KR101390212B1 - 전기분무건조를 이용한 글리아딘 나노입자의 제조방법 - Google Patents

전기분무건조를 이용한 글리아딘 나노입자의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 전기분무를 통하여 글리아딘 나노입자, 또는 글리아딘 및 젤라틴 복합 나노입자를 제조하는 방법에 관한 것으로, 본 발명의 나노입자는, 탈용매(desolvation)법으로 제조된 글리아딘 입자에 비해 평균입자크기가 작고, 제타포텐셜이 높아 나노입자의 응집을 줄일 수 있으면서 약물삽입 효율이 뛰어나 약물전달체로 사용하기에 적합하며, 본 발명의 나노입자를 약물전달체로 사용할 경우 기존 약물들의 낮은 용해도와 불안정성, 선택성 부족을 비롯한 비특이적 독성을 완화시킬 수 있다.

Description

전기분무건조를 이용한 글리아딘 나노입자의 제조방법{Preparation method for gliadin nanoparticles by electrospray}
본 발명은 약물전달체로 사용가능한 글리아딘 나노입자, 또는 글리아딘 및 젤라틴 복합 나노입자의 제조방법, 이를 이용하여 제조된 나노입자, 및 이를 포함하는 약물전달체에 관한 것이다.
글리아딘은 밀 글루텐에서 분리된 식물성 천연 단백질로서, 중성 및 지용성 아미노산이 풍부한 단백질로 알려져 있다. 글리아딘의 중성 아미노산은 생체내 점막 조직과 수소결합을 촉진하고, 지용성 잔기는 생체 조직내에서 상호작용을 촉진하므로, 글리아딘 나노입자는 특유의 소수성과 제한된 용해성을 가지고, 생체부착(bioadhesion) 능력, 특히 점막층(mucos layer)에 부착될 수 있는 중합체로서, 생분해성 및 생체적합성을 가진 약물전달체로서 주목받고 있다.
레티노인산의 조절된 방출을 위하여 평균입자크기가 500 nm보다 큰 글리아딘 나노입자가 제조된 바 있고, 또한 항헬리코박터 파이롤리 활성을 나타내는 암목시실린을 함유하는 글리아딘 입자가 제조된 적이 있으나 이들은 모두 탈용매(desolvation)법을 이용한 것이었다.
이러한 탈용매법은 약물삽입 효율이 낮고, 용액상태에서 제조된 나노입자를 분리하는데 어려움이 많으며, 제조과정에서 별도의 계면활성제가 소요되는 문제가 있었고, 제조된 나노입자가 중성을 나타내어 입자간의 응집이 발생하는 한계가 있었다.
한편 전기 분무는 어느 정도의 전기 전도도와 점도를 가지는 고분자 용액 등을 모세관에 주입시킨 후 정전기력을 부과하여 미세입자를 제조하는 방법으로 장치의 형태와 구조가 간단하여 제작이 용이하다. 발생된 입자들은 단분산 분포를 가질 수 있을 뿐 아니라 다양한 크기의 입자를 제조하기에 유용하여 최근에는 약물 전달 분야에서 약물을 함유한 입자 생성에 적용하려는 연구가 진행 되고 있다(Xie et al, Biomaterials, 27:3321(2006)).
한국공개특허 제10-2010-0134368호는 전기분무건조를 이용하여 양이온성 고분자 및 음이온성 고분자의 복합입자를 제조하는 방법을 제공하고 있으나, 글리아딘 나노입자 또는 글리아딘 및 젤라틴 복합 나노입자를 제조하는 방법에 대해서는 개시하고 있지 않고, 제조된 입자의 크기도 마이크로 수준으로 세포내 섭취가 불가능한 크기의 입자를 제공하기 위한 기술이라는 한계가 있었다.
본 발명은 전기분무를 통하여 평균입자크기가 나노크기로 작고 균일하며, 제타포텐셜이 높아 분산성이 우수하여 약물전달체로 유용한 글리아딘 나노입자, 또는 글리아딘 및 젤라틴 복합 나노입자를 제조하기 위한 방법을 제공하기 위한 것이다.
본 발명은 65 내지 80 (v/v)% 에탄올 수용액에 글리아딘을 용해시켜 글리아딘 용액을 제조하는 단계; 및 상기 글리아딘 용액을 전기분무하는 단계;를 포함하는 글리아딘 나노입자의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 글리아딘 나노입자의 제조방법에서, 상기 글리아딘 용액의 글리아딘 농도는 5 내지 10 중량%인 것이 바람직하다. 글리아딘 용액의 농도가 상기 하한치 미만인 경우 나노입자의 크기의 균일성이 저하되고, 상기 상한치를 초과하는 경우 구형의 입자를 형성하지 못하고 섬유상 네트워크를 형성하기 시작한다.
본 발명의 글리아딘 나노입자의 제조방법은, 상기 전기분무에서 용액의 유속은 0.1 내지 1 ㎖/hr 이고, 전압차는 12 내지 18 kV일 수 있다. 이는 통상의 전기분무에 비해 유속이 매우 느리고, 높은 전압을 적용하는 것으로, 상기 범위를 벗어날 경우 본 발명에서 원하는 크기의 나노입자를 형성할 수 없다.
본 발명의 글리아딘 나노입자의 제조방법은, 상기 전기분무에서 노즐의 직경이 0.1 내지 0.5 mm인 것을 특징으로 한다.
본 발명은 전기분무법에 의해 제조되어 제타포텐셜이 15 내지 30 mV이고, 평균입자크기가 200 내지 350 nm인 것을 특징으로 하는 글리아딘 나노입자를 제공한다. 본 발명의 글리아딘 나노입자는 종래 탈용매(desolvation)법으로 제조된 글리아딘 입자에 비하여 현저히 크기가 작고, 또한 제타포텔셜이 높아 제조된 나노입자가 응집되지 않고 잘 분산될 수 있다.
본 발명은 65 내지 80 (v/v)% 에탄올 수용액에 글리아딘을 용해시켜 글리아딘 용액을 제조하는 단계; 80 내지 99 (v/v)% 아세트산 수용액에 젤라틴을 용해시켜 젤라틴 용액을 제하는 단계; 상기 글리아딘 용액과 젤라틴 용액을 혼합하여 혼합용액을 제조하는 단계; 및 상기 글리아딘 및 젤라틴 혼합용액을 전기분무하는 단계;를 포함하는 글리아딘 및 젤라틴 복합 나노입자의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 글리아딘 및 젤라틴 복합 나노입자의 제조방법은, 상기 혼합용액의 글리아딘 및 젤라틴을 합한 고형분 100 중량부에 대하여 0.5 내지 5 중량부의 가교제를 더 첨가하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 글리아딘 및 젤라틴 복합 나노입자의 제조방법에서, 상기 글리아딘 용액의 글리아딘 농도는 5 내지 10 중량%이고, 젤라틴 용액의 젤라틴 농도는 0.1 내지 6 중량%인 것을 특징으로 한다.
본 발명은 전기분무법에 의해 제조되어 제타포텐셜이 15 내지 30 mV이고, 평균입자크기가 300 내지 500 nm인 것을 특징으로 하는 글리아딘 및 젤라틴 복합 나노입자를 제공한다.
본 발명은 상기 글리아딘 나노입자 또는 상기 글리아딘 및 젤라틴 복합 나노입자; 및 약제학적 활성성분;을 포함하는 서방성 약물전달체를 제공한다.
본 발명에 있어서, '약제학적 활성성분'은 질병의 예방, 치료, 완화 또는 경감을 위해 사용되는 모든 생물학적, 화학적 물질을 포함하며, 다른 약물의 약리효과를 보조해 주는 물질 또한 본 발명의 '약제학적 활성성분'에 포함된다. 예를 들어, 항암제, 항염증제, 항균제, 항바이러스제, 호르몬제, 항산화제 등이 본 발명의 '약제학적 활성성분'으로 사용될 수 있다.
또한, 전술한 성분 이외에 당 업계에 알려진 통상적인 첨가제, 예컨대 부형제, 안정화제, pH 조정제, 항산화제, 보존제, 결합제 또는 붕해제 등을 포함할 수 있다. 이때, 상기 전달체는 당 분야에 알려진 기타 첨가제, 용매 등을 추가적으로 포함할 수 있다.
또한, 상기 약물전달체는 경구제 또는 비경구제의 형태로 제제화하여 사용할 수 있으며, 정맥, 근육 또는 피하 주사제로 제조할 수 있다.
본 발명의 서방성 약물전달체에서, 상기 약제학적 활성성분은 사이클로포스파미드이고, 상기 서방성 약물전달체는 유방암 세포의 자연사를 유도하여 유방암의 치료에 사용될 수 있다.
본 발명의 전기분무를 통하여 제조된 글리아딘 나노입자, 또는 글리아딘 및 젤라틴 복합 나노입자는, 탈용매(desolvation)법으로 제조된 글리아딘 입자에 비해 평균입자크기가 작고, 제타포텐셜이 높아 나노입자의 응집을 줄일 수 있으면서 약물삽입 효율이 뛰어나 약물전달체로 사용하기에 적합하며, 본 발명의 나노입자를 약물전달체로 사용할 경우 기존 약물들의 낮은 용해도와 불안정성, 선택성 부족을 비롯한 비특이적 독성을 완화시킬 수 있다.
도 1은 주입 펌프, 분무 노즐, 고전압 서플라이어 및 수집기로 구성된 전기분무장치의 개략도이다.
도 2의 A는 제조예 2의 7 중량% 글리아딘 용액을 이용하여 제조한 글리아딘 나노입자의 전자주사현미경 사진이고, 도 2의 B는 제조예 3의 7 중량% 글리아딘 용액 및 4 중량% 젤라틴 용액의 혼합용액을 이용하여 제조한 글리아딘 및 젤라틴 복합 나노입자의 전자주사현미경 사진이다.
도 3의 A는 제조예 2의 7 중량% 글리아딘 용액을 이용하여 제조한 글리아딘 나노입자의 투과전자현미경 사진이고, 도 3의 B는 제조예 3의 7 중량% 글리아딘 용액 및 4 중량% 젤라틴 용액의 혼합용액을 이용하여 제조한 글리아딘 및 젤라틴 복합 나노입자의 투과전자현미경 사진이다.
도 4의 A는 제조예 2의 14 중량% 글리아딘 용액을 이용하여 제조된 글리아딘 나노입자의 전자주사현미경 사진이고, 도 4의 B는 제조예 3의 7 중량% 글리아딘 용액 및 8 중량% 젤라틴 용액의 혼합용액을 이용하여 제조한 글리아딘 및 젤라틴 복합 나노입자의 전자주사현미경 사진이며, 도 4의 C는 제조예 3의 14 중량% 글리아딘 용액 및 8 중량% 젤라틴 용액의 혼합용액을 이용하여 제조한 글리아딘 및 젤라 틴 복합 나노입자의 전자주사현미경 사진이다.
도 5의 A는 제조예 2의 7 중량% 글리아딘 용액을 이용하여 제조한 글리아딘 나노입자, B는 제조예 3의 7 중량% 글리아딘 용액 및 4 중량% 젤라틴 용액의 혼합용액을 이용하여 제조한 글리아딘 및 젤라틴 복합 나노입자, 및 C는 제조예 3의 7 중량% 글리아딘 용액 및 8 중량% 젤라틴 용액의 혼합용액을 이용하여 제조한 글리아딘 및 젤라틴 복합 나노입자의 입자크기 분포를 나타낸 그래프이다.
도 6의 A는 제조예 2의 14 중량% 글리아딘 용액을 이용하여 제조한 글리아딘 나노입자, B는 제조예 3의 14 중량% 글리아딘 용액 및 4 중량% 젤라틴 용액의 혼합용액을 이용하여 제조한 글리아딘 및 젤라틴 복합 나노입자, 및 C는 제조예 3의 14 중량% 글리아딘 용액 및 8 중량% 젤라틴 용액의 혼합용액을 이용하여 제조한 글리 아딘 및 젤라틴 복합 나노입자의 입자크기 분포를 나타낸 그래프이다.
도 7은 제조예 3의 7 중량% 글리아딘 용액과 4 중량% 젤라틴 용액의 혼합용액으로부터 제조된 글리아딘 및 젤라틴 복합 나노입자에서 글리아딘과 젤라틴 사이에 교차결합에 의한 중합이 있는지를 확인하기 위한 X선 회절분석 그래프이다.
도 8은 제조예 2의 7 중량% 글리아딘 용액을 이용하여 제조된 글리아딘 나노입자와 제조예 3의 7 중량% 글리아딘 용액과 4 중량% 또는 8 중량%의 젤라틴 용액의 혼합용액을 이용하여 제조한 글리아딘 및 젤라틴 복합 나노입자의 약물 방출 패턴을 나타낸 그래프이다.
도 9는 MCF7 유방암 세포를 24시간 동안 배양한 후, 배지만 첨가한 대조군 1(도 9의 A), 배지에 사이클로포스파미드가 주입되지 않은 글리아딘 나노입자만 첨가한 대조군 2(도 9의 B), 배지에 사이클로포스파미드만 첨가한 대조군 3(도 9의 C), 및 배지에 사이클로포스파미드가 주입된 글리아딘 나노입자를 첨가한 실시예(도 9의 D)를 12 시간, 24 시간 및 48 시간 배양하면서, Annexin V 및 프로피듐 요오드로 각각 염색하여 세포 자연사 및 세포괴사를 확인한 사진이다.
도 10은 대조군 1 내지 3 및 실시예에서 Bcl-2 단백질의 발현량을 확인한 웨스턴 블랏 사진이다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
제조예1 : 글리아딘의 제조
밀가루에서 추출된 동결건조되고 분쇄된 글루텐을 이용하였다. 상기 글루텐과 다이클로로메탄을 1 : 10 중량비로 20 ℃에서 2시간 동안 2회 추출하여 탈지시켰다. 상기 추출물을 여과한 후 20 ℃에서 감압 건조하였다. 건조된 글루텐 분말(100g)은 70 (v/v)% 에탄올 수용액과 1 : 10 중량비로 혼합한 후 20 ℃에서 4시간 동안 부드럽게 교반하고, 현탁액을 4600 rpm에서 원심분리하였다. 글리아딘 은 상등액에 존재하므로, 상등액을 다시 동결건조하였다. 그러나 상기 상등액의 동결건조물에는 여전히 일부의 글루텐닌 단백질을 포함하고 있으므로, 증류수로 수회 세척하여 글루텐닌 단백질을 제거한 후 여과하고, 여과된 고형물에 0.05 M 아세트산을 처리하고, 이를 다시 동결건조하여 글리아딘 분말을 제조하였다.
제조예2 : 글리아딘 나노입자의 제조
제조예 1의 글리아딘 분말은 글리아딘은 수불용성이었고, 에탄올 수용액에 있어서도 65 (v/v)% 미만 또는 80 (v/v)% 초과의 알코올 수용액에서는 용해되지 않았다.
상기 글리아딘 분말로부터 글리아딘 나노입자를 제조하기 위하여, 70 (v/v)% 에탄올 수용액에 상기 글리아딘 분말을 14 중량%가 되도록 혼합하고, 실온에서 2 시간 교반한 후, 2일 동안 숙성시켜 글리아딘 용액을 제조하였다.
상기 14 중량% 글리아딘 용액을 각각 2, 7 및 14 중량%의 글리아딘 농도로 희석하여 각각의 글리아딘 용액으로 도 1의 개략도에 나타낸 전기분무장치를 이용하여 전기분무시켰다.
글리아딘 주입 펌프(Nano NC, 한국), 분무 노즐, 고전압 서플라이어 및 접지된 글리아딘 입자 수집기로 구성된 전기분무장치에서, 각각의 글리아딘 용액을 10 ㎖ 주사기에 충진한 후, 글리아딘 용액의 공급속도 0.5 ㎖/hr로 직경 32 GA(약0.0097 inch)이고, 고전압 서플라이어에 연결된 스테인레스 스틸 노즐에 주입하였다. 이때 노즐과 접지된 스테인레스 스틸판의 전위차는 12 내지 14 kV가 되도록 고전압 서플라이어에 전압을 인가하였다.
제조예3 : 글리아딘 및 젤라틴 복합 나노입자의 제조
제조예 2와 동일하게 글리아딘 용액을 제조하고, 동일한 장치와 조건의 전기분무장치를 이용하였다.
다만, 젤라틴을 4 중량% 및 8 중량%가 되도록 90 (v/v)%의 아세트산 수용액과 혼합하고, 실온에서 2 시간 교반한 후, 2일 동안 숙성시켜 젤라틴 용액을 제조하였다.
7 중량%의 글리아딘 용액 또는 14 중량%의 글리아딘 용액과, 4 중량%의 젤라틴 용액 또는 8 중량%의 젤라틴 용액을 1 : 1 중량비로 혼합하여 혼합용액을 제조하고, 혼합용액을 상기 제조예 2의 전기분무장치를 이용하여 동일조건에서 전기분무를 실시하였다. 다만 글리아딘 및 젤라틴 고형물의 합 100 중량부에 대하여 2 중량부에 해당하는 글루타르알데하이드를 첨가하여 25 ℃에서 60 분 중합이 이루어지도록 하였다.
실험예1 : 형태적 특성 확인
제조예 2에서 제조된 글리아딘 나노입자들과, 제조예 3의 글리아딘 및 젤라틴 복합 나노입자의 형태를 전자주시현미경(SEM, TESCAN Model: VEGA/SBH Motorize)로 확인하였다. 상기 나노입자들은 터보 스퍼터 코터를 이용하여 플래티늄 코팅을 한 후 20 kV에서 SEM사진을 얻었다.
도 2의 A는 제조예 2의 7 중량% 글리아딘 용액을 이용하여 제조한 글리아딘 나노입자의 것이고, 도 2의 B는 제조예 3의 7 중량% 글리아딘 용액 및 4 중량% 젤라틴 용액의 혼합용액을 이용하여 제조한 글리아딘 및 젤라틴 복합 나노입자의 SEM 사진으로 구형의 나노입자가 형성되었음을 확인할 수 있다.
또한 투과전자현미경(TEM, JEM-2100F)를 이용하여 전압 200 kV, 음전류 95 ㎂, 방출전류 126 ㎂에서 TEM사진을 얻었다.
도 3의 A는 제조예 2의 7 중량% 글리아딘 용액을 이용하여 제조한 글리아딘 나노입자의 것이고, 도 3의 B는 제조예 3의 7 중량% 글리아딘 용액 및 4 중량% 젤라틴 용액의 혼합용액을 이용하여 제조한 글리아딘 및 젤라틴 복합 나노입자의 TEM 사진으로 구형의 나노입자가 형성되었음을 SEM 사진에 비해 더 명확히 확인할 수 있고, 평균입자크기가 글리아딘 나노입자에서 더 작음을 확인할 수 있다.
또한 제조예 2의 2 중량% 글리아딘 용액을 이용하여 제조된 글리아딘 나노입자의 경우, 입자크기가 불균일하여, 글리아딘 용액의 농도가 낮으면 단분산성의 구형 나노입자를 얻기 어려움을 알 수 있었고, 제조예 2의 14 중량% 글리아딘 용액을 이용하여 제조된 글리아딘 나노입자의 경우, 입자끼리 뭉쳐 나노크기의 입자가 형성되지 못하고 마이크로 크기의 입자와 나노입자가 혼재되어 크기가 불균일함을 알 수 있었다(도 4의 A).
또한 제조예 3의 7 중량% 글리아딘 용액 및 8 중량% 젤라틴 용액의 혼합용액을 이용하여 제조한 글리아딘 및 젤라틴 복합 나노입자는 구형 입자끼리 응집되어 불균일한 형태의 입자가 형성되었다(도 4의 B).
또한 14 중량% 글리아딘 용액 및 8 중량% 젤라틴 용액의 혼합용액을 이용하여 제조한 글리아딘 및 젤라틴 복합 나노입자의 경우는, 형성된 나노입자의 크기가 균일하지 않음은 물론 섬유상 네트워크를 형성하고 있었다(도 4의 C).
실험예2 : 입자크기 분포 및 제타포텐셜 확인
제조예 2의 7 중량% 글리아딘 용액을 이용하여 제조한 글리아딘 나노입자, 제조예 3의 7 중량% 글리아딘 용액 및 4 중량% 젤라틴 용액의 혼합용액을 이용하여 제조한 글리아딘 및 젤라틴 복합 나노입자, 및 제조예 3의 7 중량% 글리아딘 용액 및 8 중량% 젤라틴 용액의 혼합용액을 이용하여 제조한 글리아딘 및 젤라틴 복합 나노입자의 입자크기 분포와 제타포텐셜을 확인하였다.
먼저 상기 나노입자들을 탈이온수에 분산시키고, 팁 소니케이터(Sonics, Vibrcell)를 이용하여 20% 진폭으로 3분 동안 초음파 처리하고, 동적 광분산 제타사이저 4(Malvern Instrument, France)를 이용하여 입자크기 분포와 제타포텐셜을 측정한 후 그 결과를 표 1 및 도 5에 나타내었다.
구분 평균 입자크기 평균 제타포텐셜
7중량% 글리아딘 218.66±5.15 18.46±8.29
7중량% 글리아딘+4중량% 젤라틴 398.56±4.20 19.00±3.62
7중량% 글리아딘+8중량% 젤라틴 450.10±9.70 14.20±3.72
제조예 2의 7 중량% 글리아딘 용액을 이용하여 제조한 글리아딘 나노입자는 균일한 크기(218.66 nm)에 제타포텐셜이 18.46 mV로서 양전하를 띠고 있었고, 7 중량% 글리아딘에 4 중량% 젤라틴을 혼합한 혼합용액의 경우 평균 입자크기가 2 배 정도로 증가하고, 제타포텐셜은 유사하게 유지됨을 알 수 있었다. 그러나 7 중량%의 글리아딘에 젤라틴의 농도가 8 중량%로 증가된 혼합용액에서는 평균 입자크기가 증가된 반면에, 제타포텐셜은 오히려 감소하였다.
또한 제조예 3의 14 중량%의 글리아딘에 각각 4 중량% 및 8 중량%의 젤라틴을 혼합한 혼합용액으로 제조한 글리아딘 및 젤라틴 나노입자는 그 입자크기가 각각 471.6±7.8 nm 및 516.1±14.8 nm 이었고, 제타포텐셜은 각각 19.3 mV와 21.8 mV로 높은 값을 나타내었다(도 6의 B 및 C).
상기 결과로부터 나노입자의 평균입자크기는 글리아딘 용액의 농도에 비례하여 증가하다가 14 중량% 이상에서는 섬유상 구조가 됨을 알 수 있었고, 글리아딘 용액의 농도를 일정하게 할 경우 젤라틴 용액의 농도에 비례하여 평균입자크기가 증가하고, 글리아딘 용액의 농도가 7 중량%일 때 젤라틴 용액의 농도가 8 중량% 이상일 때 섬유상 네트워크가 형성됨을 알 수 있었다.
실험예3 : 글리아딘 및 젤라틴의 교차결합 확인
제조예 3의 7 중량% 글리아딘 용액과 4 중량% 젤라틴 용액의 혼합용액으로 부터 제조된 글리아딘 및 젤라틴 복합 나노입자에서 글리아딘과 젤라틴 사이에 교차결합에 의한 중합이 있는지를 확인하기 위하여 X선 회절분석기(Rigaku Corporation, Japan)를 이용하여 X선 회절분석을 실시하여 그 결과를 도 7에 나타내었다.
젤라틴은 18 degree에 주 피크가 나타났고, 글리아딘 입자는 12 및 18 degree에 주 피크가 나타났다. 글리아딘 및 젤라틴 복합 나노입자의 경우에는 12 degree에서 부 피크, 18 degree에서 주 피크가 함께 관찰되었고, 이는 젤라틴이 글리아딘의 표면에 결합되었기 때문으로 생각되었다.
실험예4 : 약물 방출 분석
제조예 2 및 3의 나노입자들의 약물 방출 패턴을 분석하기 위하여 항암제인 사이클로포스파미드를 이용하였다.
약물이 주입된 나노입자는 글리아딘 용액, 또는 글리아딘 및 젤라틴 혼합용 액에 사이클로포스파미드를 1 mg / ml 을 혼합하고, 이를 전기분무하여 제조하였다.
사이클로포스파미드가 주입된 나노입자에서 용출되어 나오는 사이클로포스파미드는 사이클로포스파미드의 니트로소 유도체를 제조한 후 325 nm에서 흡광도를 측정하여 최초 주입된 사이클로포스파미드 량에 대한 시간에 따른 방출량을 백분율로 도 8에 나타내었다.
제조예 2의 7 중량% 글리아딘 용액을 이용하여 제조된 글리아딘 나노입자와 제조예 3의 7 중량% 글리아딘 용액과 4 중량% 또는 8 중량%의 젤라틴 용액의 혼합용액을 이용하여 제조한 글리아딘 및 젤라틴 복합 나노입자 모두 2단계 방출패턴을 나타내었다.
1단계에서 제조예 3의 7 중량% 글리아딘 용액과 8 중량%의 젤라틴 용액의 혼합용액을 이용하여 제조한 글리아딘 및 젤라틴 복합 나노입자는 1 시간 이내에 46%의 사이클로포스파미드를 용출시켰다. 그러나 제조예 2의 글리아딘 나노입자와 제조예 3의 7 중량% 글리아딘 용액과 4 중량%의 젤라틴 용액의 혼합용액을 이용하여 제조한 글리아딘 및 젤라틴 복합 나노입자는 1 시간 이내에 각각 25% 및 30%가 방출됨을 확인할 수 있었다. 이러한 1단계의 빠른 방출은 나노입자 표면에 부착된 사이클로포스파미드로 인한 것으로 판단되었고, 특히 젤라틴 함량이 높아질수록 1단계에서 빠른 방출이 이루어지는 것은 젤라틴의 높은 용해성에 기인한 것일 것으로 판단되었다.
1단계 빠른 방출 이후 2단계에서는 48시간까지 사이클로포스파미드가 서서히 방출됨을 알 수 있었고, 48시간째의 방출량은 7 중량% 글리아딘 용액을 이용하여 제조한 글리아딘 나노입자는 80%, 7 중량% 글리아딘 용액과 4 중량% 젤라틴 용액의 혼합용액을 이용하여 제조한 글리아딘 및 젤라틴 복합 나노입자의 경우는 90%, 7 중량% 글리아딘 용액과 8 중량% 젤라틴 용액의 혼합용액을 이용하여 제조한 글리아딘 및 젤라틴 복합 나노입자의 경우에는 95%로 나타났다.
상기 결과로부터 약물 방출 패턴은 나노입자 표면의 젖음성(wettability)에 영향을 받는 것으로, 소수성의 글리아딘 나노입자의 경우에는 약물의 서서히 방출되지만, 친수성의 젤라틴이 나노입자에 포함될수록 방출속도가 빨라지므로, 글리아딘 나노입자에 젤라틴의 첨가농도를 조절함으로써 약물의 방출속도를 조절할 수 있음을 알게 되었다. 다만 상기 7 중량% 글리아딘 용액과 8 중량% 젤라틴 용액의 혼합용액을 이용하여 제조한 글리아딘 및 젤라틴 복합 나노입자의 경우 생체내 과량 투여시 부작용이 발생하여 서방성을 필요로 하는 약물에는 적합하지 않은 것으로 판단되었다.
실험예5 : 유방암 세포의 자연사 확인
실험예 4에서 글리아딘 및 젤라틴 복합 나노입자의 경우에도 24시간째 약 88 내지 90%의 약물이 방출되는 조절된 방출효과를 나타내었으나, 유방암 세포 자연사 확인을 위해서는 항암제인 사이클로포스파미드를 주입시킨 제조예 2의 7 중량% 글리아딘 용액을 이용하여 제조된 글리아딘 나노입자를 이용하였다. 이는 글리아딘 나노입자가 24시간째 75%의 약물 방출을 나타내어 조절된 방출효과를 나타내고, 평균입자크기가 218.7 nm로서 세포내 섭취(endocytosis)가 가능할 수도 있다는 판단을 했기 때문이다.
글리아딘 나노입자의 유방암 세포의 자연사 조절 여부를 확인하기 위하여, MCF7 유방암 세포를 24시간 동안 배양한 후, 배지만 첨가한 대조군 1(도 9의 Control), 배지에 사이클로포스파미드가 주입되지 않은 글리아딘 나노입자만 첨가한 대조군 2(도 9의 NP), 배지에 사이클로포스파미드만 첨가한 대조군 3(도 9의 CPA), 및 배지에 사이클로포스파미드가 주입된 글리아딘 나노입자를 첨가한 실시예(도 9의 NP+CPA)를 12 시간, 24 시간 및 48 시간 배양하면서, Annexin V로 염색하여 자연사한 세포를 확인하였고(녹색 염색), 프로피듐 요오드로 염색하여 세포괴사를 확인하였다(적색 염색).
대조군 1 및 2의 경우는 자연사한 세포나 세포괴사를 확인할 수 없었다. 그러나 사이클로포스파미드 만을 단독으로 첨가한 대조군 3의 경우 24시간 배양에서 세포괴사가 발생함을 확인하였고, 사이클로포스파미드를 글리아딘 나노입자에 주입한 실시예의 경우에는 유방암 세포의 자연사를 확인할 수 있었다. 실시예는 대조군 3에 비해서도 사멸된 세포가 현저히 증가되었음을 알 수 있었다.
실시예의 사이클로포스파미드가 주입된 글리아딘 나노입자의 유방암 세포에 대한 자연사 효과를 확인하기 위하여 웨스턴 블랏을 실시하여 그 결과를 도 8에 나타내었다. 실시예의 사이클로포스파미드를 주입시킨 글리아딘 나노입자와 24 시간 배양한 유방암 세포에서 Bcl-2 단백질의 생성이 현저히 감소된 것을 확인할 수 있었고, 반면에 글리아딘 나노입자만 첨가하여 배양한 대조군 2의 경우 유방암 세포에서 Bcl -2 단백질이 감소하였다.
또한 실시예의 사이클로포스파미드를 주입시킨 글리아딘 나노입자와 배양한 경우에도 12시간까지는 세포 자연사를 발생시키지 않는 것으로 나타났고, 특히 대조군 3의 사이클로포스파미드만을 첨가하여 배양한 경우에는 24시간째까지 세포 자연사를 발생시키지 않음을 알 수 있었다. 이는 실시예의 사이클로포스파미드를 주입시킨 글리아딘 나노입자가 세포내 섭취를 통해 약물 방출의 조절을 향상시킬 수 있었기 때문인 것으로 판단되었다.

Claims (11)

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  6. 65 내지 80 (v/v)% 에탄올 수용액에 글리아딘을 용해시켜 글리아딘 용액을 제조하는 단계; 80 내지 99 (v/v)% 아세트산 수용액에 젤라틴을 용해시켜 젤라틴 용액을 제하는 단계; 상기 글리아딘 용액과 젤라틴 용액을 혼합하여 혼합용액을 제조하는 단계; 및 상기 글리아딘 및 젤라틴 혼합용액을 전기분무하는 단계;를 포함하는 글리아딘 및 젤라틴 복합 나노입자의 제조방법.
  7. 제 6 항에 있어서, 상기 혼합용액의 글리아딘 및 젤라틴을 합한 고형분 100 중량부에 대하여 0.5 내지 5 중량부의 가교제를 더 첨가하는 것을 특징으로 하는 글리아딘 및 젤라틴 복합 나노입자의 제조방법.
  8. 제 6 항 또는 제 7 항에 있어서, 상기 글리아딘 용액의 글리아딘 농도는 5 내지 10 중량%이고, 젤라틴 용액의 젤라틴 농도는 0.1 내지 6 중량%인 것을 특징으로 하는 글리아딘 및 젤라틴 복합 나노입자의 제조방법.
  9. 전기분무법에 의해 제조되어 제타포텐셜이 15 내지 30 mV이고, 평균입자크기가 300 내지 500 nm인 것을 특징으로 하는 글리아딘 및 젤라틴 복합 나노입자.
  10. 청구항 제9항의 글리아딘 및 젤라틴 복합 나노입자; 및 약제학적 활성성분;을 포함하는 서방성 약물전달체.
  11. 제 10 항에 있어서, 상기 약제학적 활성성분은 사이클로포스파미드이고, 유방암 환자 치료용인 것을 특징으로 하는 서방성 약물전달체.
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