KR101411740B1 - Bicistronic expression vector for expressing antibody and method for producing antibody using the same - Google Patents

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Abstract

본 발명은 '프로모터-인트론-항체 경쇄 유전자-polyA'를 포함하는 제1발현 카세트 및 '프로모터-인트론-항체 중쇄 유전자-IRES(internal ribosome entry site)-증폭 유전자-polyA'를 포함하는 제2발현 카세트를 포함하는 항체 발현용 바이시스트로닉 발현벡터, 상기 발현벡터가 형질전환된 동물세포 및 상기 동물세포를 배양하는 단계를 포함하는 항체의 생산 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 인트론을 포함하는 항체 발현용 바이시스트로닉 발현벡터를 이용하면, 원하는 항체를 고효율로 발현시킬 수 있는 발현벡터를 제작할 수 있으며, 상기 발현벡터가 형질전환된 동물세포를 배양하여 항체를 안정적이고 고효율로 생산할 수 있다.The present invention relates to a first expression cassette comprising a 'promoter-intron-antibody light chain gene -polyA' and a second expression comprising a 'promoter-intron-antibody heavy chain-IRES (internal ribosome entry site) A biosystronic expression vector for expressing an antibody comprising a cassette, an animal cell transformed with the expression vector, and a method for producing an antibody comprising culturing the animal cell. By using the bistronic expression vector for expression of an antibody comprising the intron according to the present invention, an expression vector capable of expressing a desired antibody with high efficiency can be produced. An animal cell transformed with the expression vector can be cultured, It can be produced stably and with high efficiency.

Description

항체 발현용 바이시스트로닉 발현벡터 및 이를 이용한 항체의 생산 방법{Bicistronic expression vector for expressing antibody and method for producing antibody using the same}Bicystronic Expression Vector for Expression of Antibody and Method of Producing Antibody Using the Bicistronic Expression Vector for Expressing Antibody

본 발명은 '프로모터-인트론-항체 경쇄 유전자-polyA'를 포함하는 제1발현 카세트 및 '프로모터-인트론-항체 중쇄 유전자-IRES(internal ribosome entry site)-증폭 유전자-polyA'를 포함하는 제2발현 카세트를 포함하는 항체 발현용 바이시스트로닉 발현벡터, 상기 발현벡터가 형질전환된 동물세포 및 상기 동물세포를 배양하는 단계를 포함하는 항체의 생산 방법에 관한 것이다.
The present invention relates to a first expression cassette comprising a 'promoter-intron-antibody light chain gene -polyA' and a second expression comprising a 'promoter-intron-antibody heavy chain-IRES (internal ribosome entry site) A biosystronic expression vector for expressing an antibody comprising a cassette, an animal cell transformed with the expression vector, and a method for producing an antibody comprising culturing the animal cell.

유전자 재조합 기술을 이용하여 다양한 인간유래 단백질들이 발현되고 있으나, 진핵세포 특유의 당화, 인산화 등과 같은 일련의 과정으로 인하여 포유동물세포를 이용할 경우에만 정상적으로 생물학적 활성을 갖는 단백질이 합성되는 경우가 많다. 치료용 항체로 많이 사용되는 면역글로불린G (IgG) 유전자는 중쇄(heavy chain) 유전자와 경쇄(light chain) 유전자로 구성되어 있다. 각각의 유전자로부터 만들어지는 중쇄와 경쇄 단백질은 세포내에서 접힘(folding) 과정에서 서로 결합하여 세포 밖으로 분비된다. 유전자 재조합 항체 단백질을 생산하기 위하여 주로 포유동물세포의 하나인 CHO 세포(Chinese hamster ovary 세포, 중국 햄스터 난소 세포)를 많이 이용한다(Kaufman 등, Mol. Cell. Biol. (1985) 5, 1750).Although various human-derived proteins are expressed using genetic recombination technology, protein having normally biological activity is synthesized only when mammalian cells are used due to a series of processes such as eukaryotic cell-specific glycation and phosphorylation. The immunoglobulin G (IgG) gene, which is widely used as a therapeutic antibody, is composed of a heavy chain gene and a light chain gene. The heavy and light chain proteins from each gene are secreted out of the cell by binding to each other during folding within the cell. In order to produce the recombinant antibody protein, CHO cells (Chinese hamster ovary cells, Chinese hamster ovary cells), which is one of the mammalian cells, are frequently used (Kaufman et al., Mol. Cell. Biol. (1985) 5, 1750).

포유동물 세포에서 보다 강력하고 안정된 유전자 발현을 유도할 수 있는 재조합 발현벡터를 제조하기 위해 사용되고 있는 여러 가지 전략들 중에서 대표적인 방법은 강력한 프로모터를 선별하여 유전자 발현률을 증대시키는 방법이다. 프로모터는 여러가지 전사 인자(transcription factor)의 결합 위치와 TATA box가 존재하여, RNA 중합효소가 결합하여 mRNA 합성이 시작되는 DNA 상의 요소로서 프로모터의 성능에 따라 유전자 발현량이 크게 좌우된다. 높은 항체 발현을 위해서는 항상 높은 발현을 갖는 것이 적합한데, 대표적인 강력한 프로모터로 CMV(Cytomegalovirus) 프로모터와 인간 EF1-α(Elongation factor1-α) 프로모터 등이 있다.Among the various strategies used to produce recombinant expression vectors capable of inducing stronger and more stable gene expression in mammalian cells, a representative method is to select a strong promoter to increase gene expression rate. The promoter is a component of the DNA on which mRNA synthesis starts by binding of various transcription factors and TATA box, which binds with RNA polymerase, and the amount of gene expression depends on the performance of the promoter. For high antibody expression, it is preferable to have high expression at all times. Typical strong promoters include CMV (Cytomegalovirus) promoter and human EF1-alpha (Elongation factor 1-alpha) promoter.

강력한 프로모터의 사용을 통한 벡터 자체의 mRNA 합성능력을 높이는 방법 외에 치료용 단백질의 생산성을 높이기 위해 널리 사용되는 방법으로 유전자 증폭방법이 있다. 그 방법을 간단히 요약하면, 세포에 외부 유전자를 형질전환 시킨 후 화학 약품을 이용하여 외부 유전자가 염색체에 재조합된 세포만 성장이 가능하도록 선택 배양하여 세포를 분리한 후, 더욱 많은 단백질을 발현하도록 하기 위해서 증가된 양의 화학 약품을 배지에 첨가하여 염색체에 재조합된 외부 유전자의 증폭을 유도하는 것이다. 유전자 증폭에 사용되는 대표적인 유전자로는 DHFR (dehydrofolate reductase, 이하 'DHFR'이라 칭한다)과 GS(glutamine synthetase, 이하 'GS'라 칭한다)가 있다. 이들 증폭 유전자들의 증폭에 사용되는 약품으로는 DHFR에 대하여는 메토트렉세이트(methotroxate, 이하 'MTX'라 한다)가 사용되고 GS에 대하여는 메티오닌 설폭시민(Methioine sulfoximine, 이하 'MSX'라 한다)이 사용된다. 이러한 유전자 증폭과정을 거쳐 1000개 이상의 증폭된 외부유전자를 갖는 세포주의 제조가 가능하게 된다.In addition to enhancing the mRNA synthesis ability of the vector itself through the use of a strong promoter, there is a gene amplification method widely used to increase the productivity of the therapeutic protein. To summarize the method, an external gene is transformed into a cell, and then the cell is isolated by using a chemical agent to selectively cultivate only the cell that has been recombined with the chromosome of the foreign gene so that more proteins can be expressed , An increased amount of the chemical is added to the medium to induce amplification of the foreign gene recombined into the chromosome. Representative genes used for gene amplification include DHFR (dehydrofolate reductase) and GS (glutamine synthetase). Methotrexate (hereinafter referred to as 'MTX') is used for DHFR and Methioine sulfoximine (hereinafter referred to as 'MSX') is used for GS for the amplification of these amplified genes. Through such a gene amplification process, it becomes possible to prepare a cell line having more than 1,000 amplified foreign genes.

통상적으로 항체 유전자를 계속적으로 발현하는 세포주를 제조하기 위해서는 발현하고자 하는 중쇄와 경쇄 유전자를 포함하는 플라스미드 벡터 DNA와 증폭 유전자를 갖는 벡터 DNA를 함께 세포에 동시 형질전환시킨 후 두개의 DNA가 동시에 염색체에 삽입된 세포주를 분리하거나(Kaufman, Methods in Enz.(1990) 185, 487), 하나의 벡터 내에 SV40 프로모터에 의해 증폭유전자가 발현되도록 하여 그 벡터가 염색체에 삽입된 세포주를 분리하는 방법이 사용된다.Generally, in order to produce a cell line that continuously expresses an antibody gene, a plasmid vector DNA containing a heavy chain and a light chain gene to be expressed and a vector DNA having an amplification gene are co-transformed into cells together, and then two DNAs are co- (Kaufman, Methods in Enz. (1990) 185, 487), or a method in which an amplified gene is expressed by the SV40 promoter in one vector, and a cell line in which the vector is inserted into the chromosome is isolated .

또 다른 증폭 유전자 발현 방법으로 바이시스트로닉 벡터를 제조하는 방법이 있다. 진핵생물은 원핵생물과 달리 원칙적으로 하나의 프로모터에서 하나의 mRNA가 만들어지고 그 유전자만 해독되어 단백질이 합성된다. 그런데 일부 바이러스의 경우 mRNA 중간에 리보좀이 결합할 수 있는 서열이 있어 하나의 mRNA에서 여러 단백질을 합성할 수 있게 해 준다. 항체 유전자와 증폭 유전자가 서로 다른 프로모터에 의하여 발현될 경우, 유전자 증폭시 증폭 유전자 부분만 증폭되고 항체 유전자의 증폭은 이루어 지지 않을 수 있는데, IRES(internal ribosome entry site)를 사용하면 동일한 프로모터로부터 발현되므로 이러한 문제를 피할 수 있다.Another method for producing bi-systolic vectors by an amplification gene expression method is available. Unlike prokaryotes, eukaryotes, in principle, produce one mRNA in a single promoter and only the gene is decoded to synthesize the protein. However, some viruses have a sequence that can bind to ribosomes in the middle of mRNA, allowing the synthesis of multiple proteins in one mRNA. When the antibody gene and the amplified gene are expressed by different promoters, only the amplified gene part can be amplified and the amplification of the antibody gene may not be performed during gene amplification. If the internal ribosome entry site (IRES) is used, it is expressed from the same promoter This problem can be avoided.

한편, 트라스트주맙(trastuzumab, herceptin이라고도 함)은 미국 Genentech사에서 개발한 HER2에 대한 인간화 항체로서, HER2/neu를 과발현시키는 유방암의 치료를 주 적응증으로 하는 항체치료제이다. 트라스투주맙은 HER2에 결합하여 암세포가 증식하는 과정을 억제하며 ADCC를 통하여 암세포 사멸을 유도한다. 트라스투주맙은 그 효능이 우수하며 탈모나 오심, 구토 및 골수에 대한 부작용을 일으키지 않아 환자의 삶의 질 개선에도 효과적인 것으로 알려져 있다.
Meanwhile, trastuzumab (also known as herceptin) is a humanized antibody against HER2 developed by Genentech in the USA. It is a therapeutic agent for the treatment of breast cancer that overexpresses HER2 / neu. Trastuzumab inhibits the proliferation of cancer cells by binding to HER2 and induces cancer cell death through ADCC. Trastuzumab is known to be effective in improving the quality of life of patients by not causing adverse effects on hair loss, nausea, vomiting and bone marrow.

이러한 배경 하에서, 본 발명자들은 다양한 포유동물세포에서 강력하고 안정하게 유전자 발현을 유도할 수 있는 방법을 찾기 위해 예의 노력한 결과, 기존의 발현벡터에 인트론을 포함하는 바이시스트로닉 발현벡터를 제작하면 증폭 유전자와 함께 항체의 경쇄 및 중쇄 유전자를 동시에 고발현시킬 수 있음을 발견함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
Under these circumstances, the present inventors have made intensive efforts to find a method capable of inducing strong and stable gene expression in various mammalian cells. As a result, when a bistronic expression vector containing an intron is produced in a conventional expression vector, And the light and heavy chain genes of the antibody can be highly expressed at the same time, thereby completing the present invention.

본 발명의 하나의 목적은 '프로모터-인트론-항체 경쇄 유전자-polyA'를 포함하는 제1발현 카세트 및 '프로모터-인트론-항체 중쇄 유전자-IRES(internal ribosome entry site)-증폭 유전자-polyA'를 포함하는 제2발현 카세트를 포함하는 항체 발현용 바이시스트로닉 발현벡터를 제공하는 것이다.One object of the present invention is to include a first expression cassette comprising a 'promoter-intron-antibody light chain gene -polyA' and a 'promoter-intron-antibody heavy chain-IRES (internal ribosome entry site) amplification gene -polyA' The second expression cassette comprising a second expression cassette for expressing the antibody.

본 발명의 다른 목적은 상기 발현벡터가 형질전환된 동물세포를 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide an animal cell in which the expression vector is transformed.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 동물세포를 배양하는 단계를 포함하는 항체의 생산 방법을 제공하는 것이다.
It is still another object of the present invention to provide a method for producing an antibody comprising culturing the animal cells.

상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 '프로모터-인트론-항체 경쇄 유전자-polyA'를 포함하는 제1발현 카세트 및 '프로모터-인트론-항체 중쇄 유전자-IRES(internal ribosome entry site)-증폭 유전자-polyA'를 포함하는 제2발현 카세트를 포함하는 항체 발현용 바이시스트로닉 발현벡터를 제공한다.
In one aspect of the present invention, the present invention provides a first expression cassette comprising a 'promoter-intron-antibody light chain gene -polyA' and a 'promoter-intron-antibody heavy chain-IRES (internal ribosome entry site) And a second expression cassette comprising the amplification gene -polyA '.

본 발명은 다양한 포유동물세포에서 강력하고 안정적으로 유전자 발현을 유도할 수 있도록 인트론을 포함하여 항체의 중쇄 및 경쇄 유전자와 증폭 유전자가 하나의 유전자처럼 발현되도록 설계된 바이시스트로닉 발현벡터를 제공할 수 있는 것에 그 특징이 있다.The present invention can provide a biSystronic expression vector designed to express the heavy and light chain genes of the antibody and the amplified gene as a single gene, including introns, so as to induce strong and stable gene expression in various mammalian cells There are those features.

본 발명에서 용어, "바이시스트로닉(bicistronic)"이란, 진핵세포 내에서 mRNA의 내부에서도 리보좀이 폴리펩티드를 합성할 수 있게 되어 하나의 mRNA로부터 여러 단백질이 합성 가능하게 된 시스템을 의미하며, 본 발명에서는 항체 유전자와 증폭 유전자가 동시에 발현될 수 있도록 벡터를 디자인하였다.The term " bicistronic " in the present invention means a system in which a ribosomal polypeptide can be synthesized in the interior of mRNA in eukaryotic cells, and various proteins can be synthesized from one mRNA. A vector was designed so that an antibody gene and an amplified gene can be expressed simultaneously.

일반적으로, 대장균과 같은 원핵세포가 하나의 mRNA의 여러 위치에 리보좀이 결합하여 한번에 여러 단백질을 합성할 수 있는 폴리시스트로닉(polycistronic) 시스템을 가진 것과는 달리, 진핵세포에서는 mRNA로부터 단백질을 해독(translation)할 때, 리보좀이 mRNA의 5' 끝에 부착된 후 스캐닝(scanning) 방법을 통해서 개시 코돈인 AUG를 찾게 되고, 이 AUG 코돈으로부터 단백질의 합성이 시작됨에 따라 하나의 mRNA로부터 반드시 하나의 폴리펩티드가 형성되는 모노시스트로닉(monocistronic) 시스템을 갖게 되며, ATG의 인식 및 단백질 합성의 시작에 코작 서열(Kozac sequence)이 중요한 역할을 한다고 알려져 있다. 그러나 EMC 바이러스(Encephalomyocarditis virus, 이하 'EMCV'라 한다)의 경우는, 내부 인트론 진입부분(Internal Ribosome Entry Site, IRES, 이하 'IRES'라 칭한다)이라 불리는 특별한 구조로 되어있는 RNA 서열을 갖고 있어, 진핵세포 내에서 하나의 mRNA로부터 여러 단백질 합성이 가능하다(Jang 등, J. Virol.(1989) 63, 1651). 본 발명에서는 항체 유전자와 증폭 유전자가 동시에 발현될 수 있도록 하기 위하여, 항체의 중쇄 유전자 뒤에 IRES가 오도록 한 후 그 뒤에 증폭 유전자가 오도록 벡터를 디자인하였다.Generally, contrary to the fact that prokaryotic cells such as Escherichia coli have a polycistronic system in which a ribosome binds to various positions of one mRNA to synthesize multiple proteins at once, eukaryotic cells decode proteins from mRNA ), The ribosome is attached to the 5 'end of the mRNA, and then the AUG, which is the initiation codon, is searched through a scanning method. As the synthesis of the protein starts from the AUG codon, one polypeptide is necessarily formed from one mRNA (Kozac sequence) plays an important role in the recognition of ATG and the start of protein synthesis. However, in the case of the EMC virus (Encephalomyocarditis virus, hereinafter referred to as "EMCV"), the RNA sequence has a special structure called Internal Ribosome Entry Site (IRES) Several proteins can be synthesized from an mRNA in eukaryotic cells (Jang et al., J. Virol. (1989) 63, 1651). In the present invention, in order to allow simultaneous expression of an antibody gene and an amplified gene, a vector was designed so that IRES follows the heavy chain gene of the antibody, followed by an amplified gene.

본 발명에서 용어, "벡터(vector)"는 적당한 숙주세포 내에서 목적 유전자가 발현할 수 있도록 프로모터 등의 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 작제물로서, 본 발명의 목적상 바람직하게는 항체를 발현하기 위한 벡터를 의미하며, 바이시스트로닉 발현벡터일 수 있다.
The term "vector" in the present invention refers to a gene construct containing an essential regulatory element such as a promoter so that a desired gene can be expressed in a suitable host cell. For the purpose of the present invention, And may be a bi-systronic expression vector.

본 발명에서 용어, "인트론(intron)"은 진핵세포에서 발견되는 특징적인 서열로 유전정보를 가지고 있지 않아서 단백질을 만들지 못하는 DNA 영역을 의미하며, 핵에서 RNA 중합효소에 의하여 mRNA가 합성될 때 전사되지만 핵 밖으로 빠져나가는 과정에서 스플라이싱(splicing) 과정을 통해 제거되는 부분이다. 이러한 인트론과 비해독 엑손(untranslated exon)을 포함하는 플라스미드의 유전자 발현량이 인트론을 포함하지 않는 경우에 비하여 더 높다는 연구 결과들이 축적됨에 따라, 재조합 발현벡터에 이종 인트론을 도입함으로써 보다 안정하고 지속적인 유전자 발현이 가능하도록 개선된 벡터들이 개발되어 사용되고 있다. 그러나 기존의 인트론 삽입 벡터의 경우에는 모노시스트로닉 벡터에 사용되어 단지 하나의 유전자만을 발현시키는 단점이 있었다. 이에 본 발명자들은 이러한 단점을 극복하기 위하여 바이시스트로닉 벡터 시스템에서 외부 인트론 유전자를 프로모터 뒤에 삽입할 경우 고효율의 유전자 발현을 시킬 수 있음을 고안하였다.In the present invention, the term "intron" refers to a DNA sequence that does not have any genetic information as a characteristic sequence found in eukaryotic cells and thus can not produce a protein. When mRNA is synthesized by RNA polymerase in the nucleus, But it is the part removed through the splicing process in the process of getting out of the nucleus. As a result of studies that the amount of gene expression of the plasmid containing the untranslated exon is higher than that of the intron without the intron, introduction of the heterologous intron into the recombinant expression vector results in more stable and continuous gene expression Improved vectors have been developed and are being used. However, the existing intron insertion vector has been disadvantageous in that it is used in a monocystic vector and expresses only one gene. Therefore, the inventors of the present invention have devised that, in order to overcome such disadvantages, when the external intron gene is inserted into the bi-systolic vector system after the promoter, highly efficient gene expression can be achieved.

본 발명의 인트론은 이에 제한되지는 않으나, 바람직하게는 서열번호 1의 AI 인트론일 수 있다. 본 발명의 일실시예에서는 보다 효과적이고 짧은 서열의 인트론을 제작하기 위하여 인간 IGLV1-1L1 인트론을 기반으로 하여 인트론이 제거되는 과정인 스플라이싱에 관여하는 U1 및 U2 RNA의 서열 및 인트론의 보존적 서열(consensus sequence)을 적용하여 서열번호 1의 염기서열을 갖는 돌연변이 AI 인트론 서열을 고안하였으며, 이를 프로모터와 항체 경쇄 및 중쇄 유전자 사이에 각각 삽입하여 발현벡터를 제작하였다.The intron of the present invention is preferably, but not limited to, the AI intron of SEQ ID NO: 1. In an embodiment of the present invention, the sequence of U1 and U2 RNAs involved in splicing, which is a process of intron removal based on the human IGLV1-1L1 intron, and the conservation of introns A mutant AI intron sequence having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 was designed by applying a consensus sequence and inserted between the promoter and the antibody light chain and heavy chain genes to construct an expression vector.

본 발명에서 용어, "증폭 유전자"는 본 발명에서 안정적으로 고발현하고자 하는 항체 유전자와 함께 발현시키도록 유도하기 위하여 증폭되는 유전자를 의미하며, 세포 내 염색체로 상기 증폭 유전자 및 항체 유전자가 재조합된 세포만이 성장이 가능하도록, 증폭 유전자가 삽입되지 않은 세포는 처리된 화학약품의 존재 하에서는 성장하지 않는 원리를 이용하여, 화학 약품을 사용하여 유전자를 증폭시킬 수 있다. 본 발명의 바이시스트로닉 발현벡터를 이용하면 상기 증폭 유전자와 항체 유전자가 하나의 유전자처럼 함께 발현되도록 유도되어 궁극적으로 목적하는 항체 유전자를 고발현시킬 수 있다.The term "amplified gene" in the present invention means a gene amplified to induce expression with an antibody gene stably expressing in the present invention, and the amplified gene and the antibody gene are recombined with an intracellular chromosome In order to allow growth only, cells that do not contain amplified genes can be amplified using chemicals, using the principle that they do not grow in the presence of the treated chemicals. When the biSystronic expression vector of the present invention is used, the amplification gene and the antibody gene are induced to be expressed together as a single gene, and ultimately, the desired antibody gene can be highly expressed.

상기 증폭 유전자는 이에 제한되지는 않으나, 바람직하게는 GS(glutamine synthetase) 또는 DHFR(dehydrofolate reductase)일 수 있다. 본 발명의 일실시예에서는 증폭 유전자로 GS를 사용한 pCALHIG 발현벡터 및 증폭 유전자로 DHFR을 사용한 pCALHID 발현벡터를 제작하고(도 4 및 5), 상기 발현벡터가 항체 유전자를 고발현시키는데 유용함을 확인하였다.The amplified gene may be, but is not limited to, GS (glutamine synthetase) or DHFR (dehydrofolate reductase). In one embodiment of the present invention, a pCALHIG expression vector using GS as an amplification gene and a pCALHID expression vector using DHFR as an amplification gene were prepared (FIGS. 4 and 5), and the expression vector was found to be useful for high-level expression of an antibody gene .

본 발명에서 용어, "프로모터"는 전사조절인자들이 결합하는 DNA 염기서열 부위를 의미하며, 본 발명의 목적상 유전자 발현율을 높이기 위하여 강력하고 안정적인 유전자 발현을 유도할 수 있는 프로모터를 사용할 수 있다.In the present invention, the term "promoter " means a DNA base sequence region to which transcription regulatory elements bind, and for the purpose of the present invention, a promoter capable of inducing strong and stable gene expression can be used.

상기 프로모터는 이에 제한되지는 않으나, 바람직하게는 사이토메갈로 바이러스(Cytomegalovirus, CMV) 프로모터 또는 인간 연장인자1-α(EF-α) 프로모터일 수 있으며, 보다 바람직하게는 사이토메갈로 바이러스일 수 있다. 본 발명의 일실시예에서는 높은 항체 발현을 유도하기 위하여 지금까지 알려진 가장 강력한 동물세포용 프로모터 중의 하나인 사이토메갈로 바이러스(Bohart 등, Cell (1985) 41, 521; Thomen 등, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1984) 81, 659)의 초기 프로모터를 이용하여 발현벡터를 제작하였다.The promoter may be, but is not limited to, a cytomegalovirus (CMV) promoter or a human extender 1-alpha (EF- alpha) promoter, more preferably a cytomegalovirus. In one embodiment of the present invention, cytomegalovirus (Bohart et al., Cell (1985) 41, 521; Thomen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1984) 81, 659).

본 발명에서 용어, "항체"는 면역계 내에서 항원의 자극에 의하여 만들어지는 물질로서, 특정한 항원과 특이적으로 결합하여 림프와 혈액을 떠돌며 항원항체반응을 일으키는 물질을 의미한다. 본 발명의 목적상, 상기 항체는 계속적으로 고발현되기 위한 목적이 되는 것으로서, 본 발명의 발현벡터를 이용하여 상기 항체 유전자를 강력하고 안정적으로 발현하도록 유도할 수 있으며, 상기 발현벡터를 형질전환시킨 동물세포를 이용하여 항체를 효율적으로 생산할 수 있다.In the present invention, the term "antibody" refers to a substance produced by stimulation of an antigen in the immune system, which specifically binds to a specific antigen and migrates lymph and blood to cause an antigen-antibody reaction. For the purpose of the present invention, the antibody is intended for continuous high-level expression. The antibody gene of the present invention can be induced to express the antibody gene stably and stably using the expression vector of the present invention, and the expression vector Animal cells can be used to efficiently produce antibodies.

상기 항체는 아미노산과 당사슬로 결합된 단백질로 경쇄 2개와 중쇄 2개가 이황화결합을 통하여 Y자형의 단백질로 형성된다. 본 발명의 일실시예에서는 인트론을 포함하는 항체의 경쇄 발현벡터 및 중쇄 발현벡터를 각각 제작하여 최종적으로 경쇄/중쇄 발현벡터를 제작함으로써, 경쇄 및 중쇄를 모두 갖는 항체를 생산할 수 있는 발현벡터를 제작하였다.The antibody is a protein bound to an amino acid and an oligosaccharide, and two light chains and two heavy chains are formed as Y-shaped proteins through disulfide bonds. In one embodiment of the present invention, a light chain expression vector and a heavy chain expression vector of an intron-containing antibody are prepared, respectively, and finally a light chain / heavy chain expression vector is prepared to produce an expression vector capable of producing an antibody having both a light chain and a heavy chain Respectively.

본 발명의 항체는 이에 제한되지는 않으나, 바람직하게는 당해 분야에서 통상적으로 사용되는 치료용 항체를 모두 포함할 수 있으며, 보다 바람직하게는 HER-2(Human Epidermal Growth Factor Receptor 2)를 표적으로 하는 항체인 트라스투주맙(trastuzumab) 또는 퍼투주맙(pertuzumab)일 수 있으며, 가장 바람직하게는 트라스투주맙(trastuzumab)일 수 있다. 상기 트라스투주맙은 허셉틴(Herceptin)이라고도 하며, 유방암 세포에서 주로 발현되는 HER2/neu에 대한 항체치료제로 알려져 있는 미국 Genentech사에서 개발한 HER2에 대한 인간화 항체이다.Although the antibody of the present invention is not limited thereto, it may preferably include all therapeutic antibodies commonly used in the art, and more preferably, antibodies targeting human Epidermal Growth Factor Receptor 2 (HER-2) The antibody may be trastuzumab or pertuzumab, and most preferably trastuzumab. Trastuzumab, also called Herceptin, is a humanized antibody against HER2 developed by Genentech, Inc., which is known as a therapeutic agent for HER2 / neu antibody mainly expressed in breast cancer cells.

본 발명에서 용어, "IRES(internal ribosome entry site, 내부리보좀유입점)"는 진핵세포에서 하나의 mRNA로부터 여러 단백질 합성이 가능하도록 리보좀이 직접 결합하는 mRNA 내부에 존재하고 있는 특정 영역을 의미하며, 본 발명의 발현벡터가 바이시스트로닉 발현벡터가 될 수 있도록 하는 역할을 한다.The term "IRES (internal ribosome entry site) " in the present invention means a specific region existing in an mRNA in which ribosomes are directly bound so that various proteins can be synthesized from one mRNA in eukaryotic cells, And serves to enable the expression vector of the present invention to become a bi-systronic expression vector.

진핵세포에서 mRNA의 해독은 일반적으로 mRNA의 5'끝에 부착된 캡(cap) 구조 의존적이지만, 이러한 캡 구조 비의존성 번역을 하는 경우 리보좀이 mRNA 내부에 존재하고 있는 특정 영역에 직접 결합하여 번역을 시작하는 경우가 있어 이것을 내부개시기구라 한다. 상기 내부개시기구에서 리보좀이 직접 결합하는 mRNA 상의 부위를 IRES라 하는데, 폴리오바이러스, EMC 바이러스 등의 바이러스 mRNA 외에 면역글로불린 중쇄 결합단백질(BiP) mRNA, 초파리의 안테나유전자(Antp) mRNA 등의 세포 mRNA에서도 발견된다. The decipherment of mRNA in eukaryotic cells is generally cap-structure dependent on the 5 'end of the mRNA. However, in the case of this cap structure-independent translation, the ribosome directly binds to a specific region existing in the mRNA, This is called internal opening period. The site on the mRNA to which the ribosome directly binds in the internal initiation mechanism is called IRES. In addition to virus mRNA such as poliovirus and EMC virus, immunoglobulin heavy chain binding protein (BiP) mRNA, cell mRNA such as Drosophila antenna gene (Antp) mRNA .

본 발명에서 용어, "polyA"는 폴리아데닐산 또는 폴리아데닐산 절편이라고 불리며, 진핵생물의 mRNA 3' 말단에 보편적으로 존재하는 아데닐산의 연속한 배열을 의미한다. 그 길이는 10 내지 200 뉴클레오티드 정도이며, mRNA의 안정화, 해독, 핵에서 세포질로의 수송 등에 관여하는 것으로 알려져 있다.
The term "polyA" in the present invention is referred to as a polyadenylic acid or polyadenylic acid fragment, and refers to a contiguous sequence of adenylic acid that is commonly present at the 3 'end of the eukaryotic mRNA. Its length is about 10 to 200 nucleotides and is known to be involved in mRNA stabilization, detoxification, and transport from the nucleus to the cytoplasm.

본 발명의 항체 생산용 바이시스트로닉 발현벡터는 이에 제한되지는 않으나, 바람직하게는 도 4에 도시된 pCALHIG 또는 도 5에 도시된 pCALHID일 수 있다. 상기 pCALHIG 발현벡터는 'CMV 프로모터-AI 인트론-트라스투주맙 경쇄 유전자-polyA'를 포함하는 제1발현 카세트 및 'CMV 프로모터-AI 인트론-트라스투주맙 중쇄 유전자-IRES-GS-트라스투주맙 중쇄 유전자-polyA'를 포함하는 제2발현 카세트를 포함하는 발현벡터이며, pCALHID 발현벡터는 'CMV 프로모터-AI 인트론-트라스투주맙 경쇄 유전자-polyA'를 포함하는 제1발현 카세트 및 'CMV 프로모터-AI 인트론-트라스투주맙 중쇄 유전자-IRES-DHFR-트라스투주맙 중쇄 유전자-polyA'를 포함하는 제2발현 카세트를 포함하는 발현벡터이다. 본 발명의 일실시예서는 경쇄 발현벡터 pCALSN 및 중쇄 발현벡터 pCAHIG를 이용하여 경쇄/중쇄 발현벡터 pCALHIG를 제작하였으며, 상기 pCALHIG 발현벡터에서 증폭 유전자로서 GS 대신 DHFR을 포함하는 pCALHID 발현벡터를 제작하였다.
The bistronic expression vector for producing an antibody of the present invention is not limited thereto, but may be preferably pCALHIG shown in Fig. 4 or pCALHID shown in Fig. The pCALHIG expression vector comprises a first expression cassette comprising the 'CMV promoter-AI intron-trastuzumab light chain gene -polyA' and a 'CMV promoter-AI intron-trastuzumab heavy chain gene-IRES-GS-trastuzumab heavy chain gene -polyA ', wherein the pCALHID expression vector comprises a first expression cassette comprising a' CMV promoter-AI intron-trastuzumab light chain gene -polyA 'and a second expression cassette comprising a' CMV promoter-AI intron - < / RTI > trastuzumab heavy chain gene-IRES-DHFR-trastuzumab heavy chain gene -polyA '. In one embodiment of the present invention, a light chain / heavy chain expression vector pCALHIG was constructed using a light chain expression vector pCALSN and a heavy chain expression vector pCAHIG, and a pCALHID expression vector containing DHFR instead of GS as an amplified gene in the pCALHIG expression vector was prepared.

다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 발현벡터가 형질전환된 동물세포를 제공한다.In another embodiment, the present invention provides an animal cell in which the expression vector is transformed.

본 발명에서 동물세포에 형질전환된 발현벡터는 항체 발현용 바이시스트로닉 발현벡터이며, 상기에서 설명한 바와 같다. In the present invention, an expression vector transformed into an animal cell is a biSistronic expression vector for antibody expression, as described above.

본 발명에서 용어, "형질전환(transfection)"은 배양동물세포에 DNA를 직접 도입하여 세포의 유전형질을 변이시키는 방법으로서, 일반적으로 목적으로 하는 유전자를 플라스미드 등의 매개체에 넣어 도입하는 방법을 사용한다. 상기 형질전환은 당 분야의 통상적인 방법에 따라 실시될 수 있으며, 바람직하게는 그 예로 인산칼슘공침법, DEAE-텍스트란처리법, 전기천공법, 재분포법 등이 있다. 본 발명의 일실시예에서는 리포펙타민을 이용하여 경쇄/중쇄 발현벡터를 세포 내로 형질전환시켰다.The term "transfection" in the present invention refers to a method of directly introducing DNA into cultured animal cells to mutate the genetic traits of cells, and generally, introducing a gene of interest into a medium such as a plasmid do. The transformation can be carried out according to a conventional method in the art, and examples thereof include calcium phosphate coprecipitation, DEAE-text treatment, electroporation, redistribution and the like. In one embodiment of the present invention, the light chain / heavy chain expression vector was transformed into cells using lipofectamine.

상기 동물세포는 항체를 생산할 수 있는 한 당 분야에서 사용하는 동물세포를 제한 없이 사용할 수 있으며, 바람직하게는 중국 햄스터 난소 세포(CHO)를 사용할 수 있다.As long as the animal cell can produce an antibody, an animal cell used in the field can be used without limitation. Preferably, Chinese hamster ovary cell (CHO) can be used.

상기 동물세포는 상기에서 설명한 본원발명의 경쇄/중쇄 발현벡터가 형질전환된 것을 모두 포함하나, 바람직하게는 경쇄/중쇄 발현벡터 pCALHIG가 형질전환된 기탁번호 KCTC 12164BP의 세포주일 수 있다. 본 발명자들은 상기 pCALHIG가 형질전환된 세포주를 2012년 3월 19일자로 한국생명공학연구원 생물자원센터에 기탁하였고, 수탁번호 KCTC 12164BP를 부여받았다.The animal cell includes all of the above-described light chain / heavy chain expression vectors of the present invention, but may preferably be a cell strain of the accession number KCTC 12164BP transformed with the light chain / heavy chain expression vector pCALHIG. The present inventors deposited the pCALHIG-transformed cell line on March 19, 2012 with the Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology, and received the accession number KCTC 12164BP.

본 발명에서 상기 항체 발현용 바이시스트로닉 발현벡터가 형질전환된 동물세포는 항체를 안정적으로 고발현할 수 있다. 본 발명의 일실시예에서는 100μM MSX 농도에서 인트론을 갖는 발현벡터(pCALHIG)가 형질전환된 동물세포주가 인트론이 없는 발현벡터(pCLHIG)가 형질전환된 세포주에 비하여 약 2.5배 수준의 항체 발현량을 보임을 확인하였으며, 바이시스트로닉 발현벡터가 형질전환된 동물세포주가 모노시스트로닉 발현벡터(pCALHSG)가 형질전환된 동물세포주에 비하여 약 17배 수준의 생산성을 보임을 확인하였다(도 6).
In the present invention, the animal cell transformed with the biSistronic expression vector for antibody expression can stably express the antibody stably. In one embodiment of the present invention, an animal cell line transformed with an intron-containing expression vector (pCALHIG) at a concentration of 100 μM MSX has an expression level of about 2.5-fold higher than that of a cell line transformed with an intron-free expression vector (pCLHIG) And it was confirmed that the animal cell line transformed with the bi-systolic expression vector had about 17-fold higher productivity than the animal cell line transformed with the monocystronic expression vector (pCALHSG) (FIG. 6).

또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 동물세포를 배양하는 단계를 포함하는 항체의 생산 방법을 제공한다.In another aspect, the present invention provides a method for producing an antibody comprising culturing the animal cell.

본 발명에서 상기 동물세포는 본 발명에 따른 인트론을 포함하는 바이시스트로닉 발현벡터가 형질전환된 동물세포로서, 이는 상기에서 설명한 바와 같다.In the present invention, the animal cell is an animal cell transformed with a bicistronic expression vector containing an intron according to the present invention, as described above.

본 발명의 항체 생산 방법은 상기 동물세포를 배양함으로써, 항체를 안정적이고 고효율로 생산할 수 있다. 상기 방법은 바람직하게는 (a) 상기 동물세포를 배지에 접종하는 단계; (b) 상기 배지를 배양하는 단계; 및 (c) 상기 배양된 배지에서 항체를 정제하는 단계를 포함할 수 있다.The method for producing an antibody of the present invention can stably and efficiently produce an antibody by culturing the animal cell. The method preferably comprises the steps of: (a) inoculating said animal cells into a medium; (b) culturing the medium; And (c) purifying the antibody in the cultured medium.

본 발명에 따라 생산될 수 있는 상기 항체에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같으며, 이에 제한되지는 않으나, 트라스투주맙일 수 있다.
The antibodies that may be produced according to the present invention are as described above, but are not limited to, trastuzumab.

본 발명에 따른 인트론을 포함하는 항체 발현용 바이시스트로닉 발현벡터를 이용하면, 원하는 항체를 고효율로 발현시킬 수 있는 발현벡터를 제작할 수 있으며, 상기 발현벡터가 형질전환된 동물세포를 배양하여 항체를 안정적이고 고효율로 생산할 수 있다.
By using the bistronic expression vector for expression of an antibody comprising the intron according to the present invention, an expression vector capable of expressing a desired antibody with high efficiency can be produced. An animal cell transformed with the expression vector can be cultured, It can be produced stably and with high efficiency.

도 1은 본 발명에 따른 경쇄 발현벡터 pCLSN 및 pCALSN의 제작과정을 나타낸 그림이다.
도 2는 본 발명에 따른 중쇄 발현벡터 pCHIG 및 PCAHIG의 제작과정을 나타낸 그림이다.
도 3은 본 발명에 따른 경쇄/중쇄 발현벡터 pCLHIG의 제작과정을 나타낸 그림이다.
도 4는 본 발명에 따른 경쇄/중쇄 발현벡터 pCALHIG의 제작과정을 나타낸 그림이다.
도 5는 본 발명에 따른 경쇄/중쇄 발현벡터 pCALHID의 제작과정을 나타낸 그림이다.
도 6은 경쇄/중쇄 발현벡터 pCLHIG, pCALHIG 및 모노시스트로닉 발현벡터 pCALHSG를 형질전환시킨 세포주의 상대적 항체 발현량을 비교한 결과이다.
도 7은 경쇄/중쇄 발현벡터 pCALHIG 및 pCALHID를 형질전환시킨 세포주의 상대적 항체 발현량을 비교한 결과이다.FIG. 1 is a diagram illustrating a process for producing light chain expression vectors pCLSN and pCALSN according to the present invention.
FIG. 2 is a diagram illustrating a process for producing heavy chain expression vectors pCHIG and PCAHIG according to the present invention.
FIG. 3 is a diagram illustrating the production process of the light chain / heavy chain expression vector pCLHIG according to the present invention.
FIG. 4 is a diagram illustrating a process for producing a light chain / heavy chain expression vector pCALHIG according to the present invention.
FIG. 5 is a diagram illustrating a process for producing a light chain / heavy chain expression vector pCALHID according to the present invention.
FIG. 6 shows the results of comparing the relative antibody expression levels of the light chain / heavy chain expression vector pCLHIG, pCALHIG and the cell line transformed with the monocystronic expression vector pCALHSG.
FIG. 7 shows the results of comparing the relative antibody expression levels of the cell lines transformed with the light chain / heavy chain expression vectors pCALHIG and pCALHID.

이하, 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to examples. However, these examples are for illustrative purposes only, and the scope of the present invention is not limited to these examples.

<실시예 1> AI 인트론의 제작Example 1 Production of AI intron

인간 IGLV1-1L1 인트론(Genbank Accession No. X59707)을 기반으로 하여 인트론이 제거되는 과정인 스플라이싱(splicing)에 관여하는 U1 및 U2 RNA의 서열 및 인트론의 보존적 서열(consensus sequence)을 적용하여 서열번호 1의 염기서열을 갖는 돌연변이 AI 인트론 서열을 고안하였다. 고안된 AI 인트론 서열을 바탕으로 중간 부분의 서열이 겹치도록 올리고뉴클레오티드를 합성한 후 PCR을 통하여 어닐링(annealing) 및 필-인(fill-in)하여 DNA를 확보하였다. 올리고뉴클레오티드의 고안 시 제한효소 NheI과 ApaI 인식부위를 각각 첨가하여 이후의 클로닝 과정에 사용되도록 하였다. Based on the human IGLV1-1L1 intron (Genbank Accession No. X59707), the sequence of U1 and U2 RNA involved in splicing, which is the process of intron removal, and the consensus sequence of the intron are applied A mutant AI intron sequence having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 was devised. Based on the designed AI intron sequences, oligonucleotides were synthesized so that the sequences in the middle part overlapped, and DNA was annealed and filled-in through PCR. When oligonucleotides were designed, the restriction enzymes NheI and ApaI recognition sites were added to be used in the subsequent cloning step.

PCR 반응은 주형 없이 서로 상보적 서열을 포함하는 서열번호 2 및 3의 염기서열을 갖는 AIF 프라이머와 AIR 프라이머를 사용하여 어닐링(annealing)과 필-인(fill-in) 과정을 통해 수행되었다. PCR 반응은 94℃에서 5분간 초기 변성시킨 후, 94℃ 1분, 55℃ 1분 및 72℃에서 1분 30초로 이루어진 순환을 5회 반복하고, 마지막으로 72℃에서 7분간 증폭시켰다. PCR 반응용액은 Premix Taq (Ex Taq version) (TAKARA사) 25 ㎕, 서열번호 2 및 3의 프라이머(10 pmole/㎕) 각 2 ㎕를 포함하고, 총 부피가 50 ㎕가 되도록 증류수를 첨가하였다. PCR로 증폭된 AI 인트론 절편을 제조사의 지침에 따라 pCR2.1-TOPO 벡터(Invitrogen사)에 삽입하였다. The PCR reaction was carried out through an annealing and fill-in process using an AIF primer and an AIR primer having the nucleotide sequences of SEQ ID NOS: 2 and 3 containing complementary sequences without a template. The PCR reaction was initially denatured at 94 ° C for 5 minutes and then circulated five times at 94 ° C for 1 minute, at 55 ° C for 1 minute, and at 72 ° C for 1 minute and 30 seconds, and finally at 72 ° C for 7 minutes. The PCR reaction solution contained 25 μl of Premix Taq (Ex Taq version) (TAKARA), 2 μl each of the primers (10 pmole / μl) of SEQ ID NOs: 2 and 3, and distilled water was added so that the total volume became 50 μl. The PCR-amplified AI intron fragment was inserted into pCR2.1-TOPO vector (Invitrogen) according to the manufacturer's instructions.

AI 인트론을 클로닝이 용이한 CMV 프로모터-AI 인트론 형태로 제작하기 위하여, 상기 AI 인트론이 삽입된 pCR2.1-TOPO 벡터를 제한효소 NheI과 ApaI으로 절단하여 얻은 AI 인트론 절편을 동일한 제한효소로 처리된 pcDNA3 벡터(Invitrogen사)에 삽입하였다. 이어서 상기 AI 인트론이 삽입된 pcDNA3 벡터로부터 CMV 프로모터로부터 AI 인트론을 포함하는 절편을 PCR을 통해 증폭하였다. PCR 반응은 서열번호 4 및 5의 염기서열을 갖는 CAF 프라이머와 CAR 프라이머를 사용하여 수행되었다. PCR 반응은 94℃에서 5분간 초기 변성시킨 후, 94℃ 1분, 55℃ 1분 및 72℃에서 1분 30초로 이루어진 순환을 30회 반복하고, 마지막으로 72℃에서 7분간 증폭시켰다. PCR 반응용액은 Premix Taq (Ex Taq version) (TAKARA사) 25 ㎕, 서열번호 4 및 5의 프라이머(10 pmole/㎕) 각 2 ㎕와 DNA 주형 1 ㎕를 포함하고, 총 부피가 50 ㎕가 되도록 증류수를 첨가하였다.To construct the AI intron in the form of a CMV promoter-AI intron, which is easy to clone, the AI intron fragment obtained by digesting the pCR2.1-TOPO vector into which the AI intron was inserted was digested with restriction enzymes NheI and ApaI was treated with the same restriction enzyme pcDNA3 vector (Invitrogen). Subsequently, a fragment containing the AI intron was amplified from the CMV promoter from the pcDNA3 vector into which the AI intron was inserted by PCR. The PCR reaction was carried out using CAF primers and CAR primers having the nucleotide sequences of SEQ ID NOS: 4 and 5, respectively. The PCR reaction was initially denatured at 94 ° C for 5 minutes and then circulated 30 times at 94 ° C for 1 minute, at 55 ° C for 1 minute, and at 72 ° C for 1 minute and 30 seconds, and finally at 72 ° C for 7 minutes. The PCR reaction solution contained 25 μl of Premix Taq (Ex Taq version) (TAKARA), 2 μl each of the primers (10 pmole / μl) of SEQ ID Nos. 4 and 5 and 1 μl DNA template, so that the total volume was 50 μl Distilled water was added.

이로부터 증폭된 CMV 프로모터 하부에 AI 인트론 절편을 pCR2.1-TOPO 벡터(Invitrogen사)에 클로닝하여 pCR-CMV-AI 벡터를 제작하였다. The pCR-CMV-AI vector was prepared by cloning the AI intron fragment into the pCR2.1-TOPO vector (Invitrogen) under the amplified CMV promoter.

본 실시예에서 AI 인트론의 제조에 사용된 프라이머 및 그의 염기서열은 하기 표 1에 나타낸 바와 같다.
The primers used in the production of the AI intron in this embodiment and their base sequences are shown in Table 1 below.

프라이머primer 염기서열Base sequence 서열번호SEQ ID NO: AIFAIF GCT AGC CAG GTA AGT GCA TGG GGA CCA AGA AAG GCG CCC TGG GAA GCC CAT GGC GCC CTG CTT TCT CCT CTT GTC TCC TTT TGT CTC TTGGCT AGC CAG GTA AGT GCA TGG GGA CCA AGA AAG GCG CCC TGG GAA GCC CAT GGC GCC CTG CTT TCT CCT CTT GTC TCC TTT TGT CTC TTG 22 AIRAIR GGG CCC AGG TCA CCT GGA AGT GAG AGA GAC ACA GAC AGT TAG TAG TAC AAG AGA CAA AAG GAG ACA AGA GGA GAA AGC AGG GCG CCA TGGGGG CCC AGG TCA CCT GGA AGT GAG AGA GAC ACA GAC AGT TAG TAG TAG AAG AGA CAA AAG GAG ACA AGA GGA GAA AGC AGG GCG CCA TGG 33 CAFCAF ACA TGT GGC GCG CCG CGG CGA CGC GTT GACACA TGT GGC GCG CCG CGG CGA CGC GTT GAC 44 CARCAR GGA TCC TCT AGA AGG TCA CCT GGA AGT GAGGGA TCC TCT AGA AGG TCA CCT GGA AGT GAG 55

<실시예 2> 경쇄 발현벡터 pCLSN과 pCALSN의 제작Example 2 Production of Light Chain Expression Vector pCLSN and pCALSN

항체의 경쇄를 발현하는 벡터를 제작하기 위하여, CMV 프로모터와 GFP 유전자를 포함하는 pAcGFP-N2 벡터(Clonetech사)를 제한효소 NheI과 NotI으로 절단하여 GFP 절편을 제거한 후, 그 자리에 트라스트주맙(trastuzumab) 유전자(미국특허 US6,870,034 B2의 아미노산 서열을 바탕으로 Geneart 사로부터 유전자 합성을 통해 얻음)을 제한효소 NheI과 NotI으로 절단하여 얻은 경쇄 유전자 절편을 삽입하여 pCLSN 벡터를 제작하였다(도 1). pCLSN 벡터는 CMV 프로모터-트라스트주맙 경쇄 유전자-폴리A 절편을 포함하는 벡터이다.In order to construct a vector expressing the light chain of the antibody, the pAcGFP-N2 vector (Clonetech) containing the CMV promoter and the GFP gene was digested with restriction enzymes NheI and NotI to remove the GFP fragment, and trastuzumab ) Gene (obtained through gene synthesis from Geneart based on the amino acid sequence of US Patent No. 6,870,034 B2) was digested with restriction enzymes NheI and NotI to construct a pCLSN vector (FIG. 1). The pCLSN vector is a vector containing the CMV promoter-trachomatous light chain gene-poly A fragment.

pCLSN 벡터의 CMV 프로모터와 트라스트주맙 경쇄 유전자의 사이에 AI 인트론을 삽입하기 위하여, pCLSN 벡터를 제한효소 NdeI(CMV 프로모터 내에 위치)과 NheI(CMV 프로모터와 트라스트주맙 경쇄 유전자 사이에 위치)으로 절단한 후, 그 자리에 실시예 1에서 제작한 pCR-CMV-AI 벡터를 제한효소 NdeI과 XbaI으로 절단하여 얻은 CMV 프로모터 일부를 포함하는 AI 인트론 절편을 삽입하여 경쇄 발현벡터 pCALSN을 제작하였다(도 1). 경쇄 발현벡터 pCALSN는 CMV 프로모터-AI 인트론-트라스트주맙 경쇄 유전자-폴리A 절편을 포함하는 벡터이다.In order to insert the AI intron between the CMV promoter of the pCLSN vector and the trastuchomate light chain gene, the pCLSN vector was digested with restriction enzyme NdeI (located in the CMV promoter) and NheI (located between the CMV promoter and the trastuumate light chain gene) , A light chain expression vector pCALSN was prepared by inserting an AI intron fragment containing a part of the CMV promoter obtained by digesting the pCR-CMV-AI vector prepared in Example 1 with restriction enzymes NdeI and XbaI (FIG. 1). The light chain expression vector pCALSN is a vector containing the CMV promoter-AI intron-trachastomate light chain gene-poly A fragment.

<실시예 3> 중쇄 발현벡터 pCHIG와 pCAHIG의 제작Example 3 Production of Heavy Chain Expression Vector pCHIG and pCAHIG

CMV 프로모터와 엔브렐(Enbrel; Etanercept) 유전자를 포함하는 pcDNA3.1-kozak-TNFR-Fc-IRES-GS(대한민국 특허출원 제10-2012-0025197호)의 엔브렐 유전자를 제한효소 NheI과 NotI으로 절단한 후, 그 자리에 트라스트주맙을 제한효소 NheI과 NotI으로 절단하여 얻은 중쇄 유전자 절편을 pCHIG 벡터를 제작하였다(도 2). pCHIG 벡터는 CMV 프로모터-트라스트주맙 중쇄 유전자-IRES(internal ribosomal entry site)-GS(glutathione synthetase)-폴리A 절편을 포함하는 벡터이다.Enbrel gene of pcDNA3.1-kozak-TNFR-Fc-IRES-GS (Korean Patent Application No. 10-2012-0025197) containing the CMV promoter and Enbrel (Etanercept) gene was digested with restriction enzymes NheI and NotI Subsequently, trastuzumab was digested with restriction enzymes NheI and NotI to prepare a pCHIG vector (FIG. 2). The pCHIG vector is a vector containing the CMV promoter-internal ribosomal entry site (IRES) -GS (glutathione synthetase) -Poly A fragment.

pCHIG 벡터의 CMV 프로모터와 트라스트주맙 중쇄 유전자 사이에 AI 인트론을 삽입하기 위하여, pCHIG 벡터를 제한효소 NdeI(CMV 프로모터 내에 위치)과 NheI(CMV 프로모터와 트라스트주맙 중쇄 유전자 사이에 위치)으로 절단한 후, 그 자리에 실시예 1에서 제작한 pCR-CMV-AI 벡터를 제한효소 NdeI과 XbaI으로 절단하여 얻은 CMV 프로모터 일부를 포함하는 AI 인트론 절편을 삽입하여 중쇄 발현벡터 pCAHIG를 제작하였다(도 2). 중쇄 발현벡터 pCAHIG는 CMV 프로모터-AI 인트론-트라스트주맙 중쇄 유전자-IRES-GS-폴리A 절편을 포함하는 벡터이다.In order to insert the AI intron between the CMV promoter of the pCHIG vector and the trastuzumab heavy chain gene, the pCHIG vector was digested with restriction enzyme NdeI (located in the CMV promoter) and NheI (located between the CMV promoter and the trastuzumab heavy chain gene) The pCR-CMV-AI vector prepared in Example 1 was digested with restriction enzymes NdeI and XbaI, and an AI intron fragment containing a part of the CMV promoter obtained was inserted into the vector to construct a heavy chain expression vector pCAHIG (FIG. 2). The heavy chain expression vector pCAHIG is a vector containing the CMV promoter-AI intron-trastuzumab heavy chain gene-IRES-GS-polyA fragment.

<실시예 4> 경쇄/중쇄 발현벡터 pCLHIG와 pCALHIG의 제작Example 4 Production of light chain / heavy chain expression vector pCLHIG and pCALHIG

실시예 2에서 제작된 pCLSN 벡터로부터 PCR을 통하여 CMV 프로모터-트라스트주맙 경쇄 유전자-폴리A 절편을 증폭한 후 이를 제한효소 SacII와 MluI으로 절단하였다. 이때 PCR 반응은 pCLSN 벡터를 주형으로 하고 서열번호 6 및 7의 염기서열을 갖는 CMV_Ac 정방향 프라이머와 AflII_Ac 역방항 프라이머를 사용하여 수행되었다. PCR 반응은 94℃에서 5분간 초기 변성시킨 후, 94℃ 1분, 55℃ 1분 및 72℃에서 1분 30초로 이루어진 순환을 30회 반복하고, 마지막으로 72℃에서 7분간 증폭시켰다. PCR 반응용액은 Premix Taq (Ex Taq version) (TAKARA사) 25 ㎕, 서열번호 6 및 7의 프라이머(10 pmole/㎕) 각 2 ㎕와 DNA 주형 1 ㎕를 포함하고, 총 부피가 50 ㎕가 되도록 증류수를 첨가하였다. From the pCLSN vector prepared in Example 2, the CMV promoter-trachomatous light chain gene-poly A fragment was amplified by PCR and then digested with restriction enzymes SacII and MluI. The PCR reaction was carried out using the CMV_Ac forward primer and the AflII_Ac reverse primer having the nucleotide sequences of SEQ ID NOS: 6 and 7 with the pCLSN vector as a template. The PCR reaction was initially denatured at 94 ° C for 5 minutes and then circulated 30 times at 94 ° C for 1 minute, at 55 ° C for 1 minute, and at 72 ° C for 1 minute and 30 seconds, and finally at 72 ° C for 7 minutes. The PCR reaction solution contained 25 μl of Premix Taq (Ex Taq version) (TAKARA), 2 μl each of the primers (10 pmole / μl) of SEQ ID Nos. 6 and 7 and 1 μl of the DNA template, so that the total volume was 50 μl Distilled water was added.

실시예 3에서 제작된 pCHIG 벡터를 제한효소 SacII와 MluI으로 절단한 후 그 자리에 상기에서 준비된 CMV 프로모터-트라스트주맙 경쇄 유전자-폴리A 절편을 삽입하여 경쇄/중쇄 발현벡터 pCLHIG를 제작하였다(도 3). 경쇄/중쇄 발현벡터 pCLHIG는 CMV 프로모터-트라스트주맙 경쇄 유전자-폴리A 절편을 포함하고, CMV 프로모터-트라스트주맙 중쇄 유전자-폴리A 절편-IRES-GS-폴리A 절편을 포함하는 벡터이다.The pCHIG vector produced in Example 3 was digested with restriction enzymes SacII and MluI, and the light chain / heavy chain expression vector pCLHIG was prepared by inserting the prepared CMV promoter-trachastomate light chain gene-polyA fragment prepared in the above place ). The light chain / heavy chain expression vector pCLHIG is a vector containing the CMV promoter-travestomast light chain gene-poly A fragment and the CMV promoter-trastuzumab heavy chain gene-poly A fragment-IRES-GS-polyA fragment.

상기에서 CMV 프로모터-트라스트주맙 경쇄 유전자-폴리A 절편의 증폭에 사용된 프라이머 및 그의 염기서열은 하기 표 2에 나타낸 바와 같다.
The primers used for the amplification of the CMV promoter-trastuzumab light chain gene-poly A fragment and their base sequences are shown in Table 2 below.

프라이머primer 염기서열Base sequence 서열번호SEQ ID NO: CMV_AcCMV_AC ACA TGT CCG CGG ACT GGC GCG CCC GCC ATG CAT TAG TTA TTA AACA TGT CCG CGG ACT GGC GCG CCC GCC ATG CAT TAG TTA TTAA 66 AflII_AcAflII_AC GGA TCC ACG CGT CGC CTT AAG ATA CAT TGA TGGGA TCC ACG CGT CGC CTT AAG ATA CAT TGA TG 77

실시예 2에서 제작된 pCALSN 벡터로부터 PCR을 통하여 CMV 프로모터-AI 인트론-트라스트주맙 경쇄 유전자-폴리A 절편을 증폭한 후 이를 제한효소 SacII와 MluI으로 절단하였다. 이때 PCR 반응은 pCALSN 벡터를 주형으로 하고 서열번호 6 및 7의 염기서열을 갖는 CMV_Ac 정방향 프라이머와 AflII_Ac 역방항 프라이머를 사용하여 수행되었다). PCR 반응은 94℃에서 5분간 초기 변성시킨 후, 94℃ 1분, 55℃ 1분 및 72℃에서 1분 30초로 이루어진 순환을 30회 반복하고, 마지막으로 72℃에서 7분간 증폭시켰다. PCR 반응용액은 Premix Taq (Ex Taq version) (TAKARA사) 25 ㎕, 서열번호 6 및 7의 프라이머(10 pmole/㎕) 각 2 ㎕와 DNA 주형 1 ㎕를 포함하고, 총 부피가 50 ㎕가 되도록 증류수를 첨가하였다. From the pCALSN vector prepared in Example 2, the CMV promoter-AI intron-trachastomate light chain gene-poly A fragment was amplified by PCR and digested with restriction enzymes SacII and MluI. At this time, the PCR reaction was carried out using the CMV_Ac forward primer and AflII_Ac reverse primer having the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 6 and 7 with the pCALSN vector as a template. The PCR reaction was initially denatured at 94 ° C for 5 minutes and then circulated 30 times at 94 ° C for 1 minute, at 55 ° C for 1 minute, and at 72 ° C for 1 minute and 30 seconds, and finally at 72 ° C for 7 minutes. The PCR reaction solution contained 25 μl of Premix Taq (Ex Taq version) (TAKARA), 2 μl each of the primers (10 pmole / μl) of SEQ ID Nos. 6 and 7 and 1 μl of the DNA template, so that the total volume was 50 μl Distilled water was added.

실시예 3에서 제작된 pCAHIG 벡터를 제한효소 SacII와 MluI으로 절단한 후 그 자리에 CMV 프로모터-AI 인트론-트라스트주맙 경쇄 유전자-폴리A 절편 삽입하여 경쇄/중쇄 발현벡터 pCALHIG를 제작하였다(도 4). 경쇄/중쇄 발현벡터 pCALHIG는 CMV 프로모터-AI 인트론-트라스트주맙 경쇄 유전자-폴리A 절편을 포함하고, CMV 프로모터-AI 인트론-트라스트주맙 중쇄 유전자-폴리A 절편-IRES-GS-폴리A 절편을 포함하는 벡터이다.The pCAHIG vector produced in Example 3 was digested with restriction enzymes SacII and MluI, and the light chain / heavy chain expression vector pCALHIG was constructed by inserting the CMV promoter-AI intron-trachastomate light chain gene-poly A fragment thereon (Fig. 4) . The light chain / heavy chain expression vector pCALHIG contains the CMV promoter-AI intron-traastzum light chain gene-poly A fragment and contains the CMV promoter-AI intron-travestum heavy chain gene-poly A fragment-IRES-GS- It is a vector.

상기에서 CMV 프로모터-AI 인트론-트라스트주맙 경쇄 유전자-폴리A 절편의 증폭에 사용된 프라이머 및 그의 염기서열은 상기 표 2에 나타낸 바와 같다.
The primers and their base sequences used for the amplification of the CMV promoter-AI intron-trachastomate light chain gene-poly A fragment in the above are as shown in Table 2 above.

<실시예 5> 경쇄/중쇄 발현벡터 pCALHID의 제작Example 5 Production of light chain / heavy chain expression vector pCALHID

실시예 4에서 제작된 경쇄/중쇄 발현벡터 pCALHIG와 동일한 구조를 갖지만 증폭 유전자 GS 대신에 DHFR(dihydrofolate reductase)을 포함하는 발현벡터를 제작하기 위하여, 발현벡터 pCALHIG를 제한효소 SalI과 SfiI으로 절단하여 GS 유전자 절편을 제거하였다. pcDNA3.1-TNFR-Fc-IRES-DHFR(대한민국 특허출원 제10-2012-0025197호)를 제한효소 SalI과 SfiI으로 절단하여 얻은 DHFR 유전자 절편을 상기 발현벡터 pCALHIG에 삽입하여 경쇄/중쇄 발현벡터 pCALHID를 제작하였다(도 5). 경쇄/중쇄 발현벡터 pCALHID는 CMV 프로모터-AI 인트론-트라스트주맙 경쇄 유전자-폴리A 절편을 포함하고, CMV 프로모터-AI 인트론-트라스트주맙 중쇄 유전자-IRES-DHFR-폴리A 절편을 포함하는 벡터이다.
To construct an expression vector containing DHFR (dihydrofolate reductase) instead of the amplified gene GS, which had the same structure as the light chain / heavy chain expression vector pCALHIG prepared in Example 4, the expression vector pCALHIG was digested with restriction enzymes SalI and SfiI to obtain GS The gene fragment was removed. A DHFR gene fragment obtained by digesting pcDNA3.1-TNFR-Fc-IRES-DHFR (Korean Patent Application No. 10-2012-0025197) with restriction enzymes SalI and SfiI was inserted into the expression vector pCALHIG to obtain a light chain / heavy chain expression vector pCALHID (Fig. 5). The light chain / heavy chain expression vector pCALHID is a vector containing the CMV promoter-AI intron-traastzum light chain gene-poly A fragment and containing the CMV promoter-AI intron-travestum heavy chain gene-IRES-DHFR-polyA fragment.

<실시예 6> 경쇄/중쇄 발현벡터 pCLHIG와 pCALHIG로부터 항체의 발현율 검사Example 6 Expression of Antibodies from Light and Chain Expression Vector pCLHIG and pCALHIG

<6-1> 형질전환<6-1> Transformation

항체 단백질을 안정적으로 발현하는 세포주를 개발하기 위해, 우선 DHFR 결핍 CHO-K1 세포(ATCC CCL-61)를 형질전환 실험 전날 6-웰 플레이트에 웰당 4×105 세포의 농도로 분양한 후 37℃, 이산화탄소 배양기에서 배양하였다. 세포가 플레이트에 70 내지 80% 정도 성장한 것을 확인한 후 리포펙타민(Lipofectamine, Invitrogen사)을 이용해 경쇄/중쇄 발현벡터 pCLHIG와 pCALHIG 각각을 세포 내로 형질전환시켰다. 이때 형질전환은 Opti-MEM-1(Invitrgen 사)에 상기 발현벡터 DNA 각 4 ㎍과 리포펙타민 10 ㎕를 첨가한 배지를 사용하여 수행되었다. 이로부터 경쇄/중쇄 발현벡터 pCLHIG와 pCALHIG 각각이 형질전환된 CHO-K1 세포를 선발하였다.DHFR-deficient CHO-K1 cells (ATCC CCL-61) were pre-cultured on a 6-well plate at a concentration of 4 × 10 5 cells / well on the day before the transformation, and cultured at 37 ° C. , And cultured in a carbon dioxide incubator. After confirming that the cells were grown on the plate by about 70 to 80%, the light chain / heavy chain expression vectors pCLHIG and pCALHIG were transformed into cells using lipofectamine (Lipofectamine, Invitrogen). The transformation was carried out using Opti-MEM-1 (Invitrogen) supplemented with 4 μg of each of the above expression vector DNAs and 10 μl of lipofectamine. From these, CHO-K1 cells transformed with light chain / heavy chain expression vectors pCLHIG and pCALHIG were selected.

한편, 상기 방법으로 형질전환된 CHO-K1 세포 중에서 pCALHIG가 형질전환된 세포를 선발하여 2012년 3월 19일자로 한국생명공학연구원 생물자원센터에 기탁하였고, 수탁번호 KCTC 12164BP를 부여받았다.
On the other hand, pCALHIG-transformed cells were selected from CHO-K1 cells transformed by the above method, and deposited on March 19, 2012 at the Korea Biotechnology Research Institute, and received grant number KCTC 12164BP.

<6-2> 항체 유전자 증폭&Lt; 6-2 > Antibody gene amplification

실시예 6-1에서 경쇄/중쇄 발현벡터 pCLHIG와 pCALHIG 각각이 형질전환된 CHO-K1 세포주에 MSX(Methioine sulfoximine)의 초기 농도로 25μM을 처리한 후 세포 생장이 정상적으로 회복될 때까지 생장의 추이를 관찰하였다. 이 때, MSX의 작동 여부를 알기 위해 GS가 삽입되지 않은 CHO-K1 세포주를 대조군으로 사용하여 생장 여부를 비교하였다. MSX 25μM을 처리하고 3일 이후에 세포 수가 약 40% 감소하였으며, 이는 계대 이후 생장이 회복되는 추세를 보였다. 7일 이후의 계대에서는 MSX의 농도를 초기 농도의 2배인 50μM로 증가시켰으며, 마찬가지 방법으로 MSX에 의한 외부압력에 대해 생장이 회복되는 계대 시점에서 MSX의 농도를 증가시켜 최종적으로 100μM까지 증가시켰다. 100μM의 MSX의 농도에서 제조된 세포주 풀(pool)의 발현량을 측정하여 벡터간 발현량을 비교하였다. 발현량의 측정은 Anti-Fc를 사용한 ELISA 방법을 사용하였으며, PCD(Picograms/cell/day)로 계산하여 세포당 발현량을 구하여 이들 값의 상대적인 발현량을 비교하였다. 그 결과 100μM의 MSX 농도에서, 인트론을 갖는 pCALHIG 벡터를 형질전환시킨 세포주가 인트론이 없는 pCLHIG 벡터를 형질전환시킨 세포주에 비하여 약 2.5배 수준의 발현량을 보임을 확인하였다(도 6). 이러한 결과는 본 발명의 바이시스트로닉 벡터는 인트론을 삽입함으로써, 인트론이 없는 벡터보다 상기 항체 유전자를 계속적으로 고발현할 수 있음을 의미한다.The CHO-K1 cell line transformed with the light chain / heavy chain expression vector pCLHIG and pCALHIG in Example 6-1 was treated with 25 μM of MSX (Methioine sulfoximine) as an initial concentration, and the growth was progressed until the cell growth was restored to normal Respectively. At this time, in order to determine whether MSX works, the growth of CHO-K1 cell line without GS was used as a control group. After 3 days of treatment with MSX 25 μM, the cell number decreased by about 40%, indicating a tendency to recover growth after passage. In the passage after 7 days, the concentration of MSX was increased to 50 μM, which is twice the initial concentration. In the same way, the MSX concentration was increased to 100 μM at the passage of time when the growth was restored to the external pressure by MSX . The expression level of the cell line pool prepared at a concentration of 100 MS MSX was measured to compare the expression level of the vector. The expression level was determined by ELISA using anti-Fc and calculated by PCD (Picograms / cell / day), and the relative expression levels of these values were compared. As a result, it was confirmed that the cell line transformed with the intron-containing pCALHIG vector showed an expression level of about 2.5-fold higher than the cell line transformed with the intron-free pCLHIG vector at the MSX concentration of 100 μM (FIG. 6). These results indicate that by inserting the intron, the bi-systolic vector of the present invention can continuously express the antibody gene more consistently than the intron-free vector.

추가적으로, 본 발명의 바이시스트로닉 발현벡터가 모노시스트로닉 발현벡터에 비하여 항체 유전자의 생산성이 높음을 확인하기 위하여, 모노시스트로닉 발현벡터인 pCALHSG를 제작하여 동일한 조건에서 비교하였다. 그 결과, 본원발명의 바이시스트로닉 발현벡터가 모노시스트로닉 발현벡터에 비하여 약 17배 수준의 항체 발현량을 보임을 확인하였다(도 6). 이러한 결과는 모노시스트로닉 벡터에 비하여 본원발명의 바이시스트로닉 벡터가 항체 생산성이 높음을 의미한다.
In addition, to confirm that the biSystronic expression vector of the present invention has higher productivity of the antibody gene than the monocystronic expression vector, the monocystronic expression vector pCALHSG was prepared and compared under the same conditions. As a result, it was confirmed that the bi-systronic expression vector of the present invention showed an antibody expression level of about 17-fold higher than that of the monocystronic expression vector (FIG. 6). These results indicate that the bi-systolic vector of the present invention has higher antibody productivity than the monocystic vector.

<실시예 7> 경쇄/중쇄 발현벡터 pCALHIG와 pCALHID의 발현율 검사<Example 7> Expression rate of light chain / heavy chain expression vector pCALHIG and pCALHID

<7-1> 형질전환<7-1> Transformation

증폭 유전자 GS 대신에 DHFR를 포함하는 pCALHID 발현벡터가 형질전환된 세포주의 발현량을 비교하기 위하여, 상기 실시예 6-1과 동일한 방법으로 CHO-K1 세포와 CHO-DG44 세포(Invitrogen) 각각에 경쇄/중쇄 발현벡터 pCALHIG와 pCALHID 각각을 세포 내로 형질전환시키고, 형질전환된 CHO-K1 및 CHO-DG44 세포를 선발하였다.
In order to compare the expression amounts of the transformed cell line transformed with the pCALHID expression vector containing DHFR instead of the amplified gene GS, CHO-K1 cells and CHO-DG44 cells (Invitrogen) / Heavy chain expression vectors pCALHIG and pCALHID were transformed into cells, and transformed CHO-K1 and CHO-DG44 cells were selected.

<7-2> 항체 유전자 증폭&Lt; 7-2 > Antibody gene amplification

실시예 7-1에서 경쇄/중쇄 발현벡터 pCALHIG와 pCALHID 각각이 형질전환된 CHO-K1과 CHO-DG44 세포주에 각각 MSX와 MTX(methotroxate)를 처리하여 유전자 증폭을 수행하였다. 실시예 6-2와 동일하게 세포 생장이 정상적으로 회복될 때 MSX와 MTX의 농도를 증가시키는 방법에 의하여 MSX와 MTX의 농도를 증가시키면서 발현량을 측정하였다. 발현량의 측정은 Anti-Fc를 사용한 ELISA 방법을 사용하였으며, PCD(Picograms/cell/day)로 계산하여 세포당 발현량을 구하였다. 그 결과, pCALHIG벡터를 형질전환시킨 세포주의 경우 500μM의 MSX 농도에서, pCALHID 벡터를 형질전환시킨 세포주의 경우 5μM의 MTX 농도에서 최고 발현량을 보였으며, 이 때 상기 두 벡터를 형질전환시킨 세포주는 유사한 수준의 세포당 발현량을 보임을 확인하였다(도 7). 이러한 결과는, 증폭 유전자가 서로 다른 경우에도 인트론이 삽입된 발현벡터를 형질전환시킨 경우 유전자를 계속적으로 고발현할 수 있음을 의미한다.
Gene amplification was carried out by treating MSX and MTX (methotroxate) in the CHO-K1 and CHO-DG44 cell lines transformed with the light chain / heavy chain expression vector pCALHIG and pCALHID, respectively, in Example 7-1. The expression levels of MSX and MTX were measured by increasing the concentrations of MSX and MTX when cell growth was restored in the same manner as in Example 6-2. The expression level was determined by ELISA using Anti-Fc and PCD (Picograms / cell / day). As a result, the cell line transformed with the pCALHIG vector showed the highest expression level at an MSX concentration of 500 μM, and the cell line transformed with the pCALHID vector showed the highest expression level at the MTX concentration of 5 μM, And showed similar levels of expression per cell (Fig. 7). These results indicate that even when the amplified genes are different from each other, the gene can be continuously and highly expressed when the intron-inserted expression vector is transformed.

한국생명공학연구원Korea Biotechnology Research Institute KCTC12164BPKCTC12164BP 2012031920120319

<110> HANWHA CHEMICAL CORPORATION <120> Bicistronic expression vector for expressing antibody and method for producing antibody using the same <130> PA110546KR <160> 7 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 125 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AI intron <400> 1 caggtaagtg catggggacc aagaaaggcg ccctgggaag cccatggcgc cctgctttct 60 cctcttgtct ccttttgtct cttgtactac taactgtctg tgtctctctc acttccaggt 120 gacct 125 <210> 2 <211> 90 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AIF primer <400> 2 gctagccagg taagtgcatg gggaccaaga aaggcgccct gggaagccca tggcgccctg 60 ctttctcctc ttgtctcctt ttgtctcttg 90 <210> 3 <211> 90 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AIR primer <400> 3 gggcccaggt cacctggaag tgagagagac acagacagtt agtagtacaa gagacaaaag 60 gagacaagag gagaaagcag ggcgccatgg 90 <210> 4 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CAF primer <400> 4 acatgtggcg cgccgcggcg acgcgttgac 30 <210> 5 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CAR primer <400> 5 ggatcctcta gaaggtcacc tggaagtgag 30 <210> 6 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CMV_Ac primer <400> 6 acatgtccgc ggactggcgc gcccgccatg cattagttat taa 43 <210> 7 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AflII_Ac primer <400> 7 ggatccacgc gtcgccttaa gatacattga tg 32 <110> HANWHA CHEMICAL CORPORATION <120> Bicistronic expression vector for expressing antibody and method          for producing antibody using the same <130> PA110546KR <160> 7 <170> Kopatentin 2.0 <210> 1 <211> 125 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AI intron <400> 1 caggtaagtg catggggacc aagaaaggcg ccctgggaag cccatggcgc cctgctttct 60 cctcttgtct ccttttgtct cttgtactac taactgtctg tgtctctctc acttccaggt 120 gacct 125 <210> 2 <211> 90 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AIF primer <400> 2 gctagccagg taagtgcatg gggaccaaga aaggcgccct gggaagccca tggcgccctg 60 ctttctcctc ttgtctcctt ttgtctcttg 90 <210> 3 <211> 90 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AIR primer <400> 3 gggcccaggt cacctggaag tgagagagac acagacagtt agtagtacaa gagacaaaag 60 gagacaagag gagaaagcag ggcgccatgg 90 <210> 4 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CAF primer <400> 4 acatgtggcg cgccgcggcg acgcgttgac 30 <210> 5 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CAR primer <400> 5 ggatcctcta gaaggtcacc tggaagtgag 30 <210> 6 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CMV_Ac primer <400> 6 acatgtccgc ggactggcgc gcccgccatg cattagttat taa 43 <210> 7 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AflII_Ac primer <400> 7 ggatccacgc gtcgccttaa gatacattga tg 32

Claims (13)

'프로모터-인트론-항체 경쇄 유전자-polyA'를 포함하는 제1발현 카세트 및 '프로모터-인트론-항체 중쇄 유전자-IRES(internal ribosome entry site)-증폭 유전자-polyA'를 포함하는 제2발현 카세트를 포함하는, 항체 발현용 바이시스트로닉 발현벡터.
A second expression cassette comprising a first expression cassette comprising the promoter-intron-antibody light chain gene -polyA and a 'promoter-intron-antibody heavy chain-IRES (internal ribosome entry site) amplification gene -polyA' A biSystronic expression vector for antibody expression.
제1항에 있어서, 상기 인트론은 서열번호 1인 것인 발현벡터.
2. The expression vector according to claim 1, wherein the intron is SEQ ID NO: 1.
제1항에 있어서, 상기 증폭 유전자는 GS(glutamine synthetase) 또는 DHFR(dehydrofolate reductase)인 것인 발현벡터.
The expression vector according to claim 1, wherein the amplified gene is GS (glutamine synthetase) or DHFR (dehydrofolate reductase).
제1항에 있어서, 상기 프로모터는 사이토메갈로 바이러스(CMV) 프로모터인 것인 발현벡터.
2. The expression vector according to claim 1, wherein the promoter is a cytomegalovirus (CMV) promoter.
제1항에 있어서, 상기 항체는 트라스투주맙(trastuzumab)인 것인 발현벡터.
2. The expression vector of claim 1, wherein the antibody is trastuzumab.
제1항에 있어서, 상기 발현벡터는 도 4에 기재된 pCALHIG의 개열지도를 갖는 발현벡터.
2. The expression vector according to claim 1, wherein the expression vector has the cleavage map of pCALHIG shown in Fig.
제1항에 있어서, 상기 발현벡터는 도 5에 기재된 pCALHID의 개열지도를 갖는 발현벡터.
The expression vector according to claim 1, wherein the expression vector has the cleavage map of pCALHID shown in Fig.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 발현벡터가 형질전환된 동물세포.
An animal cell transformed with an expression vector according to any one of claims 1 to 7.
제8항에 있어서, 상기 동물세포는 중국 햄스터 난소 세포(CHO)인 것인 동물세포.
9. The animal cell of claim 8, wherein the animal cell is a Chinese hamster ovary cell (CHO).
제8항에 있어서, 상기 동물세포는 기탁번호 KCTC 12164BP인 것인 동물세포.
9. The animal cell according to claim 8, wherein the animal cell is the accession number KCTC 12164BP.
제8항의 동물세포를 배양하는 단계를 포함하는 항체의 생산 방법.
A method for producing an antibody comprising culturing the animal cell of claim 8.
제11항에 있어서,
상기 동물세포가 배양된 배양액으로부터 항체를 정제하는 단계를 추가로 포함하는 항체의 생산 방법.
12. The method of claim 11,
Further comprising the step of purifying the antibody from the culture medium in which the animal cells have been cultured.
제11항에 있어서, 상기 항체는 트라스투주맙인 것인 방법.
12. The method of claim 11, wherein the antibody is trastuzumab.
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