KR101377824B1 - Primers for waterborne virus detection and kit comprising the primers - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 수인성 바이러스 검출용 프라이머 및 이를 포함하는 검출 키트에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 노로바이러스(Norovirus), 로타바이러스(Rotavirus), 콕사키바이러스(Coxsackie virus), A형 간염 바이러스(Hepatitis A virus) 및 아스트로바이러스(Astrovirus)를 실시간 중합효소 연쇄반응(Real time-PCR)로 검출할 수 있는 프라이머 및 프로브에 관한 것이다.
The present invention relates to a primer for detecting waterborne viruses and a detection kit including the same, more specifically, a norovirus, a Rotavirus, a Coxsackie virus, and a hepatitis A virus. virus) and Astrovirus (Real Time-PCR) to detect primers and probes that can be detected.
수인성 전염병(Waterborne infection)은 병원성 미생물이 오염된 물에 의해서 전달되는 질병으로 사람이 병원성 미생물에 오염된 물을 섭취하여 발병하는 감염병을 말한다. 수인성 전염병은 원인 병원성 미생물이 입을 통해 위와 장으로 들어가 주로 위장관에서 증식을 하면서 염증을 일으키며 분변으로 배출되는데(분변-경구 전파경로), 주로 복통, 설사, 오심, 구토 등의 위장관과 관련된 증상을 보인다. Waterborne infection is a disease transmitted by water contaminated with pathogenic microorganisms and refers to an infectious disease caused by a person ingesting water contaminated with pathogenic microorganisms. Water-borne infectious diseases cause causative pathogenic microorganisms to enter the stomach and intestine through the mouth, proliferate in the gastrointestinal tract, inflamed and excreted in the feces (fecal-oral propagation pathway). see.
국내에서 유행하는 수인성 바이러스 중 대표적인 것들로서는 노로바이러스(Norovirus), 로타바이러스(Rotavirus), 콕사키바이러스(Coxsackie virus), A형 간염 바이러스(Hepatitis A virus), 아스트로바이러스(Astrovirus) 등이 있다. Representative examples of waterborne viruses in Korea include Norovirus, Rotavirus, Coxsackie virus, Hepatitis A virus, and Astrovirus.
노로바이러스는 대표적인 겨울철 식중독 유발 병원체로서, 2007년에서 2009년 사이에 발생한 수인성 및 식품매개 식중독사고의 50% 이상의 원인이 되었다고 보고되었다. 주요 증세는 오심, 구토, 복통, 설사, 발열 등인데, 드물지만 노인이나 환자 등에서 심한 탈수현상으로 사망하는 경우도 있다. 감염 경로가 매우 다양하여, 개인간의 접촉, 분변, 경구, 에어로졸 감염과 오염된 물 및 음식을 통한 감염 등이 모두 가능하다. 바이러스의 변종 또한 다양하며, 어패류 오염이나 오염된 물로 인한 경우 2가지 이상의 변종 노로바이러스에 의한 동시 감염도 흔하다. 바이러스가 잘 확산되는 이유는 소량으로 감염되기 때문에 미세 물방울, 의복이나 침구, 사람 대 사람의 전파, 그리고 주변 환경오염에 의한 감염이 쉽게 일어나며 가족이나 주변사람에 의한 2차 감염, 3차 감염도 많이 일어난다. Norovirus is a representative winter food poisoning pathogen, and it has been reported that more than 50% of waterborne and foodborne food poisoning accidents occurred between 2007 and 2009. The main symptoms are nausea, vomiting, abdominal pain, diarrhea, fever, etc. In rare cases, the elderly or patients die from severe dehydration. The path of infection is so diverse that personal contact, feces, oral, aerosol infections and contaminated water and food infections are all possible. Varieties of viruses are also diverse, and simultaneous infection by two or more varieties of noroviruses is common, especially due to shellfish contamination or contaminated water. The reason why the virus spreads well is because small amounts of infection are easily caused by microscopic droplets, clothing or bedding, human-to-human transmission, and environmental pollution. Happens.
로타바이러스는 전 세계적으로 연 60만명 이상의 사망 원인이 되는 로타바이러스 장염의 원인체로써, 주로 5세 미만의 영아들에게 감염된다. 주요한 증상은 급성설사질환으로 인한 탈수인데, 개발도상국 및 후진국의 환자들은 탈수 증상 시 적절한 수분을 공급받지 못해 치사율이 높다. 우리나라에서도 질병관리본부가 운영중인 감시시스템에 주기적으로 보고되고 있는 바이러스이다.Rotavirus is a cause of rotavirus enteritis, which causes more than 600,000 deaths per year worldwide, and mainly infects infants under five years of age. The main symptom is dehydration due to acute diarrheal diseases. Patients in developing and developing countries have a high mortality rate because they do not receive adequate water for dehydration symptoms. In Korea, the virus is regularly reported to the surveillance system operated by the Centers for Disease Control and Prevention.
콕사키바이러스도 여름에 주로 경구감염으로 유유아(乳幼兒) 사이에 만연하는 바이러스이다. 증상은 발열 및 구토, 설사 등 위장관 증세가 대표적인데, 인두염이나 기관지염등의 기도질환, 무균성 수막염, 뇌염이나 마비 등의 중추신경질환, 점막이나 피부의 발진성 질환, 근염이나 결막염으로 진행하는 경우도 있다. Coxsackieviruses are also a common oral infection in the summer and are prevalent among infants. Symptoms include gastrointestinal symptoms such as fever, vomiting and diarrhea, such as airway diseases such as pharyngitis or bronchitis, aseptic meningitis, central nervous system diseases such as encephalitis or paralysis, mucosal or skin rash, myositis or conjunctivitis There is also.
A형 간염바이러스 역시 수인성 바이러스로서, 감염시 가벼운 감기 증세, 황달이나 심한 복통, 구토, 설사와 같은 위장관 증세를 보인다. 위생 상태가 좋은 선진국에서도 감염이 급증하는 추세에 있어 크게 문제가 되고 있다. 우리나라의 경우 2009년에 2005년과 대비하여 19배 증가하였으며, 환자수는 2005년에 789명, 2006년에 2,081명,2007년에 2,233명, 2008년에 7,895명, 2009년에 15,041명으로 급속히 증가하고 있다. 수인성 바이러스는 유아나 노인 등 면역력이 취약한 연령층에서 발병하는 것이 일반적이나, A형 간염바이러스는 특이하게도 20~30대 연령층이 79%로 가장 많은 발생률을 차지하였다. Hepatitis A virus is also a waterborne virus that causes mild gastrointestinal symptoms such as jaundice, severe abdominal pain, vomiting and diarrhea. In developed countries with good hygiene, infections are rapidly increasing. In Korea, the number of patients increased 19 times compared to 2005, and the number of patients rapidly increased to 789 in 2005, 2,081 in 2006, 2,233 in 2007, 7,895 in 2008, and 15,041 in 2009. It is increasing. Waterborne viruses are commonly found in people with weak immunity, such as infants and the elderly, but hepatitis A virus is the most common in the 20s and 30s age group with 79%.
아스트로바이러스는 질병관리본부가 운영중인 감시시스템에 주기적으로 보고되고 있다. 로타바이러스와 유사한 장염 증상을 일으키는데, 일단 감염되면 34일의 잠복기를 거쳐 몸이 떨리고 설사와 두통, 구토, 복통, 발열을 동반하는 증상을 보인다. 우리나라에서는 가을부터 겨울에 걸쳐 매년 바이러스에 의한 영유아 장염이 유행한다. 어린이 설사의 28%는 아스트로 바이러스에 의한 것으로 분석되고 있다. Astroviruses are regularly reported to surveillance systems operated by the Centers for Disease Control and Prevention. It causes symptoms of rotavirus-like enteritis, which, once infected, has a 34-day incubation period, causing tremors, accompanied by diarrhea, headache, vomiting, abdominal pain, and fever. In Korea, infantile enteritis caused by viruses is prevalent every year from autumn to winter. Twenty-eight percent of children's diarrhea are attributed to the astrovirus.
수인성 전염병은 같은 시기에 다수의 환자가 발생하여 폭발적으로 유행할 수 있어 공중보건학 측면에서 중요한 질환이다. 추가적인 발생을 막고 환자들을 조기에 치료하기 위해서는 원인체 규명이 신속하게 이루어질 필요가 있는데, 수인성 전염병의 증상이 대개 유사하여 원인체 규명이 쉽지 않다. 또한 수인성 전염병을 일으키는 병원성 미생물들에는 세균, 바이러스, 원충 등이 있는데, 이 중에서 특히 바이러스는 크기가 작고 유전자와 항원의 변이가 심하여 검출이 어렵다. 각각의 수인성 바이러스에 대해 실시간 중합효소 연쇄반응(Real-time PCR)을 수행할 수 있는 프라이머들에 대해서는 보고되어 있으나(Enteropathogenic Viruses : Triggers for Exacerbation in IBD -A Prospective Cohort Study Using Real - time Quantitative Polymerase Chain Reaction, Gwen et al., Detection and Characterization of Norovirus Outbreaks in Germany : Application of a One - Tube RT - PCR Using a Fluorogenic Real - Time Detection System, M. Hohne et al.,등) 실제로 신속한 원인체 검출이 가능하려면 하나의 샘플에서 여러 종류의 원인체를 동정할 수 있도록 Real-time PCR의 프라이머 및 프로브가 개발되어야 한다.Waterborne epidemics are an important disease in terms of public health, as many patients can develop and explode at the same time. In order to prevent further development and treat patients early, the identification of the causative agent needs to be made quickly. However, the symptoms of water-borne infectious diseases are usually similar, making it difficult to identify the causative agent. In addition, pathogenic microorganisms causing water-borne infectious diseases include bacteria, viruses, protozoa, among which viruses are difficult to detect due to their small size and severe mutation of genes and antigens. Primers that can perform Real-time PCR for each waterborne virus have been reported ( Enteropathogenic). Viruses : Triggers for Exacerbation in IBD -A Prospective Cohort Study Using Real - time Quantitative Polymerase Chain Reaction , Gwen et al., Detection and Characterization of Norovirus Outbreaks in Germany : Application of a One - Tube RT - PCR Using a Fluorogenic Real - Time Detection System , M. Hohne et al., Et al.) Real-time PCR primers and probes have to be developed to identify different types of agents in a sample.
본 발명자들은 위장관 증세를 보이는 수인성 전염병의 원인체를 검출하고 동정하는 방법에 대해 연구하던 중, 대표적인 원인체들을 동시에 검출할 수 있다면 신속한 원인체 검출 및 감별진단이 가능하다는 것에 착안하여 5가지의 대표적인 수인성 바이러스를 선정하고 이들을 동시에 검출할 수 있는 프라이머와 프로브를 디자인하여 본 발명을 완성하게 되었다.
While the present inventors are studying a method for detecting and identifying a causative agent of a water-borne infectious disease showing gastrointestinal symptoms, the five representative waterborne factors are recognized in view of the fact that if a representative causal agent can be detected at the same time, rapid causative agent detection and differential diagnosis are possible. The present invention was completed by designing a primer and a probe capable of selecting viruses and detecting them simultaneously.
본 발명은 상기와 같은 배경에서 안출된 것으로, 5가지의 대표적인 수인성 바이러스에 대한 프라이머 및 프로브를 포함하는 수인성 바이러스 동정용 조성물 및 키트를 제공함을 목적으로 한다.SUMMARY OF THE INVENTION The present invention has been made in view of the above background, and an object of the present invention is to provide a composition and kit for identifying a waterborne virus comprising primers and probes for five representative waterborne viruses.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
However, the technical problem to be solved by the present invention is not limited to the above-mentioned problems, and other matters not mentioned can be clearly understood by those skilled in the art from the following description.
본 발명은 The present invention
장관 증상 유발 수인성 바이러스 특이적 프라이머로서 As intestinal symptom-inducing waterborne virus specific primers
서열번호 1 내지 10으로 기재되는 폴리뉴클레오티드를 포함하고, Comprising a polynucleotide set forth in SEQ ID NOs: 1-10,
장관 증상 유발 수인성 바이러스 특이적 프로브로서As Enteric Symptom-Induced Waterborne Virus Specific Probes
서열번호 11 내지 15로 기재되는 폴리뉴클레오티드를 포함하되,Polynucleotides set forth in SEQ ID NOs: 11-15,
여기서 here
i) 노로바이러스 type I 및 type Ⅱ는 서열번호 1 및 서열번호 2로 기재되는 폴리뉴클레오티드로 구성된 프라이머 쌍 및 서열번호 11로 기재되는 프로브로 동정되고, i) Noroviruses type I and type II are identified as primer pairs consisting of polynucleotides set forth in SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 and probes described in SEQ ID NO: 11,
ii) 로타바이러스 G-유전자형 및 P-유전자형은 서열번호 3 및 서열번호 4로 기재되는 폴리뉴클레오티드로 구성된 프라이머 쌍 및 서열번호 12로 기재되는 프로브로 동정되고,ii) the rotavirus G- and P-genotypes are identified as primer pairs consisting of polynucleotides set forth in SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4 and probes described in SEQ ID NO: 12,
iii) 콕사키바이러스 type I은 서열번호 5 및 서열번호 6으로 기재되는 폴리뉴클레오티드로 구성된 프라이머 쌍 및 서열번호 13으로 기재되는 프로브로 동정되고,iii) coxsackievirus type I is identified as a primer pair consisting of a polynucleotide set forth in SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6 and a probe described in SEQ ID NO: 13,
iv) A형 간염 바이러스는 서열번호 7 및 서열번호 8로 기재되는 폴리뉴클레오티드로 구성된 프라이머 쌍 및 서열번호 14로 기재되는 프로브로 동정되고,iv) Hepatitis A virus is identified by a primer pair consisting of a polynucleotide set forth in SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 8 and a probe described in SEQ ID NO: 14,
v) 아스트로바이러스는 서열번호 9 및 서열번호 10으로 기재되는 폴리뉴클레오티드로 구성된 프라이머 쌍 및 서열번호 15로 기재되는 프로브로 동정되는,v) an astrovirus is identified by a primer pair consisting of a polynucleotide described by SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: 10 and a probe described by SEQ ID NO: 15,
노로바이러스 type I, 노로바이러스 type Ⅱ, 로타바이러스 G-유전자형, 로타바이러스 P-유전자형, 콕사키바이러스 type I, A형 간염 바이러스 및 아스트로바이러스로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 장관 증상 유발 수인성 바이러스 동정용 조성물을 제공한다. Norovirus type I, norovirus type II, rotavirus G-type, rotavirus P-type, coxsackie virus type I, hepatitis A virus and astrovirus It provides a composition for identification.
A형 간염 바이러스는 다양한 type이 있으며, 대표적인 것은 type IA, ⅡA, ⅢA에 해당한다. 본 발명의 프라이머 및 프로브는 이들 type을 포함해서 모든 type을 검출할 수 있다. Hepatitis A virus has a variety of types, the most common of which is type IA, IIA, IIIA. The primers and probes of the present invention can detect all types, including these types.
아스트로바이러스는 type I~Ⅷ이 있으며, 국내에서는 type I이 가장 많이 발생한다. 그러나 본 발명의 프라이머 및 프로브는 이를 포함해서 모든 type을 검출할 수 있다.Astroviruses are type I to Ⅷ, and type I occurs most frequently in Korea. However, the primers and probes of the present invention can detect all types, including these.
또한 본 발명은 서열번호 1 내지 10으로 기재되는 프라이머 및 서열번호 11 내지 15로 기재되는 프로브를 포함하는, 노로바이러스 type I, 노로바이러스 type Ⅱ, 로타바이러스 G-유전자형 , 로타바이러스 P-유전자형, 콕사키바이러스 type I, A형 간염 바이러스 및 아스트로바이러스로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 장관 증상 유발 수인성 바이러스 동정용 키트를 제공한다.In addition, the present invention comprises a primer described in SEQ ID NOS: 1 to 10 and a probe described in SEQ ID NOs: 11 to 15, norovirus type I, norovirus type II, rotavirus G-genotype, rotavirus P-genotype, cock Provided are kits for identifying any one or more intestinal symptomatic induced waterborne viruses selected from the group consisting of Sakivirus type I, Hepatitis A virus and Astrovirus.
본 발명은 상기 프라이머 및 프로브를 포함하는 조성물을 이용하여 검체로부터 채취한 시료로부터 실시간 중합효소 연쇄반응(Real-time Polymerase Chain Reaction)을 수행하는 단계를 포함하는, 노로바이러스 type I, 노로바이러스 type Ⅱ, 로타바이러스 G-유전자형 , 로타바이러스 P-유전자형, 콕사키바이러스 type I, A형 간염 바이러스 및 아스트로바이러스로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 장관 증상 유발 수인성 바이러스를 동정하는 방법을 제공한다.The present invention comprises the step of performing a real-time polymerase chain reaction (Real-time Polymerase Chain Reaction) from a sample taken from the sample using the composition comprising the primer and probe, norovirus type I, norovirus type II Provided are methods for identifying any one or more enteric symptom-induced waterborne viruses selected from the group consisting of, rotavirus G-type, rotavirus P-type, coxsackievirus type I, hepatitis A virus, and astroviruses.
본 발명의 일 구현예로, 상기 실시간 중합효소 연쇄반응(Real-time Polymerase Chain Reaction)을 수행하는 단계는,In one embodiment of the present invention, the step of performing a real-time polymerase chain reaction (Real-time Polymerase Chain Reaction),
95℃에서 2분 동안 1 cycle을 수행하는 단계; 및Performing 1 cycle at 95 ° C. for 2 minutes; And
95℃에서 10초간, 55℃ 내지 60℃에서 45초간 30 내지 45 cycle을 수행하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 한다.
To perform 30 to 45 cycles for 10 seconds at 95 ℃, 45 seconds at 55 ℃ to 60 ℃; characterized in that it comprises a.
본 발명의 프라이머를 함유하는 조성물 및 키트를 이용하면 하나의 샘플에서 5가지의 대표적인 수인성 바이러스를 검출할 수 있게 된다. 따라서 장관 증상을 보이는 환자 발생시에 원인이 되는 바이러스를 신속, 정확하게 동정하는 데 중요하게 응용될 수 있을 것으로 기대된다.
The compositions and kits containing the primers of the invention allow the detection of five representative waterborne viruses in one sample. Therefore, it is expected to be an important application for the rapid and accurate identification of the causative virus in patients with intestinal symptoms.
도 1A는 Oligo6 프로그램을 사용의 예시이고, 도 1B는 바이러스의 가장 잘 보존된 부위의 탐색의 예시를 나타낸다.
도 2는 Hepatitis A virus를 사용한 Conventional PCR 과의 민감도를 비교한 도이다. 상단의 도는 Real-time PCR을 수행하여 검출한계를 확인한 도이며, 하단의 도는 Conventional PCR을 수행하여 전기영동으로 검출한계를 확인한 도이다.
도 3은 본 발명에 사용한 CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System과 iQ Multiplex Powermix를 나타낸 도이다.
도 4는 본 발명의 프라이머 및 프로브를 포함하는 조성물을 환경시료 및 임상시료에 적용하여 바이러스 검출을 확인한 도이다. 1A is an illustration of using the Oligo6 program, and FIG. 1B shows an example of the search for the best conserved site of the virus.
Figure 2 is a diagram comparing the sensitivity with Conventional PCR using Hepatitis A virus. The upper figure shows the detection limit by performing real-time PCR, and the lower figure shows the detection limit by electrophoresis by performing conventional PCR.
3 is a view showing a CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System and iQ Multiplex Powermix used in the present invention.
Figure 4 is a diagram confirming the virus detection by applying the composition comprising the primer and probe of the present invention to environmental samples and clinical samples.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
Hereinafter, preferred embodiments of the present invention will be described in order to facilitate understanding of the present invention. However, the following examples are provided only for the purpose of easier understanding of the present invention, and the present invention is not limited by the following examples.
[[ 실시예Example ]]
실시예Example 1. 양성시료의 수집 1. Collection of Positive Samples
임상시료로서 분변(stool)을 채집하였다. 분변 50 mg을 PBS 500 ㎕에 현탁시켰다. 이 현탁액을 강하게 30분간 vortex후 micro centrifuge에서 10,000 rpm에서 10분간 원심분리한 후, 상등액 140 ㎕를 채취하여 Qiagen viral RNA mini kit로 viral RNA를 추출하고, 최종적으로 80㎕의 Viral RNA 용액으로 만들어 -70℃에 보관하였다Stool was collected as a clinical sample. 50 mg of fecal suspension was suspended in 500 μl of PBS. Vortex this suspension vigorously for 30 minutes, centrifuge at 10,000 rpm for 10 minutes in a micro centrifuge, extract 140 μl of supernatant, extract viral RNA with Qiagen viral RNA mini kit, and finally make 80 μl Viral RNA solution. Store at 70 ℃
환경시료로는 지하수 및 하천수를 사용하였다. 지하수 및 하천수를 각각 약 500~1000 L를 1 MDS (Cuno) 필터에 흡착시킨 후 1.5% Beef extract를 이용하여 탈리하고 산 농축법에 의해서 바이러스를 농축하였다. 최종 농축한 20~30 ml을 제균하기 위하여 membrane필터로 여과하고 임상시료와 마찬가지로 140 ㎕를 Qiagen viral RNA mini kit로 viral RNA를 추출하였다. 최종적으로 80 ㎕의 Viral RNA 용액으로 만들어 -70 ℃에 보관하였다.
Groundwater and river water were used as environmental samples. About 500-1000 L of groundwater and river water were adsorbed on 1 MDS (Cuno) filter, and then desorbed using 1.5% Beef extract, and the virus was concentrated by acid concentration. In order to sterilize the final concentrated 20 ~ 30 ml, filtered by membrane filter and 140 ㎕ viral RNA was extracted with Qiagen viral RNA mini kit as in the clinical sample. Finally, 80 μl of Viral RNA solution was prepared and stored at -70 ° C.
실시예Example 2. 2. ViralViral RNARNA 추출 extraction
Carrier RNA을 포함한 560 uL의 Buffer AVL을 1.5 mL tube에 넣은 후, 시료 100~140 uL을 넣고 15초 동안 혼합 (pulse-vortex)하였다. 실온에서 10분 동안 정치한 후 가볍게 spin-down 하고, ethanol (96-100%) 560 uL을 넣고 15초 동안 혼합한 후 다시 spin-down 시켰다. 혼합된 시료를 QIAamp Mini spin column에 넣은 다음, 6,000 x g에서 1분 동안 원심분리하는 RNA 흡착단계를 수행하였다. 여기에 Buffer AW1 500 uL을 넣고, 6,000 x g에서 1분 동안 원심분리 하였다. QIAamp spin column을 새로운 2 mL tube에 옮긴 후 Buffer AW2 500 uL을 넣고, 20,000 x g에서 3분 동안 원심분리 하였다. 다시 QIAamp spin column을 최대속도로 1분간 원심분리 한 후, 1.5 mL tube에 QIAamp spin column을 옮겨, Buffer AVE 약 60 uL을 주입하고 1분 동안 정치하고, 6,000 x g에서 1분 동안 원심분리하여 viral RNA을 얻었다. 얻어진 RNA는 즉시 사용하거나 -70℃에 보관하였다.
After adding 560 uL of Buffer AVL containing Carrier RNA into a 1.5 mL tube, 100-140 uL of sample was added and mixed (pulse-vortex) for 15 seconds. After standing at room temperature for 10 minutes, spin down lightly, add 560 uL of ethanol (96-100%), mix for 15 seconds, and spin down again. The mixed sample was placed in a QIAamp Mini spin column, followed by an RNA adsorption step of centrifugation at 6,000 xg for 1 minute.
실시예Example 3. 3. PrimerPrimer 및 And probeprobe 제작making
실시예 1 및 2에서 분리한 임상시료와 환경시료에서 분리한 바이러스들의 염기서열 외의 국내 분리주 그리고 외국의 분리주의 염기서열은 NCBI, EMBL 그리고 DDBJ등에서 확보하였다. In addition to the nucleotide sequences of viruses isolated from clinical samples and environmental samples isolated in Examples 1 and 2, the nucleotide sequences of domestic isolates and foreign isolates were obtained from NCBI, EMBL, and DDBJ.
확보된 염기서열을 토대로 DNAStar의 Meg align program을 이용하여 프라이머(primer) 및 프로브(probe)를 선정하였다. 각각의 프라이머와 프로브의 정보는 다음과 같다. Based on the obtained nucleotide sequence, primers and probes were selected using DNAStar's Meg align program. The information of each primer and probe is as follows.
노로바이러스는 ORF1, ORF2, ORF3로 이루어진 전체 게놈 (7.6Kb)중에서 ORF2 를 구성하고 있는 capsid 부위의 최외각에 위치한 P2 domain 중 사람에게 감염되는 GenogroupI (GI-1~GI-8), Genogroup Ⅱ (GII-1~GII-17) 의 specific한 염기서열을 분석하여 G I과 G Ⅱ를 모두 검출할 수 있는 프라이머 및 프로브를 40~70 bp의 크기로 디자인하였다. Norovirus is genogroup I (GI-1 ~ GI-8), Genogroup II (infected by humans in the outermost P2 domain of the capsid region of ORF2 in the entire genome (7.6Kb) consisting of ORF1, ORF2 and ORF3). Primers and probes capable of detecting both GI and G II were designed with a size of 40-70 bp by analyzing specific nucleotide sequences of GII-1 ~ GII-17).
로타바이러스는 11개의 segment로 이루어진 이중가닥 RNA 바이러스이다. 그 중 VP4(P)와 VP7(G)은 로타바이러스의 최외각에 위치하며 유전자형을 결정하는 중요한 부위이다. 현재까지 보고된 로타바이러스는 G-유전자형이 G1~G16, P-유전자형이 P1~P27로 알려져 있다. 따라서 각 type의 specific한 염기서열을 분석하여 G-유전자형 및 P-유전자형을 모두 검출할 수 있는 프라이머 및 프로브를 40~70bp의 크기로 디자인을 하였다. Rotavirus is an 11-segment double-stranded RNA virus. Among them, VP4 (P) and VP7 (G) are located at the outermost part of rotavirus and are important sites for genotyping. Rotaviruses reported to date are known as G-types G1-G16 and P-types P1-P27. Therefore, we designed primers and probes with a size of 40-70bp that can detect both G- and P-types by analyzing specific sequences of each type.
콕사키 바이러스는 VP1에 specific한 염기서열로서, 콕사키바이러스 type I을 검출할 수 있는 프라이머 및 프로브를 디자인하였다.Coxsackie virus is a nucleotide sequence specific for VP1, and designed primers and probes capable of detecting coxsackie virus type I.
A형 간염 바이러스는 VP1/2A 부위에 specific한 염기서열로서, 모든 type의 A형 간염 바이러스를 검출할 수 있는 프라이머 및 프로브를 디자인하였다. Hepatitis A virus is a nucleotide sequence specific to the VP1 / 2A site, and designed primers and probes capable of detecting all types of hepatitis A virus.
아스트로바이러스는 단일 양성가닥바이러스로서 비구조 단백질(viral serine protease와 RNA dependent RNA polymerase)과 캡시드 단백질로 이루어진다. 특히 게놈의 잘 보존된 serine protease 부위와 3 말단 부위에서 염기서열을 분석하여 모든 type의 아스트로바이러스를 검출할 수 있도록 40~70 bp의 크기로 디자인하였다.Astrovirus is a single positive stranded virus consisting of non-structural proteins (viral serine protease and RNA dependent RNA polymerase) and capsid proteins. Especially, we designed the size of 40 ~ 70 bp to detect all types of astroviruses by analyzing the nucleotide sequence at well-preserved serine protease and 3 terminal regions of genome.
상기 제작된 프라이머 및 프로브에 대하여, Oligo6 프로그램을 사용하여 melting temperature 나 2차 구조를 계산하였다. 그리고 계산된 Tm값, 반응시간, 온도조건을 반영하여 각 바이러스의 conserved 부위를 본 발명의 프라이머 및 프로브로 선정하고 제작하였다. 프로브가 되는 염기서열의 양 끝에는 형광물질과 quencher를 각각 붙였다.For the prepared primers and probes, melting temperature or secondary structure was calculated using the Oligo6 program. The conserved site of each virus was selected as the primer and probe of the present invention by reflecting the calculated Tm value, reaction time, and temperature conditions. At both ends of the base sequence to be probed, a fluorescent substance and a quencher were attached.
도 1은 Oligo6 프로그램을 사용한 예시(A) 및 바이러스의 가장 잘 보존된 부위의 탐색 예시(B)이다.1 is an example (A) using the Oligo6 program and a search example (B) of the best conserved site of the virus.
하기 표 1은 제작된 프라이머와 프로브의 염기서열을 나타낸 표이다.
Table 1 is a table showing the nucleotide sequences of the prepared primers and probes.
((
targettarget
))
(서열번호 1)CARGARBCNATGTTYAGRTGGATGAG
(SEQ ID NO: 1)
(서열번호 11)-BHQFAM-AGC CAN TGG GAG GGC GAT CGC A
(SEQ ID NO: 11) -BHQ
(서열번호 7)TCT TGC CGT TGA TAC TCC TTG GGT
(SEQ ID NO: 7)
(서열번호 8)ATC CAG TGC TCC AGA CAC AGC ATA
(SEQ ID NO: 8)
(서열번호 9)TAC CAC CAG CAC TCT TCA AGC ACA
(SEQ ID NO: 9)
(서열번호 10)TGT CTG CAA GGT GAC TTC ACC AGA
(SEQ ID NO: 10)
실시예Example 4. 4. RealReal -- timetime PCRPCR 조건 확립 Establish condition
각 바이러스별로 monoplex로 real-time PCR을 수행하여 반응시간 및 온도조건을 확립하였다. Oligo6 프로그램을 이용하여 온도조건을 계산한 후 반응하였을 때 프라이머가 샘플에 비특이적인 반응을 보이거나 양성샘플이 detection 되지않을때 PCR 반응시간 및 온도를 조절하였다.
Real-time PCR was performed by monoplex for each virus to establish reaction time and temperature conditions. The PCR reaction time and temperature were adjusted when the primer showed nonspecific reaction to the sample or no positive sample was detected when the temperature conditions were calculated using Oligo6 program.
실시예Example 5. 5. ConventionalConventional PCRPCR 과의 민감도 비교Sensitivity comparison
각 대상 바이러스의 RNA의 전사체를 대량으로 제작한 다음, 그 RNA 전사체를 10배수씩 단계적으로 희석하였다. 이렇게 제조한 바이러스 RNA 시료를 본 발명의 프라이머 및 프로브를 적용하여 Real-time PCR을 수행하여 검출한계를 확인하였다. 결과는 도 2의 상단의 도에 나타내었다.A large amount of RNA transcript of each virus was produced, and then the RNA transcript was diluted in multiples of 10 times. The virus RNA samples thus prepared were subjected to real-time PCR using the primers and probes of the present invention to confirm the detection limits. The results are shown in the figure at the top of FIG.
상기 Real-time PCR 결과와 비교하기 위해, 동일한 RNA 전사체를 10배수씩 단계적으로 희석한 후 본 발명의 프라이머 및 프로브를 적용하여 conventional reverse transcription PCR을 통해 검출한계를 확인하였다. 결과는 도 2의 하단의 도에 나타내었다.In order to compare the results with the real-time PCR, the same RNA transcript was diluted by 10-fold step by step and the detection limit was confirmed by conventional reverse transcription PCR by applying the primer and probe of the present invention. The results are shown in the figure at the bottom of FIG.
도 2에 나타난 바와 같이, conventional PCR 에서는 2.8 x 107 까지 검출한계를 보였지만 Multiplex Real-time PCR 에서는 2.8 x 105 까지 검출한계를 보였다. 따라서 Multiplex Real-time PCR에서 2.8 x 102 만큼 더 우수한 검출한계를 보임을 알 수 있었다.
As shown in FIG. 2, the conventional PCR showed a detection limit of 2.8 x 10 7 but the multiplex real-time PCR showed a detection limit of 2.8 x 10 5 . Therefore, the detection limit of 2.8 x 10 2 is shown to be superior in Multiplex Real-time PCR.
실시예Example 6. 6. multiplexmultiplex RealReal -- timetime PCRPCR 수행 및 Perform and monoplexmonoplex RealReal -- timetime PCRPCR 과의 비교Comparison with
6-1. 6-1. MultiplexMultiplex RealReal -- timetime PCRPCR 수행 Perform
추출한 바이러스 RNA(4~40ng) 에 cDNA의 합성을 위해서 역전사반응(reverse transcription, RT)을 수행하였다. 표준 RT 반응은 버퍼(50 mM Tris-HCl; pH 8.3, 75 mM KCl, 10 mM DTT, 3 mM MgCl2, 0.5 mM dNTP)에서 42℃, 50분 동안 수행하였다.Reverse transcription (RT) was performed to synthesize cDNA on the extracted viral RNA (4-40 ng). Standard RT reactions were performed in a buffer (50 mM Tris-HCl; pH 8.3, 75 mM KCl, 10 mM DTT, 3 mM MgCl 2, 0.5 mM dNTP) for 42 ° C., 50 minutes.
Multiplex Real-time PCR 조성은 하나의 Tube에 Bio-rad 社 의 iQ Multiplex Powermix (2x reaction buffer with dNTPs 12 Mm MgCl2 iTaq DNA polymerase, and stabilizers) 25 ㎕, 5가지 동시검출용 Forward primer 1, Reverse primer 1 ㎕, Probe 1 ㎕, 추출 cDNA 10㎕ 첨가하고 증류수로 총 50㎕로 맞추었다. 사용한 기기 및 Powermix는 도 3에 나타내었다. Multiplex Real-time PCR composition is composed of Bio-rad's iQ Multiplex Powermix (2x reaction buffer with dNTPs 12 Mm MgCl 2 ) in one tube. iTaq DNA polymerase, and stabilizers) 25 μl, 5 simultaneous detection of forward primer 1, reverse primer 1 μl, probe 1 μl and extracted
Multiplex Real-time PCR 반응 조건은 하기의 표 2와 같다. Multiplex real-time PCR reaction conditions are shown in Table 2 below.
annealingdenaturation
annealing
55 - 60℃95 ℃
55-60
45 sec 10 sec
45
6-2. 6-2. monoplexmonoplex RealReal -- timetime PCRPCR 과의 민감도 비교Sensitivity comparison
일반적으로 Monoplex 법으로 했을 경우 한 쌍의 프라이머에 하나의 바이러스가 반응하여 dimer 형성 등의 저해요소들이 적은 반면, multiplex 법은 여러 쌍의 프라이머 및 여러 가지의 바이러스가 들어가는 이유로 민감도가 떨어지는 경향을 보인다. 본 발명은 하나의 샘플에서 여러 종의 바이러스들을 동정해 낼 수 있는 것이 특징이므로, multiplex Real-time PCR을 수행했을 때에도 높은 민감도를 유지하는지 확인하기 위해 하기의 실험을 수행하였다.In general, the monoplex method has less inhibitory factors such as dimer formation due to one virus reacting to a pair of primers, whereas the multiplex method tends to be less sensitive due to the introduction of several pairs of primers and various viruses. Since the present invention is characterized by being able to identify several viruses in one sample, the following experiment was performed to confirm whether the sensitivity is maintained even when multiplex real-time PCR is performed.
각 바이러스를 multiplex로 Real-time PCR 수행하여, 제작된 각 수인성 바이러스의 primer 및 probe의 교차반응을 점검하고 확립하였다. 각 대상 바이러스의 RNA는 cDNA 합성을 거쳐 10배 희석하여 각각의 PCR 반응으로 비교하였다.Real-time PCR was performed with multiplexes of each virus to check and establish the cross-reaction of primers and probes of the produced waterborne viruses. RNA of each virus was diluted 10-fold through cDNA synthesis and compared with each PCR reaction.
결과는 하기 표 3에 나타내었다. The results are shown in Table 3 below.
상기 표 3과 같이 본 발명의 프라이머 및 프로브는 Multiplex 에서도 민감도가 우수하다는 결과를 얻었다. 이는 본 발명의 프라이머 및 프로브들이 Multiplex법을 수행할 때에 발생할 수 있는 저해요소를 최소화하도록 디자인되어 있음을 의미한다. 표 3에 기재되지 않은 바이러스의 경우에도 표 3으로 확인한 바이러스들과 동일한 방법으로 디자인하였으므로 같은 효과를 가질 것을 당업자가 용이하게 유추할 수 있다.
As shown in Table 3, the primers and probes of the present invention obtained excellent sensitivity even in Multiplex. This means that the primers and probes of the present invention are designed to minimize the inhibitory factors that may occur when performing the Multiplex method. Viruses not listed in Table 3 can also be easily inferred by those skilled in the art because they are designed in the same manner as the viruses identified in Table 3 and have the same effect.
실시예Example 7. 환경시료 및 임상시료에 적용 7. Applied to environmental and clinical samples
본 발명의 프라이머 및 프로브를 환경시료 및 임상시료에 적용하여 multiplex Real-time PCR을 수행하였다. 실험 방법은 실시예 6과 동일하다. 수인성 바이러스 4종을 하나의 tube에 혼합하여 첨가하고 실험을 수행한 결과, 4종의 바이러스를 동시에 검출할 수 있었다. 결과는 도 4에 나타내었다. Multiplex Real-time PCR was performed by applying the primers and probes of the present invention to environmental samples and clinical samples. The experimental method is the same as in Example 6. Four water viruses were mixed and added to one tube, and the experiments were performed. As a result, four viruses could be detected simultaneously. The results are shown in Fig.
본 발명을 이용하면 5가지의 바이러스를 동시에 검출할 수 있으나, 본 연구실 장비의 한계로 probe 파장 값이 중복되는 현상이 발생하여 결과를 얻지 못하였다. 이런 문제점은 probe의 modification 값을 해당 장비의 성능에 따라 고안하거나 Two-Plex 방식으로 두 개의 tube를 이용해 중복되지 않게 반응한다면 해결할 수 있을 것이며, 이는 당업자에게 자명한 사실이다.
Using the present invention, five viruses can be detected at the same time, but due to the limitations of the laboratory equipment, the phenomenon of overlapping probe wavelength values has not been obtained. This problem can be solved if the modification value of the probe is designed according to the performance of the equipment or if the reaction is not duplicated using two tubes in a two-plex method, which is obvious to those skilled in the art.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해되어야 한다.
It will be understood by those skilled in the art that the foregoing description of the present invention is for illustrative purposes only and that those of ordinary skill in the art can readily understand that various changes and modifications may be made without departing from the spirit or essential characteristics of the present invention. will be. It is therefore to be understood that the above-described embodiments are illustrative in all aspects and not restrictive.
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Claims (4)
서열번호 1 내지 10으로 기재되는 폴리뉴클레오티드를 포함하고,
장관 증상 유발 수인성 바이러스 특이적 프로브로서
서열번호 11 내지 15로 기재되는 폴리뉴클레오티드를 포함하되,
여기서
i) 노로바이러스 type I 및 type Ⅱ는 서열번호 1 및 서열번호 2로 기재되는 폴리뉴클레오티드로 구성된 프라이머 쌍 및 서열번호 11로 기재되는 프로브로 동정되고,
ii) 로타바이러스 G-유전자형 및 P-유전자형은 서열번호 3 및 서열번호 4로 기재되는 폴리뉴클레오티드로 구성된 프라이머 쌍 및 서열번호 12로 기재되는 프로브로 동정되고,
iii) 콕사키바이러스 type I은 서열번호 5 및 서열번호 6으로 기재되는 폴리뉴클레오티드로 구성된 프라이머 쌍 및 서열번호 13으로 기재되는 프로브로 동정되고,
iv) A형 간염 바이러스는 서열번호 7 및 서열번호 8로 기재되는 폴리뉴클레오티드로 구성된 프라이머 쌍 및 서열번호 14로 기재되는 프로브로 동정되고,
v) 아스트로바이러스는 서열번호 9 및 서열번호 10으로 기재되는 폴리뉴클레오티드로 구성된 프라이머 쌍 및 서열번호 15로 기재되는 프로브로 동정되는,
노로바이러스 type I, 노로바이러스 type Ⅱ, 로타바이러스 G-유전자형 , 로타바이러스 P-유전자형, 콕사키바이러스 type I, A형 간염 바이러스 및 아스트로바이러스로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 장관 증상 유발 수인성 바이러스 동정용 조성물.
As intestinal symptom-inducing waterborne virus specific primers
Comprising a polynucleotide set forth in SEQ ID NOs: 1-10,
As Enteric Symptom-Induced Waterborne Virus Specific Probes
Polynucleotides set forth in SEQ ID NOs: 11-15,
here
i) Noroviruses type I and type II are identified as primer pairs consisting of polynucleotides set forth in SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 and probes described in SEQ ID NO: 11,
ii) the rotavirus G- and P-genotypes are identified as primer pairs consisting of polynucleotides set forth in SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4 and probes described in SEQ ID NO: 12,
iii) coxsackievirus type I is identified as a primer pair consisting of a polynucleotide set forth in SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6 and a probe described in SEQ ID NO: 13,
iv) Hepatitis A virus is identified by a primer pair consisting of a polynucleotide set forth in SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 8 and a probe described in SEQ ID NO: 14,
v) an astrovirus is identified by a primer pair consisting of a polynucleotide described by SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: 10 and a probe described by SEQ ID NO: 15,
Norovirus type I, norovirus type II, rotavirus G-type, rotavirus P-type, coxsackie virus type I, hepatitis A virus and astrovirus Identification composition.
Norovirus type I, Norovirus type II, Rotavirus G-type, Rotavirus P-type, Coxsackievirus type I, comprising primers set forth in SEQ ID NOs: 1 to 10 and probes set forth in SEQ ID NOs: 11 to 15 And at least one enteric symptom-inducing waterborne virus identification kit selected from the group consisting of hepatitis A virus and astrovirus.
상기 실시간 중합효소 연쇄반응(Real-time Polymerase Chain Reaction)을 수행하는 단계는,
95℃에서 2분 동안 1 cycle을 수행하는 단계; 및
95℃에서 10초간, 55℃ 내지 60℃에서 45초간 30 내지 45 cycle을 수행하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
The method of claim 3,
Performing the real-time polymerase chain reaction (Real-time Polymerase Chain Reaction),
Performing 1 cycle at 95 ° C. for 2 minutes; And
Performing 30 to 45 cycles at 95 ° C. for 10 seconds and 55 ° C. to 60 ° C. for 45 seconds.
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