다 (0.13 g, 65%). LCMS(API-ES) m/z: 395.2. 396.0 [M+H+]; 394.0 [M-H+].

실시예 9

5-[2-(3-아미노-페닐아미노)-4-시클로프로필아미노-피라졸로[1,5-A][1,3,5]트리아진-8-일]-펜탄산 (10A)

10 mL의 MeOH 및 0.5 mL의 H₂O 중 화합물 (9a) (0.12 g, 0.3 mmol)의 용액에 NaOH (40 mg, 1 mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 1시간 동안 환류하고, 농축하여 MeOH를 제거하였다. 반응 용액을 HCl로 pH 4로 조절하고, 고체를 여과에 의해 수집하고, 물로 세척하고, 진공하에서 P₂O₅에서 건조시켜 5-[2-(3-아미노-페닐아미노)-4-시클로프로필아미노-피라졸로[1,5-a][1,3,5]트리아진-8-일]-펜탄산 (10a)를 제공하였다 (0.1 g, 90%). LCMS(API-ES) m/z: 381.2, 382.0 [M+H+]; 380.0 [M-H+].

실시예 10

(11,14)3,5-N-{시클로프로필-피라졸로[1,5-A][1,3,5]트리아진-4-일-아미노}-(2N,4N)-페닐-1,5-디아자-시클로테트라데카-8-온 (11A)

5% DIEA/NMP (1 mL) 중 HATU (0.12 g. 0.3 mmol) 및 화합물 (10a) (0.1 g, 0.25 mmol)의 용액을 실온에서 30분 동안 교반하였다. 정제용 RP-HPLC (0.05 g, 55%)에 의해 (11,14)3,5N-{시클로프로필-피라졸로[1,5-a][1,3,5]트리아진-4-일-아미노}-(2N,4N)-페닐-1,5-디아자-시클로테트라데카-8-온 (11a)를 얻었다. LCMS(API-ES) m/z: 363.1, 364.0 [M+H+]; 362.0 [M-H+].

실시예 1-10에서 언급된 것과 유사한 방식으로 하기의 화학식을 갖는 화합물 을 합성하고 정제하였다.

실시예 11

(11,14)3,5N-{[{N-메틸-N-(1-메틸-피롤리딘-3-일)-카르보닐}-펜-3-일]-피라졸로[1,5-A][1,3,5]트리아진-4-일-아미노}-(2N,4N)-페닐-1,5-디아자-시클로테트라데카-8-온 (11G)

1,3-[2-(3-아미노-페닐아미노)-8-(4-메톡시카르보닐-부틸)-피라졸로[1,5-a][1,3,5]트리아진-4-일아미노]-벤조산 메틸 에스테르 (9b)를 실시예 8에 언급된 것과 유사한 방식으로 얻었다. LCMS(API-ES) m/z: 489.5. 490.1 [M+H+]; 488.0 [M-H+].

실시예 12

3-[2-(3-아미노-페닐아미노)-8-(4-카르복시-부틸)-피라졸로[1,5-A][1,3,5]트리아진-4-일아미노]-벤조산 (10 B)

50 mL의 MeOH 및 5 mL의 H₂O 중 화합물 (9b) (1.5 g, 3.06 mmol)의 용액에 NaOH (400 mg. 10 mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 1시간 동안 환류하고, 농축하였다. 진한 HCl을 첨가하여 용액을 산화시켰다. 고체를 여과에 의해 수집하고, 물로 세척하고, 진공하에서 P₂O₅에서 건조시켜 1,3-[2-(3-아미노-페닐아미노)-8-(4-메톡시카르보닐-부틸)-피라졸로[1,5-a][1,3,5]트리아진-4-일아미노]-벤조산 메틸 에스테르 (13a)를 얻었다 (1.3 g. 93%). LCMS(API-ES) m/z: 461.4. 462.0 [M+H+]; 460.1 [M-H+].

실시예 13

(11,14)3,5N-{{(N-메틸-N-(1-메틸-피롤리딘-3-일)-카르보닐}-펜-3-일]-피라졸로[1,5-A][1,3,5]트리아진-4-일-아미노}-(2N,4N)-페닐-1,5-디아자-시클로테트라데카-8-온 (11 G)

60 mL의 NMP 중 DIEA (0.45 mL) 및 화합물 (10b) (300 mg, 0.6 mmol)의 혼합물에 HATU (410 mg, 1.08 mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 5분 동안 초음파 처리하고, 0.5시간 동안 실온에 두었다. 메틸-(1-메틸-피롤리딘-3-일)-아민 (0.117 mL, 0.9 mmol)을 첨가한 후, 추가로 HATU (228 mg. 0.6 mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 0.5시간 동안 교반하였다. 조 생성물을 정제용 RP-HPLC에 의해 정제하여 (11,14)3,5N-{[{N-메틸-N-(1-메틸피롤리딘-3-일)-카르보닐}-펜-3-일]-피라졸로[1,5-a][1,3,5]트리아진-4-일-아미노}(2N,4N)-페닐-1,5-디아자-시클로테트라데카-8-온 (11g)을 얻었다 (210 mg, 57%). LCMS(API-ES) m/z: 539.6. 540.2 [M+H+]; 538.1 [M-H+].

상기의 실시예에서 언급된 것과 유사한 방식으로 하기의 화학식을 갖는 화합물을 합성하고 정제하였다.

실시예 14

(11,14)3,5N-{[(3-디메틸아미노-피롤리딘-1-카르보닐)-펜-3-일]-피라졸로[1,5-A]피리미딘-2,4-일-디아미노}-(2N,4N)-페닐-1,5-디아자-시클로테트라데칸-6-온 (18A)

실시예 15

5-(5,7-디히드록시-피라졸로[1,5-A]피리미딘-3-일)-펜탄니트릴 (12 A)

얼음물 배스에서 교반하면서 20 mL의 EtOAc 중 5-(5-아미노-1H-피라졸-4-일)-펜탄니트릴 (2a) (1 g, 6.09 mmol)의 용액에 에틸 3-클로로-3-옥소프로피오네이트 (2.34 mL, 18.27 mmol)를 적가한 후, TEA (3.08 mL, 30.45 mmol)를 적가하였 다. 반응 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 EtOAc로 희석하고, 10% 수성 HCl, 포화 NaHCO₃ 및 염수에 의해 세척하고, 무수 Na₂S0₄에서 건조시키고, 농축하였다.

MeOH (10 mL) 및 TEA (2 mL) 중 상기 잔류물의 용액을 2시간 동안 환류하고, 농축하고, 진공하에서 건조시켜 5-(5,7-디히드록시-피라졸로[1,5-a]피리미딘-3-일)-펜탄니트릴 (15)를 얻었고, 이를 다음 단계에서 추가의 정제 없이 사용하였다 (1.56 g). LCMS(API-ES) m/z: 232.2. 233.0 [M+H+]; 231.0 [M-H+].

실시예 16

5-(5,7-디클로로-피라졸로[1,5-A]피리미딘-3-일)-펜탄니트릴 (13A)

옥시염화 인 (25 mL) 중 N,N-디메틸아닐린 (854 ㎕, 6.74 mmol) 및 화합물 (12a) (1.56 g. 6.74 mmol)의 혼합물을 가열하여 밀봉된 튜브에서 4시간 동안 환류한 후, 농축하였다. 잔류물을 EtOAc (50 mL)에 용해시키고, 포화 수성 NaHCO₃, 10% HCl, 및 염수로 세척하고, 무수 Na₂SO₄에서 건조시켰다. 용매의 제거로 5-(5,7-디클로로-피라졸로[1,5-a]피리미딘-3-일)-펜탄니트릴 (13a)를 얻었다 (1.24 g, 69%). LCMS(API-ES) m/z: 269.1, 269.0. 271.0 [M+H+].

실시예 17

3-[5-클로로-3-(4-시아노-부틸)-피라졸로[1,5-A]피리미딘-7-일아미노]-벤조산 에틸 에스테르 (14A)

10 mL의 에탄올 중 화합물 (13a) (1.24 g, 4.62 mmol)의 용액에 에틸 3-아미 노벤조에이트 (764 mg. 4.62 mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 50℃에서 2시간 동안 가열한 후, 실온으로 냉각시켰다. 용매를 제거하고, 잔류물을 EtOAc (50 mL)에 용해시키고, 포화 수성 NaHCO₃, 10% HCl, 및 염수로 세척하고, 무수 Na₂SO₄에서 건조시켰다. 용매의 제거로 EtOAc/헥산 (25% 내지 50%)을 사용하는 플래쉬 칼럼에 의해 정제한 잔류물로 3-[5-클로로-3-(4-시아노-부틸)-피라졸로[1,5-a]피리미딘-7-일아미노]-벤조산 에틸 에스테르 (14a)를 얻었다 (1.0 g. 50%). LCMS(API-ES) m/z: 397.8. 398.0. 400.0 [M+H+]; 395.9. 398.0 [M-H+].

실시예 18

3-[5-(3-아미노-페닐아미노)-3-(4-시아노-부틸)-피라졸로[1,5-A]피리미딘-7-일아미노]-벤조산 에틸 에스테르 (15A)

2 mL의 NMP 중 벤젠-1,3-디아민 (69 mg, 0.636 mmol) 및 화합물 (14a) (0.63 g. 1.6 mmol)의 혼합물을 160℃에서 밤새 가열하였다. 반응 혼합물을 EtOAc (50 mL)로 희석하고, 포화 수성 NaHCO₃ 및 염수로 세척하고, 무수 Na₂SO₄에서 건조시켰다. HPLC 정제로 3-[5-(3-아미노-페닐아미노)-3-(4-시아노-부틸)-피라졸로[1,5-a]피리미딘-7-일아미노]-벤조산 에틸 에스테르 (15a)를 얻었다 (0.37 g. 50%). LCMS(API-ES) m/z: 469.5, 470.1 [M+H+]; 468.0 [M-H+].

실시예 19

3-[5-(3-아미노-페닐아미노)-3-(4-메톡시카르보닐-부틸)-피라졸로[1,5-A]피리미딘-7-일아미노]-벤조산 메틸 에스테르 (16A)

5 mL의 MeOH 중 화합물 (15a) (0.24 g. 0.5 mmol)의 용액에 0℃에서 5분 동안 HCl 가스를 기포로 통과시켰다. 반응 혼합물을 밀봉하고, 1시간 동안 실온에서 교반하고, 농축하고, 잔류물을 EtOAc에 용해시키고, NaHCO₃, 염수 및 물로 세척하였다. 유기 추출액을 건조시키고, 농축하여 3-[5-(3-아미노-페닐아미노)-3-(4-메톡시카르보닐-부틸)-피라졸로[1,5-a]피리미딘-7-일아미노]-벤조산 메틸 에스테르 (16a)를 얻었다 (102.1 mg). LCMS(API-ES) m/z: 488.5, 489.1 [M+H+]; 487.0 [M-H+].

실시예 20

3-[5-(3-아미노-페닐아미노)-3-(4-카르복시-부틸)-피라졸로[1,5-A]피리미딘-7-일아미노]-벤조산 (17A)

5 mL의 MeOH 중 화합물 (16a) (102.1 mg, 0.203 mmol)의 용액에 1M NaOH (0.41 mL, 0.407 mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 1시간 동안 환류시키고, 농축하였다. HPLC 정제로 3-[5-(3-아미노-페닐아미노)-3-(4-카르복시-부틸)-피라졸로[1,5-a]피리미딘-7-일아미노]-벤조산 (17a)를 얻었다 (50 mg). LCMS(API-ES) m/z: 460.5. 461.1 [M+H+]; 459.0 [M-H+].

실시예 21

1 mL의 NMP 중 DIEA (50 ㎕) 및 화합물 (17 a) (35 mg, 0.075 mmol)의 혼합물에 HATU (50 mg, 0.12 mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 2분 동안 초음파 처리하고, 0.5시간 동안 실온에서 두었다. 그 다음, 디메틸-피롤리딘-3-일-아민 (15 ㎕. 0.1 mmol)을 첨가한 후, 추가로 HATU (5 mg. 0.12 mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 0.5시간 동안 교반하였다. 정제용 RP-HPLC 정제로 (11,14)3,5N-{[(3-디메틸아미노-피롤리딘-1-카르보닐)-펜-3-일]피라졸로[1,5-a]피리미딘-2,4-일-디아미노}-(2N,4N)-페닐-1,5-디아자-시클로테트라데칸-6-온 (18a)를 얻었다 (15 mg). LCMS(API-ES) m/z: 538.6, 539.2 [M+H+]; 537.0 [M-H+].

유사한 방식으로 하기의 화합물을 합성하고 정제하였다.

실시예 22

CK2 단백질 키나아제 억제 분석:

분광광도 PK/LDH 커플링 분석(spectrophotometric PK/LDH coupled analysis)의 사용을 통해 CK2 단백질 키나아제 활성을 측정하여 ATP 턴오버를 검출한다. 전장 His-태그 부착된(Full Length His-tagged) 인간 CK2를 이. 콜라이(E. coli) 발현 시스템으로부터 클로닝하고, 발현하고, 정제한다. CK2 포스포릴화를 위한 펩티드 기질은 RRRDDDSDDD (미국 뉴저지 피스캐터웨이 소재 젠스크립트 코포레이 션(Genscript Corporation, Piscataway, NJ, USA))였다. 전형적인 CK2 효소 분석은 약 20 nM 인간 CK2, 100 μM 펩티드 기질, 50 mM 트리스-HCl pH 8.0, 100 mM NaCl, 10 mM MgCl₂, 200 μM EDTA, 5 mM 2-머캅토에탄올, 1 mM 포스포엔올 피루베이트, 150 μM NADH, 0.5% PK/LDH 믹스 (시그마(Sigma) #P-0294), 2.5% DMSO 및 50 μM ATP를 함유하였다. 억제제 화합물을 100% DMSO에 현탁하고, 첨가하여 2.5 부피%의 일정 DMSO 비율에서 다양한 농도를 달성하였다. ATP를 첨가하여 포스포릴화 반응을 개시하기 전에, CK2 효소를 억제제 및 다른 분석 성분과 5분 동안 예비 인큐베이션하였다. 340 nm에서 UV/Vis 흡광도의 변화로 반응의 진행을 계속해서 관찰하였다. 반응 속도를 억제제 농도에 대해 플롯팅하고, 경쟁적 억제를 가정하고 10 μM의 Km 값을 사용하여 Ki 값을 고정하였다. 매우 강한 결합인 경우, Ki를 측정하는데 타이트-바인딩(tight-binding) 방법을 사용하였다. 그 결과를 표 1 및 2에 기록하였다.

실시예 23

세포 성장의 억제

맥코이(McCoy)의 5A 개질 매질을 갖는 10% 우태아혈청 및 F-12 K 매질 각각에서 HCT-116 및 PC-3 세포를 37℃에서 5% CO₂로 각각 배양하였다. 96 웰 플레이트에 100 μL 매질의 부피 중 2,000-4,000/웰의 밀도로 세포를 플레이팅하였다. 밤새 인큐베이션한 후, 다양한 양의 CK2 억제제를 함유하는 추가의 50 μL 매질을 각 웰 내에 첨가하여 1% 디메틸술폭시드 중 0.01 내지 20 μM 범위의 최종 억제제 농 도를 얻었다. 대조군 웰은 매질 중에 1% 디메틸술폭시드만을 함유하였다.

대조군 세포가 전면 생장에 도달하기 전에 세포가 성장하도록 3 내지 5일의 추가적인 인큐베이션 후, 15μL/웰 MTT 시약 (5 mg/mL)을 첨가하고, 4시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 매질을 제거하고 새롭게 생성된 포르마잔을 디메틸술폭시드 (100μL/well)에 용해시키고, 540 nm에서 측정하였다. 흡수 데이타를 방정식에 대입하고, 칼레이다그래프(KaleidaGraph) 프로그램 (시너지 소프트웨어(Synergy Software))을 사용하여 IC50 값을 측정하였다. IC50에 대한 대입 방정식은 y = a + b/(1+(x/IC50))인데, 여기서 x는 화합물 농도, a는 540 nM에서의 배경 흡수, b는 화합물 농도 0에서의 흡수이다. 그 결과를 표 1 및 2에 기록하였다.

상기 실시예는 화학식 I의 화합물, 및 CK2 단백질 키나아제에 대한 활성 정도를 측정하기 위해 용이하게 수행될 수 있는 분석을 예시하고 있다. 상기 분석에 있어서 선택된 표적에 대한 원하는 수준의 활성을 갖는 억제제를 선택하는데 있어서 당업계에 알려진 다른 적합한 분석이 사용될 수 있음이 명백하다.

본 발명이 특정 및 바람직한 실시태양에 따라 설명되었지만, 당업자는 변형 및 변이가 일상적인 실험 및 본 발명의 실시를 통해 이루어질 수 있음을 알 것이다.

Claims

하기의 화학식 I의 구조를 갖는 화합물.

<화학식 I>

(식 중에서,

R1은 C1-6 알킬, C3-6 시클로알킬, 피리디닐 또는 페닐이며, 상기 페닐은 비치환되거나 또는 C1-4 알콕시 또는 -C(=O)(R4)로 치환되고,

R2 및 R3은 수소이고;

R4는 C1-6 알콕시, 비치환된 피페라지닐, 또는 C1-6 알킬로 치환된 피페라지닐, 비치환된 피롤리디닐, 또는 C1-6 알킬 또는 N,N-C1-6 알킬아미노로 치환된 피롤리디닐, 비치환된 아제티디닐, 또는 히드록실, C1-6 알킬 또는 N,N-C1-6 알킬아미노로 치환된 아제티디닐, 또는 아미노이며, 상기 아미노는 비치환되거나 또는 하나 이상의 C1-6 알킬, N,N-C1-6 알킬-아미노-C1-6 알킬, 비치환된 아제티디닐, 또는 C1-6 알킬 또는 N,N-C1-6 알킬아미노로 치환된 아제티디닐, 비치환된 피롤리디닐, 또는 C1-6 알킬로 치환된 피롤리디닐, 또는 비치환된 피페리디닐, 또는 C1-6 알킬로 치환된 피페리디닐로 치환되고;

n = 2-6이고;

X는 CH 또는 N임)
제1항에 있어서, X가 질소인 화합물.
제2항에 있어서, R1이 C1-6 알킬, C3-6 시클로알킬, 피리디닐 또는 페닐인 화합물.
제3항에 있어서, R1이 시클로프로필, i-Pr, 또는 n-Pr인 화합물.
제3항에 있어서, R1이 페닐인 화합물.
제5항에 있어서, 상기 페닐기가 C1-6 알콕시, C1-6 알콕시카르보닐, 또는 아미노카르보닐인 하나 이상의 치환체를 갖는 화합물.
제6항에 있어서, 상기 C1-6 알콕시기가 에톡시인 화합물.
제6항에 있어서, 상기 C1-6 알콕시카르보닐기가 에톡시카르보닐인 화합물.
제3항에 있어서, R1이 피리디닐인 화합물.
제2항에 있어서,

로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 화합물.
제1항에 있어서,

(11,14)3,5N-{시클로프로필-피라졸로[1,5-a][1,3,5]트리아진-4-일-아미노}-(2N,4N)-페닐-1,5-디아자-시클로테트라데카-8-온;

(11,14)3,5N-{이소프로필-피라졸로[1,5-a][1,3,5]트리아진-4-일-아미노}-(2N,4N)-페닐-1,5-디아자-시클로테트라데카-8-온;

(11,14)3,5N-{n-프로필-피라졸로[1,5-a][1,3,5]트리아진-4-일-아미노}-(2N,4N)-페닐-1,5-디아자-시클로테트라데카-8-온;

(11,14)3,5N-{피리드-3-일-피라졸로[1,5-a][1,3,5]트리아진-4-일-아미노}-(2N,4N)-페닐-1,5-디아자-시클로테트라데카-8-온;

(11,14)3,5N-{(3-에톡시페닐)-피라졸로[1,5-a][1,3,5]트리아진-4-일-아미노}-(2N,4N)-페닐-1,5-디아자-시클로테트라데카-8-온;

(11,14)3,5N-{(3-에톡시카르보닐페닐)-피라졸로[1,5-a][1,3,5]트리아진-4-일-아미노}-(2N,4N)-페닐-1,5-디아자-시클로테트라데카-8-온;

(11,14)3,5N-{3-(3-{[메틸(1-메틸피롤리딘-3-일)아미노]카르보닐}페닐)-피라졸로[1,5-a][1,3,5]트리아진-4-일-아미노}-(2N,4N)-페닐-1,5-디아자-시클로테트라데카-8-온;

(11,14)3,5N-{3-(피페라진-1-일카르보닐)페닐-피라졸로[1,5-a][1,3,5]트리아진-4-일-아미노}-(2N,4N)-페닐-1,5-디아자-시클로테트라데카-8-온;

(11,14)3,5N-{3-[3-(디메틸아미노)피롤리딘-1-일]카르보닐}페닐-피라졸로[1,5-a][1,3,5]트리아진-4-일-아미노}-(2N,4N)-페닐-1,5-디아자-시클로테트라데카-8-온;

(11,14)3,5N-{4-[(3-{[3-(디메틸아미노)피롤리딘-1-일]카르보닐}페닐)아미노]-피라졸로[1,5-a][1,3,5]트리아진-4-일-아미노}-(2N,4N)-페닐-1,5-디아자-시클로테트라데카-8-온;

(11,14)3,5N-{4-{[3-({[2-(디메틸아미노)에틸]아미노}카르보닐)페닐]아미노}-피라졸로[1,5-a][1,3,5]트리아진-4-일-아미노}-(2N,4N)-페닐-1,5-디아자-시클로테트라데카-8-온;

(11,14)3,5N-{4-({3-[(3-히드록시아제티딘-1-일)카르보닐]페닐}아미노)-피라졸로[1,5-a][1,3,5]트리아진-4-일-아미노}-(2N,4N)-페닐-1,5-디아자-시클로테트라데카-8-온;

(11,14)3,5N-{4-[(3-{[(3-히드록시시클로부틸)아미노]카르보닐}페닐)아미노]-피라졸로[1,5-a][1,3,5]트리아진-4-일-아미노}-(2N,4N)-페닐-1,5-디아자-시클로테트라데카-8-온;

(11,14)3,5N-{4-[(3-{[[2-(디메틸아미노)에틸](메틸)아미노]카르보닐}페닐)아미노]-피라졸로[1,5-a][1,3,5]트리아진-4-일-아미노}-(2N,4N)-페닐-1,5-디아자-시클로테트라데카-8-온;

(11,14)3,5N-{4-[(3-{[메틸(1-메틸피페리딘-4-일)아미노]카르보닐}페닐)아미노]-피라졸로[1,5-a][1,3,5]트리아진-4-일-아미노}-(2N,4N)-페닐-1,5-디아자-시클로테트라데카-8-온;

(11,14)3,5N-{[(3-{[3-(디에틸아미노)피롤리딘-1-일]카르보닐}페닐)아미노]-피라졸로[1,5-a][1,3,5]트리아진-4-일-아미노}-(2N,4N)-페닐-1,5-디아자-시클로테트라데카-8-온;

(11,14)3,5N-{[(3-{[3-(디에틸아미노)아제티딘-1-일]카르보닐}페닐)아미노]-피라졸로[1,5-a][1,3,5]트리아진-4-일-아미노}-(2N,4N)-페닐-1,5-디아자-시클로테트라데카-8-온;

(11,14)3,5N-{{[3-(피페라진-1-일카르보닐)페닐]아미노}-피라졸로[1,5-a][1,3,5]트리아진-4-일-아미노}-(2N,4N)-페닐-1,5-디아자-시클로테트라데카-8-온; 및

(11,14)3,5N-{4-[(3-{[[2-(디에틸아미노)에틸](메틸)아미노]카르보닐}페닐)아미노]-피라졸로[1,5-a][1,3,5]트리아진-4-일-아미노}-(2N,4N)-페닐-1,5-디아자-시클로테트라데카-8-온

으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 화합물.
제1항에 있어서, X가 CH인 화합물.
제12항에 있어서,

로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 화합물.
하기 화합물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 화합물을 포함하는, 암, 자가 면역 질병, 바이러스성 질병, 진균성 질병, 신경변환 장애, 심혈관 질병을 치료하기 위한 제약 조성물.
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