KR101386385B1 - 표면 플라즈몬 공명 센서용 항원 감도향상제 - Google Patents

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강신원
염세혁
장은윤
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경북대학교 산학협력단
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Abstract

본 발명은 표면 플라즈몬 공명 센서용 항원 감도향상제에 관한 것으로서, 더욱 자세하게는 낮은 농도의 항원을 고감도로 빠르게 측정할 수 있는 표면 플라즈몬 공명 센서용 항원 감도향상제에 관한 것이다.

Description

표면 플라즈몬 공명 센서용 항원 감도향상제{Antigen sensitivity improvers for surface plasmon resonance sensor}
본 발명은 표면 플라즈몬 공명 센서용 항원 감도향상제에 관한 것으로서, 구체적으로는 표면플라즈몬 공명 센서 단독 사용보다 낮은 농도의 항원을 고감도로 빠르게 측정할 수 있는 항원 감도향상제에 관한 것이다.
바이오센서에 대한 다양한 연구가 이루어지고 있으며 특히 광학적 방법과 전기화학적 방법을 이용한 바이오센서의 개발은 큰 성과를 보여 많은 의료 기관에서 다양한 방법으로 사용되고 있다.
광학적 방법의 경우 검출될 물질의 말단에 형광 특성을 갖는 물질을 부착시킨 후 항원 항체 반응을 이용하여 검출한다. 이 경우 항원 항체 반응의 결합력에 따라 검출 물질 간의 민감도 차이가 클 뿐 아니라, 샘플의 정제 및 처리를 위해 다양한 과정을 거쳐야 하기 때문에 상대적으로 민감도가 떨어진다.
전기화학적인 방법의 경우는 전기화학 반응이 일어나는 전기화학 셀이 필요하여 소형화에 한계를 보이는 단점이 있다.　또한 위의 두 가지 방법들은 모두　가격이 비싸고, 측정하기 위하여 전문적인 기술자가 필요하며 측정에 많은 시간이 소요되며 고가의 장비가 사용된다는 단점이 있다. 이러한 단점을 극복하고, 초소형화, 휴대 가능성, 실시간 진단과 같은 특성을 요구되고 있다.
상기 문제점을 극복하기 위하여, 최근에는 나노기술과 융합된 나노 바이오센서에 대한 다양한 연구가 진행되고 있다. 나노 바이오센서는 나노 기술과 바이오 기술의 융합분야로서 나노물질 혹은 나노구조체를 이용하여 바이오센서의 성능을 개선하거나 나노기술을 이용하여 분자 수준에서 물질을 검출하는 센서이다. 이러한 나노 바이오센서는 그 방식에 따라 빛을 이용한 광학식 센서, 외부자극에 따른 전기적 특성의 변화를 이용하는 반도체식 센서 및 화학적 변화를 이용한 화학식 센서로 구분된다. 이들 중 광학식 바이오센서는 높은 정확성 및 안정성뿐만 아니라 실시간 측정이 가능한 장점으로 활발한 연구가 진행되고 있다. 하지만 상기 광학식 바이오센서는 낮은 농도의 항원을 검출하기 힘들다는 단점이 있다. 이러한 단점을 극복하고 미세한 물질의 측정에서도 감도가 우수한 바이오센서 또는 항원 감도 향상 첨가제의 개발이 요구되고 있다.
이에 본 발명자들은 기존 문제를 해결하면서 광학식 바이오센서를 연구 및 개발한 결과, 소형화 및 휴대가 가능하며 미량의 항원도 효과적으로 검출할 수 있는 항원 감도향상제을 제공하고자 한다.
상술한 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 염화금(HAuCl4), 세트리모늄 브로마이드(Cetrimonium bromide; CTAB), 나트륨 보로하이드라이드(NaBH4) 및 물을 포함하는 금 나노 시드(seed) 용액을 제조하는 (1) 단계; 상기 금 나노 시드 용액 및 성장 용액을 혼합하여 금 나노 시드를 성장시켜 금 나노점을 제조하는 (2) 단계; 상기 금 나노점에 자기조립단분자막을 형성하는 (3) 단계; 및 자기조립단분자막이 형성된 금 나노점에 항체를 고정하는 (4) 단계; 를 포함하는 표면 플라즈몬 공명 센서용 항원 감도향상제 제조방법을 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 (2) 단계의 용액은 아스코르브산(Ascorbic acid)을 더 포함하며, (2) 단계에서 제조된 금 나노점의 평균 직경이 5 ~ 20 ㎚일 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 금 나노 시드 용액, 성장 용액 및 아스코르브산의 부피비가 100 : 80 ~ 140 : 0.4 ~ 1로 사용할 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 (3) 단계의 자기조립단분자막은 11-멜캅토-운데카노익 액시드(11-Mercapto-undecanoic acid)로 형성되고, (4) 단계의 항체는 C-반응성 단백질 항체 또는 트로포닌 T(Troponin T) 항체를 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 성장 용액은 CTAB, 질산은(AgNO3) 및 염화금(HAuCl4)을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 평균 직경 5 ~ 20 ㎚의 금 나노점; 항체; 및 상기 금 나노점과 항체를 연결하는 자기조립단분자막; 을 포함하는 표면 플라즈몬 공명 센서용 항원 감도향상제를 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 본 발명의 항원 감도향상제는 평균 직경이 20 ~ 40 ㎚이며, 항체는 C-반응성 단백질 항체 또는 트로포닌 T(Troponin T) 항체를 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 표면 플라즈몬 공명 센서로 다공성 산화 알루미늄막(220); 상기 다공성 산화 알루미늄막의 다공성 표면에 형성된 금속 증착층(230); 상기 금속 증착층과 접합(A)된 자기조립단분자막(240); 및 상기 금속증착층과 접합된 자기조립단분자막의 타끝단(A')에 결합된 항체(250); 를 포함하는 바이오센서이며, 상기 다공성 산화 알루미늄막은 기공의 평균 깊이가 1 ~ 3 ㎛이고 기공의 평균 직경이 40 ~ 50 ㎚이며, 상기 금속 증착층은 금 및 니켈을 포함하며, 상기 금속 증착층의 평균 두께가 10 ~ 30 ㎚이고, 상기 자기조립단분자막은 11-멜캅토-운데카노익 액시드(11-Mercapto-undecanoic acid)로 형성된 것이며, 상기 항체는 C-반응성 단백질 항체 또는 트로포닌 T(Troponin T) 항체를 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 C-반응성 단백질 또는 트로포닌 T 항원; 및 본 발명의 항원 감도향상제; 를 이용하여 C-반응성 단백질 또는 트로포닌 T 항원을 측정하는 방법을 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 본 발명의 항원 측정방법은 낮은 농도인 1×102 ~ 1×1013 ag/㎖의 항원도 검출할 수 있다.
본 발명의 항원 감도향상제는 표면 플라즈몬 공명 센서 단독 사용보다 낮은 농도의 항원에서도 감도를 우수하게 높이며 항원의 측정시간을 크게 감소시킬 수 있어, 소형의 휴대용 진단 기기 개발에 응용될 수 있을 것으로 기대된다.
도 1은 본 발명의 바람직한 일실시예에 따른 표면 플라즈몬 공명 센서용 항원 감도향상제의 제조방법을 나타내는 흐름도이다.
도 2는 본 발명의 바람직한 일실시예에 따라 제조된 표면 플라즈몬 공명 센서인 바이오센서의 단면도이다.
도 3은 실시예 3의 금 나노점에 항체를 고정하는 방법을 나타낸 모식도이다.
도 4는 실험예 1에서 측정한 반사파장의 변화 결과이다.
도 5는 실험예 2의 (1)에서 측정한 이종 항원 응답특성 결과이다.
도 6은 실험예 2의 (2)에서 측정한 이종 항원 응답특성 결과이다.
도 7은 실험예 3에서 측정한 반사파장 그래프이다.
도 8은 실험예 3에서 측정한 반사파장 이동값이다.
도 9는 실험예 3에서 측정한 반사파장 그래프이다.
도 10은 실험예 3에서 측정한 반사파장 이동값이다.
도 11은 실험예 3에서 측정한 반사파장 그래프이다.
도 12는 실험예 3에서 측정한 반사파장 이동값이다.
도 13은 실험예 3에서 측정한 반사파장 그래프이다.
도 14는 실험예 3에서 측정한 반사파장 이동값이다.
도 15는 실험예 3에서 측정한 반사파장 그래프이다.
도 16은 실험예 3에서 측정한 반사파장 이동값이다.
도 17은 실험예 4에서 측정한 기공 깊이 변화에 따른 감도변화이다.
이하, 본 발명을 첨부된 도면을 참조하여 보다 상세히 설명한다.
상술한 바와 같이, 통용되는 바이오센서들은 가격이 비싸고, 측정하기 위하여 전문적인 기술자가 필요하며 측정에 많은 시간이 소요되며 고가의 장비가 사용된다는 단점이 있었다. 또한, 상기 바이오센서들 중 광학식 바이오센서는 많은 장점에도 불구하고 낮은 농도의 항원을 검출하기 힘들다는 단점이 있었다.
이에 본 발명의 표면 플라즈몬 공명 센서용 항원 감도향상제의 제조방법은 염화금(HAuCl4), 세트리모늄 브로마이드(Cetrimonium bromide; CTAB), 나트륨 보로하이드라이드(NaBH4) 및 물을 포함하는 금 나노 시드(seed) 용액을 제조하는 (1) 단계; 상기 금 나노 시드 용액 및 성장 용액을 혼합하여 금 나노 시드를 성장시켜 금 나노점을 제조하는 (2) 단계; 상기 금 나노점에 자기조립단분자막을 형성하는 (3) 단계; 및 자기조립단분자막이 형성된 금 나노점에 항체를 고정하는 (4) 단계; 를 포함하여 상술한 문제의 해결을 모색하였다. 이를 통해 낮은 농도의 항원에서도 감도가 우수하며 항원의 측정시간을 놀랍게 감소시킬 수 있어, 소형의 휴대용 진단 기기 개발에 응용될 수 있는 표면 플라즈몬 공명 센서용 항원 감도향상제를 제공한다.
도 1은 본 발명의 일실시예에 따른 항원 감도향상제의 제조방법을 나타내는 흐름도로서 이를 중심으로 본 발명의 항원 감도향상제 제조방법을 설명하면 다음과 같다.
(1) 단계로 염화금(HAuCl4), 세트리모늄 브로마이드(Cetrimonium bromide; CTAB), 나트륨 보로하이드라이드(NaBH4) 및 물을 포함하는 금 나노 시드(seed) 용액을 제조한다(S1). 상기 금 나노 시드 용액은 염화금, CTAB, 나트륨 보로하이드라이드 및 물을 포함하는 것이라면 부피비를 특별히 제한하지 않으나, 바람직하게는 염화금 1 mol/ℓ 대비 300 ~ 450 mol/ℓ의 CTAB, 1 ~ 4 mol/ℓ의 나트륨 보로하이드라이드 및 물을 포함할 수 있다. 더욱 바람직하게는 염화금 100 mol/ℓ 대비 350 ~ 420 mol/ℓ의 CTAB, 1.5 ~ 3 mol/ℓ의 나트륨 보로하이드라이드 및 물을 포함할 수 있으나 이에 한정하지는 않는다.
본 발명의 일구현예에 따르면, 성장 용액은 CTAB, 질산은(AgNO3) 및 염화금(HAuCl4)을 포함하여 제조할 수 있다. 상기 성장 용액은 염화금, CTAB 및 질산은을 포함하는 것이라면 부피비를 특별히 제한하지 않으나, 바람직하게는 염화금 100 mol/ℓ 대비 100 ~ 300 mol/ℓ의 CTAB 및 0.1 ~ 0.5 mol/ℓ의 질산은을 포함할 수 있다. 더욱 바람직하게는 염화금 100 mol/ℓ 대비 150 ~ 300 mol/ℓ의 CTAB 및 0.2 ~ 0.4 mol/ℓ의 질산은을 포함할 수 있으나, 이에 한정하지는 않는다.
(2) 단계는 상기 금 나노 시드 용액 및 성장 용액을 혼합하여 금 나노 시드를 성장시켜 금 나노점을 제조한다. 상기 금 나노 시드 용액과 성장 용액의 부피비는 특별히 제한하지 않으나, 바람직하게는 금 나노 시드 용액 : 성장 용액의 부피비가 1 : 0.1 ~ 2일 수 있으나, 이에 한정하지는 않는다. 또한, 상기에서 제조된 금 나노점은 평균 직경이 5 ~ 20 ㎚인 것일 수 있으나, 이에 한정하지는 않는다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 (2) 단계는 금 나노 시드 용액 및 성장 용액 이외에 아스코르브산(Ascorbic acid)을 더 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 일실시예에 따르면, 금 나노 시드 용액, 성장 용액 및 아스코르브산의 부피비가 100 : 80 ~ 140 : 0.4 ~ 1일 수 있다.
(3) 단계는 상기에서 제조된 금 나노점에 자기조립단분자막을 형성한다. 상기 자기조립단분자막은 카르복실 작용기를 가지는 분자로 형성되는 것이라면 특별히 제한하지 않으나, 바람직하게는 11-멜캅토-운데카노익 액시드(11-Mercapto-undecanoic acid)로 형성된 것일 수 있으나, 이에 한정하는 것은 아니다.
또한, 상기 금 나노점의 뭉침을 방지하기 위하여 초음파 처리하는 것을 더 포함할 수 있다. 상기 초음파 처리시 사용되는 초음파는 특별히 제한하지 않는다.
(4) 단계로 자기조립단분자막이 형성된 금 나노점에 항체를 고정한다. 상기 금 나노점에 고정되는 항체는 검출하고자 하는 항원의 항체라면 특별히 제한하지 않으나, 바람직하게는 C-반응성 단백질 항체 또는 트로포닌 T(Troponin T) 항체를 포함할 수 있으나, 이에 한정하는 것은 아니다.
또한, 본 발명의 항원 감도향상제는 평균 직경 5 ~ 20 ㎚ 금 나노점; 항체; 및 상기 금 나노점과 항체를 연결하는 자기조립단분자막; 을 포함한다. 상기 항체는 자기조립단분자막에 의해 금 나노점에 고정되는 것이 바람직하나 이에 한정하는 것은 아니다. 또한. 상기 금 나노점은 금 나노입자를 제조하는 통상의 방법으로 제조된 것이라면 특별한 제한이 없다. 나아가, 상기 자기조립단분자막은 카르복실 작용기를 가지는 분자로 형성되는 것이라면 특별히 제한하지 않으나, 바람직하게는 11-멜캅토-운데카노익 액시드(11-Mercapto-undecanoic acid)로 형성된 것일 수 있으나, 이에 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 본 발명의 항원 감도향상제는 평균 직경이 20 ~ 40 ㎚일 수 있다.
본 발명의 다른 일실시예에 따르면, 본 발명의 항원 감도향상제는 항체로 C-반응성 단백질 항체 또는 트로포닌 T(Troponin T) 항체를 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 일실시예에 따르면, 본 발명의 항원 감도향상제는 본 발명의 바이오센서용으로 사용될 수 있다.
도 2는 본 발명의 표면 플라즈몬 공명 센서로 사용될 수 있는 바이오센서의 일구현예로 알루미늄(210); 상기 알루미늄 일면에 적층된 다공성 산화 알루미늄막(220); 상기 다공성 산화 알루미늄막의 일면에 적층된 금속 증착층(230); 상기 금속 증착층과 접합(A)된 자기조립단분자막(240); 및 상기 자기조립단분자막의 끝단(A')에 결합된 항체(250); 을 포함하는 바이오센서(200)의 단면도이다.
본 발명의 일구현예에 따르면, 바이오센서의 다공성 산화 알루미늄막은 기공의 평균 깊이가 1 ~ 3 ㎛이고 기공의 평균 직경이 40 ~ 50 ㎚이며, 금속 증착층은 금 및 니켈을 포함하며, 금속 증착층의 평균 두께가 10 ~ 30 ㎚이고, 자기조립단분자막은 11-멜캅토-운데카노익 액시드(11-Mercapto-undecanoic acid)로 형성된 것이며, 항체는 C-반응성 단백질 항체 또는 트로포닌 T(Troponin T) 항체를 포함할 수 있다.
본 발명은 C-반응성 단백질 또는 트로포닌 T 항원을 측정하는 방법을 제공하는데, 상기 항원 측정 방법은 C-반응성 단백질 또는 트로포닌 T 항원; 및 상술한 방법을 통해 제조된 항원 감도향상제를 이용한다. 상기 항원 측정방법은 항원 농도 100 ag/㎖ 이하, 바람직하게는 항원 농도 1×102 ~ 1×1013 ag/㎖의 항원도 검출할 수 있으나, 이에 한정하는 것은 아니다.
또한, 본 발명의 항원 측정방법은 상기 바이오센서 및/또는 상기 항원 감도향상제를 사용할 수 있으며, 상기 바이오센서 단독 사용보다 바이오센서 및 항원 감도향상제의 복합 사용이 항원 검출에 있어서 약 2배의 높은 감도를 보였다(도 7 내지 16 참조).
나아가, 본 발명의 다른 일실시예에 따르면, 항원 측정방법은 상기 항원 감도향상제 및 표면 플라즈몬 공명 센서로 상기 바이오센서를 포함할 수 있다.
이하, 실시예와 비교예를 통하여 본 발명의 구성 및 그에 따른 효과를 보다 상세히 설명하고자 한다. 그러나, 본 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 예시일 뿐이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
[ 실시예 ]
실시예 1. 바이오센서 제작
(1) 다공성 산화 알루미늄막
알루미늄막 표면에 생성되어 있는 자연 산화막 및 불순물의 제거, 알루미늄 표면의 평탄화를 위하여 전해 연마하였다. 전해연마는 에탄올 30 중량% 및 과염소산 70 중량%를 혼합한 혼합액에 알루미늄막을 넣은 후 20 V의 전압을 인가하여 전해 연마하였다. 상기 전해연마된 알루미늄막을 탄소전극 및 전해질 용액으로 0.3M 옥살산 수용액이 포함된 전기화학 장치에 넣은 후 40 V의 전압을 인가하여 9 ℃에서 양극 산화하였다. 2차 양극산화를 하기 위해서 상기 양극산화 후 산화된 알루미늄막을 크롬산 1.8 중량% 및 인산 6 중량%를 포함하는 수용액에 넣은 후 90분 동안 60 ℃에서 상기 알루미늄막 표면에 생성된 양극산화막을 제거하였다.
이후 양극산화막이 제거된 알루미늄막을 상기에 기재된 전해연마 이후의 양극 산화방법과 같은 방법으로 양극 산화하여 다공성 산화 알루미늄막을 생성하였다. 상기 다공성 산화 알루미늄막의 기공은 50 ㎚로 생성하였다.
(2) 금속 증착층
상기 실시예 1의 (1)에서 생성한 다공성 산화 알루미늄막 일면에 금속 증착층을 적층하기 위하여 전자선 증착기를 사용하여 니켈 및 금을 증착하였다. 상기 증착은 전자선 증착기에 4.0 × 10-6 torr 분위기에서 0.1 Å/초의 조건으로 니켈 5 ㎚ 및 금 15 ㎚ 두께의 금속 증착층을 생성하였다.
(3) 자기조립단분자막 형성
상기 실시예 1의 (2)에서 생성한 금속 증착층이 포함된 다공성 산화 알루미늄막에 자기조립단분자막을 생성하기 위하여, 상기 다공성 산화 알루미늄막을 20 mM의 11-멜캅토-운데카노익 액시드(11-Mercapto-undecanoic acid, 미국 캘리포니아 소재 Sigma에서 구매)를 포함하는 버퍼용액에 24시간 동안 침지하여 자기조립단분자막을 생성하였다.
(4) C-반응성 단백질 항체 결합
상기 실시예 1의 (3)에서 생성한 자기조립단분자막이 포함된 다공성 산화 알루미늄막에 C-반응성 단백질 항체의 결합을 돕기 위하여, 상기 다공성 산화 알루미늄막을 50 mM의 1-에틸-3-3-메틸아미노프로필 카르보디이미드 하이드로클로라이드(1-ethyl-3-3-dimethylaminopropyl carbodiimide hydrochloride) 및 50 mM의 n-하이드록시석신이미드(n-hydroxysuccinimide)를 포함하는 에탄올에 넣은 후 1시간 동안 교반하였다. 이후 상기 에탄올에 300 ㎍/㎖의 C-반응성 단백질 항체(미국 캘리포니아 소재 Sigma에서 구매)를 더 넣고 1시간 동안 교반한 후 상기 다공성 산화 알루미늄막을 꺼내 트리스-염화수소(Tris-HCl, pH 7.4, 미국 캘리포니아 소재 Sigma에서 구매) 완충용액으로 세척하여 C-반응성 단백질 감지막을 제조하였다.
실시예 2. 트로포닌 T 항체 결합
상기 실시예 1의 (3)에서 생성한 자기조립단분자막이 포함된 다공성 산화 알루미늄막에 트로포닌 T 항체를 결합하여 트로포닌 T 감지막을 제조하였다. 트로포닌 T항체 및 다공성 산화 알루미늄막의 결합을 돕기 위하여, 상기 다공성 산화 알루미늄막을 50 mM의 1-에틸-3-3-메틸아미노프로필 카르보디이미드 하이드로클로라이드(1-ethyl-3-3-dimethylaminopropyl carbodiimide hydrochloride) 및 50 mM의 n-하이드록시석신이미드(n-hydroxysuccinimide)를 포함하는 에탄올에 넣은 후 1시간 동안 교반하였다. 이후 상기 에탄올에 10 ㎍/㎖의 트로포닌 T 항체(미국 캘리포니아 소재 Sigma에서 구매)를 더 넣고 1시간 동안 교반한 후 상기 다공성 산화 알루미늄막을 꺼내 트리스-염화수소(Tris-HCl, pH 7.4, 미국 캘리포니아 소재 Sigma에서 구매) 완충용액으로 세척하여 트로포닌 T 감지막을 제조하였다.
실시예 3. 금 나노점 제작 및 항체 고정
금 나노점은 세트리모늄 브로마이드(Cetrimonium bromide; CTAB) 용액 및 습식 화학 방법을 이용하여 제작하였다.
25 ℃에서 1 ㎖의 0.5 mM 염화금(HAuCl4) 용액 및 1 ㎖의 0.2M CTAB 용액을 혼합하여 혼합액을 제조한 후 0.12 ㎖의 10 mM 나트륨 보로하이드라이드(NaBH4)가 용해된 증류수에 상기 혼합액을 첨가하였다. 상기 증류수를 0 ℃에서 2분 동안 교반한 후 2시간 동안 27 ℃의 배스(bath)에 보관하여 시드(seed) 용액을 제조하였다.
성장 용액은 0.2 M의 CTAB 용액 50 ㎖, 2.5 ㎖의 4 mM 질산은(AgNO3) 용액 및 1 mM의 염화금 용액 50 ㎖을 혼합한 후 0.079 M의 아스코르브산(Ascorbic acid) 용액 670 ㎕를 첨가하여 제조하였다.
120 ㎕의 시드 용액 및 120 ㎕의 성장 용액을 혼합한 후 27 ℃에서 20분 동안 교반하여 10 ㎚의 금 나노점을 제조하였다. 이후 상기 금 나노점에 항체를 고정하는 방법은 하기 도면 4에 나타내었다.
도 3의 (a) 단계와 같이 금 나노점에 자기조립단분자막을 형성하기 위하여, 상기 금 나노점을 20 mM의 11-멜캅토-운데카노익 액시드(11-Mercapto-undecanoic acid, 미국 캘리포니아 소재 Sigma에서 구매)가 포함된 에탄올에 첨가한 후 40 ℃에서 3시간 동안 초음파를 처리하여 금 나노점 표면에 자기조립단분자막(SAMs)을 형성하였다.
도 3의 (b) 단계와 같이 금 나노점에 항체를 고정하기 전 단계로, 상기 자기조립단분자막이 형성된 금 나노점을 트리스-염화수소(Tris-HCl, pH 7.4, 미국 캘리포니아 소재 Sigma에서 구매) 완충용액에 첨가하여 분산시킨 후 0.4 M의 1-에틸-3-3-메틸아미노프로필 카르보디이미드 하이드로클로라이드(1-ethyl-3-3-dimethylaminopropyl carbodiimide hydrochloride; EDC) 및 50 mM의 n-하이드록시석신이미드(n-hydroxysuccinimide; NHS)를 첨가 및 교반하였다.
이후 도 3의 (c) 단계와 같이 금 나노점에 항체를 고정하기 위하여, 상기 완충용액에 300 ㎍/㎖의 C-반응성 단백질 항체(미국 캘리포니아 소재 Sigma에서 구매)를 더 넣고 4 ℃에서 1시간 동안 교반한 후 원심분리하여 항체가 고정된 금 나노점을 제조하였다.
실험예 1. 트로포닌 T 감지막의 응답특성
상기 실시예 2에서 제조한 트로포닌 T 감지막의 응답특성을 측정하기 위하여, 1 pg/㎖, 100 pg/㎖, 10 ng/㎖ 또는 1 ㎍/㎖ 농도의 트로포닌 T 항원 및 상기 트로포닌 T 감지막을 반응시켜 반사파장의 변화를 측정하였다.
상기 반사파장의 변화 측정은 Y형 광섬유 프로브의 한 끝단을 백색관원과 연결하고 Y형 광섬유 프로브의 다른 한 끝단을 분광기와 연결하여 광을 조사하면서, Y형 광섬유 프로브의 또 다른 한 끝단을 챔버에 연결하여 실험하였다. 상기 챔버는 상기 실시예 2에서 제조한 트로포닌 T 감지막, 트로포닌 T 항원 및 마이크로 펌프로 구성하였다. 상기 백색광원(Ocean optics 사의 DH-2000-BAL)은 광원으로 중수소 램프 및 텅스텐-할로겐 램프로 구성되어 듀얼모드로 작동하며, 파장영역은 210 ~ 1500 ㎚였다. 상기 분광기(Ocean optics 사의 QE65000)는 200 ~ 1100 ㎚의 넓은 감지영역 및 최대 0.14 ㎚의 해상도를 가지는 것을 사용하였다. 상기 분광기에서 검출된 빛은 분광기와 연결된 컴퓨터의 분광분석 프로그램(Ocean optics 사의 Spectrasuit)에 의해 분석하였다.
상기 반사파장의 변화 측정 결과는 하기 도면 4에 나타냈다. 하기 도 4에서 확인되는 바와 같이, 1 pg/㎖의 항원은 파장의 변화가 없었으나 100 pg/㎖의 낮은 농도에서도 트로포닌 T 항원이 검출되는 것을 확인할 수 있었다. 상기 실시예 2에서 제조한 트로포닌 T 감지막은 100 pg/㎖ 이상의 농도 모두에서 트로포닌 T 항원에 응답되는 것으로 확인되어 트로포닌 T 감지막의 우수한 반응 특성을 확인할 수 있었다.
실험예 2. 이종 항원에 대한 응답특성 측정
상기 실시예 1의 (4)에서 제조한 C-반응성 단백질 감지막 및 실시예 2에서 제조한 트로포닌 T 감지막의 이종 항원에 대한 응답특성을 측정하기 위하여, 트로포닌 T 항원 10 ㎍/㎖ 또는 살모넬라균 1 ㎍/㎖, 감지막을 반응시켜 반사파장의 변화를 측정하였다. 상기 반사파장의 변화 측정은 상기 실험예 1과 같은 방법으로 실험하였다.
(1) C-반응성 단백질 감지막의 이종 항원 응답특성
실시예 1의 (4)에서 제조한 C-반응성 단백질(CRP; C-Reactive Protein) 감지막의 기준 반사파장을 상기 실험예 1과 같은 방법으로 측정하고, 트로포닌 T 항원 10 ㎍/㎖를 주입하여 반사파장의 변화를 측정하였다. 이후 상기 감지막을 트리스-염화수소(Tris-HCl) 완충용액으로 세척한 후, C-반응성 단백질 항원(CRP Ab; CRP Anti-body) 10 ㎍/㎖를 주입하여 반사파장의 변화를 측정하였다.
상기에서 측정된 반사파장은 하기 도면 5에 나타내었다. 하기 도 5에서 확인되는 바와 같이, 트로포닌 T 항원을 주입하여 측정한 반사파장은 변화가 일어나지 않음을 확인할 수 있으며, C-반응성 단백질 항원을 주입하여 측정한 반사파장은 이동하였음을 확인할 수 있었다. 따라서, 상기 실시예 1의 (4)에서 제조한 C-반응성 단백질 감지막은 선택성이 있어 측정하고자 하는 항원에만 반응함을 확인할 수 있었다.
(2) 트로포닌 T 감지막의 이종 항원 응답특성
실시예 2에서 제조한 트로포닌 T 감지막의 기준 반사파장을 상기 실험예 1과 같은 방법으로 측정하고, 살모넬라균 1 ㎍/㎖를 주입하여 반사파장을 측정하였다. 이후 상기 감지막을 트리스-염화수소(Tris-HCl) 완충용액으로 세척한 후, 트로포닌 T 항원 1 ㎍/㎖를 주입하여 반사파장의 변화를 측정하였다.
상기에서 측정된 반사파장은 하기 도면 6에 나타내었다. 하기 도 6에서 확인되는 바와 같이, 살모넬라균을 주입하여 측정한 반사파장은 변화가 일어나지 않음을 확인할 수 있으며, 트로포닌 T 항원을 주입하여 측정한 반사파장이 이동하였음을 확인할 수 있었다. 따라서, 상기 실시예 2에서 제조한 트로포닌 T 감지막은 선택성이 있어 이종 항원에 대해서는 반응하지 않음을 확인할 수 있었다.
실험예 3. C-반응성 단백질 감지막의 응답특성
상기 실시예 1의 (4)에서 제조한 C-반응성 단백질 감지막의 응답특성 및 상기 감지막 및 실시예 3의 항체가 고정된 금 나노점(GNP labeled Ab; Gold Nano Particle labeled Anti-body)의 복합사용의 응답특성을 측정하기 위하여 반사파장의 변화를 상기 실험예 1과 같은 방법으로 측정하였다.
실시예 1의 (4)에서 제조한 감지막의 기준 반사파장을 상기 실험예 1과 같은 방법으로 측정하고, 100 ag/㎖, 1 fg/㎖, 1 pg/㎖, 1 ng/㎖ 또는 1 ㎍/㎖ 농도의 C-반응성 단백질 항원(CRP Ag; CRP Anti-gen)를 주입하여 30분 동안 상기 감지막과 상기 항원를 반응시킨 후 반사파장을 측정하였다. 이후 비특이적 반응을 제거하기 위해 감지막을 트리스-염화수소(Tris-HCl) 완충용액으로 세척한 후, 세척한 감지막 및 실험예 2의 항체가 고정된 금 나노점을 실험예 1과 같은 챔버에 투여하여 상기 세척한 감지막, 항체가 고정된 금 나노점 및 C-반응성 단백질 항원을 30분 동안 반응시켰다. 이후 반사파장의 변화를 실험예 1과 같은 방법으로 측정하였다. 상기에서 측정한 반사파장들 및 반사파장의 이동값은 하기 도면 7 내지 도 16에 나타내었다.
도 7에서 확인되는 바와 같이, 실시예 1의 (4)에서 제조한 감지막과 100 ag/㎖ 농도의 C-반응성 단백질 항원 또는 항체가 고정된 금 나노점을 주입하여 측정한 반사파장은 반사파장의 이동값이 작은 것을 확인할 수 있었다.
도 8에서 확인되는 바와 같이, 100 ag/㎖ 농도의 C-반응성 단백질 항원 주입 후 측정한 반사파장은 기준 반사파장에서 0.1 ㎚이하로 이동한 것을 확인할 수 있으며, 이는 반사파장 이동이 너무 작아 분광기의 측정 한계를 벗어난 값이므로 신뢰성이 없다. 또한, 항체가 고정된 금 나노점과 감지막을 반응시킨 후 측정한 반사파장은 기준 반사파장보다 0.2 ㎚의 반사파장 이동을 확인할 수 있었다.
도 9에서 확인되는 바와 같이, 실시예 1의 (4)에서 제조한 감지막과 1 fg/㎖ 농도의 C-반응성 단백질 항원 또는 항체가 고정된 금 나노점을 주입하여 측정한 반사파장은 반사 파장의 이동값이 작아, 반사파장이 이동한 것을 확인하게 힘들었다.
도 10에서 확인되는 바와 같이, 1 fg/㎖ 농도의 C-반응성 단백질 항원 주입 후 측정한 반사파장은 기준 반사파장에서 0.4 ㎚ 이동한 것을 확인할 수 있으며, 항체가 고정된 금 나노점과 감지막을 반응시킨 후 측정한 반사파장은 기준 반사파장보다 1.1 ㎚ 이동한 것을 확인할 수 있었다. 이는 상기 감지막 및 항체가 고정된 금 나노입자를 복합 사용이 1 fg/㎖ 농도의 C-반응성 단백질 항원을 효과적으로 검출하는 것을 확인할 수 있다.
도 11에서 확인되는 바와 같이, 실시예 1의 (4)에서 제조한 감지막과 1 pg/㎖ 농도의 C-반응성 단백질 항원 또는 항체가 고정된 금 나노점을 주입하여 측정한 반사파장은 기준 반사파장보다 이동한 것을 확인할 수 있었다.
도 12에서 확인되는 바와 같이, 1 pg/㎖ 농도의 C-반응성 단백질 항원 주입 후 측정한 반사파장은 기준 반사파장에서 1.5 ㎚ 이동한 것을 확인할 수 있으며, 항체가 고정된 금 나노점과 감지막을 반응시킨 후 측정한 반사파장은 기준 반사파장보다 2.9 ㎚ 이동한 것을 확인할 수 있었다. 이는 상기 감지막 및 항체가 고정된 금 나노입자를 복합 사용이 감지막만 사용하여 항원을 검출하는 것보다 효과적인 것을 확인할 수 있었다. 이는 상기 감지막만 사용한 반사파장 이동 값에 비해 항체가 고정된 금 나노점을 사용한 반사파장의 감도가 약 2배 향상된 것을 확인할 수 있었다.
도 13에서 확인되는 바와 같이, 실시예 1의 (4)에서 제조한 감지막과 1 ng/㎖ 농도의 C-반응성 단백질 항원 또는 항체가 고정된 금 나노점을 주입하여 측정한 반사파장은 기준 반사파장보다 이동한 것을 확인할 수 있었다.
도 14에서 확인되는 바와 같이, 1 ng/㎖ 농도의 C-반응성 단백질 항원 주입 후 측정한 반사파장은 기준 반사파장에서 2.5 ㎚ 이동한 것을 확인할 수 있으며, 항체가 고정된 금 나노점과 감지막을 반응시킨 후 측정한 반사파장은 기준 반사파장보다 5 ㎚ 이동한 것을 확인할 수 있었다. 이는 상기 감지막만 사용한 반사파장 이동 값에 비해 항체가 고정된 금 나노점을 사용한 반사파장의 감도가 약 2배 향상된 것을 확인할 수 있었다.
도 15에서 확인되는 바와 같이, 실시예 1의 (4)에서 제조한 감지막과 1 ㎍/㎖ 농도의 C-반응성 단백질 항원 또는 항체가 고정된 금 나노점을 주입하여 측정한 반사파장은 기준 반사파장보다 이동한 것을 확인할 수 있었다.
도 16에서 확인되는 바와 같이, 1 ㎍/㎖ 농도의 C-반응성 단백질 항원 주입 후 측정한 반사파장은 기준 반사파장에서 4.5 ㎚ 이동한 것을 확인할 수 있으며, 항체가 고정된 금 나노점과 감지막을 반응시킨 후 측정한 반사파장은 기준 반사파장보다 7.8 ㎚ 이동한 것을 확인할 수 있었다.
도 7 내지 도 16에서 확인되는 바와 같이, 실시예 1의 (4)에서 제조한 감지막만 사용하는 것보다 항체가 고정된 금 나노점 및 상기 감지막을 복합 사용하는 것이 항원 검출 감도가 휠씬 높은 것을 확인할 수 있었다. 또한, 본 발명의 감지막은 넓은 측정대역과 높은 민감도가 있음을 확인하였다.
실험예 4. 다공성 산화 알루미늄의 기공 깊이 변화에 따른 감도변화
상기 실시예 1의 (1)에서 제조한 다공성 산화 알루미늄(AAO; Anodic Aluminum Oxide)의 기공 깊이를 1 ~ 5 ㎛로 변화시키면서 감도의 변화를 측정하였다. 상기 감도의 변화 측정은 실험예 1에서 사용한 반사파장 이동과 같은 방법으로 측정하였고, 상기 결과는 도면 17에 나타내었다.
도 17에서 확인되는 바와 같이, 1 ㎛의 두께를 가지는 다공성 산화 알루미늄막을 감지막으로 활용하였을 때 가장 좋은 감도를 가지는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 1 ㎛ 미만의 다공성 산화 알루미늄막은 표면의 정렬도에 대한 신뢰성이 낮아 본 발명의 감지막에는 활용하지 않았다.
상기 실시예 및 실험예를 통해 알 수 있듯이, 본 발명의 바이오센서는 낮은 농도인 100 pg/㎖의 트로포닌 T 항체 또는 1 fg/㎖의 C-반응성 단백질 항체를 효과적으로 검출할 수 있으며, 이종 항원에 반응하지 않아 선택성이 있는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 본 발명의 감지막은 넓은 측정대역과 높은 민감도가 있어 항원의 측정시간을 크게 감소시킬 수 있어 소형 휴대용 진단 기기 개발에 응용될 수 있을 것으로 기대된다.

Claims (10)

  1. 염화금(HAuCl4), 세트리모늄 브로마이드(Cetrimonium bromide; CTAB), 나트륨 보로하이드라이드(NaBH4) 및 물을 포함하는 금 나노 시드(seed) 용액을 제조하는 (1) 단계;
    상기 금 나노 시드 용액 및 성장 용액을 혼합하여 금 나노 시드를 성장시켜 금 나노점을 제조하는 (2) 단계;
    상기 금 나노점에 자기조립단분자막을 형성하는 (3) 단계; 및
    자기조립단분자막이 형성된 금 나노점에 항체를 고정하는 (4) 단계;
    를 포함하는 표면 플라즈몬 공명 센서용 항원 감도향상제 제조방법.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 (2) 단계의 상기 혼합시 아스코르브산(Ascorbic acid)을 더 혼합하며, (2) 단계에서 제조된 금 나노점의 평균 직경이 5 ~ 20 ㎚인 항원 감도향상제 제조방법.
  3. 제 2항에 있어서, 금 나노 시드 용액, 성장 용액 및 아스코르브산의 부피비가 100 : 80 ~ 140 : 0.4 ~ 1로 포함하는 것을 특징으로 하는 항원 감도향상제 제조방법.
  4. 제 1항에 있어서, (3) 단계의 자기조립단분자막은 11-멜캅토-운데카노익 액시드(11-Mercapto-undecanoic acid)로 형성되고, (4) 단계의 항체는 C-반응성 단백질 항체 또는 트로포닌 T(Troponin T) 항체를 포함하는 것을 특징으로 하는 항원 감도향상제 제조방법.
  5. 제 1항에 있어서, 상기 성장 용액은 CTAB, 질산은(AgNO3) 및 염화금(HAuCl4)을 포함하는 것을 특징으로 하는 항원 감도향상제 제조방법.
  6. 평균 직경 5 ~ 20 ㎚의 금 나노점;
    항체; 및
    상기 금 나노점과 항체를 연결하는 자기조립단분자막;
    을 포함하는 표면 플라즈몬 공명 센서용 항원 감도향상제.
  7. 제 6항에 있어서, 상기 표면 플라즈몬 공명 센서용 항원 감도향상제의 평균 직경이 20 ~ 40 ㎚이며, 상기 항체는 C-반응성 단백질 항체 또는 트로포닌 T(Troponin T) 항체를 포함하는 것을 특징으로 하는 표면 플라즈몬 공명 센서용 항원 감도향상제.
  8. 제 7항에 있어서, 상기 표면 플라즈몬 공명 센서가
    다공성 산화 알루미늄막(220);
    상기 다공성 산화 알루미늄막의 다공성 표면에 형성된 금속 증착층(230);
    상기 금속 증착층과 접합(A)된 자기조립단분자막(240); 및
    상기 금속증착층과 접합된 자기조립단분자막의 타끝단(A')에 결합된 항체(250);
    를 포함하는 바이오센서이며, 상기 다공성 산화 알루미늄막은 기공의 평균 깊이가 1 ~ 3 ㎛이고 기공의 평균 직경이 40 ~ 50 ㎚이며, 상기 금속 증착층은 금 및 니켈을 포함하며, 상기 금속 증착층의 평균 두께가 10 ~ 30 ㎚이고, 상기 자기조립단분자막은 11-멜캅토-운데카노익 액시드(11-Mercapto-undecanoic acid)로 형성된 것이며, 상기 항체는 C-반응성 단백질 항체 또는 트로포닌 T(Troponin T) 항체를 포함하는 것을 특징으로 하는 표면 플라즈몬 공명 센서용 항원 감도향상제.
  9. C-반응성 단백질 또는 트로포닌 T 항원을 측정하는 방법에 있어서,
    C-반응성 단백질 또는 트로포닌 T 항원; 및
    제 6항 내지 제8항 중 어느 한 항의 항원 감도향상제;
    를 이용하는 것을 특징으로 하는 항원 측정방법.
  10. 제 9항에 있어서, 상기 항원 측정방법이 1×102 ~ 1×1013 ag/㎖의 항원 검출을 특징으로 하는 항원 측정방법.
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