KR101411957B1 - 사료용 복합 미생물 제제, 이를 포함하는 사료용 첨가제 및 사료 - Google Patents

사료용 복합 미생물 제제, 이를 포함하는 사료용 첨가제 및 사료 Download PDF

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Abstract

본 발명은 생균제 사료용 복합 미생물 제제에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 콩물 유래의 바실러스 속 균주, 코니박테리움 속 균주, 스포로락토바실러스 속 균주, 락토바실러스 속 균주, 버크홀데리아 속 균주, 메소리조비움 속 균주, 스핑고모나스 속 균주, 슈도모나스 속 균주 및 메틸박테리움 속 균주; 당밀 유래의 글루코노박터 속 균주, 리시니바실러스 속 균주, 피치아 속 균주, 바실러스 속 균주 및 락토바실러스 속 균주; 줄풀 유래의 마이크로코커스 속 균주; 및 쌀 유래의 아세토박터 속 균주;를 포함하여 구성되는 MR-1 균주(기탁번호: KCTC12386BP)를 포함하는 것을 특징으로 하는 생균제 사료용 복합 미생물 제제에 관한 것이다.
상술한 본 발명에 따른 복합 미생물 제제는 열에 강한 내열성 균주를 포함하여 가열처리 시에도 미생물 제제를 생존시킬 수 있고, 내산성 균주를 포함시켜 장까지 도달하여 정상적인 기능을 발휘할 수 있으므로, 동물들의 사료 섭취량을 증대시킴으로써, 증체량을 증가시키는 효과가 있다.

Description

사료용 복합 미생물 제제, 이를 포함하는 사료용 첨가제 및 사료{COMPLEX MICROBE FOR ANIMAL FEED AND COMPLEX MICROBE ADDITIONS INCLUDING THE SAME, AND FEED INCLUDING COMPLEX MICROBE ADDITIONS}
본 발명은 무항생제 사료용 복합 미생물 제제에 관한 것으로, 보다 상세하게는 가축 또는 가금류에 사용되는 사료용 항생제를 대체할 수 있는 무항생제 사료용 복합 미생물 제제와, 상기 무항생제 사료용 복합 미생물 제제가 포함된 사료용 첨가제 및 상기 사료용 첨가제를 포함하는 무항생제 사료에 관한 것이다.
일반적으로 가축에 급여하는 사료에는 동물의 성장 촉진 및 질병억제, 질병치료 및 발육촉진 등을 위해 항생제가 종종 사용된다. 더욱이, 항생제의 첨가는 병원성 미생물의 감염을 예방하기 위해 사용되기도 하지만, 항생제 급여를 통해 사료의 소화율을 향상시킴으로써 사료효율과 증체량을 증가시키는 효과도 있다.
가축농가의 대부분은 가축용 사료에 미량의 항생제가 포함되어 있음에도 불구하고, 가축의 자가 치료와 예방의 목적으로 화학성분의 항생제를 첨가하여 급여하고 있다. 특히 병원 미생물에 의한 질병에 대한 대책으로써 백신접종이나 각종 항생제 등이 가축용 사료에 첨가되고 있다.
그러나 특별한 경우를 제외하고는 야외에서의 모든 질병에 관하여 백신 접종이나 항생제로 대응하는 것은 불가능에 가깝고, 또 그것이 실시 가능하다 하더라도 방대한 양의 약제와 그에 따른 비용을 필요로 하게 되며, 무엇보다 항생제의 오남용은 막을 수 없는 실정이다.
이러한 항생제의 장기급여와 오남용으로 인해 가축 자체에 복합내성균주의 만연으로 질병 발생 시 치료를 어렵게 할 수 있을 뿐만 아니라, 항생제 잔류에 의해 가축의 상품가치를 저하시키는 경우도 있다. 또한, 항생제가 가축의 체내에서 잔류하게 됨으로써 사람이 2차적으로 섭취하면 인체에도 내성이 발현되어 국민 보건에 심각한 문제를 일으키게 된다. 그래서 전 세계적으로 항생제 규제가 강화되고 있는 시점이다.
우리나라의 축산업은 FTA 개방과 함께 위기에 봉착해 있으며, 이에 따른 축산업의 경쟁력을 높이기 위하여 값싸고 안전한 식품의 필요성이 대두되고 있다. 특히 항생제가 사용된 축산물은 국제 교역상에 어려움이 있다.
이로 인해 항생제를 대체코자 하는 많은 투자가 진행되고 있으며, 특히 사료 첨가용 복합 미생물 제제, 면역제제 및 비항생제성 항균제제 등이 대표적인 항생제 대체 물질로 사용되고 있다.
여기서 복합 미생물 제제는 가축의 장내 균총의 균형을 유지하고, 사료의 소화, 흡수율을 높여, 질병 예방, 면역체제 강화 등에 따른 가축의 생산성을 높이기 위해 사료 첨가제 또는 약품으로, 항생제와는 반대로 미생물을 활성화시키는 작용이 있다. 상기 복합 미생물 제제에 사용되는 것은 대표적으로, 호기성간균, 통성혐기성구균, 유산균, 효모 등이 있고, 일반적으로 살아있는 상태로 투여된다.
유럽특허 제0861905호에는 신규한 락토바실러스 속 균주 및 이를 포함하는 위장질환의 치료를 위한 약학적 조성물 및 유제품이 개시된 바 있으며, 국제특허 제1999-29833호에는 식품에 적용될 수 있는 생균제 및 천연약제로서 유용한 균주인 락토바실러스 파라카제이가 개시된 바 있다. 또한, 대한민국특허공개 제1998-78353호에는 유해미생물 억제 활성을 갖는 신규 내산성 락토바실러스 속 미생물 및 이를 함유하는 가축용 생균활성제가 개시된 바 있다. 그러나, 대한민국특허공개 제1998-78353호에 개시된 락토바실러스는 어느 정도 장내 미생물 및 효소의 균형을 개선시키는 효과를 얻을 수는 있으나, 사료 분쇄 시 고열이 발생하고 펠렛 제조 시에 120℃의 온도에서 가공성형이 되는데 펠렛화 과정을 거치면서 가열처리에서 대부분(90%) 이상 사멸하여 기대하는 효과를 얻을 수가 없었다. 또한 생균을 포함한 사료를 투여 시 위산에 의해 사멸하여 장까지 도달할 수 없어 정상적인 기능을 발휘하지 못한다는 문제점이 대두되었다.
이에 본 발명에서는 상기와 같은 문제점을 해결할 수 있도록, 내열성이 우수하여 가열처리 시에도 미생물 제제를 생존시킬 수 있고, 내산성 및 항균성이 우수하여 미생물 제제가 장까지 도달하여 정상적인 기능을 발휘할 수 있으면서 항생제를 대체할 수 있도록 하는 생균제 사료용 복합 미생물 제제를 제공하는 것을 그 해결과제로 한다.
또한, 본 발명은 상기 생균제 사료용 복합 미생물 제제를 포함하는 사료용 첨가제를 제공하는 것을 다른 해결과제로 한다.
또한, 본 발명은 상기 사료용 첨가제에 따른 사료용 첨가제를 포함하는 생균제 사료를 제공하는 것을 그 해결과제로 한다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명은 일 양태로서,
콩물 유래의 바실러스 속 균주, 코니박테리움 속 균주, 스포로락토바실러스 속 균주, 락토바실러스 속 균주, 버크홀데리아 속 균주, 메소리조비움 속 균주, 스핑고모나스 속 균주, 슈도모나스 속 균주 및 메틸박테리움 속 균주;
당밀 유래의 글루코노박터 속 균주, 리시니바실러스 속 균주, 피치아 속 균주, 바실러스 속 균주 및 락토바실러스 속 균주;
줄풀 유래의 마이크로코커스 속 균주; 및
쌀 유래의 아세토박터 속 균주;를 포함하여 구성되는 MR-1 균주(기탁번호: KCTC12386BP)를 포함하는 것을 특징으로 하는 생균제 사료용 복합 미생물 제제에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 다른 양태로서, 상기 복합 미생물 제제를 포함하는 것을 특징으로 하는 생균제 사료용 첨가제에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 또 다른 양태로서, 상기의 사료용 첨가제를 포함하는 것을 특징으로 하는 생균제 사료에 관한 것이다.
상술한 본 발명에 따른 복합 미생물 제제는 열에 강한 내열성 균주를 포함하여 가열처리에도 미생물 제제를 생존시킬 수 있고, 내산성 균주를 포함시켜 장까지 도달하여 정상적인 기능을 발휘할 수 있으므로, 동물들의 사료 섭취량을 증대시킴으로써, 증체량을 증가시키는 효과가 있다. 그리고, 장내 정상적인 균총을 유지시켜 장내 이상 발효에 의한 암모니아, 황화수소 등 발암 촉진 물질을 감소시킨다. 뿐만 아니라, 이러한 유해물질을 흡착하고 배설시키는 작용을 하여 냄새를 최소화하여 사육환경을 향상시켜 가축의 호흡기 질병과 설사 등을 예방하여 건강을 유지시켜주고, 가축의 증체율과 육질을 향상시키는 효능이 있다. 따라서 본 발명에 따른 복합 미생물 제제를 처리할 경우, 상기 제제가 유기산, 항생물질, 소화효소, 비타민 등의 유익한 대사산물의 생성과 사료의 소화촉진, 영양소 흡수촉진을 통하여 사료효율을 개선시키고, 항균물질의 생성으로 장내 부패균의 억제, 유해균의 증식 억제, 유익균의 증식이 촉진되어 체내 면역 시스템을 개선시키는 효과가 있다. 또한, 부수적으로 소화율을 높여서 분변에서의 악취감소 효과로 인해 가축 관리자의 호흡기 질병을 예방할 수 있는 효과가 있다.
도 1은 복합 미생물 제제를 섭취한 돼지의 사이토카인(TNFα, IFNγ) 생성 농도를 나타낸 것이다.
이하, 본 발명을 자세히 설명한다.
본 발명은 일 양태로서, 콩물 유래의 바실러스 속 균주, 코니박테리움 속 균주, 스포로락토바실러스 속 균주, 락토바실러스 속 균주, 버크홀데리아 속 균주, 메소리조비움 속 균주, 스핑고모나스 속 균주, 슈도모나스 속 균주 및 메틸박테리움 속 균주; 당밀 유래의 글루코노박터 속 균주, 리시니바실러스 속 균주, 피치아 속 균주, 바실러스 속 균주 및 락토바실러스 속 균주; 줄풀 유래의 마이크로코커스 속 균주; 및 쌀 유래의 아세토박터 속 균주;를 포함하여 구성되는 MR-1 균주(기탁번호: KCTC12386BP)를 포함하는 것을 특징으로 하는 생균제 사료용 복합 미생물 제제에 관한 것이다.
이러한 본 발명의 복합 미생물 제제에 있어서 상기 MR-1 균주(기탁번호: KCTC12386BP)는 균주를 구성하는 대부분의 균주가 항균성을 나타내고, 특히 콩물 유래의 메소리조비움 속 균주, 스핑고모나스 속 균주, 슈도모나스 속 균주 및 메틸박테리움 속 균주가 내열성 및 내산성을 갖고 있어 가열처리에도 미생물 제제를 생존시킬 수 있고, 복합 미생물 제제가 장까지 도달하여 정상적인 기능을 발휘할 수 있게 된다. 따라서, 본 발명의 MR-1 균주를 포함하는 복합 미생물 제제는 미생물의 성장 및 장내 균총에 직간접적으로 관여해 소화에 유용한 미생물을 증가시키고, 이를 통해 사료의 소화율을 높이고, 병원성 세균에 대한 항균성 및 체내 면역 시스템을 개선시키게 된다.
따라서 다른 양태로서 본 발명은, 상기 복합 미생물 제제를 포함하는 것을 특징으로 하는 생균제 사료용 첨가제에 관한 것이다. 바람직하게는 상기 첨가제는 분말 또는 펠렛 제형이거나 액상 제형인 것을 특징으로 한다.
또다른 양태로서 본 발명은, 상기 사료용 첨가제를 포함하는 것을 특징으로 하는 생균제 사료에 관한 것이다. 바람직하게는 상기 사료는 가축용 또는 가금류용 사료임을 특징으로 한다.
이하 본 발명의 내용을 실시예 및 시험예를 통해 보다 상세하게 설명하기로 한다. 다만 이들 실시예는 본 발명의 이해를 위한 예시에 불과할 뿐 본 발명의 권리범위가 이에 한정되는 것으로 해석하여서는 안된다.
<실시예 1> 대상 균주 및 병원성 미생물의 준비
1. 대상 균주의 준비
대상균주는 한국생명공학연구원 생명자원센터(Korean Collection for Type Culture: KCTC)에 국제기탁한 복합 미생물 균주 MR-1(기탁번호:KCTC12386BP)으로, MR-1 균주의 조성은 하기 표 1에 나타내었다.
또한, MR-1 균주를 구성하는 일부 균주에 대해서도 항균성, 내열성 및 내산성 시험의 대상균주로 하였다.
No. Name of Strain 분리원
1 Micrococcus luteus MR-WR 줄풀
2 Acetobacter pasteurianus MR-R1 유산균 쌀
3 Acetobacter sp. MR-R2 유산균 쌀
4 Corynebacterium imitans MR-L1 콩물
5 Bacillus subtilis MR-L2 콩물
6 Gluconobacter cerinus MR-C1 당밀
7 Lysinibacillus fusiformis nov. MR-C2 당밀
8 Sphingomonas sp. novel MR-HR1 열처리 콩물
9 Pseudomonas saccharophila MR-HR2 열처리 콩물
10 Methylobacterium sp. MR-HR3 열처리 콩물
11 Mesorhizobium sp. MR-HR4 열처리 콩물
12 Burkholderia gladioli MR-OS1 콩물
13 Bacillus subtilis strain CICC 20612 MR-OS2 콩물
14 Sporolactobacillus nakayamae MR-O2 콩물
15 Lactobacillus plantarum MR-O3 콩물
16 Bacillus racemilactius MR-O4 콩물
17 Pichia sp. MR-CD1 당밀
18 Bacillus sp. MR-CD3 당밀
19 Lactobacillus casei MR-CD4 당밀
20 Bacillus subtilis MR-P1 열처리 및 염장처리 콩물
21 Uncultured prokaryote clone MR-P2 열처리 및 염장처리 콩물
22 Bacillus subtilis MR-P3 열처리 및 염장처리 콩물
23 Bacillus subtilis MR-P4 열처리 및 염장처리 콩물
24 Bacillus subtilis MR-P5 열처리 및 염장처리 콩물
25 Bacillus licheniformis MR-P6 열처리 및 염장처리 콩물
26 Bacillus subtilis MR-H1 열처리 및 염장처리 콩물
27 Bacillus subtilis MR-H2 열처리 및 염장처리 콩물
28 Bacillus pumilus MR-H3 열처리 및 염장처리 콩물
2. 병원성 미생물의 선정
상기 대상 균주의 항균성 시험을 위하여 소, 돼지 및 닭에 설사를 유발하는 병원성 미생물을 하기 표 2와 같이 선정하였다.
병원성 박테리아 접종
미생물 축종 / 분리 및 증상 배지 종류 Stock volume OD 0.5 적정 배양 시간
Escherichia coli K99 소 / 설사 (대장균) TSB 10ml 10㎕ 4 hr
Escherichia coli K88 돼지 / 설사 (대장균) TSB 10ml 10㎕ 4 hr
Salmonella enteritidis 닭 / 설사 (장염균) TSB 10ml 10㎕ 5 hr
상기 각각의 병원성 미생물을 TSB(Tryptic Soy Broth) 배지에 10㎕ 접종하고 37℃, 240rpm 으로 진탕배양기(shaking incubator)에서 배양하였다. 다음으로 상기 병원성 미생물의 성장곡선을 파악하여 OD(optical density)값 0.5가 되도록 준비했다. 이때 OD값을 0.5로 맞추기 위하여 E.coli K99(Escherichia coli K99)은 4시간, E.coli K88(Escherichia coli K88)은 4시간, SE(Salmonella enteritidis)는 5시간 정도 배양하였다.
<시험예 1> 대상균주에 대한 항균성 시험
상기 MR-1 균주와 MR-1 균주를 구성하는 균주 중 1~19번의 균주를 대상균주로 하여, 상기 선정된 병원성 미생물에 대한 항균력을 검증하였다.
구체적으로 Bottom 배지로는 NDLM 배지(플레이트 당 20ml)를 이용하였다. 이 때, 대상 균주의 활성화를 위해 배지를 1일간 진탕 배양하였다.
다음으로, 배지 위에 글래스 로드(glass rod)로 상기 병원성 미생물 100㎕를 고르게 접종하고 코르크 보러를 이용하여 플레이트에 4개의 구멍을 뚫은 후, 플레이트 당 균주를 4개씩 접종하였다. 이 때 주입되는 균주의 양은 20㎕로 하였다. 30℃에서 24시간 배양한 후 클리어 존의 크기를 측정하고, 이를 수치화하여 그 결과를 하기 표 3에 나타내었다.
Figure 112013041639922-pat00001
상기 표 3에서 확인할 수 있는 바와 같이, Micrococcus luteus MR-WR는 돼지설사균인 K88에 약한 항균력을 가지는 것으로 나타났으며, Acetobacter pasteurianus MR-R1는 소설사균인 K99와 돼지설사균 K88에 항균력을 가지는 것으로 나타났다. 또한 Acetobacter sp. MR-R2는 소설사균인 K99에 항균력을 가지며 돼지설사균 K88에 약한 항균력을 가지는 것으로 나타났고, Bacillus subtilis MR-L2는 소설사균 K99에 항균력을, Gluconobacter cerinus MR-C1은 소설사균인 K99와 돼지설사균 K88에 항균력을 가지는 것으로 나타났다. 또한 Lysinibacillus fusiformis nov. MR-C2는 소설사균인 K99에 다소 강한 항균력을 가지는 것으로 나타났고, Sphingomonas sp. novel MR-HR1은 소설사균인 K99에 강한 항균력을 가지는 것으로 나타났으며, Pseudomonas saccharophila MR-HR2는 K99, K88, 닭·돼지의 설사균인 Salmonella균 모두에 항균력을 가지며 특히 소설사균인 K99에 매우 강한 항균력을 가지는 것을 확인할 수 있었다. 또한 Methylobacterium sp. MR-HR3는 K99, K88, Salmonella균 모두에 항균력을 가지며 소설사균인 K99에 강한 항균력을 가지는 것으로 확인되었고, Mesorhizobium sp. MR-HR4는 K99에 강한 항균력을 가지며 Salmonella균에 항균력을 가지는 것으로 나타났으며, Burkholderia gladioli MR-OS1는 소설사균 K99에 강한 항균력을 가지는 것으로 확인되었다. 또한 Bacillus subtilis MR-OS2는 소설사균 K99에 다소 강한 항균력을, Sporolactobacillus nakayamae MR-O2는 소설사균 K99에 강한 항균력을 가지는 것으로 나타났으며, Lactobacillus plantarum MR-O3는 소설사균 K99에 다소 강한 항균력을 가지는 것으로 나타났다. 또한, Bacillus racemilactius MR-O4는 K99에 항균력을, Pichia sp. MR-CD1은 K99에 다소 강한 항균력을 가지며 K88에 약한 항균력을 가지는 것으로 나타났으며, Bacillus sp. MR-CD3는 K99와 K88에 항균력을, Lactobacillus casei MR-CD4는 K99와 K88에 항균력을 가지는 것으로 확인되었다.
아울러, 상기의 균주들을 모두 포함하고 있는 MR-1 균주는 3종 모두에 항균력을 가지며 특히 소설사균 K99에 매우 강한 항균력을 가지는 것으로 확인되었다.
따라서 상기의 결과로부터 본 발명의 MR-1 균주가 가축용 사료 또는 가금용 사료에 포함될 경우 강한 항균력을 나타낼 수 있음을 확인할 수 있었다.
<시험예 2> 대상균주에 대한 내열성 시험
상기에서 준비한 MR-1 균주 중 8~11번 균주를 배양한 배양액을 250ml 삼각플라스크에 넣고, 오토클레이브(autoclave)로 100℃에서 30분간 자비살균 하기 전과 한 후의 미생물 생균수를 계수하여 그 결과를 표 4에 나타내었다.
균 주 멸균전 개체수 (CFU/ml) 멸균후 개체수
(CFU/ml) 		생존율(%)
스핑고모나스 속 (MR-HR1) 2.0×107 8.7×106 43.5
슈도모나스 사카로필라 (MR-HR2) 1.0×107 9.5×106 50.0
메틸로박테리움 속 (MR-HR3) 1.5×107 7.1×106 47.3
메소리조비움 속 (MR-HR4) 1.2×107 7.3×106 60.8
상기 표 4에서 보는 바와 같이, 본 발명의 MR-1 균주를 구성하는 균주 중, 스핑고모나스 속, 슈도모나스 사카로필라, 메틸로박테리움 속 및 메조리조비움 속에 속하는 균주의 경우, 열처리 콩물에서 분리한 균주로서 멸균 전 개체수와 멸균 후 개체수를 비교시 그 생존율이 40% 이상인 것을 확인할 수 있었는 바, 내열성이 우수한 균주인 것을 확인할 수 있었다. 이는, 본 발명의 MR-1 균주의 경우 사료 제조 공정시 열처리에 의한 생균제 활성감소와 같은 문제점을 극복할 수 있는 복합 미생물 제제로 사용가능함을 의미한다.
<시험예 3> 대상균주에 대한 내산성 시험
상기 내열성 시험에서 양호한 특성을 보인 균주(MR-1 균주를 구성하는 균주 중 8~11번 균주)를 대상균주로 하고, 이를 NaCl 0.4g과 HCl 1.4ml을 200ml 메스플라스크(volumetric flask)에 넣고 증류수로 표선을 맞춘 인공위액에 배양액을 넣고 4시간 교반하여 반응전과 반응후의 미생물 생균수를 계수하여 그 결과를 표 5에 나타내었다.
균 주 인공위액 반응전
개체수(CFU/ml) 		인공위액 반응후
개체수(CFU/ml) 		생존율
(%)
스핑고모나스 속 (MR-HR1) 2.5×107 9.2×106 36.8
슈도모나스 사카로필라 (MR-HR2) 1.2×107 8.9×106 74.1
메틸로박테리움 속 (MR-HR3) 1.3×107 8.6×106 66.2
메소리조비움 속 (MR-HR4) 1.0×107 8.4×106 84.0
상기 표 5에서 확인할 수 있는 바와 같이, MR-1을 구성하는 균주 중 일부 균주인 대상균주는 인공 위액과 반응 후 전부 30% 이상의 생존율을 보이며 우수한 내산성을 지니는 것으로 나타났다. 따라서 상기의 균주를 포함하는 MR-1 균주는 동물의 섭취 시 장까지 미생물이 도달하여 항균 특성을 나타낼 수 있는 것으로 판단된다.
<시험예 4> 대상균주에 대한 항생제 내성 시험
상기 MR-1 균주와 MR-1 균주를 구성하는 균주 중 1~19번의 균주를 대상균주로 하였고, 4종의 항생제(세프티오퍼, 암피실린, 염산옥시테트라사이클린, 플로르페니콜)를 준비하여 항생제 내성을 시험하였다. 이 때, 상기 항생제는 각 역가에 따른 희석비를 환산하여 희석하여 사용하였다.
시험을 위하여 Bottom 배지로는 NDLM 배지(플레이트 당 20ml)를 이용하였다. 이 때, 대상 균주의 활성화를 위해 배지를 1일간 진탕 배양하였다.
다음으로, 준비된 Bottom 배지 위에 면봉으로 대상균주의 균액 100㎕를 고르게 접종하고 코르크 보러를 이용하여 플레이트에 4개의 구멍을 뚫은 후, 플레이트 의 각 구멍에 4종의 항생제를 각각 약 20㎕씩 주입하였다. 30℃에서 24시간 배양한 후 클리어 존의 크기를 측정하고, 이를 수치화하여 그 결과를 하기 표 6에 나타내었다.
Figure 112013041639922-pat00002
상기 표 6에서 확인할 수 있는 바와 같이, Corynebacterium imitans MR-L1은 4종의 항생제 모두에서 내성을 가지며 특히 세프티오퍼와 염산옥시테트라사이클린에서 내성을 더욱 가지는 것으로 확인되었고, Bacillus subtilis MR-L2은 염산옥시테트라사이클린에서 내성을 가지는 것으로 나타났다. 또한, Gluconobacter cerinus MR-C1는 세프티오퍼와 암피실린에 내성을 가지며 플로르페니콜에서 내성을 더욱 가지는 것으로 나타났고, Lysinibacillus fusiformis nov. MR-C2는 세프티오퍼와 플로르페니콜에서 내성을 가지며 염산옥시테트라사이클린에서 내성을 더욱 가지는 것으로 확인되었다. Sphingomonas sp. novel MR-HR1는 암피실린 외 3종에 내성을 가지며 특히 염산옥시테트라사이클린과 플로르페니콜에서 강한 내성을 가지는 것으로 나타났고, Pseudomonas saccharophila MR-HR2는 4종 모두에서 내성을 가지며 암피실린에 내성을 더욱 가지고 특히 염산옥시테트라사이클린에서 강한 내성을 가지는 것으로 나타났으며, Methylobacterium sp. MR-HR3는 세프티오퍼와 플로르페니콜에서 내성을 가지는 것으로 확인되었다. 또한, Mesorhizobium sp. MR-HR4는 플로르페니콜에서 내성을 가지고, Lactobacillus plantarum MR-O3는 염산옥시테트라사이클린과 플로르페니콜에서 내성이 좋은 것으로 확인되었으며, Pichia sp. MR-CD1은 세프티오퍼 외 3종에 내성을 가지며 암피실린에서 내성을 더욱 가지는 것으로 확인되었다. 또한, Bacillus sp. MR-CD3는 세프티오퍼와 암피실린에서 내성이 좋은 것으로 확인되었고, Lactobacillus casei MR-CD4는 염산옥시테트라사이클린에서 내성을 가지는 것으로 확인되었다.
아울러, 상기의 균주들을 모두 포함하고 있는 MR-1 균주는 세프티오퍼 외 3종에 내성을 가지며 플로르페니콜에서 내성을 더욱 가지는 것으로 확인되었다.
따라서 상기의 결과로부터 본 발명의 MR-1 균주가 가축용 사료 또는 가금용 사료에 포함될 경우 항생제 내성을 가짐을 확인할 수 있었다.
<시험예 5> 돼지 사양 시험
상기 MR-1 균주를 대상균주로 하여 육성돈에 있어서 사료 내 첨가가 생산성적 및 혈액성상에 미치는 영향을 확인하기 위한 시험을 진행하였다.
시험 조건은 다음과 같다.
(1) 실험농장 : 녹원축산(경남 김해시 주촌면 소재, 대표: 권상오)
(2) 공시동물 : 이유자돈 38일령(10kg) 92(두)(23두씩 4처리)
(3) 시험 기간 : 2012.11.12-12.27(45일간)
(4) 실험구 명칭
① 대조구 1(항생제 처리구): 항생제(티아물린(테트라사이클린)) 1kg/ton + 부형제 0.2%/급여사료
② 대조구 2(무항생제 처리구): 0.2%/급여사료
③ 대조구 3(타사 생균제): 생균제 0.2%/급여사료
④ 시험구 1(복합 생균제 MR-1 처리구): 생균제 0.2%/급여사료
(4) 측정항목
① 생산성 (일당증체량, 일당사료섭취량, 사료효율)
② 영양소 소화율
③ 면역능력 지표 (WBC, Cell population, TNF-α, IFN-γ)
상기 시험에 따른 생산성(일당증체량, 일당사료섭취량, 사료효율)에 대한 시험결과는 하기 표 7에 나타내었다. 이 때, 생산성 및 증체율을 측정하기 위해 입수시와 매주별 이유자돈의 체중을 측정하여 증체율을 계산하였으며, 사료 섭취율은 주간별로 누적 사료 섭취량으로 계산하였다. 사료 효율(%)은 체중 증가량을 사료 섭취율로 나누어 계산하였다.
Figure 112013041639922-pat00003
※단, 상기 표에서 값은 평균±SEs (n=23)의미로 표현되었다. a, b, c, d의 서로 다른 윗 첨자들의 값은 던칸의 다중분석을 이용하여 분석하였으며, 그 값들은 유의성 있는 차이를 나타낸다. (P < 0.05, 던칸의 다중분석(Duncan's test)).
상기 표 7에서 확인할 수 있는 바와 같이, MR-1 균주를 포함하는 복합 생균제를 45일간 처리한 시험구의 경우, 대조구에 비하여 일당증체량이 증가하는 반면에 사료 섭취량은 감소하는 경향을 보였다. 특히 사료 효율 및 요구율에서 대조구 1 내지 3에 비하여 유의차 있게 개선되는 것으로 확인되었다 (P<0.05). 즉, 상기 결과로부터 MR-1 균주를 포함하는 복합 미생물 제제를 처리할 경우, 상기 제제가 유기산, 항생물질, 소화효소, 비타민 등의 유익한 대사산물의 생성과 사료의 소화촉진, 영양소 흡수촉진을 통하여 사료효율을 개선시킨 것으로 판단되어진다. 특히, 항균성이 강화되어 항균물질의 생성으로 장내 부패균의 억제, 유해균의 증식 억제, 유익균의 증식 촉진 등으로 인해 설사예방 등의 살균효과가 있는 것으로 판단된다.
또한, 각 돼지 그룹별의 영양소 소화율, 면역능력 지표 (WBC, Cell population, TNFα, IFNγ)에 대한 결과는 하기 표 8 및 도 1에 나타내었다.
Figure 112013041639922-pat00004
※ 단, 상기 표에서 값은 평균±SEs (n=5)의미로 표현되었다. a, b, c의 서로 다른 윗 첨자들의 값은 던칸의 다중분석을 이용하여 분석하였으며, 그 값들은 유의성 있는 차이를 나타낸다. (P < 0.05, 던칸의 다중분석(Duncan's test)).
※ 약어: WBC(White blood cel), RBC(Red blood cel), HGB( Hemoglobin concentration), HCT(Hematocrit), MCV(Mean corpuscular volume), MCH(Mean corpuscular hemoglobin), MCHC(Mean corpuscular hemoglobin concentration), PLT(Platelet)
상기 표 8에서 보는 바와 같이, 혈액학 분석결과 MR-1균주를 처리한 시험구의 경우 대조구 1 내지 2의 경우에 비하여 WBC(백혈구)의 증가가 많은 것으로 확인되었으며, MCV(평균 적혈구 용적) 및 MCH(평균 혈구 혈색소)의 경우에 있어서는 대조구 1 내지 3의 경우에 비하여 증가하는 경향을 보였다. 이는 시험구의 경우 MR-1 균주의 투여로 인하여 면역과 깊은 관련성이 있는 백혈구 수치를 증가시켜 항병력이 증가되는 결과를 가져왔기 때문인 것으로 판단된다. 즉, 비병원성 물질인 MR-1의 균체가 병변을 유도하지 않는 수준에서 가축의 면역기능을 자극함으로써 장내 유해 세균에 대한 면역능력을 증강시켜주는 것으로 판단되어진다.
또한 도 1은 복합 미생물 제제를 섭취한 돼지의 사이토카인(TNFα, IFNγ) 생성농도를 나타낸 것이다. 이때, 혈장 내 TNFα, IFNγ의 사이토카인(Cytokine) 생성농도 분석은 시험개시일(0일)과 시험종료일(45일)에 각 그룹으로부터 채혈한 혈액 내 혈장을 이용하였으며, 혈장 내 TNFα 및 IFNγ의 사이토카인 생성 농도는 sandwich ELISA kits(Abcam plc., Cambridge, MA, USA)내 지침 가이드에 따라 측정한 후, 혼합제제의 급여에 따른 면역세포의 반응을 측정하였다. 여기서, 면역세포의 반응을 측정하기 위하여 시험 개시일(0일)과 시험 종료일(45일)에 각 그룹 내 이유자돈의 목 경정맥에서 채혈한 혈액샘플(5ml)을 EDTA 진공채혈관(Becton and Dickson Inc., NJ, USA)에 옮겨 담은 후, 각 진공채혈관을 -4℃에 보관하였다. 실험실 내 무균 상태의 클린 벤치에서 각 샘플 내 혈장을 새로운 1.5ml 에펜돌프 튜브에 옮겨 담은 후, 사이토카인(TNFα, IFNγ) 생성농도를 분석하기까지 -80℃에 보관하였다.
도 1을 참조하면, 혈장 내 TNFα 생산 유도에 있어서, 시험구(MR-1 처리구)의 사료를 급여한 경우 대조구 2(무항생제 처리구)의 사료를 급여한 경우에 비하여 혈장 내 TNFα 생산 유도가 유의적으로 증가되었으나, 대조구 1(항생제 처리구)와 비교하여 비슷한 수준의 결과를 나타내는 것이 관찰되었다. 반면에, 혈장 내 IFNγ 생산 유도에 있어서, 시험구(MR-1 처리구)의 사료를 급여한 경우에 대조구 1(항생제 처리구)의 사료를 급여한 경우에 비하여 혈장 내 IFNγ 생산 유도가 유의적으로 증가된 것을 확인할 수 있었다. 아울러 대조구 1(항생제 처리구)의 사료를 급여한 경우 대조구 2(무항생제 처리구)의 사료를 급여한 경우에 비하여 혈장 내 IFNγ 생산 유도가 유의적으로 증가된 것을 확인할 수 있었다. 이는, 항생제가 장 내의 내재성 박테리아들의 환경을 변화시킴에 따라 항바이러스 인자(IFNγ)의 역할이 감소되기 때문인 것으로 판단할 수 있다. 따라서 MR-1균주의 처리가 항생제 처리보다 항바이러스 인자의 역할을 증가시키는 역할을 하는 것으로 판단되어진다.
또한, 상기 시험이 완료된 후 시험구의 돼지에 대하여 출하가 2주 정도 빨리 이루어졌는바, 면역력의 향상됨에 따라 성장속도 등에서 보다 효율적임을 의미하는 것으로 판단된다.
상술한 바와 같이 본 발명의 복합 미생물 균주인 MR-1(기탁번호: KCTC12386BP)은 항균성이 우수하고, 내열성 및 내산성을 갖는 균주를 포함하고 있고, 항생제에 대한 우수한 내성을 가지는 것으로 확인되었고, 돼지의 사양 시험을 통해 돼지의 면역력을 향상시킴을 확인할 수 있었다. 따라서 본 발명의 MR-1 균주를 포함하는 복합 미생물 제제는 미생물의 성장 및 장내 균총에 직간접적으로 관여해 소화에 유용한 미생물을 증가시키고, 이를 통해 사료의 소화율을 높이게 된다. 더욱이, 이와 같이 사료의 소화율을 높임으로써 분뇨 중 냄새의 원인물질인 유기물과 질소 함량을 낮추어 사료의 소화율을 높임으로써 분뇨 중 냄새의 원인물질인 유기물질과 질소 함량을 낮추어 악취를 감소하게 된다. 뿐만 아니라, 사료의 제조공정 과정 중 가열 공정 과정을 거쳐도 일정 수의 균수를 유지하여 병원성 세균에 대한 항균성 및 체내 면역 시스템을 개선시키게 된다.
한국생명공학연구원 KCTC12386BP 20130319

Claims (5)

  1. 콩물 유래의 바실러스 속 균주, 코니박테리움 속 균주, 스포로락토바실러스 속 균주, 락토바실러스 속 균주, 버크홀데리아 속 균주, 메소리조비움 속 균주, 스핑고모나스 속 균주, 슈도모나스 속 균주 및 메틸박테리움 속 균주;
    당밀 유래의 글루코노박터 속 균주, 리시니바실러스 속 균주, 피치아 속 균주, 바실러스 속 균주 및 락토바실러스 속 균주;
    줄풀 유래의 마이크로코커스 속 균주; 및
    쌀 유래의 아세토박터 속 균주;를 포함하여 구성되는 MR-1 균주(기탁번호: KCTC12386BP)를 포함하는 것을 특징으로 하는 생균제 사료용 복합 미생물 제제.
  2. 제 1 항에 따른 복합 미생물 제제를 포함하는 것을 특징으로 하는 생균제 사료용 첨가제.
  3. 제 2 항에 있어서,
    상기 첨가제는 분말 또는 펠릿 제형이거나 액상 제형인 것을 특징으로 하는 생균제 사료용 첨가제.
  4. 제 2 항 또는 제 3 항에 따른 사료용 첨가제를 포함하는 것을 특징으로 생균제 사료.
  5. 제 4 항에 있어서, 상기 사료는 가축용 또는 가금류용 사료임을 특징으로 하는 생균제 사료.
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