KR101365721B1 - Ｇ6ｐｄ의 유전적 다형성 다중 동시 진단 장치 및 이를 이용한 진단 방법 - Google Patents
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Abstract
G6PD 결핍 진단 장치가 제공된다. 이 진단 장치는 G6PD 유전자의 변이형들을 각각 검출하기 위한 각각의 항체가 제공된 복수의 감지 영역들로 구성된 감지부 및 감지부로 G6PD 유전자에 포함된 변이형들에 대한 중합효소 연쇄 반응물을 제공하기 위한 중합효소 연쇄 반응부를 포함한다.
Description
본 발명은 진단 장치 및 이를 이용한 진단 방법에 관한 것으로, 더 구체적으로 G6PD의 유전적 다형성을 동시에 다중으로 검출할 수 있는 진단 장치 및 이를 이용한 진단 방법에 관한 것이다.
포도당-6-인산 탈수소 효소(Glucose-6-Phosphate Dehydrogenase : G6PD, 이하 'G6PD'라 표기함.)는 오탄당 인산 회로(pentose phosphate pathway)에 관여하는 효소로서, 포도당-6-인산(glucose-6-phosphate)을 6-포스포글루콘산(6-phosphogluconate)으로 전환한다. G6PD는 세포 내 환원형 니코틴아미드 아데닌 디뉴틀레오티드 인산(Nicotinamide Adenine Dinucleotide Phosphate H : NADPH, 이하 'NADPH'라 표기함.)의 생성원으로 대부분의 포유동물 종에 매우 잘 보존되어 있으며, G6PD에 의해 생성된 NADPH는 여러 다른 세포에서 슈퍼옥사이드 음이온(superoxide anion)과 질소 산화물(nitrogen oxide, NOx)을 포함하는 활성 산소 종(Reactive Oxygen Species : ROS, 이하 'ROS'라 표기함.)의 생성, 및 글루타치온 퍼옥시다제(GPx : Gultathione Peroxidase) 및 카탈라아제(catalase)를 통한 이들 ROS의 제거에 필요하다는 것이 앞서 보고되었다.
ROS가 과잉 생성되거나, 또는 이들에 대한 제거가 제대로 이루어지지 않을 경우, 이로 인한 산화 스트레스가 발생하며, 이는 생체 내에서 동맥 경화, 심혈관 질환 및 당뇨병 등과 같은 대사성 질환이나, 신경 및 신장 질환, 암, 알츠하이머병(Alzheimer's disease) 등과 같은 다양한 질병에 많은 영향을 미친다고 보고되었다.
G6PD 결핍은 가장 흔한 적혈구 효소 결핍 질환으로서, X-염색체 열성으로 유전되고, 인종 및 성별에 따라 중증도에 차이가 있다고 알려져 있다. 전 세계적으로 약 4억 명의 사람들이 G6PD의 일부 또는 전체의 활성이 비정상적인 것으로 보고되었는데, 국가마다 0.1 ％에서 30 ％까지 다양하게 보고되고 있으나, 한국에서는 유병률이 0.9 ％에서 3.5 ％ 정도로 낮게 보고되고 있다. G6PD 결핍은 신생아 황달, 급성 및 만성 용혈성 빈혈을 일으키지만, 평소에는 대부분 증상이 없고, 감염, 약제 등에 의한 스트레스에 의해 용혈이 발생한다.
현재까지 연구된 바에 의하면, G6PD를 암호화하는 유전자는 13가지의 엑손(exon)으로 구성되며, 20 kb 크기의 유전자 서열이 밝혀져 있다. 300여 가지 이상의 다양한 유전형이 보고되었으며, 현재까지 약 160 종의 변이형들이 보고되었으나, 이러한 다양한 변이형들 중에서 G6PD의 활성에 직접적으로 영향을 미치는 변이는 "A" 변이형, "Mediterranean 및 A-" 변이형 등의 몇 종에 불과한 것으로 알려져 있다. "A" 변이형의 유전자를 갖는 사람은 정상적인 G6PD 활성의 약 85 ％ 수준의 활성을 나타내고, "Mediterranean 및 A-" 변이형의 유전자를 갖는 사람은 정상적인 G6PD 활성의 약 15 ％ 수준의 활성을 나타낸다. 특히, "Mediterranean 및 A-" 변이형의 유전자를 갖는 사람은 말라리아(malaria) 치료제, 설폰아미드계(sulfonamide) 의약품 등에 대해 심각한 부작용을 보이는 것으로 알려져 있다.
G6PD 결핍증의 발생 빈도는 말라리아가 풍토병인 지역인 아프리카와 동남아시아 지역들에서 매우 높다. 아프리카 흑인 집단에서 G6PD A- (class-Ⅲ)가 90 ％ 정도 관찰되며, G6PD A- 연관 표현형(phenotype)은 4 가지의 다른 유전자형(genotype)들과 일치하는데, 모두 376 A → G 다형성 변이형(polymorphic variant)과는 씨스형(cis-)으로 위치한다. 서남아시아에서 G6PD 유전자의 유전적 다형성은 각 인종에 따라 특이적이다. 예를 들면, G6PD Viangchan (871 G → A)은 캄보디아, 태국 등에서 가장 공통으로 나타나는 유전적 다형성이고, G6PD Vanua Lava (383 T → C)는 인도네시아에서 가장 보편적인 유전적 다형성이다. 이 두 G6PD의 유전자의 변이형들은 class-Ⅲ에 속하는 표현형을 나타낸다.
G6PD의 유전적 다형성이 있는 사람은 클로로퀸(chloroquine)과 같은 항말라리아 약물 또는 일부 다른 의약품을 복용하거나, 잠두(fava bean)와 같은 음식을 섭취할 경우, 산화 스트레스에 노출되어 용혈성 빈혈 증상이 나타날 위험이 있다. G6PD 유전자의 변이형은 G6PD의 활성을 변화시키고, 이러한 G6PD의 활성 변화는 이에 의해 대사되는 약물의 독성을 유발하여 부작용을 유발시키기 때문에, G6PD 결핍의 진단을 위해 초기 단계에서 G6PD 유전자의 변이형 유전자형을 분석(genotyping)하는 것이 요구되고 있는 실정이다.
G6PD 결핍증은 G6PD의 활성을 측정하여 표현형을 결정하지만, 혈액 내에 있는 효소보다 DNA가 더 안정적이기 때문에, DNA를 이용한 유전자형 분석은 G6PD 결핍증 검사(screening)에 매우 유용할 것으로 기대된다. 그러나 현재 G6PD 유전자의 변이형을 분석하기 위한 체계적인 방법이 확립되어 있지 않은 실정이다.
중합효소 연쇄 반응(Polymerase Chain Reaction : PCR, 이하 'PCR'로 표기함.)이란 특정 부위의 DNA를 템플릿(template)으로 하여, 이를 특이적으로 증폭시킬 수 있는 상보적인 염기 서열을 가진 프라이머(primer)를 합성한 다음, 이를 이용하여 핵산을 증폭시키는 기술이다. 이러한 PCR 방법으로 하나의 튜브(tube)에서 동시에 다중으로 유전자들을 증폭시킬 수 있는 다중 PCR(Multiplex PCR) 방법을 통해 각각의 특정 유전자의 유무 및 변이형을 판단할 수 있다.
상술한 다중 PCR을 이용하는 다중 동시 분석 장치의 개발을 통해 G6PD 유전자의 단일 염기 다형성(Single Nucleotide Polymorphism : SNP, 이하 '스닙'으로 표기함.)을 분석하고, 그리고 G6PD 결핍을 진단할 수 있는 진단 장치가 필요하다.
본 발명이 해결하고자 하는 과제는 G6PD의 유전자의 다형성을 동시에 다중으로 검출하여 G6PD 결핍을 진단할 수 있는 G6PD 결핍 진단 장치를 제공하는 데 있다.
본 발명이 해결하고자 하는 다른 과제는 G6PD의 유전자의 다형성을 동시에 다중으로 검출하여 G6PD 결핍을 진단할 수 있는 G6PD 결핍 진단 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명이 해결하고자 하는 과제는 이상에서 언급한 과제들에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기한 과제를 달성하기 위하여, 본 발명은 G6PD 결핍 진단 장치를 제공한다. 이 진단 장치는 G6PD 유전자의 변이형들을 각각 검출하기 위한 각각의 항체가 제공된 복수의 감지 영역들로 구성된 감지부 및 감지부로 G6PD 유전자에 포함된 변이형들에 대한 중합효소 연쇄 반응물을 제공하기 위한 중합효소 연쇄 반응부를 포함할 수 있다.
중합효소 연쇄 반응물은 변이형-합텐 결합물질일 수 있다. 합텐은 펩타이드, 나노 입자, 형광 입자 또는 이들의 조합 중에서 선택된 적어도 하나를 포함할 수 있다.
중합효소 연쇄 반응물은 G6PD 유전자를 대립형질 특정 중합효소 연쇄 반응 방법 또는 다중 대립형질 특정 중합효소 연쇄 반응 방법으로 처리하는 것에 의해 형성될 수 있다.
중합효소 연쇄 반응부는 중합효소, 프라이머 세트 및 사전혼합물을 포함할 수 있다. 프라이머 세트는 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 중합효소는 Taq 중합효소일 수 있다. 사전혼합물은 주형 RNA, dNTP 및 완충 용액을 포함할 수 있다.
감지부는 6개의 감지 영역들을 포함하되, 변이형들은 아프리카에서 발생하는 A- (202 G → A), A- (376 A → G), A- (542 A → T), Mediterranean (563 C → T), A- (680 G → T) 및 A- (968 T → C)일 수 있다. 변이형들에 사용되는 프라이머 세트는 Exon4 202(G → A), Exon5 376(A → G), Exon6 542(A → T), Exon6 563(C → T), Exon7 680(G → T) 및 Exon9 968(T → C)을 포함할 수 있다.
감지부는 7개의 감지 영역들을 포함하되, 변이형들은 동남아시아에서 발생하는 Vanua Lava (383 T → C), Mahidol (487 G → A), Coimbra (592 C → T), Viangchan (871 G → A), Union (1360 C → T), Canton (1376 G → A) 및 Kaiping (1388 G → A)일 수 있다. 변이형들에 사용되는 프라이머 세트는 Exon5 383(T → C), Exon6 487(G → A), Exon6 592(C → T), Exon9 871(G → A), Exon11 1360(C → T), Exon12 1376(G → A) 및 Exon12 1388(G → A)을 포함할 수 있다.
감지부의 항체에 특이 결합한 중합효소 연쇄 반응물에 광을 제공하여 형광 에너지를 발생시키기 위한 광원부 및 항체에 특이 결합한 중합효소 연쇄 반응물로부터 발산되는 형광 에너지를 감지하는 센서부를 더 포함할 수 있다.
센서부에 의해 감지된 형광 에너지를 전기적 신호로 전환하는 측정부를 더 포함할 수 있다.
감지부는 대조 영역을 더 포함할 수 있다.
중합효소 연쇄 반응물을 투입하기 위한 시료 투입구 및 중합효소 연쇄 반응물을 감지부로 이송하기 위한 유로를 더 포함할 수 있다.
감지부의 항체에 특이 결합한 중합효소 연쇄 반응물을 분석하는 것은 전기영동법, 스냅샷법, 모세관 전기이동법, 실시간 중합효소 연쇄 반응법, 미세배열 기반 측정법 또는 면역크로마토그래피 측정법을 이용할 수 있다.
상기한 다른 과제를 달성하기 위하여, 본 발명은 G6PD 결핍 진단 방법을 제공한다. 이 방법은 생체시료로부터 G6PD 유전자의 변이형들에 대한 중합효소 연쇄 반응물을 형성하는 단계 및 G6PD 유전자의 변이형들을 각각 검출하기 위한 각각의 항체가 제공된 복수의 감지 영역들로 구성된 감지부에 중합효소 연쇄 반응물을 주입하여 항체에 중합효소 연쇄 반응물을 특이적으로 결합시켜 중합효소 연쇄 반응물-항체 결합물질을 형성하는 단계를 포함할 수 있다.
중합효소 연쇄 반응물은 변이형-합텐 결합물질일 수 있다.
중합효소 연쇄 반응물을 형성하는 단계는 G6PD 유전자를 대립형질 특정 중합효소 연쇄 반응 또는 다중 대립형질 특정 중합효소 연쇄 반응 방법을 이용할 수 있다.
대립형질 특정 중합효소 연쇄 반응 또는 다중 대립형질 특정 중합효소 연쇄 반응 방법은 중합효소, 프라이머 세트 및 사전혼합물로 구성된 용액에 생체시료를 투입하여 중합효소 연쇄 반응을 진행하는 것일 수 있다. 프라이머 세트는 올리고뉴클레이티드를 포함할 수 있다. 프라이머 세트는 합텐이 표지될 수 있다. 합텐은 펩타이드, 나노 입자, 형광 입자 또는 이들의 조합 중에서 선택된 적어도 하나를 포함할 수 있다. 중합효소는 Taq 중합효소일 수 있다. 사전 혼합물은 주형 RNA, dNTP 및 완충 용액을 포함할 수 있다.
감지부는 6개의 감지 영역들을 포함하되, 변이형들은 아프리카에서 발생하는 A- (202 G → A), A- (376 A → G), A- (542 A → T), Mediterranean (563 C → T), A- (680 G → T) 및 A- (968 T → C)일 수 있다. 변이형들에 사용되는 프라이머 세트는 Exon4 202(G → A), Exon5 376(A → G), Exon6 542(A → T), Exon6 563(C → T), Exon7 680(G → T) 및 Exon9 968(T → C)을 포함할 수 있다.
감지부는 7개의 감지 영역들을 포함하되, 변이형들은 동남아시아에서 발생하는 Vanua Lava (383 T → C), Mahidol (487 G → A), Coimbra (592 C → T), Viangchan (871 G → A), Union (1360 C → T), Canton (1376 G → A) 및 Kaiping (1388 G → A)일 수 있다. 변이형들에 사용되는 프라이머 세트는 Exon5 383(T → C), Exon6 487(G → A), Exon6 592(C → T), Exon9 871(G → A), Exon11 1360(C → T), Exon12 1376(G → A) 및 Exon12 1388(G → A)을 포함할 수 있다.
감지부에 광을 제공하여 중합효소 연쇄 반응물-항체 결합물질로부터 형광 에너지를 발생시키는 단계 및 중합효소 연쇄 반응물-항체 결합물질로부터 발산되는 형광 에너지를 포집하는 단계를 더 포함할 수 있다.
포집된 형광 에너지를 전기적 신호로 전환하는 단계를 더 포함할 수 있다.
감지부는 대조 영역을 더 포함할 수 있다.
감지부의 항체에 특이 결합한 중합효소 연쇄 반응물을 분석하는 단계를 더 포함하되, 항체에 특이 결합한 중합효소 연쇄 반응물을 분석하는 단계는 전기영동법, 스냅샷법, 모세관 전기이동법, 실시간 중합효소 연쇄 반응법, 미세배열 기반 측정법 또는 면역크로마토그래피 측정법을 이용할 수 있다.
상술한 바와 같이, 본 발명의 과제 해결 수단에 따르면 G6PD 유전자를 중합효소 연쇄 반응으로 전처리한 후, 복수의 감지 영역들로 구성된 감지부를 갖는 진단 장치로 G6PD 유전자의 변이형들을 동시에 분석함으로써, 복합적으로 조합된 G6PD 유전자의 변이형들을 구별하여 다중으로 동시에 분석할 수 있다. 이에 따라, G6PD 결핍을 신뢰성있게 신속하고 간편하게 그리고 정확도가 높게 진단을 할 수 있는 G6PD 결핍 진단 장치가 제공될 수 있다.
또한, 본 발명의 과제 해결 수단에 따르면 G6PD 유전자를 중합효소 연쇄 반응으로 전처리한 후, 복수의 감지 영역들로 구성된 감지부로 G6PD 유전자의 변이형들을 분석함으로써, 복합적으로 조합된 G6PD 유전자의 변이형들을 구별하여 다중으로 동시에 분석할 수 있다. 이에 따라, G6PD 결핍을 신뢰성있게 신속하고 간편하게 그리고 정확도가 높게 진단을 할 수 있는 G6PD 결핍 진단 방법이 제공될 수 있다.
도 1은 아시아형 및 아프리카형 G6PD의 유전자 변이형들을 나타내는 도표;
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 G6PD 결핍 진단 장치를 설명하기 위한 개략적인 구성 블록도;
도 3 및 도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 G6PD 결핍 진단 장치에 사용되는 미세유체 칩들을 설명하기 위한 개략적인 평면도들;
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 G6PD 결핍 진단 장치를 이용하여 측방 유동 면역분석 방법으로 아프리카형 G6PD 유전자의 변이형들을 분석한 결과 도표;
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 G6PD 결핍 진단 장치를 이용하여 측방 유동 면역분석 방법으로 아시아형 G6PD 유전자의 변이형들을 분석한 결과 도표;
도 7 및 도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 G6PD 결핍 진단 장치에 사용되는 미세유체 칩으로 아프리카형 G6PD 유전자의 변이형들을 분석한 결과 도표들;
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른 G6PD 결핍 진단 장치에 사용되는 미세유체 칩으로 아시아형 G6PD 유전자의 변이형들을 분석한 결과 도표;
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따른 G6PD 결핍 진단 장치를 이용하여 전기 영동 분석 방법으로 아프리카형 G6PD 유전자의 변이형들을 분석한 결과 도표;
도 11은 본 발명의 일 실시예에 따른 G6PD 결핍 진단 장치를 이용하여 전기 영동 분석 방법으로 아시아형 G6PD 유전자의 변이형들을 분석한 결과 도표.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 G6PD 결핍 진단 장치를 설명하기 위한 개략적인 구성 블록도;
도 3 및 도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 G6PD 결핍 진단 장치에 사용되는 미세유체 칩들을 설명하기 위한 개략적인 평면도들;
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 G6PD 결핍 진단 장치를 이용하여 측방 유동 면역분석 방법으로 아프리카형 G6PD 유전자의 변이형들을 분석한 결과 도표;
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 G6PD 결핍 진단 장치를 이용하여 측방 유동 면역분석 방법으로 아시아형 G6PD 유전자의 변이형들을 분석한 결과 도표;
도 7 및 도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 G6PD 결핍 진단 장치에 사용되는 미세유체 칩으로 아프리카형 G6PD 유전자의 변이형들을 분석한 결과 도표들;
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른 G6PD 결핍 진단 장치에 사용되는 미세유체 칩으로 아시아형 G6PD 유전자의 변이형들을 분석한 결과 도표;
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따른 G6PD 결핍 진단 장치를 이용하여 전기 영동 분석 방법으로 아프리카형 G6PD 유전자의 변이형들을 분석한 결과 도표;
도 11은 본 발명의 일 실시예에 따른 G6PD 결핍 진단 장치를 이용하여 전기 영동 분석 방법으로 아시아형 G6PD 유전자의 변이형들을 분석한 결과 도표.
이하, 첨부된 도면들을 참조하여 본 발명의 바람직한 실시예를 상세히 설명하기로 한다. 본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 첨부되는 도면들과 함께 상세하게 후술되어 있는 실시예를 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 여기서 설명되는 실시예에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 형태로 구체화될 수도 있다. 오히려, 여기서 소개되는 실시예는 개시된 내용이 철저하고 완전해질 수 있도록 그리고 당업자에게 본 발명의 사상이 충분히 전달될 수 있도록 하기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다. 명세서 전문에 걸쳐 동일 참조 부호는 동일 구성 요소를 지칭한다.
본 명세서에서 사용된 용어는 실시예들을 설명하기 위한 것이며 본 발명을 제한하고자 하는 것은 아니다. 본 명세서에서, 단수형은 문구에서 특별히 언급하지 않는 한 복수형도 포함한다. 명세서에서 사용되는 '포함한다(comprises)' 및/또는 '포함하는(comprising)'은 언급된 구성요소, 단계, 동작 및/또는 장치는 하나 이상의 다른 구성요소, 단계, 동작 및/또는 장치의 존재 또는 추가를 배제하지 않는다. 또한, 바람직한 실시예에 따른 것이기 때문에, 설명의 순서에 따라 제시되는 참조 부호는 그 순서에 반드시 한정되지는 않는다. 이에 더하여, 본 명세서에서, 어떤 막이 다른 막 또는 기판 상에 있다고 언급되는 경우에 그것은 다른 막 또는 기판 상에 직접 형성될 수 있거나 또는 그들 사이에 제 3의 막이 개재될 수도 있다는 것을 의미한다.
또한, 본 명세서에서 기술하는 실시예들은 본 발명의 이상적인 예시도인 단면도 및/또는 평면도들을 참고하여 설명될 것이다. 도면들에 있어서, 막 및 영역들의 두께는 기술적 내용의 효과적인 설명을 위해 과장된 것이다. 따라서, 제조 기술 및/또는 허용 오차 등에 의해 예시도의 형태가 변형될 수 있다. 따라서, 본 발명의 실시예들은 도시된 특정 형태로 제한되는 것이 아니라 제조 공정에 따라 생성되는 형태의 변화도 포함하는 것이다. 예를 들면, 직각으로 도시된 식각 영역은 라운드지거나 소정 곡률을 가지는 형태일 수 있다. 따라서, 도면에서 예시된 영역들은 개략적인 속성을 가지며, 도면에서 예시된 영역들의 모양은 장치의 영역의 특정 형태를 예시하기 위한 것이며 발명의 범주를 제한하기 위한 것이 아니다.
도 1은 아시아형 및 아프리카형 G6PD의 유전자 변이형들을 나타내는 도표이고, 그리고 표 2 및 표 3은 각각 아프리카형 G6PD의 유전자 변이형들 및 아시아형 G6PD의 유전자 변이형들을 나타내는 표들이다.
| G6PD 유전자의 유전적 다형 | WHO classification (Phenotype) |
| A- (376 A → G, 202 G → A) | Class-III |
| A- (376 A → G, 968 T → C) | Class-III |
| A- (376 A → G, 680 G → T) | Class-III |
| A- (376 A → G, 542 A → T) | Class-III |
| Mediterranean (563 C → T) | Class-II |
도 1 및 표 2를 참조하면, 아프리카에서 발생하는 아프리카형 G6PD의 유전자 변이형들은 A- (202 G → A), A- (376 A → G), A- (542 A → T), Mediterranean (563 C → T), A- (680 G → T) 및 A- (968 T → C)의 6 가지이다.
| G6PD 유전자의 유전적 다형 | WHO classification (Phenotype) |
| Vanua Lava (383 T → C) | Class-III |
| Mahidol (487 G → A) | Class-II |
| Coimbra (592 C → T) | Class-II |
| Viangchan (871 G → A) | Class-III |
| Union (1360 C → T) | Class-II |
| Canton (1376 G → A) | Class-II |
| Kaiping (1388 G → A) | Class-II |
도 1 및 표 3을 참조하면, 동남아시아에서 발생하는 아시아형 G6PD의 유전자 변이형들은 Vanua Lava (383 T → C), Mahidol (487 G → A), Coimbra (592 C → T), Viangchan (871 G → A), Union (1360 C → T), Canton (1376 G → A) 및 Kaiping (1388 G → A)의 7 가지이다.
본 발명의 기술적 특징들이, 미세유체 칩(microfluidic chip)을 사용하는 진단 장치를 예로 들어 설명될 것이다. 하지만, 본원 발명의 기술적 사상은 예시된 미세유체 칩을 사용하는 진단 장치에 한정되지 않으며, G6PD 유전자의 스닙을 측정할 수 있는 진단 장치들에 적용될 수 있다. 예를 들면, 중합효소 연쇄 반응물을 분석할 수 있는 전기영동법(electrophoresis), 스냅샷법(snapshot), 모세관 전기이동법(capillary electrophoresis), 실시간 중합효소 연쇄 반응법(real time PCR), 미세배열 기반 측정법(microarray-based assay) 또는 면역크로마토그래피 측정법(immunochromatography assay) 등을 이용하는 진단 장치를 통해서도 구현될 수 있다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 G6PD 결핍 진단 장치를 설명하기 위한 개략적인 구성 블록도이다.
도 2를 참조하면, G6PD 결핍 진단 장치(100)는 미세유체 칩(110), 광원부(120), 센서부(sensing unit, 130), 측정부(140) 및 중합효소 연쇄 반응부(150)를 포함한다.
미세유체 칩(110)은 복수의 감지 영역들(도 3의 113a, 113b, 113c, 113d, 113e, 113f 또는 도 4의 113g, 113h, 113i, 113j, 113k, 113l, 113m 참조)로 구성된 감지부를 포함할 수 있다. 감지 영역들은 생체시료에 포함된 G6PD 유전자의 변이형들(표 1 및 표 2 참조)을 각각 검출하기 위한 각각의 항체를 가질 수 있다. 항체는 생체시료에 포함된 G6PD 유전자의 변이형들로부터 중합효소 연쇄 반응(PCR)을 통해 형성된 중합효소 연쇄 반응물과 특이적으로 결합하여 중합효소 연쇄 반응물-항체 결합물질을 형성할 수 있다.
미세유체 칩(110)의 감지부는 복수의 감지 영역들로 구성되기 때문에, 미세유체 칩(110)은 생체시료에 포함된 G6PD 유전자의 변이형들을 동시에 검출할 수 있다.
중합효소 연쇄 반응물-항체 결합물질의 중합효소 연쇄 반응물은 변이형-합텐(hapten) 결합물질일 수 있다. 합텐은 펩타이드(peptide), 나노 입자(nano particle), 형광 입자(fluorescent particle) 또는 이들의 조합 중에서 선택된 적어도 하나를 포함할 수 있다. 펩타이드 및 형광 입자는 각각 아래의 표 3 및 표 4와 같은 것들 중 적어도 하나를 포함할 수 있다. 합텐은 광원부(120)로부터 제공되는 광에 의해 형광 에너지를 발생시킬 수 있다. 합텐이 형광에너지를 발생시키는 것은 직접 형광 발광, 형광 공명 에너지 전이(Fluorescence Resonance Energy Transfer : FRET) 효과 등과 같은 다양한 방법에 의한 것일 수 있다. 형광 공명 에너지 전이 효과를 이용할 경우, 형광 입자는 양자 효율이 높은 형광체가 사용될 수 있고, 그리고 나노 입자는 금(Au), 은(Ag), 구리(Cu), 알루미늄(Al), 니켈(Ni), 코발트(Co), 철(Fe), 아연(Zn) 및 망간(Mn) 중에서 선택된 적어도 하나를 포함하는 금속 나노 입자일 수 있다.
| 펩타이드 | 펩타이드 아미노산 서열 정보 |
| 1 | TLCHVTHGGGC |
| 2 | CPPGPPTGLALSALA |
| 3 | SRYSKKFKPEIAIRPK |
| 4 | EKFHQIEKEFSEVEGR |
| 5 | GLRNSPQGERRRKKRG |
| 6 | AFPQMTKSYRNPRNK |
| 7 | SVATEDINRTFKPLIG |
| 상품명 | 리포터 염료를 위한 형광 최대값 |
| Orgon Green® 488-X | 517nm |
| G-FAM 플루오레센 | 520nm |
| Rhodamine Green™-X | 527nm |
| Orgon Green® 514 | 530nm |
| TETTM | 536nm |
| JOE | 547nm |
| HEX™ | 556nm |
| Cy3™ | 563nm |
| TAMRA™ | 573nm |
| Rhodamine Red™-X | 580nm |
| ROX™ | 602nm |
| Texas Red®-X | 603nm |
| Bodipy®630/650-X | 640nm |
| Bodipy®650/665-X+ | 660nm |
| Cy5™ | 662nm |
| Cy5.5™ | 707nm |
미세유체 칩(110)은 유체 형태의 시료, 즉, 중합효소 연쇄 반응물을 포함하는 용액 등과 같은 시료의 이동, 정지, 속도 변화, 시험 용액 등과 같은 다른 유체와의 혼합, 분리 및 교체 등과 같은 다양한 동작들이 가능할 수 있다. 미세유체 칩(110)은 유체의 흐름에 영향을 줄 수 있는 변수인 유체 채널(channel)의 폭, 깊이, 길이 등, 재료로 사용되는 고분자 물질의 종류, 검출에 사용되는 유체의 종류, 접촉 각도 등을 고려하여 구현될 수 있다. 또한, 미세유체 칩(110)은 유체의 능률적인 수송을 위한 펌프(pump) 및 밸브(valve)의 종류와 방식, 그리고 설치되어 있는 위치 등의 변수를 고려하여 구현될 수 있다.
진단하고자 하는 환자로부터 채취한 생체시료는 중합효소 연쇄 반응부(150)에서 전처리 과정을 거친 후, 중합효소 연쇄 반응물을 포함하는 용액 형태로 미세유체 칩(110)에 주입되고, 중합효소 연쇄 반응물은 유체 채널을 통해 이동하여 감지부의 감지 영역들 각각의 항체와 특이적으로 결합하여 중합효소 연쇄 반응물-항체 결합물질을 형성한다.
광원부(120)는 미세유체 칩(110)에 평면 균일 광을 제공할 수 있다. 광원부(120)에 의해 제공된 평면 균일 광은 미세유체 칩(110)의 감지부의 감지 영역들 각각의 중합효소 연쇄 반응물-항체 결합물질의 중합효소 연쇄 반응물인 변이형-합텐 결합물질의 합텐으로부터 형광 에너지를 발생시킬 수 있다. 미세유체 칩(110)의 감지부의 감지 영역들 각각의 중합효소 연쇄 반응물-항체 결합물질의 합텐으로부터 발생하는 형광 에너지를 이용하여 생체시료의 G6PD 유전자의 복수의 변이들에 대한 감염 여부를 측정하기 때문에, 생체시료의 G6PD 유전자의 복수의 변이들을 동시에 검출할 수 있다.
광원부(120)로부터 미세유체 칩(110)에 평면 균일 광이 제공되기 때문에, 중합효소 연쇄 반응물-항체 결합물질의 합텐으로부터 발생하는 형광 에너지는 2차원 형태로 센서부(130)에 의해 감지될 수 있다.
광원부(120)는 고휘도 발광 다이오드(Light Emitting Diode : LED) 및 도광판을 포함할 수 있다. 고휘도 발광 다이오드 및 도광판에 의해 다파장 평면 균일 광이 생성될 수 있다. 미세유체 칩(110)에 단일파장 평면 균일 광을 제공하기 위해 광원부(120)와 미세유체 칩(110) 사이에 광 필터(125)가 제공될 수 있다. 광원부(120)로부터 생성된 다파장 평면 균일 광은 광 필터(125)를 통과하면서 특정의 단일파장 평면 균일 광으로 바뀔 수 있다. 광 필터(125)는 초퍼(chopper) 형태일 수 있다. 즉, 여러 종류의 광 필터들(125)이 하나의 초퍼에 구비된 형태일 수 있다. 이에 따라, 미세유체 칩(110)에 여러 가지 특정의 단일파장 평면 균일 광이 제공될 수 있다.
미세유체 칩(110)이 복수의 감지 영역들로 구성된 감지부를 갖기 때문에, 복수의 감지 영역들로부터 서로 다른 형광 에너지들이 발생할 수 있다. 이에 따라, 생체시료에 포함된 G6PD 유전자의 복수의 변이형들 각각에 대한 형광 에너지가 발생할 수 있다.
센서부(130)는, 앞서 설명되어진 것과 같이, 미세유체 칩(110)의 감지부의 중합효소 연쇄 반응물-항체 결합물질의 합텐으로부터 발생하는 형광 에너지를 2차원 형태로 감지할 수 있다. 센서부(130)는 특정한 방향성 없이 방사상으로 발산되는 형광 에너지를 감지하기 위해 미세유체 칩(110)과의 거리를 가깝게 유지하고, 삼면을 둘러싼 형태일 수 있다. 또한, 센서부(130)는 고감도 검출기를 포함할 수 있다.
측정부(140)는 센서부(130)에 의해 감지된 형광 에너지를 전기적 신호로 전환할 수 있다. 전기적 신호는 전류 피크(peak) 형태일 수 있다. 측정부(140)는 센서부(130)에 의해 감지된 형광 에너지를 전기적 신호를 전환하여 축적할 수 있다. 측정부(140)는 전류 피크 형태의 전기적 신호를 축적하여 측정하기 때문에, 미세유체 칩(110)의 감지부의 중합효소 연쇄 반응물-항체 결합물질의 합텐으로부터 발생하는 형광 에너지에 대한 검출 감도가 높아질 수 있다.
미세유체 칩(110)이 복수의 감지 영역들로 구성된 감지부를 갖기 때문에, 복수의 감지 영역들로부터 서로 다른 형광 에너지들이 발생할 수 있다. 이러한 서로 다른 형광 에너지들 각각은 서로 다른 전류 피크 형태의 전기적 신호들로 전환될 수 있다. 이에 따라, 생체시료에 포함된 G6PD 유전자의 복수의 변이형들 각각에 대한 전류 피크들을 포함하는 전기적 신호가 측정될 수 있다.
측정부(140)는 전류 피크 형태의 전기적 신호를 해석하여 각각의 전류 피크들에 대응하는 생체시료에 포함된 G6PD 유전자의 복수의 변이형들의 종류 및 G6PD 유전자 복수의 변이형들의 정도를 분석할 수 있다. 이에 따라, 생체시료에 포함된 G6PD 유전자의 복수의 변이형들 각각에 대한 정성적 및 정량적 분석이 가능해 질 수 있다. 또한, 생체시료에 포함된 G6PD 유전자의 복수의 변이형들을 동시에 분석하는 것이 가능해 질 수 있다.
중합효소 연쇄 반응부(150)는 미세유체 칩(110)의 감지부로 생체시료에 포함된 G6PD 유전자의 복수의 변이형들에 대한 중합효소 연쇄 반응물을 제공할 수 있다. 중합효소 연쇄 반응물은 변이형-합텐 결합물질일 수 있다. 중합효소 연쇄 반응물은 생체시료를 대립형질 특정(allele specific) 중합효소 연쇄 반응 방법 또는 다중 대립형질 특정(multiplex allele specific) 중합효소 연쇄 반응 방법으로 처리하는 것에 의해 형성될 수 있다. 대립형질 특정 중합효소 연쇄 반응 방법 또는 다중 대립형질 특정 중합효소 연쇄 반응 방법은 중합효소, 프라이머 세트(primer set) 및 사전혼합물(premix)로 구성된 용액을 포함하는 중합효소 연쇄 반응부(150)에 생체시료를 투입하여 중합효소 연쇄 반응을 진행하는 것일 수 있다. 프라이머 세트는 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)를 포함할 수 있다. 프라이머 세트는 합텐이 표지된 것(hapten labeled)일 수 있다. 본 발명의 실시예에 따른 프라이머 세트는 아래 표 5 또는/및 표 6과 같은 프라이머들을 포함할 수 있다. 표 5 및 표 6 각각의 프라이머 세트는 각각 아프리카형 G6PD 결핍 진단 장치 및 아시아형 G6PD 결핍 진단 장치에 사용될 수 있다. 또는 표 5 및 표 6의 프라이머들을 모두 포함하는 프라이머 세트가 사용될 수 있다. 중합효소는 Taq 중합효소일 수 있다. 사전혼합물은 주형(template) RNA, dNTP(deoxyribonucleotide) 및 완충(buffer) 용액을 포함할 수 있다.
| No. | Primer name | Sequences (5' → 3') |
| 1 | Exon4 202 (G → A)_F | CAGGAGATGCGTTTATGTCTTC |
| Exon4 202 (G → A)_R | CGGGAACGGGCATAGCCCAT | |
| 2 | Exon5 376 (A → G)_F | GCGCCTCAACAGCCACATGG |
| Exon5 376 (A → G)_R | TTCGTGGAGCAACGCTGCCA | |
| 3 | Exon6 542 (A → T)_F | GCAGCTCTGATCCTCACTCC |
| Exon6 542 (A → T)_R | GATGTGGTTGGACAGCCGGA | |
| 4 | Exon6 563 (C → T)_F | GCAGCTCTGATCCTCACTCC |
| Exon6 563 (C → T)_R | GTCCTCACGGAACAGGGAGA | |
| 5 | Exon7 680 (G → T)_F | GGCCCCATCTGGAACCGGT |
| Exon7 680 (G → T)_R | TCCATGGCCACCAGACACAG | |
| 6 | Exon9 968 (T → C)_F | GAGGCCACCAAAGGGTACCC |
| Exon9 968 (T → C)_R | TCTCAGGGTGTGGACCAGTG |
* 밑줄 친 문자는 스닙을 표시함.
| No. | Primer name | Sequences (5'→3') |
| 1 | Exon5 383 (T → C)_F | TGTCTGTCCGTGTCTCCCAG |
| Exon5 383 (T → C)_R | GCCTGTGACCCCAGGTGGG | |
| 2 | Exon6 487 (G → A)_F | CTCCGGGCTCCCAGCAGAA |
| Exon6 487 (G → A)_R | GTCACCCTTGTCTGAGTTCTG | |
| 3 | Exon6 592 (C → T)_F | TCCGTGAGGACCAGATCTACT |
| Exon6 592 (C → T)_R | GTCACCCTTGTCTGAGTTCTG | |
| 4 | Exon9 871 (G → A)_F | TTGGCTTTCTCTCAGGTCAAGA |
| Exon9 871 (G → A)_R | GATGAAGGGCACCCCTACGT | |
| 5 | Exon11 1360 (C → T)_F | GAGCCAGATGCACTTCGTGT |
| Exon11 1360 (C → T)_R | TGGAGTGAGTGGAGGAGGTG | |
| 6 | Exon12 1376 (G → A)_F | CCCTCAGCGACGAGCTCCA |
| Exon12 1376 (G → A)_R | TGGAGTGAGTGGAGGAGGTG | |
| 7 | Exon12 1388 (G → A)_F | CAACGAGGCCGTGTACACCA |
| Exon12 1388 (G → A)_R | GCAGCAGTGGGGTGAAAATAT |
* 밑줄 친 문자는 스닙을 표시함.
상기한 프라이머들은 아프리카형 G6PD 유전자의 6 가지 변이형들과 아시아형 G6PD 유전자의 7 가지 변이형들을 분석하기 위한 각각의 프라이머를 설계(design)하고, 각각의 스닙을 포함하는 G6PD DNA와 설계된 프라이머들로 시험(test)하여 스닙을 특이적으로 분석할 수 있는 프라이머들로 결정된 것이다. 확정된 각각의 대립형질 특이 프라이머를 아프리카형 G6PD 유전자의 6 가지 변이형들 및 아시아형 G6PD 유전자의 7 가지 변이형들과 섞어 다중 대립형질 특이 중합효소 연쇄 반응 조건을 확립하였다. 비특이적으로 증폭을 보이는 대립형질 특이 프라이머는 다시 설계하여 이러한 과정을 반복하여 특이적 증폭을 보이도록 하였다.
중합효소 연쇄 반응부(150)는 생체시료에 포함된 G6PD 유전자의 변이형들 동시에 증폭할 수 있는 하나의 시험관일 수 있다. 중합효소 연쇄 반응부(150) 내에서 프라이머의 서열은 G6PD 유전자의 RNA를 증폭하는 과정인 중합효소 반응에 의해 중합효소 연쇄 반응물로 형성될 수 있다.
도 3 및 도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 G6PD 결핍 진단 장치에 사용되는 미세유체 칩들을 설명하기 위한 개략적인 평면도들이다.
도 3을 참조하면, 아프리카형 G6PD 결핍 진단 장치에 사용되는 미세유체 칩(110A)은 유체 형태의 생체시료, 즉 중합효소 연쇄 반응물을 포함하는 시료의 이동, 정지, 속도 변화, 시험 용액 등과 같은 다른 유체와의 혼합, 분리 및 교체 등과 같은 다양한 동작들이 가능할 수 있다. 본 발명의 실시예에 따른 미세유체 칩(110A)은 기판 몸체의 내부에 시료 투입구(111), 유로(112) 및 제 1 내지 제 6 감지 영역들(113a, 113b, 113c, 113d, 113e, 113f)을 포함할 수 있다. 아프리카형 G6PD 유전자의 변이형들은 6 가지이기 때문에, 미세유체 칩은 6개의 감지 영역들을 가질 수 있다. 미세유체 칩(110A)은 제 1 내지 제 6 감지 영역들(113a, 113b, 113c, 113d, 113e, 113f)로부터 검출되는 결과값들에 대한 검증을 위한 대조 영역(113r)을 더 포함할 수 있다.
시료 투입구(111)는 미세유체 칩(110A)으로 중합효소 연쇄 반응물을 포함하는 시료를 투입하기 위한 통로 역할을 하는 동시에, 투입된 중합효소 연쇄 반응물을 포함하는 시료를 제 1 내지 제 6 감지 영역들(113a, 113b, 113c, 113d, 113e, 113f)로 이송하는 유로 역할을 할 수 있다. 본 발명의 실시예에 따른 미세유체 칩(110A)은 모세관력(capillary force)을 이용하여 중합효소 연쇄 반응물을 포함하는 시료를 이송시킬 수 있다. 하지만, 본 발명의 실시예에 따른 미세유체 칩(110A)은 모세관력 외의 다른 다양한 방법들을 이용하여 중합효소 연쇄 반응물을 포함하는 시료를 이송시킬 수도 있다.
유로(112)는 중합효소 연쇄 반응물을 포함하는 시료를 제 1 내지 제 6 감지 영역들(113a, 113b, 113c, 113d, 113e, 113f)로 이송할 수 있다. 유로(112)는 제 1 내지 제 6 감지 영역들(113a, 113b, 113c, 113d, 113e, 113f)로 중합효소 연쇄 반응물을 포함하는 시료를 이송하기 위해 제 1 내지 제 6 감지 영역들(113a, 113b, 113c, 113d, 113e, 113f)을 가로지르는 직선 형태를 가질 수 있다. 이와는 달리, 제 1 내지 제 6 감지 영역들(113a, 113b, 113c, 113d, 113e, 113f) 또는/및 대조 영역(113r)이 직렬로 배치되지 않을 경우, 유로(112)는 제 1 내지 제 6 감지 영역들(113a, 113b, 113c, 113d, 113e, 113f) 또는/및 대조 영역(113r) 각각에 따로 연결된 분기형 유로일 수 있다. 본 발명의 실시예에 따른 미세유체 칩(110A)은 모세관력을 이용하여 중합효소 연쇄 반응물을 포함하는 시료를 이송시킬 수 있다. 하지만, 본 발명의 실시예에 따른 미세유체 칩(110A)은 모세관력 외의 다른 다양한 방법들을 이용하여 중합효소 연쇄 반응물을 포함하는 시료를 이송시킬 수도 있다.
제 1 내지 제 6 감지 영역들(113a, 113b, 113c, 113d, 113e, 113f) 각각에 포함된 항체는 이송된 중합효소 연쇄 반응물을 포함하는 유체의 중합효소 연쇄 반응물과 특이적으로 결합할 수 있다.
도 4를 참조하면, 아시아형 G6PD 결핍 진단 장치에 사용되는 미세유체 칩(110B)은 유체 형태의 생체시료, 즉 중합효소 연쇄 반응물을 포함하는 시료의 이동, 정지, 속도 변화, 시험 용액 등과 같은 다른 유체와의 혼합, 분리 및 교체 등과 같은 다양한 동작들이 가능할 수 있다. 본 발명의 실시예에 따른 미세유체 칩(110B)은 기판 몸체의 내부에 시료 투입구(111), 유로(112) 및 제 1 내지 제 7 감지 영역들(113g, 113h, 113i, 113j, 113k, 113l, 113m)을 포함할 수 있다. 아프리카형 G6PD 유전자의 변이형들은 6 가지이기 때문에, 미세유체 칩은 6개의 감지 영역들을 가질 수 있다. 미세유체 칩(110B)은 제 1 내지 제 7 감지 영역들(113g, 113h, 113i, 113j, 113k, 113l, 113m)로부터 검출되는 결과값들에 대한 검증을 위한 대조 영역(113r)을 더 포함할 수 있다.
시료 투입구(111)는 미세유체 칩(110B)으로 중합효소 연쇄 반응물을 포함하는 시료를 투입하기 위한 통로 역할을 하는 동시에, 투입된 중합효소 연쇄 반응물을 포함하는 시료를 제 1 내지 제 7 감지 영역들(113g, 113h, 113i, 113j, 113k, 113l, 113m)로 이송하는 유로 역할을 할 수 있다. 본 발명의 실시예에 따른 미세유체 칩(110B)은 모세관력을 이용하여 중합효소 연쇄 반응물을 포함하는 시료를 이송시킬 수 있다. 하지만, 본 발명의 실시예에 따른 미세유체 칩(110B)은 모세관력 외의 다른 다양한 방법들을 이용하여 중합효소 연쇄 반응물을 포함하는 시료를 이송시킬 수도 있다.
유로(112)는 중합효소 연쇄 반응물을 포함하는 시료를 제 1 내지 제 7 감지 영역들(113g, 113h, 113i, 113j, 113k, 113l, 113m)로 이송할 수 있다. 유로(112)는 제 1 내지 제 7 감지 영역들(113g, 113h, 113i, 113j, 113k, 113l, 113m)로 중합효소 연쇄 반응물을 포함하는 시료를 이송하기 위해 제 1 내지 제 7 감지 영역들(113g, 113h, 113i, 113j, 113k, 113l, 113m)을 가로지르는 직선 형태를 가질 수 있다. 이와는 달리, 제 1 내지 제 7 감지 영역들(113g, 113h, 113i, 113j, 113k, 113l, 113m) 또는/및 대조 영역(113r)이 직렬로 배치되지 않을 경우, 유로(112)는 제 1 내지 제 7 감지 영역들(113g, 113h, 113i, 113j, 113k, 113l, 113m) 또는/및 대조 영역(113r) 각각에 따로 연결된 분기형 유로일 수 있다. 본 발명의 실시예에 따른 미세유체 칩(110B)은 모세관력을 이용하여 중합효소 연쇄 반응물을 포함하는 시료를 이송시킬 수 있다. 하지만, 본 발명의 실시예에 따른 미세유체 칩(110B)은 모세관력 외의 다른 다양한 방법들을 이용하여 중합효소 연쇄 반응물을 포함하는 시료를 이송시킬 수도 있다.
제 1 내지 제 7 감지 영역들(113g, 113h, 113i, 113j, 113k, 113l, 113m) 각각에 포함된 항체는 이송된 중합효소 연쇄 반응물을 포함하는 유체의 중합효소 연쇄 반응물과 특이적으로 결합할 수 있다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 G6PD 결핍 진단 장치를 이용하여 측방 유동 면역분석(lateral flow Immunoassay) 방법으로 아프리카형 G6PD 유전자의 변이형들을 분석한 결과 도표이다.
도 5를 참조하면, 아프리카형 G6PD 유전자의 변이형이 없을 경우, 미세유체 칩(도 3의 110A 참조)의 감지 영역들에는 아무런 변화가 일어나지 않는 것(No Mutation)을 알 수 있다. 아프리카형 G6PD 유전자의 변이형들이 단일 변이형인 경우, 미세유체 칩의 감지 영역들에는 그에 해당하는 각각의 G6PD 유전자의 변이형이 검출되는 것(1 Mutation)을 알 수 있다. 그리고 아프리카형 G6PD 유전자의 변이형들이 이중 변이형인 경우, 미세유체 칩의 감지 영역들에는 그에 해당하는 G6PD 유전자의 변이형들이 검출되는 것(2 Mutation)을 알 수 있다. 이때, 아프리카형 G6PD 유전자의 변이형들이 이중 변이형인 경우, Mediterranean (563 C → T)는 검출되지 않음을 알 수 있다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 G6PD 결핍 진단 장치를 이용하여 측방 유동 면역분석 방법으로 아시아형 G6PD 유전자의 변이형들을 분석한 결과 도표이다.
도 6을 참조하면, 아시아형 G6PD 유전자의 변이형이 없을 경우, 미세유체 칩(도 4의 110B 참조)의 감지 영역들에는 아무런 변화가 일어나지 않는 것(No Mutation)을 알 수 있다. 그리고 아시아형 G6PD 유전자의 변이형들이 존재할 경우, 미세유체 칩의 감지 영역들에는 그에 해당하는 각각의 G6PD 유전자의 변이형이 검출되는 것(1 Mutation)을 알 수 있다.
도 7 및 도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 G6PD 결핍 진단 장치에 사용되는 미세유체 칩으로 아프리카형 G6PD 유전자의 변이형들을 분석한 결과 도표들이다.
도 7을 참조하면, 아프리카형 G6PD 유전자의 변이형이 없을 경우, 미세유체 칩의 감지 영역들에는 아무런 변화가 일어나지 않는 것(No Mutation)을 알 수 있다. 아프리카형 G6PD 유전자의 변이형들이 단일 변이형인 경우, 미세유체 칩의 감지 영역들에는 그에 해당하는 각각의 G6PD 유전자의 변이형이 검출되는 것(1 Mutation)을 알 수 있다.
도 8을 참조하면, 아프리카형 G6PD 유전자의 변이형들이 이중 변이형인 경우, 미세유체 칩의 감지 영역들에는 그에 해당하는 G6PD 유전자의 변이형들이 검출되는 것(2 Mutation)을 알 수 있다. 이때, 아프리카형 G6PD 유전자의 변이형들이 이중 변이형인 경우, Mediterranean (563 C → T)는 검출되지 않음을 알 수 있다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른 G6PD 결핍 진단 장치에 사용되는 미세유체 칩으로 아시아형 G6PD 유전자의 변이형들을 분석한 결과 도표이다.
도 9를 참조하면, 아시아형 G6PD 유전자의 변이형이 없을 경우, 미세유체 칩(도 4의 110B 참조)의 감지 영역들에는 아무런 변화가 일어나지 않는 것(No Mutation)을 알 수 있다. 그리고 아시아형 G6PD 유전자의 변이형들이 존재할 경우, 미세유체 칩의 감지 영역들에는 그에 해당하는 각각의 G6PD 유전자의 변이형이 검출되는 것(1 Mutation)을 알 수 있다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따른 G6PD 결핍 진단 장치를 이용하여 전기 영동 분석 방법으로 아프리카형 G6PD 유전자의 변이형들을 분석한 결과 도표이다.
도 10을 참조하면, 아프리카형 G6PD 유전자의 변이형이 없을 경우, 크로마토그래피의 감지 영역들에는 아무런 변화가 일어나지 않는 것(No Mutation)을 알 수 있다. 아프리카형 G6PD 유전자의 변이형들이 단일 변이형인 경우, 크로마토그패피의 감지 영역들에는 그에 해당하는 각각의 G6PD 유전자의 변이형이 검출되는 것(1 Mutation)을 알 수 있다. 그리고 아프리카형 G6PD 유전자의 변이형들이 이중 변이형인 경우, 크로마토그래피의 감지 영역들에는 그에 해당하는 G6PD 유전자의 변이형들이 검출되는 것(2 Mutation)을 알 수 있다. 이때, 아프리카형 G6PD 유전자의 변이형들이 이중 변이형인 경우, Mediterranean (563 C → T)는 검출되지 않음을 알 수 있다.
도 11은 본 발명의 일 실시예에 따른 G6PD 결핍 진단 장치를 이용하여 전기 영동 분석 방법으로 아시아형 G6PD 유전자의 변이형들을 분석한 결과 도표이다.
도 11을 참조하면, 아시아형 G6PD 유전자의 변이형이 없을 경우, 크로마토그래피의 감지 영역들에는 아무런 변화가 일어나지 않는 것(No Mutation)을 알 수 있다. 그리고 아시아형 G6PD 유전자의 변이형들이 존재할 경우, 크로마토그래피의 감지 영역들에는 그에 해당하는 각각의 G6PD 유전자의 변이형이 검출되는 것(1 Mutation)을 알 수 있다.
본 발명의 실시예에 따른 G6PD 결핍 진단 장치는 G6PD 유전자를 중합효소 연쇄 반응 과정을 하나의 시험관에서 전처리 한 후, 복수의 감지 영역들로 구성된 감지부를 갖는 진단 장치로 G6PD 유전자의 변이형들을 동시에 분석함으로써, 복합적으로 조합된 G6PD 유전자의 변이형들을 구별하여 다중으로 동시에 분석할 수 있다. 이에 따라, G6PD 결핍을 신뢰성있게 신속하고 간편하게 그리고 정확도가 높게 진단을 할 수 있는 G6PD 결핍 진단 장치가 제공될 수 있다.
특히, 본 발명의 실시예에 따른 G6PD 결핍 진단 장치는 말라리아가 높은 빈도로 발생하는 지역에서 항말라리아 약물을 처방하기 전에 G6PD 유전자의 유전적 다형성을 분석하여 얻은 결과를 통해, G6PD 결핍증을 갖는 사람에게 산화 스트레스를 일으키는 항말라리아 약물의 처방을 방지함으로써, 용혈성 빈혈 발생을 예방하는 역할을 할 수 있다.
또한, 본 발명의 실시예에 따른 G6PD 결핍 진단 장치는 G6PD 유전자의 유전적 다형성을 분석하여 얻은 결과를 통해, G6PD 결핍증을 갖는 사람에게 산화 스트레스를 일으키는 식품 섭취를 피하도록 안내함으로써, 용혈성 빈혈 발생을 예방하도록 널리 활용될 수 있다. 더 넓은 관점에서는, 본 발명의 실시예에 따른 G6PD 결핍 진단 장치는 G6PD 유전자의 유전적 다형성 분석을 통해 G6PD에 의해 대사되는 약물의 개발 단계에서 필수적으로 유용하게 사용될 수 있다.
이에 더하여, 본 발명의 실시예에 따른 G6PD 결핍 진단 장치는 유전자의 결함에 의해 일어날 수 있는 유전병의 진단도 가능할 수 있다. 이에 따라, 다중 중합효소 연쇄 반응을 통해 G6PD 유전자의 스닙을 분석하여 G6PD 결핍증을 진단할 뿐만 아니라, 다른 유전성 질환의 진단 및 분석할 수 있는 진단 장치에 응용이 가능할 수 이싸다. 분석 및 G호흡기 바이러스 진단 방법은 생체시료를 역전사 과정과 중합효소 연쇄 반응 과정을 하나의 시험관에서 수행하는 단일 단계 역전사 중합효소 연쇄 반응으로 전처리 한 후, 5개의 감지 영역들로 구성된 감지부를 갖는 미세유체 칩으로 인플루엔자 A형 바이러스의 5가지 아형들(H1N1, H3N2, H5N1, H7N3 및 H9N2)을 동시에 분석함으로써, 호흡기 질환 의심 환자의 생체시료로부터 RNA 및 DNA를 직접 검출하여 매우 신속하고 정확하게 다양한 호흡기 바이러스를 동시에 진단할 수 있다. 이에 따라, 본 발명의 실시예에 따른 호흡기 바이러스 진단 방법은 유행 호흡기 바이러스 주의 확보 및 이의 분자생물학적 특성 연구에 이용될 수 있다.
게다가, 본 발명의 실시예에 따른 호흡기 바이러스 진단 장치는 신종 인플루엔자, 조류 인플루엔자, 계절 인플루엔자, 호흡기 세포 융합 바이러스, 중증 급성 호흡기 증후군 등의 호흡기 감염 질환의 실시간 규명 및 조기 확산을 예방하는 데 사용될 수 있고, 그리고 식품 원인균 감염 검색 및 동·식물 병충해 안전 관리에 적용될 수 있고, 그리고 축산물 생산 이력 추적 및 특용작물 관리와 같은 농축산물 원산지 현장 감별 등에도 적용 가능할 수 있다. 또한, 친자 신원 규명 및 범죄자 규명 등과 같은 법의학에도 응용 가능하며, 그 밖에도 환경 모니터링, 생화학 전쟁 등과 같은 군사적 용도에도 적용 가능하기 때문에, 그 파급 효과가 클 수 있다.
이상, 첨부된 도면들을 참조하여 본 발명의 실시예들을 설명하였지만, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들에는 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
100 : 진단 장치 110, 110A, 110B : 미세유체 칩
111 : 시료 투입구 112 : 유로
113a, 113b, 113c, 113d, 113e, 113f, 113g, 113h, 113i, 113j, 113k, 113l, 113m : 감지 영역
113r : 대조 영역 120 : 광원부
125 : 광 필터 130 : 센서부
140 : 측정부 150 : 중합효소 연쇄 반응부
111 : 시료 투입구 112 : 유로
113a, 113b, 113c, 113d, 113e, 113f, 113g, 113h, 113i, 113j, 113k, 113l, 113m : 감지 영역
113r : 대조 영역 120 : 광원부
125 : 광 필터 130 : 센서부
140 : 측정부 150 : 중합효소 연쇄 반응부
Claims (34)
- G6PD 유전자의 변이형들을 각각 검출하기 위한 각각의 항체가 제공된 복수의 감지 영역들로 구성된 감지부; 및
상기 감지부로 G6PD 유전자에 포함된 상기 변이형들에 대한 중합효소 연쇄 반응물을 제공하기 위한 중합효소 연쇄 반응부를 포함하는 G6PD 결핍 진단 장치. - 제 1항에 있어서,
상기 중합효소 연쇄 반응물은 변이형-합텐 결합물질인 것을 특징으로 하는 G6PD 결핍 진단 장치. - 제 2항에 있어서,
상기 합텐은 펩타이드, 나노 입자, 형광 입자 또는 이들의 조합 중에서 선택된 적어도 하나를 포함하는 것을 특징으로 하는 G6PD 결핍 진단 장치. - 제 1항에 있어서,
상기 중합효소 연쇄 반응물은 상기 G6PD 유전자를 대립형질 특정 중합효소 연쇄 반응 방법 또는 다중 대립형질 특정 중합효소 연쇄 반응 방법으로 처리하는 것에 의해 형성되는 것을 특징으로 하는 G6PD 결핍 진단 장치. - 제 1항에 있어서,
상기 중합효소 연쇄 반응부는 중합효소, 프라이머 세트 및 사전혼합물을 포함하는 것을 특징으로 하는 G6PD 결핍 진단 장치. - 제 5항에 있어서,
상기 프라이머 세트는 올리고뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 G6PD 결핍 진단 장치. - 제 5항에 있어서,
상기 중합효소는 Taq 중합효소인 것을 특징으로 하는 G6PD 결핍 진단 장치. - 제 5항에 있어서,
상기 사전혼합물은 주형 RNA, dNTP 및 완충 용액을 포함하는 것을 특징으로 하는 G6PD 결핍 진단 장치. - 제 1항에 있어서,
상기 감지부는 6개의 감지 영역들을 포함하되,
상기 변이형들은 아프리카에서 발생하는 A- (202 G → A), A- (376 A → G), A- (542 A → T), Mediterranean (563 C → T), A- (680 G → T) 및 A- (968 T → C)인 것을 특징으로 하는 G6PD 결핍 진단 장치. - 제 9항에 있어서,
상기 변이형들에 사용되는 프라이머 세트는 Exon4 202(G → A), Exon5 376(A → G), Exon6 542(A → T), Exon6 563(C → T), Exon7 680(G → T) 및 Exon9 968(T → C)을 포함하는 것을 특징으로 하는 G6PD 결핍 진단 장치. - 제 1항에 있어서,
상기 감지부는 7개의 감지 영역들을 포함하되,
상기 변이형들은 동남아시아에서 발생하는 Vanua Lava (383 T → C), Mahidol (487 G → A), Coimbra (592 C → T), Viangchan (871 G → A), Union (1360 C → T), Canton (1376 G → A) 및 Kaiping (1388 G → A)인 것을 특징으로 하는 G6PD 결핍 진단 장치. - 제 11항에 있어서,
상기 변이형들에 사용되는 프라이머 세트는 Exon5 383(T → C), Exon6 487(G → A), Exon6 592(C → T), Exon9 871(G → A), Exon11 1360(C → T), Exon12 1376(G → A) 및 Exon12 1388(G → A)을 포함하는 것을 특징으로 하는 G6PD 결핍 진단 장치. - 제 1항에 있어서,
상기 감지부의 상기 항체에 특이 결합한 상기 중합효소 연쇄 반응물에 광을 제공하여 형광 에너지를 발생시키기 위한 광원부; 및
상기 항체에 특이 결합한 상기 중합효소 연쇄 반응물로부터 발산되는 상기 형광 에너지를 감지하는 센서부를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 G6PD 결핍 진단 장치. - 제 13항에 있어서,
상기 센서부에 의해 감지된 상기 형광 에너지를 전기적 신호로 전환하는 측정부를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 호흡기 바이러스 진단 장치. - 제 1항에 있어서,
상기 감지부는 대조 영역을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 G6PD 결핍 진단 장치. - 제 1항에 있어서,
상기 중합효소 연쇄 반응물을 투입하기 위한 시료 투입구; 및
상기 중합효소 연쇄 반응물을 상기 감지부로 이송하기 위한 유로를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 G6PD 결핍 진단 장치. - 제 1항에 있어서,
상기 감지부의 상기 항체에 특이 결합한 상기 중합효소 연쇄 반응물을 분석하는 것은 전기영동법, 스냅샷법, 모세관 전기이동법, 실시간 중합효소 연쇄 반응법, 미세배열 기반 측정법 또는 면역크로마토그래피 측정법을 이용하는 것을 특징으로 하는 G6PD 결핍 진단 장치. - 생체시료로부터 G6PD 유전자의 변이형들에 대한 중합효소 연쇄 반응물을 형성하는 단계; 및
상기 G6PD 유전자의 상기 변이형들을 각각 검출하기 위한 각각의 항체가 제공된 복수의 감지 영역들로 구성된 감지부에 상기 중합효소 연쇄 반응물을 주입하여 상기 항체에 상기 중합효소 연쇄 반응물을 특이적으로 결합시켜 중합효소 연쇄 반응물-항체 결합물질을 형성하는 단계를 포함하는 G6PD 결핍 진단에 관한 정보 제공 방법. - 제 18항에 있어서,
상기 중합효소 연쇄 반응물은 변이형-합텐 결합물질인 것을 특징으로 하는 G6PD 결핍 진단에 관한 정보 제공 방법. - 제 18항에 있어서,
상기 중합효소 연쇄 반응물을 형성하는 단계는 상기 G6PD 유전자를 대립형질 특정 중합효소 연쇄 반응 또는 다중 대립형질 특정 중합효소 연쇄 반응 방법을 이용하는 것을 특징으로 하는 G6PD 결핍 진단에 관한 정보 제공 방법. - 제 20항에 있어서,
상기 대립형질 특정 중합효소 연쇄 반응 또는 상기 다중 대립형질 특정 중합효소 연쇄 반응 방법은 중합효소, 프라이머 세트 및 사전혼합물로 구성된 용액에 상기 생체시료를 투입하여 중합효소 연쇄 반응을 진행하는 것을 특징으로 하는 G6PD 결핍 진단에 관한 정보 제공 방법. - 제 21항에 있어서,
상기 프라이머 세트는 올리고뉴클레이티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 G6PD 결핍 진단에 관한 정보 제공 방법. - 제 21항에 있어서,
상기 프라이머 세트는 합텐이 표지된 것을 특징으로 하는 G6PD 결핍 진단에 관한 정보 제공 방법. - 제 23항에 있어서,
상기 합텐은 펩타이드, 나노 입자, 형광 입자 또는 이들의 조합 중에서 선택된 적어도 하나를 포함하는 것을 특징으로 하는 G6PD 결핍 진단에 관한 정보 제공 방법. - 제 21항에 있어서,
상기 중합효소는 Taq 중합효소인 것을 특징으로 하는 G6PD 결핍 진단에 관한 정보 제공 방법. - 제 21항에 있어서,
상기 사전 혼합물은 주형 RNA, dNTP 및 완충 용액을 포함하는 것을 특징으로 하는 G6PD 결핍 진단에 관한 정보 제공 방법. - 제 18항에 있어서,
상기 감지부는 6개의 감지 영역들을 포함하되,
상기 변이형들은 아프리카에서 발생하는 A- (202 G → A), A- (376 A → G), A- (542 A → T), Mediterranean (563 C → T), A- (680 G → T) 및 A- (968 T → C)인 것을 특징으로 하는 G6PD 결핍 진단에 관한 정보 제공 방법. - 제 27항에 있어서,
상기 변이형들에 사용되는 프라이머 세트는 Exon4 202(G → A), Exon5 376(A → G), Exon6 542(A → T), Exon6 563(C → T), Exon7 680(G → T) 및 Exon9 968(T → C)을 포함하는 것을 특징으로 하는 G6PD 결핍 진단에 관한 정보 제공 방법. - 제 18항에 있어서,
상기 감지부는 7개의 감지 영역들을 포함하되,
상기 변이형들은 동남아시아에서 발생하는 Vanua Lava (383 T → C), Mahidol (487 G → A), Coimbra (592 C → T), Viangchan (871 G → A), Union (1360 C → T), Canton (1376 G → A) 및 Kaiping (1388 G → A)인 것을 특징으로 하는 G6PD 결핍 진단에 관한 정보 제공 방법. - 제 29항에 있어서,
상기 변이형들에 사용되는 프라이머 세트는 Exon5 383(T → C), Exon6 487(G → A), Exon6 592(C → T), Exon9 871(G → A), Exon11 1360(C → T), Exon12 1376(G → A) 및 Exon12 1388(G → A)을 포함하는 것을 특징으로 하는 G6PD 결핍 진단에 관한 정보 제공 방법. - 제 18항에 있어서,
상기 감지부에 광을 제공하여 상기 중합효소 연쇄 반응물-항체 결합물질로부터 형광 에너지를 발생시키는 단계; 및
상기 중합효소 연쇄 반응물-항체 결합물질로부터 발산되는 상기 형광 에너지를 포집하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 G6PD 결핍 진단에 관한 정보 제공 방법. - 제 31항에 있어서,
포집된 상기 형광 에너지를 전기적 신호로 전환하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 G6PD 결핍 진단에 관한 정보 제공 방법. - 제 18항에 있어서,
상기 감지부는 대조 영역을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 G6PD 결핍 진단에 관한 정보 제공 방법. - 제 18항에 있어서,
상기 감지부의 상기 항체에 특이 결합한 상기 중합효소 연쇄 반응물을 분석하는 단계를 더 포함하되,
상기 항체에 특이 결합한 상기 중합효소 연쇄 반응물을 분석하는 단계는 전기영동법, 스냅샷법, 모세관 전기이동법, 실시간 중합효소 연쇄 반응법, 미세배열 기반 측정법 또는 면역크로마토그래피 측정법을 이용하는 것을 특징으로 하는 G6PD 결핍 진단에 관한 정보 제공 방법.
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