KR101390158B1 - 미토콘드리아 특이적으로 형광능이 부여된 퇴행성 뇌질환에 대한 약물 검출용 형질전환체 및 이를 이용한 약물 검출 방법 - Google Patents

미토콘드리아 특이적으로 형광능이 부여된 퇴행성 뇌질환에 대한 약물 검출용 형질전환체 및 이를 이용한 약물 검출 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 미토콘드리아 특이적으로 형광능이 부여된 퇴행성 뇌질환에 대한 약물 검출용 형질전환체 및 약물 검출 방법에 관한 것으로, 본 발명의 미토콘드리아 특이적으로 형광능이 부여된 형질전환체는 소교세포의 미토콘드리아 대사에 대한 연구에 활용할 수 있고, 퇴행성 뇌질환에 대한 약물을 용이하게 검출할 수 있어 알츠하이머 및 뇌졸중 등 다양한 퇴행성 뇌질환에 대한 약물개발에 사용될 수 있다.

Description

미토콘드리아 특이적으로 형광능이 부여된 퇴행성 뇌질환에 대한 약물 검출용 형질전환체 및 이를 이용한 약물 검출 방법{Tnsduced cell for drug screening against degenerative brain diseases having mitocondria-specific fluorescence}
본 발명은 미토콘드리아 특이적으로 형광능이 부여된 퇴행성 뇌질환에 대한 약물 검출용 형질전환체 및 약물 검출 방법에 관한 것이다.
뇌세포는 크게 신경세포(neuron)와 교세포(glia cell)로 나뉘어 지는데, 교세포의 일부를 차지하는 소교세포 (microglia)는 뇌에서 면역작용에 관여하는 주요한 세포로서 뇌신경이 손상을 받거나 퇴화되었을 때 활성화되어 영양물질 (trophic factor)을 분비하여 신경의 생존을 돕거나 대식세포 (macrophage)처럼 염증을 유도하는 다양한 물질을 분비하여 신경의 퇴화를 유도하는 것으로 알려져 있다. 대표적으로 알려진 분비물질로는 단백질 분해효소(protease), 프로스타글란딘류 (prostaglandins), 사이토카인(cytokine) 등이 알려져 있다. 또한, 활성화된 소교세포는 다양한 초기 염증 매개자(pro-inflammatory mediators;TNF-α, IL-6, IL-1b 및 iNOS 등) 및 활성 산소종(superoxide, hydroxyl radicals, hydrogen peroxide 및 nitric oxide)을 발생시킬 수 있다.
다양한 종류의 퇴행성 뇌질환에서 소교세포의 활성화가 관찰되었다. 뇌졸중의 경우, 소교세포의 활성화가 매우 빠른시간 내에 일어나며, 특히 허혈성 뇌졸중의 경우 발병 후 수시간 내에 소교세포의 활성화가 관찰되고, 수십 시간 후에 성상세포의 활성화가 관찰되며 이는 수개월간 유지되기도 한다. 알츠하이머병(Alzheimer's disease)의 경우에도 노용균반점 (senile plague)의 형성에 소교세포가 중요한 역할을 한다는 것은 매우 잘 알려져 있으며, 이부프로펜 등과 같은 소염제가 노용균반점의 형성을 억제하여 치매 발병을 예방하는 것으로 알려져 있다. 최근 말초 혈액 혹은 활성화된 교세포에서 생성되는 사이토카인류 등이 흥분성 신경전달 물질, 간질, 퇴행성 신경질환에 의한 신경세포 독성을 유발하는 인자임이 밝혀졌다. 따라서 신경세포의 사멸과 기능의 저하를 억제하기 위하여 교세포, 특히 소교세포의 활성화를 억제하는 것은 뇌졸중, 알츠하이머병 등의 퇴행성 뇌질환 치료제 개발에 매우 중요하다.
퇴행성 뇌질환은 국내의 경우 노인성 치매는 65세 이상 인구의 10 %를 차지하고 있으며 파킨슨병은 약 1 % 정도를 차지하고 있다. 또한, 허혈성 뇌졸중은 암 다음으로 높은 사망원인 중의 하나이며 2001년 통계청 자료에 의하면 인구 10 만명 당 매년 74명이 뇌졸중에 의해서 사망하고 있다. 이들 뇌질환은 주로 50세 이상의 고령층에서 급격히 발생빈도가 증가하는 성인 질환이며, 심각한 사회적 경제적 부담이 되는 질환일 뿐만 아니라, 노인 연령층에서 삶의 질적 저하를 초래하는 주요 질환이다. 더구나 최근의 추세로 보면 평균수명의 연장으로 노령인구의 증가로 말미암아 퇴행성 뇌질환 환자가 증가하고 있으며 이를 해결하기 위해서는 퇴행성 뇌질환의 예방 및 치료제의 개발이 시급한 실정이다.
따라서, 지난 10여 년간 퇴행성 뇌질환과 관련이 있는 소교세포의 활성화를 억제함으로써 신경세포 사멸을 억제할 수 있는 항염증제를 개발하기 위하여 많은 연구가 이루어져 왔으며, 지금까지 보고된 약물중 소교세포 활성화를 억제함으로써 신경세포 보호 효과를 나타내거나 신경세포사멸 억제 가능성이 있는 것으로 알려진 대표적인 약물로는 (1) 비스테로이드성 소염제 (Nonsteroidal antiinflammatory drug; NSAID), (2) 프로펜토필린 (propentophylline), VIP(vasoactive intestinal polypeptide) 및 PACAP (pituitary adenylate cyclase activating polypeptide) 등의 cAMP-증강제, (3) 에스트로겐 (estrogen) 등의 스테로이드성 호르몬, (4) 아편유사제 (opoids), 엔도몰핀 (endomorphin) 및 낼럭손 (naloxone) 등의 길항제, (5) 로바스타틴 (Lovastatin) 등의 메발론산 경로 억제제 (mevalonate pathway inhibitors), (6) 15d-PGJ2, 시글리타존(ciglitazone)과 같은 PPAR-γ(peroxisome proliferator-activated receptor-γ) 아고니스트 (7) 멜라토닌 (melatonine), 칸나비노이드 (cannabinoid) 등의 기타물질이 알려져 있으며, 특히 최근에 PPAR-γ 아고니스트들은 항염증제로서 그 중요성이 부각되고 있고 있다. 또한, 알츠하이머병의 치료에 쓰이고 있는 NSAID도 일종의 PPAR-γ 아고니스트로 최근에 보고된 바 있다. 또한, 소교세포의 활성화 기전을 비롯한 많은 연구에도 불구하고 소교세포의 활성화 억제 또는 저하와 관련된 기전은 아직까지 모호한 실정이며, 소교세포의 활성을 억제하는 항염증제의 개발 또한 아직까지도 국내 외적으로 미흡한 상태이고, 또한 인체에 부작용이 적으면서 소교세포 (microglia) 활성을 선택적으로 억제하는 약물은 현재까지 보고된 바가 없다. 따라서, 퇴행성 뇌질환에 대한 약물 검출 방법의 개발을 통한 퇴행성 뇌질환 약물의 개발이 시급한 실정이다.
소교세포의 활성화시 수반되는 소교세포의 형태적 변화는 활성화의 중요한 지표로 알려져 있다. 중추신경계에서 소교세포는 다양한 병리학적 자극에 의하여 활성화되고, 상기 소교세포의 자극은 세포의 기능 상태 및 표현형을 변화시킨다. 특히, 3-NP(3-nitropropionic acid)에 의해 유도된 신경 퇴화 모델 및 나이 든 마우스의 활성화된 뇌의 소교세포는 미토콘드리아의 이상(dysfuntion)을 보인다. 미토콘드리아 이상을 일으키는 퇴행성 뇌질환의 유발 독소들에 의하여 활성화되는 분자적 경로가 소교세포에 존재한다. 미토콘드리아의 융합과 분열과정은 미토콘드리아 기능을 유지하는데 중요하다. 미토콘드리아 분열 및 융합은 큰 GTPase 패밀리에 의하여 조절되고, Drp1(dynamin-related protein)에 의한 분열 또는 Opa1(optic atrophy 1)에 의한 분열이 존재한다. 지나친 미토콘드리아 분열 또는 불충분한 미토콘드리아 융합은 미토콘드리아 단편화(fragmentation)을 유도하는데, 상기 단편화는 호흡 및 에너지 생산을 감소시켜, 미토콘드리아 막 포텐셜 및 mtDNA가 손실된다. 소교세포의 미토콘드리아 다이나믹스는 최근에 중요한 세포의 질적 조절 및 세포의 기능의 한 부분으로 인식되었고, 소교세포의 염증반응시 미토콘드리아 단편화가 일어난다는 사실이 알려졌다.
이에 본 발명자들은 상기의 사실에 근거하여, 렌티 바이러스를 이용하여 미토콘드리아 특이적으로 형광능이 부여된 소교세포 유래의 형질전환체를 제조하고, 이를 통해 미토콘드리아를 관찰하여 퇴행성 뇌질환에 대한 약물을 검출함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 미토콘드리아 표적 염기 서열이 융합된 형광단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 렌티 바이러스 벡터를 제공함에 있다.
본 발명의 또다른 목적은, 미토콘드리아 표적 서열이 융합된 형광단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 렌티 바이러스 벡터가 형질 도입된 소교세포(microglia) NMB-mito-BV2(기탁번호:KCTC 12203BP)를 제공함에 있다.
본 발명의 또 다른 목적은, 상기 렌티 바이러스 벡터가 형질 도입된 소교세포(microglia) NMB-mito-BV2(기탁번호:KCTC 12203BP)를 이용한 퇴행성 뇌질환에 대한 약물 검출 방법을 제공함에 있다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 미토콘드리아 표적 염기 서열이 융합된 형광단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 렌티 바이러스 벡터를 제공한다.
또한, 본 발명은 미토콘드리아 표적 서열이 융합된 형광단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 렌티 바이러스 벡터가 형질 도입된 소교세포(microglia)NMB-mito-BV2(기탁번호:KCTC 12203BP)를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 렌티 바이러스 벡터가 형질 도입된 소교세포(microglia) NMB-mito-BV2(기탁번호:KCTC 12203BP)를 이용한 퇴행성 뇌질환에 대한 약물 검출 방법을 제공한다.
본 발명의 미토콘드리아 특이적으로 형광능이 부여된 형질전환체는 소교세포의 미토콘드리아 대사에 대한 연구에 활용할 수 있고, 퇴행성 뇌질환에 대한 약물을 용이하게 검출할 수 있어 알츠하이머 및 뇌졸중 등 다양한 퇴행성 뇌질환에 대한 약물개발에 사용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 소교세포의 미토콘드리아 특이적 형광능을 부여하기 위한 렌티 바이러스 벡터의 구조를 나타낸 도이다.
도 2는 본 발명의 소교세포 NMB-mito-BV2가 미토콘드리아 특이적으로 형광능이 부여됨을 관찰한 도이다.
도 3은 본 발명의 소교세포 NMB-mito-BV2가 미토콘드리아 특이적으로 DsRed2-mito를 발현함을 나타낸 도이다.
도 4는 LPS(Lipopolysaccharide)를 소교세포 NMB-mito-BV2에 처리한 경우와 비 처리한 경우의 미토콘드리아의 이미지를 나타낸 도이다.
도 5는 LPS를 소교세포 NMB-mito-BV2에 처리한 경우와 비 처리한 경우의 Drp1의 인산화 경향을 나타낸 도이다.
도 6은 Prdx5 유전자는 CMV 프로모터와 연결되고, emGFP 유전자는 SV40 프로모터와 연결된 염기서열을 포함하는 렌티 바이러스 벡터의 구조를 나타낸 도이다.
도 7은 소교세포 NMB-mito-BV2와, Prdx5(Peroxiredoxin-5)유전자를 추가적으로 형질도입한 소교세포 NMB-mito-BV2에 LPS 처리 후의 미토콘드리아 이미지를 나타낸 도이다.
도 8은 소교세포 NMB-mito-BV2와, Prdx5 유전자를 추가적으로 형질도입한 소교세포 NMB-mito-BV2에 LPS 처리 후의 Drp1의 인산화 경향을 비교한 도이다.
도 9은 소교세포 NMB-mito-BV2와 Prdx5 유전자를 추가적으로 형질도입한 소교세포 NMB-mito-BV2에 LPS 처리 후의 염증반응 관련 단백질의 인산화 경향을 비교한 도이다.
도 10는 소교세포 NMB-mito-BV2와, Prdx5 유전자를 추가적으로 형질도입한 소교세포 NMB-mito-BV2에 LPS 처리 후의 염증반응 관련 유전자의 발현 정도를 비교한 도이다.
본 발명은 퇴행성 뇌질환에 대한 약물 검출용 형질전환체를 제조하기 위한 미토콘드리아 표적 염기 서열이 융합된 형광단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 렌티 바이러스 벡터를 제공한다.
상기 형광단백질을 코딩하는 유전자는 적색(red) 형광 단백질인 DsRed2을 코딩하는 유전자, 녹색(green) 형광 단백질을 코딩하는 유전자, 황색(yellow) 형광 단백질을 코딩하는 유전자일 수 있으나, DsRed2를 코딩하는 유전자임이 바람직하다.
상기 미토콘드리아 표적 염기 서열은 상기 서열을 갖는 유전자에서 발현되는 단백질을 미토콘드리아에 위치시키는 역할을 한다. 상기 미토콘드리아 표적 염기 서열은 미토콘드리아에 위치하는 단백질들이 보유한 미토콘드리아 표적 서열을 코딩하는 염기서열일 수 있고, 바람직하게는 인간의 시토크롬 c 옥시다제의 서브유닛 Ⅷ의 유전자로부터 유래한 염기 서열이나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 DsRed2 단백질은 적색 형광을 내는 단백질이고, 미토콘드리아 표적 염기 서열은 상기 염기 서열이 코딩한 아미노산을 갖는 단백질을 미토콘드리아에 위치시키는 역할을 한다. 이하, DsRed2 단백질을 코딩하는 염기서열과 미토콘드리아 표적 염기서열이 융합된 DNA 서열을 DsRed2-mito 유전자(서열 번호 1)라 한다.
상기 렌티 바이러스 벡터를 제조하는 방법은 하기와 같다. DsRed2-mito 유전자를 LA Taq 중합효소를 이용한 PCR을 통하여 증폭하였다. 그리고 박테리오파지 λ의 위치 특이적 재조합(site-specific recombination)특성을 부여하는 게이트웨이 클로닝 시스템(gateway cloning system)을 사용하여 유전자들을 클로닝 하였다. 상기의 유전자를 게이트웨이 엔트리 벡터에 재조합하여 서브배양하고, 상기 게이트웨이 엔트리 벡터를 게이트웨이 데스티네이션 벡터(gateway destination vector)의 하나의 종류인 렌티 바이러스 벡터와 LR 재조합 반응시켜, DsRed2-mito 유전자(서열 번호 1)를 포함하는 재조합 렌티 바이러스 벡터를 제조한다. 상기 렌티 바이러스 벡터의 염기서열을 서열번호 2로 나타낸다.
본 발명은 상기 미토콘드리아 표적 서열이 융합된 형광단백질을 코딩하는 염기 서열를 포함하는 렌티 바이러스 벡터가 형질 도입된 소교세포(microglia)NMB-mito-BV2(기탁번호:KCTC 12203BP)를 제공한다.
본 발명의 소교세포 NMB-mito-BV2는 미토콘드리아 표적 염기 서열이 융합된 형광단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 렌티 바이러스를 폴리벤과 함께 쥐의 소교세포 유래의 BV-2 세포에 감염시켜 제조한다. 상기 렌티 바이러스에 의하여 형질도입된 세포를 선별하고, 선별된 클로니를 증식시켜, 이를 보관한다. 또한, 상기 세포를 NMB-mito-BV2이라고 명명하였고, 생명공학연구원에 2012년 5월 12일에 기탁하여, 수탁번호 KCTC 12203BP를 부여받았다.
본 발명의 소교세포 NMB-mito-BV2는 미토콘드리아 특이적으로 형광능이 부여된다. 소교세포에 형질도입된 형광단백질은 미토콘드리아 표적 서열(MTS)과 융합된다. 상기 미토콘드리아 표적 서열은 형광단백질이 미토콘드리아에 위치하도록 하는 서열로써, 상기 서열을 통하여 형질도입된 형광단백질이 특이적으로 미토콘드리아에 위치하게 되어 미토콘드리아 특이적으로 형광능이 부여된다.
상기 미토콘드리아 특이적으로 형광능이 부여되는 성질을 이용하여 퇴행성 뇌질환에 대한 약물을 검출할 수 있다.
상기 퇴행성 뇌질환은 알츠하이머 및 뇌졸중 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명은 상기 소교세포 NMB-mito-BV2를 이용한 퇴행성 뇌질환에 대한 약물 검출 방법을 제공한다. 본 발명의 약물 검출 방법은,
1) 미토콘드리아 표적 염기서열이 연결된 형광단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 렌티 바이러스 벡터를 소교세포에 형질도입하여 소교세포 NMB-mito-BV2를 제조하는 단계;
2) 상기 2)단계의 소교세포 NMB-mito-BV2에 퇴행성 뇌질환에 대한 후보 약물을 코딩하는 유전자를 추가적으로 형질도입하는 단계; 및
3) 상기 1)단계의 세포 및 상기 2)단계의 세포에 면역반응 증강제를 처리하여 미토콘드리아를 관찰하는 단계;를 포함할 수 있다.
상기 1)단계의 형광단백질은 적색 형광 단백질인 DsRed2, 녹색 형광 단백질일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
또한, 미토콘드리아 표적 염기서열은 미토콘드리아에 위치하는 단백질이 갖는 미토콘드리아 표적 서열을 코딩하는 염기서열일 수 있고, 바람직하게는 인간의 시토크롬 c 옥시다제의 서브유닛 Ⅷ의 유전자로부터 유래한 서열이나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 2)단계의 퇴행성 뇌질환에 대한 후보 약물을 코딩하는 유전자는 Prdx5(Peroxiredoxin-5)일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 3)단계의 면역반응 증강제는 LPS(Lipopolysaccharide)가 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명의 퇴행성 뇌질환에 대한 약물 검출 방법은,
1)소교세포 NMB-mito-BV2에 퇴행성 뇌질환에 대한 후보 약물을 처리하는 단계;
2)상기 1)단계의 소교세포 NMB-mito-BV2에 면역 반응 증강제를 처리하는 단계; 및
3)상기 2)단계의 미토콘드리아를 관찰하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 3)단계의 미토콘드리아 관찰 시 미토콘드리아 단편화가 일어나지 않았다면, 상기 1)단계에서 후보 약물이 퇴행성 뇌질환에 대한 약물일 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예 또는 제제예에 의거하여 보다 구체적으로 설명한다. 실시예 또는 제제예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 발명의 범위가 이들 실시예 또는 제제예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
< 실시예 1> 미토콘드리아 특이적으로 형광능을 부여하는 렌티 바이러스 벡터의 제조
DsRed2-mito 유전자는 pDsRed2-Mito(clontech, CA, USA)로부터 얻었고, 이를 서열 번호 1에 나타내었다. 상기 DsRed2-mito 단백질의 구성부분인 DsRed2 단백질은 산호말미잘(discosoma) 유래 단백질이고, Mito는 인간의 시토클롬 c 옥시다제의 서브유닛 Ⅷ으로부터 유래한 미토콘드리아 표적 서열(MTS, mitocondria targeting sequence)이다. DsRed2-mito 단백질은 상기 DsRed2와 Mito를 결합한 단백질이다.
DsRed2-Mito 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 LA Taq 중합효소(TaKara, japan)을 이용한 PCR을 통하여 증폭하였다. 그리고 박테리오파지 λ의 위치 특이적 재조합(site-specific recombination) 성질을 부여하는 게이트웨이 클로닝 시스템(gateway cloning system)을 사용하여 상기 유전자들을 클로닝하였다. 상기의 유전자들을 게이트웨이 엔트리 벡터(gateway entry vector)인 pCR8/GW/TOPO(invitrogen, OR, USA)에 서브클론(subcloned)하고, 게이트웨이 엔트리 벡터와 재조합 단백질을 검출하기 위한 재조합 단백질의 C-말단 V5 에피토프(epitope)를 갖도록 하는 게이트웨이 데스티내이션 벡터(gateway destination vector), pLenti6.3/V5-DEST 또는 pLenti7.3/V5-DEST(invitrogen, OR, USA)를 LR 재조합 반응시켜 발현 클론을 제조하였다.
상기 렌티 바이러스 벡터의 구조를 도 1에 나타내었고, 이의 염기 서열을 서열번호 2에 나타내었다.
< 실시예 2> 미토콘드리아 특이적으로 형광능이 부여된 뇌 소교세포 제조
1.세포 배양
v-raf/c-myc으로 재조합한 레트로바이러스에 감염되어 불멸화되고(immortalized) 암세포화된 쥐의 소교세포를 Dr.jau-shyong Hong(NIEHS, NC, USA)로부터 제공받았다(이하, BV-2 세포라고 함). BV-2 세포는 10%의 FBS(Gibco, USA), 페니실린/스트렙토마이신(Gibco, USA)이 함유된 DMEM(welgene, South Korea)에서 37℃, 5%의 CO2의 배양기에서 배양하였다. 상기 세포들은 6-웰 플레이트에서 1~2×105 cell/well의 밀도로 24시간 동안 서브배양(sub-culture)하였고, 이 후 이를 이용하였다.
2. 미토콘드리아 특이적 형광능을 부여하는 렌티 바이러스 벡터를 BV - 2세포에 형질도입
실시예 1에서 제조한 렌티 바이러스 벡터를 포유동물에 대한 렌티 바이러스벡터의 감염 효율을 증가시키는 물질인 폴리벤(polybene(8㎍/ml))과 함께 처리하여, BV-2 세포에 감염시켰다. 상기 렌티 바이러스 벡터에 의하여 형질도입된 세포들을 4㎍/ml의 블라스티시딘(Blasticidin(Izumi et al.1991))에 의하여 선별하였고, 상기의 결과 선별된 클론을 증식시키고, 보관하였다. 이를 NMB-mito-BV2이라고 명명하였고, 생명공학연구원에 2012년 5월 12일에 기탁하여, 수탁번호 KCTC 12203BP를 부여받았다.
실험예 1. 미토콘드리아 이미징을 이용한 형질 도입 세포의 미토콘드리아 특이적 형광능 확인
DsRed2-mito 유전자(서열 번호 1)를 발현하는 NMB-mito-BV2 세포를 0.1%의 폴리-D-라이신에 접종하고, 24mm 반경의 커버슬립(MARIENFELD, Germany)으로 덮었다. 이 후 24시간 동안 배양하였다. 세포를 PBS로 세척하고, PBS 용액에서 4%의 파라포름알데하이드(paraformaldehyde)로 20분 동안 고정하였다. 이 후, PBS로 세 번 세척하고, 커버슬립을 VECTASHIELD(VECTOR lavoratories, CA, USA)를 이용하여 배지에 위치시켰다. 37℃에서 15분 동안 고정 및 배양한 후, 0.5μM의 Mitotracker를 처리하였다. 이미지는 Carl Zeiss LSM-710 공초점 현미경(Carl Zeiss, Gernmany)을 이용하여 얻었다. 이미지는 plan-apochrimat 100X/1.40 oil DIC M27 대물렌즈를 이용하여 기록하였고, 이 후의 이미지 수득 과정은 Zeiss LSM image examiner(ZEN 2009 light edition)을 이용하였다. 이의 결과를 도 2에 나타내었다.
도 2에 나타난 바와 같이, 미토콘드리아를 특이적으로 염색하는 마이토트랙커(Mitotracker)로 염색된 위치와 적색 형광을 나타내는 위치가 일치함을 확인하였고, 이는 NMB-mito-BV2 세포가 미토콘드리아 특이적으로 형광능을 획득한 것임을 나타낸다.
실험예 2. 웨스턴 블로팅을 이용한 형질 도입 및 형광 유전자의 미토콘드리아 특이적 발현 확인.
1.미토콘드리아 단백질 추출
미토콘드리아 추출 키트(Mitochondria isolation kit(Thermo, IL, USA))를 사용설명서에 따라 이용하여, 미토콘드리아 단백질을 추출하였다.
2. 웨스턴 블롯팅
웨스턴 블롯팅을 위하여, 단백질 용해물을 얼음에 냉각시킨 PRO-PREP 단백질 추출 용액(iNtRON Biotechnology, South Korea) 및 RIPA(NP-40 완충제,ELPIS Biotech, South Korea)를 이용하여 준비하였다. 단백질 농도는 infinite-F50 micro plate reader(TECAN, Switzerland)를 사용하여 결정하였다. 그리고 20-40㎍의 단백질 용해물을 8-12%의 SDS-PAGE(sodium-dodecyl sulfate polyacrylamide) 겔을 이용한 전기영동에 의하여 분리하였고, 니트로셀룰로오스 막(GE, PA, USA)에 이동시켰다. 블로킹 완충액(blocking buffer)에서 배양함으로써, 상기 막으로 이동을 중지 시켰고, β-액틴(β-Actin(SantaCruz, CA, USA)), 미토콘드리아 시트크롬 C 옥시다제 서브유닛 Ⅳ(Cytochrome C oxidase subunit Ⅳ(COX Ⅳ; Cell signaling Biotechnology, MA, USA)) 및 V5-에피토프(epitope, Ab Frontier, Seoul, South Korea)대한 일차 항체를 이용하여 4℃에서 하룻밤 동안 블롯팅 하였다. 이 후, 150mM NaCl 및 0.1%의 TBS-T(Tween-20)가 포함된 10mM Tris-HCL(pH 7.5)로 세척하였고, HRP(horseradish peroxidase)가 결합된 염소 항-토끼 IgG 및 항-마우스 IgG(Thermo, IL, USA)에 대한 항체를 처리하여 상온에서 1시간 동안 배양하였다. TBS-T(Tris-buffered Saline and Tween 20)를 이용하여 여분의 항체를 제거 후, 화학발광 검출 시스템(Ab Frontier, South Korea)을 이용하여 특정한 결합을 검출하였고, 로딩 대조군으로는 β-액틴 및 미토콘드리아 시트크롬 C 옥시다제 서브유닛 Ⅳ를 이용하였다. 이의 결과를 도 3에 나타내었다.
도 3에 나타난 바와 같이, 세포질 내에는 V5-에피토프가 세포질에서는 검출되지 않았고, 미토콘드리아에서 검출되었다. 이는 V5-에피토프가 결합된 적색 형광 단백질이 미토콘드리아에서 특이적으로 발현되었음을 나타낸다. 상기의 결과는 미토콘드리아 특이적으로 적색 형광 단백질 유전자가 발현됨을 시사한다.
실험예 3 LPS 처리 후, 소교세포의 염증반응 확인
1. 미토콘드리아 분열 확인
NMB-mito-BV2 세포주에 1㎍/ml의 LPS를 12시간 동안 처리하여, 형광 현미경을 통하여 미토콘드리아를 관찰하였다. LPS를 처리하지 않은 NMB-mito-BV2 세포주와 비교하여, 이의 결과를 도 4에 나타내었다.
도 4에 나타난 바와 같이, LPS 처리 후 미토콘드리아 단편화(fragmentation) 되는 것을 확인하였는데, 이는 염증 반응시 미토콘드리아 단편화 또는 과도한 분열이 일어나는 것을 시사한다.
또한, 미토콘드리아를 관찰함으로써, 염증반응이 일어남을 확인할 수 있어, 소교세포의 염증반응을 용이하게 확인할 수 있는 가능성을 제시한다.
2. Drp1 의 웨스턴 블롯팅을 통한 serin 637 부위의 인산기 제거 확인
염증반응이 일어날 때, Drp1의 serin 637 부위에 인산기가 제거된다는 사실이 알려졌다. 따라서, 1㎍/ml의 LPS를 처리 후, 실험예 2와 같은 방법으로 Drp1(Dyamin-related protein 1) 및 Phospho-DRP1(Ser637)의 항체를 이용하여 웨스턴 블롯팅을 수행하였다. 이의 결과를 도 5에 나타내었다.
도 5에 나타난 바와 같이, Drp1에 대한 Phospho-Drp1(Ser637) 비율이 줄어드는 것을 확인하였다.
실시예 3. NMB-mito-BV2 세포를 이용한 퇴행성 뇌질환에 대한 약물 검색
1. Dsr2 - mito 유전자가 형질도입된 NMB - mito - BV2 세포의 미토콘드리아와 Prdx5(Peroxiredoxin 5)가 추가적으로 형질도입된 NMB - mito - BV2 세포에 LPS 처리 후, 미토콘드리아 형태 비교.
Prdx5 유전자(서열 번호 3)가 추가적으로 형질도입된 NMB-mito-BV2 세포[실시예 2와 같은 방식으로 Prdx5 유전자는 cytomegalovirus immediate early(CMV) 프로모터와 연결되고, emGFP cDNA는 simian Virus 40(SV40) 프로모터와 연결된 염기서열을 포함하는 렌티 바이러스 벡터(도 6 및 서열 번호 4 참조)를 NMB-mito-BV2 세포에 형질도입]와, Dsr2-mito 유전자만 형질도입된 NMB-mito-BV2 세포에 각각 1㎍/ml의 LPS를 12시간 동안 처리하고, 공 초점 형광 현미경을 통하여 미토콘드리아를 관찰하였다. emGFP는 Prdx5 단백질의 발현 여부를 확인하기 위하여 함께 도입하였다. 이의 결과를 도 7에 나타내었다.
도 7에 나타난 바와 같이, Dsr2-mito+Prdx5가 형질도입된 NMB-mito-BV2 세포는 Dsr2-mito만 형질도입된 NMB-mito-BV2 세포와 비교하여, 미토콘드리아가 단편화 또는 분열이 일어나지 않는 것을 확인하였다.
이는 Prdx5 단백질이 소교세포의 염증반응을 억제함을 시사한다. 따라서, 미토콘드리아 관찰을 통하여 Prdx5 단백질이 염증반응을 억제하여, 알츠하이머 또는 치매의 약물로서 사용될 수 있다는 것을 나타낸다.
2. Dsr2 - mito + Prdx5 가 형질도입된 세포와 Dsr2 - mito 유전가가 형질도입된 NMB-mito-BV2 세포에 LPS 처리 후, 염증 관련 단백질에 인산화 경향 비교.
Prdx5 단백질이 염증반응을 억제하는지 재확인하기 위하여, 웨스턴 블롯팅을 이용하여 염증관련 단백질의 인산화 경향을 확인하였다.
pS637 Drp1, Drp1, p-P38, P38, p-ERK1/2, ERK1/2, p-JNK 및 JNK에 대한 항체를 이용하여, 실험예 2와 같은 방법으로 웨스턴 블롯팅을 수행하였다. 이의 결과를 도 8 및 9에 나타내었다.
도 8에 나타난 바와 같이, Drp1 단백질의 아미노산 서열 637번 세린기의 인산화 비율이 Prdx5를 발현하는 형질도입세포에서 더욱 높음을 확인하였고, 이는 Prdx5가 소교세포의 염증을 억제할 수 있음을 시사한다(염증반응이 일어나는 경우, Drp1 단백질의 637번 세린기의 인산화가 제거되는 사실이 알려져 있고, 본 명세서내에서 재확인하였음).
도 9에 나타난 바와 같이, 염증반응 유발 경로의 단백질인 P38, ERK1/2, JNK에서 인산화 비율이 Prdx5를 발현하는 형질도입 세포에서 현저히 떨어짐을 확인하였다(상기의 단백질은 염증반응시 인산화되는 것이 알려져 있음).
상기의 결과, Prdx5 단백질은 소교세포의 염증을 억제하여, 퇴행성 뇌질환인 치매 또는 알츠하이머 병의 치료용 약물로 사용될 수 있음을 알 수 있고, 미토콘드리아 관찰만으로 퇴행성 뇌질환에 대한 약물의 검색이 가능함을 재확인할 수 있다.
3. RT - PCR 을 통한 염증 관련 유전자 발현량 비교
사용설명서에 따라서 Tri-solution regent(Bio Science Technology, South Korea)를 이용하여 각각의 세포들로부터 총 RNA를 추출하였다. ASP-2680(ACTGene, NJ, USA)분광기를 사용하여 추출된 RNA의 농도 및 품질을 결정하였다. 42℃에서 60분동안 20㎕의 5x Reverse Transcription Master Premix(ELPIS Biotech, South Korea)를 사용하여 총 RNA 1㎍으로부터 cDNA를 합성하였다. IL-1β, IL-6, IL-23p19 및 GAPDH(Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase)단백질을 코딩하는 유전자의 특이적 프라이머(4uL의 HiPi Plus 5x PCR premix(ELPIS-Biotech, south Korea)에서 각각 10pM)를 이용하여 정량적 RT-PCR를 수행하였다. 94℃에서 30초, 58-62℃에서 30초 및 72℃에서 30초의 PCR 조건으로 25-28회 반복하였고, 마지막 사이클에는 72℃에서 10분 동안 최종 배양(final incubation)을 하였다. PCR 생산물을 공지의 표준물질인 100bp DNA 래더 마커(ladder Maker)와 함께 2%의 아가로오즈 젤 전기영동을 수행하여, 상기 생산물을 분리하였다. 비교 유전자 발현의 정량화는 Multo Gauge(FUJIFILM, japan)을 이용하여 분석하였다. 이의 결과를 도 10에 나타내었다.
도 10에 나타난 바와 같이, GAPDH에 대한 IL-1β, IL-6, IL-23p19 발현량은 Prdx5가 함께 형질 도입된 소교세포에서 현저히 줄어듬을 확인하였다. 면역 활성 유전자로 잘 알려진 상기 유전자들은 Prdx5에 의하여 발현이 억제됨을 나타내고, 이는 Prdx5가 염증 반응을 억제함으로써, 퇴행성 뇌질환에 있어서 약물로 사용될 수 있는 것을 시사한다.
한국생명공학연구원 KCTC12203BP 20120507
서열목록 전자파일 첨부

Claims (14)

  1. 인간의 시토크롬 c 옥시다제 서브유닛 Ⅷ의 유전자로부터 유래한 미토콘드리아 표적 염기서열과 융합된 형광단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 렌티 바이러스 벡터.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 형광단백질은 황색 형광단백질, 녹색 형광단백질, 적색 형광단백질인 DsRed2 단백질로 이루어진 군으로부터 선택된 1 종 이상인 것을 특징으로 하는, 렌티 바이러스 벡터.
  3. 삭제
  4. 제 1항에 있어서, 상기 인간의 시토크롬 c 옥시다제 서브유닛 Ⅷ의 유전자로부터 유래한 미토콘드리아 표적 염기서열과 융합된 형광단백질을 코딩하는 유전자의 염기서열은 서열 번호 1의 염기 서열인 것을 특징으로 하는 렌티 바이러스 벡터.
  5. 제 1항에 있어서, 상기 렌티 바이러스 벡터는 서열 번호 2의 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는, 렌티 바이러스 벡터.
  6. 미토콘드리아 표적 염기 서열이 융합된 형광단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 렌티 바이러스 벡터가 형질도입되어, 미토콘드리아 특이적으로 형광능이 부여된 퇴행성 뇌질환에 대한 약물 검출용 소교세포 NMB-mito-BV2(수탁번호:KCTC 12203BP).
  7. 제 6항에 있어서, 상기 형광단백질은 황색 형광단백질, 녹색 형광단백질, 적색 형광단백질인 DsRed2 단백질로 이루어진 군으로부터 선택된 1 종 이상인 것을 특징으로 하는, 퇴행성 뇌질환에 대한 약물 검출용 소교세포 NMB-mito-BV2(수탁번호:KCTC 12203BP).
  8. 제 6항에 있어서, 상기 미토콘드리아 표적 염기 서열은 인간의 시토크롬 c 옥시다제 서브유닛 Ⅷ의 유전자로부터 유래한 염기서열인 것을 특징으로 하는, 퇴행성 뇌질환에 대한 약물 검출용 소교세포 NMB-mito-BV2(수탁번호:KCTC 12203BP).
  9. 제 6항에 있어서, 상기 미토콘드리아 표적 염기 서열과 융합된 형광단백질을 코딩하는 유전자 서열은 서열 번호 1의 염기 서열인 것을 특징으로 하는, 퇴행성 뇌질환에 대한 약물 검출용 소교세포 NMB-mito-BV2(수탁번호:KCTC 12203BP).
  10. 제 6항에 있어서, 상기 렌티 바이러스 벡터는 서열 번호 2의 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 퇴행성 뇌질환에 대한 약물 검출용 소교세포 NMB-mito-BV2(수탁번호:KCTC 12203BP).
  11. 제 6항에 있어서, 상기 퇴행성 뇌질환은 알츠하이머 또는 뇌졸중인 것을 특징으로 하는 퇴행성 뇌질환에 대한 약물 검출용 소교세포 NMB-mito-BV2(수탁번호:KCTC 12203BP).
  12. 1) 미토콘드리아 표적 서열이 융합된 형광단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 렌티 바이러스 벡터를 소교세포에 형질도입하여 소교세포 NMB-mito-BV2 (수탁번호:KCTC 12203BP)를 제조하는 단계;
    2) 상기 1)단계의 소교세포 NMB-mito-BV2 (수탁번호:KCTC 12203BP)에 퇴행성 뇌질환에 대한 후보 약물을 코딩하는 유전자를 추가적으로 형질도입하는 단계; 및
    3) 상기 1)단계의 세포 및 상기 2)단계의 세포에 면역반응 증강제를 처리하여 미토콘드리아를 관찰하는 단계;를 포함하는 퇴행성 뇌질환에 대한 약물 검출 방법.
  13. 제 12항에 있어서, 상기 퇴행성 뇌질환에 대한 후보 약물을 코딩하는 유전자는 서열 번호 3의 페록시레독신 5(Peroxiredoxin 5)을 코딩하는 유전자인 것을 특징으로 하는 퇴행성 뇌질환에 대한 약물 검출 방법.
  14. 제 12항에 있어서, 상기 3)단계에서 염증반응 증강제는 지질다당류(Lipopolysaccharide)인 것을 특징으로 하는 퇴행성 뇌질환에 대한 약물 검출 방법.
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