KR101418408B1

KR101418408B1 - 핵산 정제 장치 및 정제 방법

Info

Publication number: KR101418408B1
Application number: KR1020090031950A
Authority: KR
Inventors: 구영미; 이양원; 최일규; 박한오
Original assignee: (주)바이오니아
Priority date: 2009-04-13
Filing date: 2009-04-13
Publication date: 2014-07-11
Also published as: KR20100113393A

Abstract

본 발명은 이온투과성 멤브레인을 이용하여 연속적으로 핵산을 자동 추출하는 핵산 정제 장치 및 방법에 관한 것으로서, 상세하게는 생체시료가 포함된 용액이 주입되는 주입부, 생체시료로부터 핵산을 분리하기 위한 이온투과성 멤브레인을 가지는 정제실린더와 상기 정제실린더에 전압을 인가하는 전극 및 전극버퍼가 구비되는 정제부 및 상기 정제부의 이온투과성 멤브레인에 부착된 핵산 및 핵산을 제외한 잔여물 용액이 구분되어 배출되는 배출부로 구성된 핵산 정제 장치 및 방법에 관한 것이다.

본 발명에 따른 핵산을 정제하는 방법은 생체시료를 포함하는 용액을 주입부를 통해 핵산 정제 장치에 주입하는 단계; 전압을 인가하여 상기 시료용액으로부터 핵산을 분리하는 단계; 및 상기 분리된 핵산을 회수하는 단계;를 포함하여 구성된다.

핵산, 세포, 정제, 분리

Description

핵산 정제 장치 및 정제 방법{A Nucleic Acid Purification Device And Purification Method Using The Same}

본 발명은 이온투과성 멤브레인을 이용하여 연속적으로 핵산을 자동 추출하는 핵산 정제 장치 및 방법에 관한 것으로서, 별도 정제공정의 필요 없이 연속적으로 핵산을 정제하도록 한 핵산 정제 장치 및 그 방법에 관한 것이다.

일반적으로 생물체로부터 핵산을 분리 및 정제하는 과정은 다양한 시약을 이용하여 수작업으로 추출하거나 또는 전자동 유전자 추출 장비를 통하여 추출할 수 있다. 하지만, 이러한 종전 방법은 세포로부터 핵산을 추출하여 정제하는 단계까지 유해한 시약의 사용은 물론 배치(batch) 작업으로 많은 노력과 시간, 장비가 소요되는 문제가 있다.

대한민국특허공개 제10-2008-0058900호(전기장에 의하여 핵산을 농축하기 위한 핵산 농축 장치 및 그를 이용하여 핵산을 농축하는 방법)에서는 전극의 표면에 10 내지 60℃에서 고체상태인 이온성 액체 물질을 포함하는 전극의 전기장에 의하여 핵산을 농축하는 방법으로, 핵산을 포함하는 시료를 챔버에 주입하여 전압을 인가한 후 전극의 표면에 상기 고체상태의 이온성 액체 물질이 포함된 전극인 (+)전 극으로 상기 시료 중의 핵산을 이동시킨 다음 전압 인가를 중단하고 상기 시료를 냉각시켜 핵산을 농축하는 방법이 개시되어 있다. 그러나, 상기 방법에 의하면 고온에서 액상인 이온성 액체물질을 냉각시켜 고체상태로 변화시키는 냉각 단계가 필요하며 정제된 핵산 시료를 상기 고체상태의 이온성 액체 물질의 표면으로부터 주사바늘을 이용하여 채취하여야 하는 불편함이 있다.

또한, 대한민국특허공개 제10-2005-0088867호(이온투과성 폴리머로 코팅된 전극을 이용한 핵산 정제 방법 및 그 장치)와 미국특허번호 제0073049호(Method and Apparatus for Nucleic Purification Using Ion-permeable Polymer-Coated Electrode)에서는 이온투과성 폴리머가 코팅된 전극을 직접적으로 이용하여 핵산이 포함된 시료로부터 핵산을 정제하는 방법이 개시되어 있다. 그런데, 이러한 종래의 핵산 정제를 위한 방법 및 장치는 이온투과성 폴리머를 전극 표면에 코팅하여 핵산을 정제하게 되므로 전극에 인가하는 전압이 2.5V 이하로 제한되며, 그 이상이 되면 전극에 부착된 핵산이 산화되어 분해 및 손상된 핵산을 정제하게 되는 문제가 있다. 또한, 이온투과성 폴리머를 전극에 직접 코팅을 하여야 하는 제작 단계는 물론 이온투과성 폴리머를 전극에 직접 코팅하는 과정에서 투입된 시료와 전극의 접촉 면적을 넓게 설치해야 회수율을 높일 수 있는데, 시료와 전극의 접촉 면적을 넓히는데 한계가 있다.

따라서, 본 발명의 목적은 별도 정제공정의 필요 없이 연속적인 핵산 정제가 가능하도록, 핵산이 통과할 수 없는 이온투과성 멤브레인을 이용한 핵산 정제 장치 및 방법을 제공하는 것이다.

본 발명에 따른 핵산 정제 장치는 생체시료가 포함된 용액이 주입되는 주입부; 관로에 의해 상기 주입부와 연결되고, 상기 생체시료로부터 핵산을 분리하기 위한 이온투과성 멤브레인을 가지는 정제실린더와 상기 정제실린더에 전압을 인가하는 전극이 구비되는 정제부; 및 상기 정제부와 상기 관로에 의해 연결되어 용액을 배출하는 배출부;를 포함하여 구성된다.

상기 정제부는 상기 정제부 몸체의 중앙 부분에 상기 용액이 제1방향으로 흐르도록 배치되는 정제실린더; 상기 제1방향에 수직인 방향에 상기 정제실린더를 사이에 두고, 상기 정제실린더 및 상호 간에 이격되도록 배치되는 제1 및 제2전극; 및 상기 제1 및 제2전극과 상기 정제실린더 사이에 배치되며, 버퍼용액을 가지는 한 쌍의 전극버퍼;를 포함하여 구성된다.

상기 정제실린더는 서로 이격되고, 전기적으로 분리되는 한 쌍의 상기 이온투과성 멤브레인을 포함하여 구성되고, 상기 이온투과성 멤브레인은 외면이 상기 정제실린더 외부로 노출되어 상기 버퍼용액과 접촉하고, 내면은 상기 용액과 접촉한다.

상기 핵산의 정제시 상기 제1 및 제2전극에 상기 핵산이 이온투과성 멤브레인에 부착되도록 하기 위한 제1전압이 인가되며, 상기 핵산의 수득을 위해 상기 제1전압과 극성이 반대인 제2전압이 인가되어 상기 이온투과성 멤브레인으로부터 상기 핵산을 탈착시킨다.

상기 이온투과성 멤브레인 막은 하기 화학식 1의 고분자 화합물로써,

[화학식1]

당량(equivalent weight, EW)이 1100(g polymer/equivalent of ionic group)인 나피온 과불화 멤브레인(Nafion perfluorinated membrane)이다.

상기 용액에 포함된 상기 생체시료를 상기 핵산이 분리가능하도록 파쇄하는 파쇄부;를 추가로 포함하여 구성된다.

상기 파쇄부는 발열에 의해 열을 제공하는 히터;와 상기 히터의 외부를 나선 형태로 권취하여 형성되는 나선관로;를 포함하여 구성된다.

상기 한 쌍의 이온투과성 멤브레인은 50마이크로미터(㎛) 내지 10센티미터(cm) 범위 내의 간격을 가진다.

상기 주입부는 상기 용액의 주입을 위한 제1주입구; 상기 관로의 세척 및 상기 핵산의 회수를 위한 증류수가 주입되는 제2주입구; 및 상기 제1 및 제2주입구의 개폐를 조절하기 위한 제1밸브;를 포함하여 구성된다.

상기 배출부는 상기 핵산이 포함된 증류수의 배출을 위한 제1배출구; 상기 핵산이 추출되고 남은 상기 생체시료 잔여물이 포함된 상기 용액 및 상기 관로 세척에 사용된 증류수의 배출을 위한 제2배출구; 및 상기 제1 및 제2배출구의 개폐를 조절하기 위한 제2밸브;를 포함하여 구성된다.

또한, 본 발명에 따른 핵산 정제 방법은 생체시료가 포함된 용액이 주입되는 주입부; 생체시료로부터 핵산을 분리하기 위한 이온투과성 멤브레인을 가지는 정제실린더와 상기 정제실린더에 전압을 인가하는 제1 및 제2전극, 상기 제1 및 제2전극과 상기 정제실린더 사이에 배치되며 버퍼용액을 가지는 한 쌍의 전극버퍼를 구비하는 정제부; 및 상기 핵산과 상기 핵산이 분리되고 남은 상기 용액이 배출되는 배출부;를 포함하여 구성되는 핵산 정제 장치를 이용한 핵산 정제방법에 있어서, 상기 생체시료를 포함하는 상기 용액을 상기 주입부를 통해 상기 핵산 정제 장치에 주입하는 단계; 상기 전압을 인가하여 상기 용액으로부터 상기 핵산을 분리하는 단계; 및 상기 분리된 핵산을 회수하는 단계;를 포함하여 구성된다.

상기 핵산 분리 단계는 상기 파쇄된 생체시료가 포함된 상기 용액을 상기 정제부로 이송하는 단계; 상기 제1 및 제2전극에 상기 제1전압을 인가하여 상기 제1전압이 상기 전극버퍼에 의해 상기 이온투과성 멤브레인에 전달 및 유지되는 단계; 상기 용액에 포함된 상기 핵산이 상기 이온투과성 멤브레인에 부착되는 단계; 및 상기 배출부를 통해 상기 핵산이 분리되고 남은 잔여용액이 배출되는 단계;를 더 포함하여 구성된다.

상기 핵산 회수 단계는 증류수에 의해 상기 주입부, 상기 정제부 및 상기 배출부가 세척되고, 상기 세척에 사용된 상기 증류수가 배출되는 세척단계; 상기 핵산의 회수를 위한 증류수가 공급되고, 상기 제1 및 제2전극에 상기 제1전압과 극성이 반대인 제2전압이 인가되는 단계; 및 상기 제2전압 인가에 따라 상기 이온투과성 멤브레인으로부터 탈착된 상기 핵산이 상기 증류수에 혼합되어 배출되는 단계;를 더 포함하여 구성된다.

[화학식 1]

본 발명에 따른 핵산 정제 장치 및 정제 방법은 일관성 있는 과정을 통해 생체시료를 직접 파쇄하고, 별도 정제공정의 필요 없이 연속적으로 핵산을 정제하여 농축하는 것이 가능하며, 이를 통해 별도의 유해한 시약을 사용하지 않고 정제한 핵산을 바로 PCR(polymerase Chain Reaction)과 같은 반응에 사용할 수 있는 효과 가 있다.

또한, 본 발명에 따른 핵산 정제 장치 및 정제 방법은 단위 부피당 극미량으로 존재하는 생체시료에 대한 정제 및 순도 높은 핵산의 농축을 통해 연속적으로 실시간 정량 PCR에 그대로 보내어 검사대상에 대한 정량 및 분석을 용이하고 빠르게 수행하는 것이 가능해진다.

이하, 본 발명의 바람직한 실시예를 첨부한 도면을 참조하여 당해 분야의 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 설명하기로 한다. 첨부된 도면들에서 구성에 표기된 참조번호는 다른 도면에서도 동일한 구성을 표기할 때에 가능한 한 동일한 도면번호를 사용하고 있음에 유의하여야 한다. 또한, 본 발명을 설명함에 있어, 관련된 공지의 기능 또는 공지의 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명을 생략하기로 한다. 그리고 도면에 제시된 어떤 특징들은 설명의 용이함을 위해 확대 또는 축소 또는 단순화된 것이고, 도면 및 그 구성요소들이 반드시 적절한 비율로 도시되어 있지는 않다. 그러나 당업자라면 이러한 상세 사항들을 쉽게 이해할 것이다.

본 발명의 핵산 정제 장치 및 그를 이용하여 핵산을 정제하는 방법을 실시하기 위한 구체적인 내용은 다음과 같다.

도 1 및 도 2는 본 발명에 따른 핵산 정제 장치의 정제부 구성을 도시한 구 성 예시도로써, 도 1은 본 발명의 정제부의 구성을 설명하기 위해 장치를 부분적으로 절취하여 개방된 형태를 도시한 예시도이고, 도 2a는 절취전 정제부를 도 1의 I-I`선을 따라 절취한 단면을 도시한 단면도이며, 도 2b는 절취된 부분의 평면도이다.

도 1 및 도 2를 참조하면, 정제부(100)는 전극(110 : 110a, 110b), 전극버퍼(120 : 120a, 120b) 및 정제실린더(140)를 포함하여 구성된다.

전극(110)은 생체시료가 포함된 용액 중 핵산을 분리 및 정제하기 위한 전계를 형성한다. 여기서, 생체시료는 수돗물을 포함한 식수, 상수원, 하천, 정수장 등의 수계 및 농·축·수산물과 같은 식품류, 임의의 식물, 동물, 조직, 생물학적 유체, 핵산이 포함된 세포와 같은 생물학적 시료, 미생물이 감염될 수 있는 물질, 이의 용해물(Lysate), 파쇄물 및 이의 등가 물질을 포함한다. 또한, 상기 미생물은 바이러스, 원생동물, 박테리아 및 이의 등가 생물을 포함하며, 상기 생물학적 유체는 혈액, 혈장, 가래, 뇨, 뇌 척수액, 위 세척액, 루코포레시스(Leukophoresis) 및 이의 등가 물질이 포함될 수 있으나, 이로써 본 발명을 한정하는 것은 아니다. 즉, 상기 전극(110)은 외부 전원장치(미도시)로부터 제공되는 전압과 버퍼용액에 의해 몸체(130) 내부에 일방향으로의 흐름을 가지는 전계를 형성하고, 이를 통해 용액 중의 핵산을 상기 이온투과성 멤브레인(150)에 부착시킴과 아울러, 상기 이온투과성 멤브레인(150)에 부착된 핵산을 탈착시키는 역할을 한다. 이를 위해 전극(110)은 몸체(130)의 제1면(131)에 제1전극(110a)이 설치되고, 제1면(131)과 대면하는 제2면(132)에 제2전극(110b)이 설치된다. 이러한 전극(110)의 배치는 이온투과성 멤브레인(150)이 마주보게 배치되어 관로가 형성된 정제실린더(140)를 흐르는 용액의 흐름방향과 교차하는 방향으로 핵산의 이동력을 발생시키기 위한 것이다. 때문에 전극(110)의 배치 방향은 정제실린더(140) 속을 이동하는 용액의 이동방향과 교차하는 방향으로 결정된다. 또한, 이와 같은 핵산의 이동력을 발생시키기 위한 전압은 전극(110)과 이온투과성 멤브레인(150) 사이에 배치되는 전극버퍼(120)의 버퍼용액에 의해 전극(110)으로부터 이온투과성 멤브레인(150)으로 전달된다. 이와 같은 전극(110)에 인가되는 전압의 극성은 핵산을 용액으로부터 분리하는 때와 분리된 핵산을 회수하는 때가 서로 달라지게 된다. 예를 들어 핵산을 용액으로부터 분리하는 경우 제1전극(110a)에 정극성(+) 전압을 인가하고 제2전극(110b)에 부극성(-) 전압을 인가함으로써 용액 속의 핵산이 이온투과성 멤브레인(150)에 부착되도록 하고 이를 통해 핵산을 시료용액으로부터 분리한다. 그리고, 분리/정제된 핵산의 회수시에는 이와는 반대로 제1전극(110a)에 부극성(-) 전압을 인가하고 제2전극(110b)에는 정극성(+) 전압을 짧은 시간 인가하여 이온투과성 멤브레인(150)에 흡착된 핵산을 이온투과성 멤브레인(150)으로부터 탈착하게 된다. 이때, 핵산과 이온투과성 멤브레인(150)의 분리를 위한 역전압을 필요 이상으로 장시간 인가하는 경우 반대편 이온투과성 멤브레인(150) 표면에 재흡착이 발생하므로 대략 2초 전후의 짧은 시간 동안만 역전압을 가하여 핵산을 분리 회수하게 된다. 아울러, 전극을 통해 공급되는 전압의 크기는 대략 1 내지 50V 범위에서 광범위하게 적용하는 것이 가능하고, 높은 전압을 공급할수록 분리/정제 효율이 커지게 된다. 특히 본 발명의 핵산 정제 장치는 이온투과성 멤브레인(150)이 전 극(110)과 직접적으로 접촉하고 있지 않고 전극버퍼(120)에 의해 전계가 중계되기 때문에 높은 전압을 가하는 경우에도 핵산의 산화를 방지할 수 있으며, 이를 통해 분해 및 손상되지 않은 핵산을 정제하는 것이 가능해진다.

전극버퍼(120)는 전극(110)에 인가되는 전압을 이온투과성 멤브레인(150)에 전달하는 역할을 한다. 이를 위해 전극버퍼(120)는 제1전극(110a)과 이온투과성 멤브레인(150)의 사이 및 제2전극(110b)과 이온투과성 멤브레인(150) 사이에 각각 배치되는 제1 및 제2전극버퍼(120a, 120b)로 구성된다. 이 전극버퍼(120)는 버퍼용액과 버퍼용액을 수용하는 주입영역(121) 및 접촉영역(122)으로 구성된다. 주입영역(121)과 접촉영역(122)은 모두 버퍼용액을 수용하여 전압의 인가에 필요한 일정량 이상의 양을 유지하는 역할과 함께 전극(110)과 이온투과성 멤브레인(150) 사이에 일정한 길이 이상의 전압 전도 경로를 제공한다. 특히, 접촉영역(122)의 경우 이온투과성 멤브레인(150)의 외부에 직접 버퍼용액이 접촉하도록 형성되며, 이를 통해 전극(110)에 가해지는 전압을 효과적으로 이온투과성 멤브레인(150)에 전달하게 된다. 한편 버퍼용액은 핵산이 전기장의 흐름에 따라 이동할 수 있도록 도체화되어 전자와 양자를 공급하는 역할 및 핵산의 변성을 방지하는 역할을 한다. 이러한 버퍼용액으로는 TRIS와 EDTA가 있으며, 붕산염(borate 또는 붕산(boric acid))이나 아세트산염(acetate 또는 아세트산(acetic acid))가 이온화하여 전기의 흐름이 발생되도록 한다. 특히 본 발명에서는 핵산의 운동성을 촉진시켜 분리/정제의 효율을 증가시키도록 TAE(Tris-acetate-EDTA) 버퍼를 사용한다. 하지만, 이로써 본 발명을 한정하는 것은 아니며, 핵산의 변형을 방지하고 전도효과가 우수하 며, 분리/정제 효율을 증가시키는 물질은 어느 것을 사용해도 무방하다. 아울러, 이러한 버퍼용액은 이온투과성 멤브레인(150) 또는 용액의 전기전도도에 대해 1 내지 100배의 범위의 전기전도도를 가지도록 하는 것이 바람직하다.

몸체(130)는 핵산의 분리/정제를 위한 공간을 제공하며, 이를 위한 전극(110), 전극버퍼(120) 및 이온투과성 멤브레인(150)을 포함하여 관로로 형성된 정제실린더(140)의 설치공간을 제공한다. 이러한 몸체(130)는 전기 전도도에 영향을 주지 않고 기계적, 화학적 특성과 같은 각종 특성이 우수한 폴리카보네이트(polycarbonate)와 같은 합성수지 또는 이의 등가물질을 이용하여 제조될 수 있다. 또한, 이러한 몸체(130)는 폴리카보네이트를 재료로 하여 형성되는 경우 투명하게 형성되어 내부확인이 용이한 장점을 가지지만, 이로써 본 발명을 한정하는 것은 아니다. 한편, 몸체의 대략 중앙에는 이온투과성 멤브레인(150)을 포함하여 구성되는 정제실린더(140)가 배치된다. 이 정제실린더(140)는 관로와 같이 용액의 이송을 위한 관 형태로 형성되며, 제1 및 제2전극버퍼(120)와 접촉하는 한 쌍의 이온투과성 멤브레인(150)이 서로 이격되어 설치된다. 이 이온투과성 멤브레인(150)의 외부에는 전극버퍼(120)의 접촉영역에 의해 버퍼용액이 접촉한다. 아울러, 정제실린더(140)의 일단은 생체시료를 포함하는 용액이 주입되는 관로와 주입노즐에 의해 연결되고, 타단은 배출부(73)와 연결된다. 이러한 정제실린더(140)는 몸체의 제3면(133)으로부터 제4면(134)을 연결하는 방향으로 배치된다. 아울러, 몸체의 제1면(131)과 제2면(132)에 제1전극(110a) 및 제2전극(110b)이 설치되며, 이 제1 및 제2전극(110a, 110b) 사이에 제1 및 제2전극버퍼(120a, 120b)가 각각 배치된다.

이온투과성 멤브레인(150)은 정제실린더(140)에 설치되어 핵산의 분리/정제가 수행되는 공간, 정제된 핵산 및 분리된 핵산의 잔여 용액에 대한 이동로로써 이용된다. 좀더 상세히 설명하면, 정제실린더(140)에서 이온투과성 멤브레인(150)은 관형태로 형성되는 면에 대면하여 각각 설치되는 한 쌍으로 구성되어, 정제실린더(140)와 함께 용액의 이송을 위한 유로를 형성한다. 이러한 한 쌍의 이온투과성 멤브레인(150)은 약 50마이크로미터(㎛) 내지 10센티미터(㎝) 범위의 간격을 갖도록 이격될 수 있으며, 이러한 범위는 생체시료의 농도, 이온투과성 멤브레인에 걸리는 전압의 세기, 정제실린더(140)의 길이, 용액의 이송속도와 같은 변수에 의해 적정한 범위가 결정되어야 한다. 이온투과성 멤브레인(150)은 전술한 바와 같이 외부 표면이 전극버퍼(120)의 버퍼용액과 접촉하게 된다. 그리고, 이온투과성 멤브레인(150)으로 파쇄된 생체시료 용액이 주입되면, 버퍼용액을 통해 전달되는 전압에 의해 이온투과성 멤브레인(150)에 생체시료 내의 핵산이 흡착되게 된다. 그리고, 남은 잔여물은 이온투과성 멤브레인(150)과 연결된 배출부(73)를 통해 배출되어 핵산의 분리/정제가 이루어지게 된다. 본 발명에 이용 가능한 이온투과성 멤브레인(150)으로는 니트로셀룰로오스 멤브레인(nitrocellulose membrane), 나일론 멤브레인(nylon membrane), 나피온 멤브레인(Nafion membrane), 폴리술폰 멤브레인(polysulfone membrane), PBI 멤브레인(PBI : polybenzimidazole membrane), PEEK 멤브레인(PEEK :polyetheretherketone membrane) 이의 등가물질일 수 있으나, 이로써 본 발명을 한정하는 것은 아니며, 이온 교환 특성, 이온 전도 능력 및 높은 열과 압력에도 잘 견디는 성질을 가지고 핵산은 투과되지 않는 멤브레인이면 무엇 이든 이용가능하다.

본 발명의 실시예에서는전술된 멤브레인들 중 가장 우수한 효율을 가지는 과불화 나피온 멤브레인을 사용하여 이온투과성 멤브레인(150)을 구현하였으며,과불화 나피온 멤브레인의 구조는 아래의 화학식1과 같다.

본 발명에 사용되는 이온투과성 멤브레인(150)은 폴리테트라플루오르에틸렌 백본(polytetrafluoroethylene backbone)과 이 주쇄를 따라 일정 간격으로 긴 퍼플루오로비닐 에테르(perfluorovinyl ether) 곁사슬이 결합되는 구조로 그 말단에 슬폰산염 이온기(sulfonate ionic group)가 공유 결합하고 있다. 본 발명에서는 나피온(Nafion)이라고 알려진 이온투과성 멤브레인을 사용하였으며, 두께는 대략 50.8㎛ 내지 178㎛이며, 당량(equivalent weight, EW)이 1100(g polymer/equivalent of ionic group)인 멤브레인(150)을 사용하였다.

도 3은 본 발명에 따른 핵산 정제 장치의 개략적인 구성을 도시한 구성예시도이다.

도 3을 참조하면 본 발명에 따른 핵산 정제 장치는 관로(60), 주입부(71), 배출부(73), 펌프(80), 파쇄부(65) 및 정제부(100)를 포함하여 구성된다.

관로(60)는 생체시료를 포함하는 용액, 분리된 핵산 및 핵산을 제외한 잔여물의 이동로를 제공한다. 이 관로(60)는 주입부(71), 펌프(80), 파쇄부(65), 정제부(100) 및 배출부(73)를 경유하여 설치된다. 구체적으로 관로(60)는 주입부(71)와 펌프(80), 파쇄부(65)를 경유하여 펌프(80)와 정제부(100)를 연결하며, 정제부(100)과 배출부(73)를 연결하여 이동로를 형성한다. 특히, 관로(60) 중 일부는 히터(90)와 함께 파쇄부(65)를 구성한다. 좀더 상세히 설명하면, 본 발명에 따른 핵산 정제 장치는 별도의 전처리 과정 없이 핵산을 포함하는 생체시료 용액을 장치에 투입하면, 생체시료를 파쇄하는 과정 및 파쇄된 시료로부터 핵산을 분리/정제하고, 이를 용이한 방법으로 회수하는 것이 가능해진다. 또한, 관로(60)에는 관로의 세척 및 핵산의 회수를 위한 증류수가 주입부(71)를 통해 공급되어 배출부(73)를 통해 배출된다. 이러한 관로(60)는 내화학성, 내열성과 같은 기계적 특성이 우수하고, 열 및 화학물질에 의한 변형이 적은 합성수지, 금속 및 이의 등가물질을 이용하여 제조될 수 있다. 아울러, 이러한 관로(60)는 테프론(teflon)이라는 상품명으로 알려진 폴리테트라플루오로에틸렌(Polytetrafluoroethylene)과 같이 열 및 화학물질에 의한 변형이 적고, 기계적 강도, 내화학성과 같은 특성이 우수한 합성수지를 이용하여 형성될 수 있다.

주입부(71)는 핵산 분리를 위한 생체시료가 포함된 용액 및 관로(60)의 세척과 핵산의 회수에 필요한 증류수의 주입이 이루어진다. 이를 위해 주입부(71)는 주입밸브(70a)와 주입밸브(70a)에 의해 개폐가 제어되는 제1 및 제2주입구(71a, 71b)를 포함하여 구성될 수 있다. 제1주입구(71a)는 생체시료 용액이 주입되며, 제2주입구(71b)는 증류수가 주입된다. 주입밸브(70a)는 후술할 배출밸브(70b)와 함께 자동제어가 가능한 솔레노이드방식 밸브가 이용될 수 있으나 이로써 본 발명을 한정하는 것은 아니다.

배출부(73)는 핵산이 포함된 증류수, 핵산이 분리된 세포 잔여물이 포함된 용액 및 관로(60)의 세척을 위해 사용된 증류수가 배출된다. 이를 위해 배출부(73)는 배출밸브(70b)와 배출밸브(70b)에 의해 개폐가 제어되는 제1 및 제2배출구(73a, 73b)를 포함하여 구성될 수 있다. 제1배출구(73a)에 의해 핵산이 포함된 증류수가 배출되며, 제2배출구(73b)에 의해 핵산을 제외한 잔여물이 포함된 용액 및 관로(60)의 세척에 사용된 증류수가 배출된다.

펌프(80)는 주입부(71)를 통해 주입된 용액 및 증류수의 주입 및 배출에 이용된다. 이 펌프(80)는 회전하는 바퀴를 사용하여 저압공간을 만들고 이를 통해 용액 및 증류수의 흐름을 만들어 관로(60) 안의 내용물을 일방향으로 이송하는 연동펌프(Peristaltic Pump)를 사용할 수 있으나 이로써 본 발명을 한정하는 것은 아니다.

파쇄부(65)는 관로(60)를 통해 이송되는 생체시료 용액 속의 생체시료를 핵산의 분리가 가능한 형태로 파쇄한다. 이 파쇄부(65)는 필요에 따라 핵산 정제 장치에 추가하여 구성하거나 생략될 수 있다. 파쇄부(65)는 초음파, 열 또는 이의 등가 수단을 이용한 파쇄장치이면 어떠한 장치를 이용해도 무방하며, 제시된 예에 의해 본 발명을 한정하는 것은 아니다. 본 발명에 따른 핵산 정체 장치는 열을 이 용하여 생체시료를 파쇄하도록 구성된 파쇄부(65)의 예가 제시되어 있다. 이러한, 파쇄부(65)는 생체시료의 파쇄를 위한 열을 공급하는 히터(90) 및 히터(90)의 외부에 권취되는 나선관로(61)를 포함하여 구성된다. 나선관로(61)는 전술한 관로(60)의 일부분을 히터(90)에 권취하는 형태로 형성하거나, 별도의 나선관로(61)를 형성한 후 이를 관로(60)와 연결하여 형성할 수 있으나 이로써 본 발명을 한정하는 것은 아니다. 히터(90)는 섭씨 100℃의 열을 관로(60) 내부의 용액에 지속적으로 공급하며, 히터(90)의 온도는 일정하게 유지된다. 이를 위해, 히터(90)와 관로(60)는 접촉면적을 넓게 하기 위한 형태로 결합되며, 일례로 도 3에서와 같이 관로(60)가 히터(90)의 열방출부를 나선형으로 권취하도록 설치될 수 있다. 아울러, 파쇄부(65)는 내열 테이프와 같은 내열 부재를 더 포함하여 구성될 수 있으며, 내열 부재는 세포의 효과적인 파쇄 및 일정한 온도 유지를 위해 관로(60)와 히터(90)를 감싸도록 설치될 수 있다. 또한, 관로(60)를 히터(90)가 감싸는 형태로 설치되는 것도 무방하며 이로써 본 발명을 한정하는 것은 아니다.

정제부(100)는 파쇄부(65)에 의해 파쇄된 시료가 관로(60)를 통해 정제부(100) 내 정제실린더(140)로 이동하게 되면 핵산을 분리하여 정제한다. 이를 위해, 정제부(100)는 히터(90)와 배출부(73) 사이에 배치되며, 내부에 전극(110), 버퍼용액, 이온투과성 멤브레인(150)을 포함하여 구성된다. 이러한 정제부(100)는 핵산이 가지는 부극성(-) 전기 특성에 기인하여 용액으로부터 핵산을 분리/정제하고, 분리/정제된 핵산을 회수하게 된다. 즉, 정제부(100)에 구성되는 전극(110)에 의해 용액에 전계를 가하고, 이를 통해 용액 속의 핵산을 이온투과성 멤브레 인(150)에 흡착시켜 분리/정제하게 된다. 분리/정제가 진행된 후 정제부(100)는 전극(110)의 극성을 바꾸어 전계를 변화시킴으로써 이온투과성 멤브레인(150)에 흡착된 핵산을 이온투과성 멤브레인으로부터 탈착하고 이를 관로(60)를 통해 회수하게 된다.

도 4는 본 발명에 따른 핵산 분리과정을 설명하기 위한 순서도이다.

도 4을 참조하면 본 발명에 따른 핵산의 분리/정제 방법은 시료용액 주입단계(S100), 파쇄단계(S200), 핵산 분리/정제 단계(S300) 및 핵산 회수단계(S400)를 포함하여 구성된다.

시료용액 주입단계(S100)는 핵산을 분리하기 위한 생체시료와 계면활성제 등의 시료 파쇄를 돕는 물질이 포함된 용액을 혼합하여 시료용액을 본 발명에 따른 정제장치의 주입부(71)를 통해 주입하는 단계이다. 주입부(71)에서 관로(60)를 통해 정제부(100)로 용액이 이송되며, 이 단계에서 3-way 밸브 시스템을 통해 핵산이 포함된 시료와 세척 및 핵산 분리를 위한 증류수가 주입되는 주입구를 구분하여 이용할 수 있다. 즉, 시료용액의 주입을 위해 제1밸브(70a)에 의해 제1주입구(71a)가 개구상태로 전환되고, 제1주입구(71a)를 통해 관로(60)로 용액이 주입된다. 또한, 용액의 주입과 동시에 펌프(80)가 동작하여 주입된 용액을 관로(60)를 따라 이송시키게 된다.

파쇄단계(S200)는 주입된 용액 속의 생체시료를 파쇄하는 단계이다. 파쇄단계(S200)에서 주입된 용액은 펌프(80)에 의해 관로(60)를 따라 히터(90)와 나선관 로(61)에 의해 형성되는 파쇄부(65)로 이송된다. 이때, 히터(90)에 의해 발열이 이루어지고, 히터(90)에 의해 나선관로(61)로 열이 공급되어 용액 속의 생체시료를 파쇄하게 된다. 이때, 히터(90)는 섭씨 100℃를 유지하게 되고, 나선관로(61)를 따라 흐르는 용액은 충분한 열을 제공받게 되어, 시료용액 속의 미생물 또는 세포이 충분히 파쇄되게 된다.

핵산 분리/정제 단계(S300)는 파쇄된 시료용액으로부터 이온투과성 멤브레인에 핵산을 흡착하여 분리하고, 핵산이 분리된 잔여 용액을 외부로 배출하는 단계이다. 생체시료 용액이 정제부(100)로 이송되면, 전극(110)을 통해 제1전압(예를 들어 제1전극(110a)에는 정극성(+) 전압, 제2전극(110b)에는 부극성(-)전압)이 인가된다. 전극(110)에 제1전압이 인가됨에 따라 전극버퍼(120) 내의 버퍼용액에 의해 전압이 정제실린더(140)의 이온투과성 멤브레인(150)에 전달된다. 이온투과성 멤브레인(150)이 극성을 가지게 됨에 따라 용액 속의 핵산이 정극성(+) 극성을 가지는 이온투과성 멤브레인(150)에 흡착되게 된다. 이러한 과정은 용액 전량에 대해 이루어지며, 준비된 용액의 분리/정제가 진행되는 동안 전극(110)에는 계속적으로 제1전압의 인가가 유지된다. 한편, 핵산 분리/정제 단계(S300)에서 핵산이 분리되고 남은 잔여물질을 포함하는 용액은 배출부(73)를 통해 외부로 배출된다.

핵산 회수단계(S400)는 이온투과성 멤브레인(150)에 부착되어 있는 핵산을 분리하여 회수하는 단계이다. 이를 위해 핵산 회수단계(S400)에서는 증류수를 주입하여 세척하고, 제1전압에 대해 극성이 반전된 역전압인 제2전압을 인가하여 핵산을 이온투과성 멤브레인(150)으로부터 탈착한 후, 회수용 증류수를 공급하여 분 리/정제된 핵산을 회수하게 된다.

상기 핵산 분리/정제 단계(S300)와 핵산 회수 단계(S400)에서 3-way 밸브 시스템을 통해 핵산이 분리/정제된 용액과 세척 및 핵산 분리 후의 잔여물질을 포함하는 용액이 배출되는 배출구를 구분하여 이용할 수 있다. 즉, 이를 위해서 핵산 분리/정제 단계(S300)에서 잔여물을 포함하는 용액은 제2밸브(70b)에 의해 개구 상태로 전환되는 제2배출구(73b)를 통해 외부로 배출된다.

또한, 핵산 회수단계(S400)에서 제1밸브(70a)는 제1주입구(71a)를 닫고 제2주입구(71b)를 열어 증류수를 주입한다. 상기 주입된 증류수는 펌프(80)에 의해 관로(60)로 따라 이송되며, 내부의 잔여물을 세척하고, 제2배출구(73b)를 통해 외부로 배출되게 된다. 이때, 세척과정이 진행되는 동안 제1전압의 인가는 지속적으로 이루어지며, 이를 통해 분리된 핵산은 이온투과성 멤브레인(150)에 부착된 상태를 유지하게 된다. 더불어, 핵산이 제외된 잔여용액의 배출에 이용된 제2배출구(73b)도 제2밸브(70b)에 의해 열린 상태를 유지하게 된다. 그리고, 증류수에 의한 세척이 이루어지면, 전극(110)을 통해 제2전압이 인가된다. 이때 제2전압은 2초 정도의 짧은 순간만 인가되어 이온투과성 멤브레인(150)에 부착된 핵산이 쉽게 탈착되고, 타측 이온투과성 멤브레인(150)에 다시 부착되는 것을 방지하게 된다. 이후, 증류수가 외부로부터 다시 주입되고, 이온투과성 멤브레인(150)으로부터 탈착된 핵산은 증류수에 섞여 외부로 배출된다. 또한, 이때에는 제2밸브(70b)에 의해 제2배출구(73b)가 닫히고, 제1배출구(73a)가 열리게 되어 핵산을 포함하는 증류수를 별도로 분리하여 배출하게 된다.

이러한 본 발명에 따른 분리방법을 실제 시행한 예가 아래에 기재되어 있다.

핵산의 분리를 위해 비이온성 계면활성제 Triton X-100이 포함된 증류수 10ml 중에 대장균 1000cell를 첨가하고, 100℃를 유지하는 히터를 통과시켜 대장균을 파쇄하였다. 핵산 정제 장치의 백금 전극에 50V 전압을 인가하였으며, 이때 백금 전극의 버퍼를 10X TAE를 사용하여 용해된 시료가 상기 장치를 통과하면서 이온투과성 멤브레인 막에 핵산이 흡착될 수 있도록 하였다. 대장균의 Genomic DNA가 이온투과성 멤브레인 막에 흡착된 상태를 유지하면서 증류수를 주입하여 상기 장치의 유로를 세척하였다. 이온투과성 멤브레인 막에 흡착되어 정제되어 있는 핵산을 추출하기 위하여 한 쌍의 백금 전극의 전압 극성을 바꿔서 2초 인가 후 전압 인가를 중단하였다. 증류수를 흘려주면서 이온투과성 멤브레인 막으로부터 분리된 대장균 Genomic DNA를 200㎕ 수집하였다. 수집한 시료를 SYBR 2X PCR Premix25㎕, Forward primer 1㎕(10 pmoles/㎕), Reverse primer 1㎕(10 pmoles/㎕), 증류수 18㎕, 수집한 시료 5㎕를 혼합하여 real-time PCR(ExiCycler^TM96, 바이오니아)을 수행하였다. Real-time PCR 조건은 95℃에서 10분 동안 예비 변성하고, 변성 95℃에서 30초, 어닐링 55℃에서 10초를 45회 반복 수행하였다.

Real-time PCR 결과, 시료에 대한 측정 결과는 다음 표 1과 같다.

시료명(copy)	Ct	PCR농도 (copy)	최종농도 (copy)	수집비율 (%)	단위부피(mL)당 농축효율
표준시료1 (900000)	16.78
표준시료2 (90000)	20.27
표준시료3 (9000)	24.00
표준시료4 (900)	27.52
표준시료5 (90)	31.16
수집한 Genomic DNA	33.43	21.01	840.40	84.0	42배

수집한 대장균 세포로부터 Genomic DNA를 분리 정제하여 얻은 수집비율은 84%에 해당하는 실험치 42배 농축되었음을 확인하였고, 이로써 본 발명의 핵산 정제 장치를 통해 효율적인 핵산 분리/정제는 물론 단위부피당 생체시료 용액의 농축효율이 뛰어남을 알 수 있었다.

도 1 및 도 2는 본 발명에 따른 핵산 정제 장치의 정제부 구성을 도시한 구성 예시도로써,

도 1은 본 발명의 정제부의 구성을 설명하기 위해 장치를 부분적으로 절취하여 개방된 형태를 도시한 예시도.

도 2a는 절취전 정제부를 도 1의 I-I`선을 따라 절취한 단면을 도시한 단면도.

도 2b는 절취된 부분의 평면도.

도 3은 본 발명에 따른 핵산 정제 장치의 개략적인 구성을 도시한 구성예시도.

도 4는 본 발명에 따른 핵산 분리과정을 설명하기 위한 순서도.

<도면의 주요 부분에 대한 부호의 설명>

60 : 관로 65 : 파쇄부

71 : 주입부 73 : 배출부

80 : 펌프 90 : 히터

100 : 농축부 110a, 110b : 전극

120 : 전극버퍼 140 : 농축실린더

150 : 이온투과성 멤브레인

Claims

생체시료가 포함된 용액이 주입되는 주입부;

관로에 의해 상기 주입부와 연결되고, 상기 생체시료로부터 핵산을 분리하기 위한 이온투과성 멤브레인을 가지는 정제실린더와 상기 정제실린더에 전압을 인가하는 전극이 구비되는 정제부; 및

상기 정제부와 상기 관로에 의해 연결되어 용액을 배출하는 배출부;를 포함하여 구성되는 것을 특징으로 하는 핵산 정제 장치.
제 1 항에 있어서,

상기 정제부는

상기 정제부 몸체의 중앙 부분에 상기 용액이 제1방향으로 흐르도록 배치되는 정제실린더;

상기 제1방향에 수직인 방향에 상기 정제실린더를 사이에 두고, 상기 정제실린더 및 상호 간에 이격되도록 배치되는 제1 및 제2전극; 및

상기 제1 및 제2전극과 상기 정제실린더 사이에 배치되며, 버퍼용액을 가지는 한 쌍의 전극버퍼;를 포함하여 구성되는 것을 특징으로 하는 핵산 정제 장치.
제 2 항에 있어서,

상기 정제실린더는 서로 이격되고, 전기적으로 분리되는 한 쌍의 상기 이온 투과성 멤브레인을 포함하여 구성되고,

상기 이온투과성 멤브레인은 외면이 상기 정제실린더 외부로 노출되어 상기 버퍼용액과 접촉하고, 내면은 상기 용액과 접촉하는 것을 특징으로 하는 핵산 정제 장치.
제 2 항에 있어서,

상기 핵산의 정제시 상기 제1 및 제2전극에 상기 핵산이 이온투과성 멤브레인에 부착되도록 하기 위한 제1전압이 인가되며, 상기 핵산의 수득을 위해 상기 제1전압과 극성이 반대인 제2전압이 인가되어 상기 이온투과성 멤브레인으로부터 상기 핵산을 탈착시키는 것을 특징으로 하는 핵산 정제 장치.
제 1 항에 있어서,

상기 이온투과성 멤브레인 막은 하기 화학식 1의 고분자 화합물로써,

[화학식1]

당량(equivalent weight, EW)이 1100(g polymer/equivalent of ionic group)인 나피온 과불화 멤브레인(Nafion perfluorinated membrane)인 것을 특징으로 하 는 핵산 정제 장치.
제 1 항에 있어서,

상기 용액에 포함된 상기 생체시료를 상기 핵산이 분리가능하도록 파쇄하는 파쇄부;를 추가로 포함하여 구성되는 것을 특징으로 하는 핵산 정제 장치.
제 6 항에 있어서,

상기 파쇄부는

발열에 의해 열을 제공하는 히터;와

상기 히터의 외부를 나선 형태로 권취하여 형성되는 나선관로;를 포함하여 구성되는 것을 특징으로 하는 핵산 정제 장치.
제 4 항에 있어서,

상기 한 쌍의 이온투과성 멤브레인은 50마이크로미터(㎛) 내지 10센티미터(cm) 범위 내의 간격을 가지는 것을 특징으로 하는 핵산 정제 장치.
제 1 항에 있어서,

상기 주입부는 상기 용액의 주입을 위한 제1주입구;

상기 관로의 세척 및 상기 핵산의 회수를 위한 증류수가 주입되는 제2주입구; 및

상기 제1 및 제2주입구의 개폐를 조절하기 위한 제1밸브;를 포함하여 구성되는 것을 특징으로 하는 핵산 정제 장치.
제 1 항에 있어서,

상기 배출부는

상기 핵산이 포함된 증류수의 배출을 위한 제1배출구;

상기 핵산이 추출되고 남은 상기 생체시료 잔여물이 포함된 상기 용액 및 상기 관로 세척에 사용된 증류수의 배출을 위한 제2배출구; 및

상기 제1 및 제2배출구의 개폐를 조절하기 위한 제2밸브;를 포함하여 구성되는 것을 특징으로 하는 핵산 정제 장치.
생체시료가 포함된 용액이 주입되는 주입부; 생체시료로부터 핵산을 분리하기 위한 이온투과성 멤브레인을 가지는 정제실린더와 상기 정제실린더에 전압을 인가하는 제1 및 제2전극, 상기 제1 및 제2전극과 상기 정제실린더 사이에 배치되며 버퍼용액을 가지는 한 쌍의 전극버퍼를 구비하는 정제부; 및 상기 핵산과 상기 핵산이 분리되고 남은 상기 용액이 배출되는 배출부;를 포함하여 구성되는 핵산 정제 장치를 이용한 핵산 정제방법에 있어서,

상기 생체시료를 포함하는 상기 용액을 상기 주입부를 통해 상기 핵산 정제 장치에 주입하는 단계;

상기 전압을 인가하여 상기 용액으로부터 상기 핵산을 분리하는 단계; 및

상기 분리된 핵산을 회수하는 단계;를 포함하여 구성되는 것을 특징으로 하는 핵산 정제 방법.
제 11 항에 있어서,

상기 핵산 분리 단계는

파쇄된 생체시료가 포함된 상기 용액을 상기 정제부로 이송하는 단계;

상기 제1 및 제2전극에 제1전압을 인가하여 상기 제1전압이 상기 전극 버퍼에 의해 상기 이온투과성 멤브레인에 전달 및 유지되는 단계;

상기 용액에 포함된 상기 핵산이 상기 이온투과성 멤브레인에 부착되는 단계; 및

상기 배출부를 통해 상기 핵산이 분리되고 남은 잔여용액이 배출되는 단계;를 더 포함하여 구성되는 것을 특징으로 하는 핵산 정제 방법.
제 11 항에 있어서,

상기 핵산 회수 단계는

증류수에 의해 상기 주입부, 상기 정제부 및 상기 배출부가 세척되고, 상기 세척에 사용된 상기 증류수가 배출되는 세척단계;

상기 핵산의 회수를 위한 증류수가 공급되고, 상기 제1 및 제2전극에 제1전압과 극성이 반대인 제2전압이 인가되는 단계; 및

상기 제2전압 인가에 따라 상기 이온투과성 멤브레인으로부터 탈착된 상기 핵산이 상기 증류수에 혼합되어 배출되는 단계;를 더 포함하여 구성되는 것을 특징으로 하는 핵산 정제 방법.
제 12 항에 있어서,

상기 이온투과성 멤브레인 막은 하기 화학식 1의 고분자 화합물로써,

[화학식 1]

당량(equivalent weight, EW)이 1100(g polymer/equivalent of ionic group)인 나피온 과불화 멤브레인(Nafion perfluorinated membrane)인 것을 특징으로 하는 핵산 정제 방법.