KR101363139B1

KR101363139B1 - 안지오제닌의 신규 용도

Info

Publication number: KR101363139B1
Application number: KR1020110101899A
Authority: KR
Inventors: 김재찬; 주광식; 전연숙; 위성욱
Original assignee: 중앙대학교 산학협력단
Priority date: 2011-10-06
Filing date: 2011-10-06
Publication date: 2014-02-21
Also published as: KR20130037477A

Abstract

본 발명은 안지오제닌을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명은 종래 신생 혈관 생성에 관여한다고 알려진 안지오제닌이 초기 염증 시에 각막의 신생혈관 생성을 오히려 억제하는 효과가 있을 뿐 만 아니라, 염증부위의 IL-1α, TGF-β, SDF-1 및 caspase-3 양을 감소시키는 효과가 있음을 새롭게 밝혀낸 것으로, 이를 통한 안지오제닌의 염증성 질환 예방 및 치료 용도에 관한 것이다.

Description

안지오제닌의 신규 용도{Novel Use Of Angiogenine}

본 발명은 안지오제닌의 신규한 염증성 질환 예방 및 치료 용도에 관한 것이다.

면역은 외부로부터 우리 몸의 각종 조직과 세포를 보호하는 중요한 기능을 담당하고 있는 동시에 자가 면역 반응을 비롯한 과도한 면역 반응은 중요 조직의 괴사와 세포 자멸사를 일으킴으로써 여러 중요한 조직, 장기를 손상시키고 심한 경우 생명까지도 위협한다. 이러한 과도한 면역 반응의 적절한 억제와 유발을 통해서 종양, 자가면역질환, 감염성 질병 등 각종 질환을 치료해왔다. 특히 안구는 포도막염을 비롯한 자가 면역 질환이 잘 발생하는 조직으로 알려져 있으며, 백내장, 녹내장과 연령관련 황반 변성 등의 각종 안 질환의 병인이 면역학적 기전으로 설명되고 있다.

특히 실명의 주요 원인 중의 하나인 녹내장은 한국을 비롯한 아시아에서는 정상 안압 녹내장의 형태가 많으며, 그 원인으로 안압 이외에 다른 인자들이 제시되고 있으며 그 중 하나로 면역학적인 요인이 있다. 또한 각막염이나 스티븐스 존슨 증후군, 화학 화상 등에서는 안구 조직 손상에 의해 유발된 여러 내, 외적 인자들에 의해 안구에 구조적인 변화가 발생하고 면역세포와 면역 매개 물질 등을 통한 안구 면역반응에 따라 이차적으로 각막 신생혈관과 혼탁이 발생하게 되어 시력 저하를 유발한다. 이러한 여러 면역학적 안구 질환에 있어서 면역학적인 회피를 통해서 이차적 면역 염증 반응을 조절함으로써 질환의 진행을 억제하고 치료할 수 있다.

안지오제닌 (Angiogenin)은 안과 분야에서 아직 많이 연구되지 않은 물질로 혈관내피성장인자 (VEGF)와 함께 혈관생성을 유발하는 분비성 단백질 중의 하나이다. 이는 리보 핵산 분해 효소(RNase)의 일종으로 특히 종양세포에서 성장과 혈관생성을 유발하는 것이 잘 알려져 있다. 또한 최근에는 근위축성 축삭경화증 (Amyotrophic lateral sclerosis, ALS)에 있어서 안지오제닌 유전자 변이가 그 발생에 관계가 있으며, 안지오제닌 투여를 통한 근위축성 축삭경화증과 파킨슨병 등의 퇴행성 신경계 질환(neurodegenerative diseases)에서 그 신경 보호 효과(neuroprotection)가 알려짐으로써 연구가 활발히 진행되고 있다. Nadine 등은 사람의 태반에서 채취한 영양막 세포(trophoblastic cell), 영양막 기저막(trophoblast basement membrane), 내피 바닥층 (the endothelial basal lamina), 태아 혈관, 태아와 모체의 적혈구, 양막 세포 등에서 안지오제닌이 발현다고 발표하였으며, 이것은 안지오제닌이 단순히 혈관 생성 작용 뿐만 아니라 혈관과 조직에서 항상성을 유지하고, 태아에 대한 모체의 면역 관용 (maternal immune tolerance)에 관여할 것이라고 주장하였다.

그러나 현재까지 안지오제닌이 염증성 질환에 있어서 어떠한 면역학적 작용을 수행하는지에 관한 연구는 구체적으로 수행된 바 없는 실정이며, 특히 만성 안구 염증 등에 있어서, 각막혼탁, 신생혈관형성 등에 미치는 영향에 대해서는 연구가 전무하다. 이에 따라 본 발명의 발명자들은 안과에서 안지오제닌이 신경계의 질환이자 면역적 병인이 관여하는 녹내장을 비롯한 여러 면역성 질환에서 면역을 조절하는 중요한 인자로서의 기능을 수행할 수 있는지에 대해 연구하였고, 이와 관련된 우수한 효과를 확인한 후 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서 본 발명은 안지오제닌의 신규한 염증성 질환의 예방 및 치료 용도를 제공하고자 한다.

상기 과제의 해결을 위해, 본 발명은 안지오제닌을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명의 안지오제닌은 염증반응 초기에 각막의 신생혈관 형성을 억제하고 신경절 세포를 보호하며, 염증부위의 IL-1α, TGF-β, SDF-1 및 caspase-3 양을 감소시키는 효과가 있어, 염증성 질환, 보다 구체적으로 만성 안구 염증 또는 면역학적 기전이 관련하는 정상 안압 녹내장의 예방 및 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 만성 안압 상승 쥐 모델에서 안지오제닌의 안압 하강 효과 검토 실험에 대한 결과 그래프이다.
도 2는 만성 안압 상승 쥐 모델에서의 망막 신경절 세포 밀도 결과 사진이다. (a)는 일반 망막세포이고, (b)는 안지오제닌처리군, (c)는 안지오제닌 비처리한 대조군이다.
도 3은 상공막 정맥 전기 소작 후 7일 째에 쥐의 안구에서 분리한 망막 조직으로 시행한 역전사 중화효소연쇄반응의 결과 그래프이다.
도 4는 각막 화학 화상 모델의 전안부 사진을 통한 실험 결과이다. 도 4a 는 전안부 사진촬영 결과, 도 4b는 이를 통한 등급 결과 그래프, 도 4c는 각막 신생혈관 면적 계산 결과 그래프이다.
도 5는 각결막 화학 손상 후 3일과 7일째에 채취한 손상 부위의 조직에서 시행한 역전사 중화효소연쇄반응 결과 그래프이다. 도 5a는 역전사 중화효소연쇄반응 실험 결과 사진이며, 도 5b는 손상 후 3일째의 결과 비교 그래프, 도 5c에서는 손상 후 7일째의 결과 비교 그래프이다.

본 발명은 안지오제닌을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

이하 실시예에서 확인할 수 있는 바와 같이, 본 발명은 종래 신생 혈관 생성에 관여한다고 알려진 안지오제닌이 초기 염증 시에 각막의 신생혈관 생성을 오히려 억제하는 효과가 있을 뿐 만 아니라, 신경절 세포 보호 효과, 염증부위의 IL-1α, TGF-β, SDF-1 및 caspase-3양을 감소시키는 효과가 있음을 새롭게 밝혀낸 것으로, 이를 통한 안지오제닌의 염증성 질환 예방 및 치료 용도를 제공한다.

따라서 본 발명에 따른 안지오제닌을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물은 염증성 질환의 치료에 사용될 수 있다.

따라서 본 발명은 안지오제닌을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물, 염증성 질환 치료제의 제조를 위한 안지오제닌의 용도, 그리고 치료상 유효량의 안지오제닌을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 염증성 질환의 치료 방법을 제공한다.

본 발명의 한 구체예에서, 상기 염증성 질환은 염증을 주병변으로 하는 질병을 총칭하는 의미로, 보다 구체적으로는 패혈증, 동맥경화, 균혈증, 전신염증반응증후군, 다장기기능부전, 암, 골다공증, 치주염, 전신성 홍반성 루푸스, 류마티스성 관절염, 골관절염, 유년형 만성 관절염, 척추관절증, 전신성 경화증, 특발성 염증성 근장애, 쇼그렌 증후군 (Sjoegren's syndrome), 전신성 맥관염, 유육종증 (sarcoidosis), 자가면역 용혈성 빈혈, 자가면역성 혈소판감소증, 갑상선염, 진성당뇨병, 면역 매개성 신장 질환, 중추신경계 또는 말초신경계의 탈수초 질환, 특발성 탈수초 다발성 신경염, 길랑-바레 증후군 (Guillain-Barre syndrome), 만성 염증성 탈수초 다발성 신경염, 간담즙성 질환, 감염성 또는 자가면역성 만성 활성 간염, 원발성 담즙성 간경변, 육아종성 간염, 경화성 담관염, 염증성 장질환 (Inflammatory bowel disease, IBD), 궤양성 대장염 (Ulcerative colitis), 크론병 (Crohn's disease), 과민성 대장 증후군 (Irritable Bowel Syndrome), 글루텐 (gluten) 민감성 장질환, 휘플병 (Whipple's disease), 자가면역성 또는 면역 매개성 피부 질환, 수포성 피부 질환 다형홍반, 접촉성 피부염, 건선, 알레르기성 질환, 천식, 알레르기성 비염, 아토피성 피부염, 음식물 과민증, 두드러기, 폐의 면역질환, 호산구성 폐렴, 특발성 폐 섬유증, 과민성 폐렴, 이식 거부 또는 이식 편대숙주질환인 염증성 질환일 수 있다.

또한 보다 구체적으로 상기 염증성 질환은 만성 안구 염증일 수 있다.

이하의 실시예에서 확인할 수 있는 바와 같이, 각막 화학 화상 모델에서 안지오제닌이 투여된 실험군은 각막 혼탁과 각막 신생혈관 형성이 유의적으로 감소되었으며, IL-1α, TGF-β, SDF-1 및 caspase-3 수치 또한 낮게 측정되어, 안지오제닌은 창상 치유과정의 섬유화를 방지하고, 신생혈관과 함께 혈관에서 누출되는 여러 물질들의 각막 침착을 막아 각막 혼탁을 방지할 수 있음을 알 수 있었다. 따라서 이를 통해 만성 안구 염증의 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명의 다른 구체예에서, 상기 염증성 질환은 면역학적 기전이 관련하는 정상 안압 녹내장일 수 있다.

이하의 실시예에서 또한 확인할 수 있는 바와 같이, 쥐의 상공막 정맥을 전기 소작하여 제조된 만성 녹내장 모델에서, 안지오제닌이 투여된 실험군의 평균 안압이 대조군에 비해 유의적으로 낮게 나타났으며, 막막 신경절 세포 밀도가 감소되지 않았는 바, 안지오제닌은 화학 주성 인자처럼 작용하여 단핵구가 혈관에서 망막 내, 방수 유출로 모이는 것을 촉진시키고, 활성화된 대식세포가 망막 신경절 세포의 자멸사를 막고, 방수 유출로의 흐름을 증가시키는 것으로 판단된다. 따라서 이러한 안지오제닌이 갖는 안압 하강 효과 및 신경절 세포 보호 효과를 통해 면역학적 기전이 관련하는 정상 안압 녹내장의 치료제로 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명의 한 구체예에서, 안지오제닌을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물은 약학 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 사용하는 적절한 담체, 부형제, 붕해제, 감미제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제, 향미제, 항산화제, 완충액, 정균제, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 첨가제를 추가로 포함할 수 있다.

구체적으로 담체, 부형제 및 희석제는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 사용할 수 있으며, 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트, 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제할 수 있다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용할 수 있다. 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 있으며 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제 등이 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기재로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 다른 구체예에서, 상기 안지오제닌을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물은 통상적인 방법에 따라 과립제, 산제, 피복정, 정제, 환제, 캡슐제, 좌제, 겔, 시럽, 즙, 현탁제, 유제, 점적제 또는 액제로 제형화하여 사용할 수 있다.

본 발명의 일실시예에 따르면 상기 약학 조성물은 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 동맥내, 복강내, 흉골내, 경피, 비측내, 흡입, 국소, 직장, 경구, 안구내 또는 피내 경로를 통해 통상적인 방식으로 대상체로 투여할 수 있다.

상기 안지오제닌의 바람직한 투여량은 대상체의 상태 및 체중, 질환의 종류 및 정도, 약물 형태, 투여경로 및 기간에 따라 달라질 수 있으며 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 본 발명의 일실시예에 따르면 이에 제한되는 것은 아니지만 1일 투여량이 0.01 내지 200 mg/kg, 구체적으로는 0.1 내지 200 mg/kg, 보다 구체적으로는 0.1 내지 100 mg/kg 일 수 있다. 투여는 하루에 한 번 투여할 수도 있고 수회로 나누어 투여할 수도 있으며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 상기 '대상체'는 인간을 포함하는 포유동물일 수 있으나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

< 실험예 >

하기의 실험예들은 본 발명에 따른 각각의 실시예에 공통적으로 적용되는 실험예를 제공하기 위한 것이다.

1. 대상 실험 쥐 ( Rat )

중앙대학교 의과대학 임상연구소에서 사육한 쥐(Sprague-Dawley계, 수컷)를 실험동물로 이용하였다. 8주된 20마리 흰 쥐의 몸무게는 평균 260g (250~270 g) 이었다. 실험 동물 사육실 온도는 22~25 °C, 상대습도는 50~60%로 유지하였고, 자동명암 조절이었다.

2. 만성 안압 상승 모델 제작과 안압 측정

쥐 20마리에 Tiletimine과 Zolazepam 혼합 약제(Zoletil®)와 0.05cc/50g과 Xylazine (Rompum®) 0.05cc/100g을 1:1로 혼합하여 근육 주사하여 마취하였다. 윤부 가장자리를 4등분하여 90도 간격으로 각각 2 mm 절개를 한 후 위쪽 절개의 가장자리로 2개의 방사상 결막 절개를 시행하였다. 조직을 뒤쪽으로 밀어서 외안근이 보이게 한 뒤 상직근 근처에 위치한 2개의 등쪽 상공막 정맥과 외직근 근처에 있는 1개의 귀쪽 상공막정맥을 분리하였다. 정맥의 수술적 분리 후에 주변조직에서 멀리 떨어지도록 3 mm 넓이의 집게를 사용하여 들어 올린 후 주변조직에 열손상이나 접촉에 의한 기계적 손상이 없도록 전기소작 하였다. 안압은 Tonopen (Solan, FL, USA)을 사용하여 연속 3번 이상 측정하고 기구에서 5 percentile 이내의 안정된 안압으로 확인된 값만을 기록하였다. 쥐 10마리 10안은 실험 2일전부터 안지오제닌 10μ를 하루에 4회 투여하고, 상공막정맥 전기소작 후에도 하루에 4번 6시간 간격으로 투여하였다. 대조군 10마리 10안은 생리 식염수 10μ를 손상 전, 후에도 지속적으로 안지오제닌과 동일한 방법으로 투여 하였다. 시술 전과 시술 후 3일, 1, 2, 4, 8 주에 안압을 측정하고, 한 마리씩 희생하여 안구를 적출 후 조직검사 및 Brn-3a, CD11b에 대한 면역화학염색을 시행하였고, 역전사 중화효소연쇄반응(Reverse transcription polymerase chain reaction)을 이용하여 CD11b 수치를 망막 조직에서 측정하였다.

3. 조직절편제작과 면역조직화학염색

4% paraformaldehyde용액에 전 고정한 후 조직 조직을 파라핀 처리하여 파라핀 블록을 만든 후에 조직 절편을 자른 후 슬라이드 글라스 위에 붙였다. Dewaxing Solution으로 파라핀을 제거한 후 알코올로 2 회 반복 처리하였다. 10분 동안 1% Triton X-100을 처리하고, PBS로 10분씩 3회 헹구었다. Normal donkey serum(Vector, CA, USA)으로 1시간 동안 blocking한 후 0.1% triton X-100이 포함된 일차항체 mouse anti-NR1 (1:500), mouse anti-GluR2/4 (1:1000), rabbit anti-GluR6/7 (1:000), rabbit antimGluR6(1:10000)를 사용하여 4℃에서 하루 동안 반응시켰다. PBS로 다시 10분씩 3회 헹구어주고, 4℃에서 두 시간 동안 0.1% triton X-100과 함께 2차 항체 goat anti-rabbit-또는 anti-mouse-rhodamine (SantaCruz, CA, USA) 로 처리하였다. 2차 항체처리가 끝난 후, PBS로 10분씩 3회 헹구어주었다. 망막신경절세포를 염색하는 Brn-3a와 단핵구에서 유래한 대식세포를 염색하는 CD11b를 일차항체로 사용하여 염색하였다.

4. 각막화학화상 모델 제작과 전안부 사진촬영

쥐 20마리 20안에 거름 종이를 4mm 지름의 원형으로 자른 후 NaOH에 완전히 적신 후, 상측 각막 윤부를 중심으로 각막과 결막 위에 놓고 6초간 손상을 입힌 후 세척하였다. 쥐 10마리 10안은 실험 2일전부터 안지오제닌 10μl씩 6시간 간격으로 하루 4회 투여하고, NaOH 손상 후에도 하루에 4회씩 일정하게 투여하였다. 남은 대조군 10안은 생리 식염수를 손상 2일전부터 안지오제닌과 동일한 방법으로 투여하였다. 안지오제닌과 생리 식염수를 모두 손상 후 7일째까지만 투여 하였다.

손상 후 3일, 1, 2, 4, 8주에 각막 혼탁과 신생혈관 정도를 전안부 사진 촬영을 통해 평가하였고, 3일째와 7일째에는 각결막 손상 부위를 채취하여 역전사 중화효소연쇄반응을 이용하여 IL-1α, TGF-β, SDF-1 및 caspase-3의 발현을 분석하였다.

각막혼탁은 Sonoda 와 Streilein이 제시한 분류법을 사용하여 0 등급은 완전하게 투명한 각막, 1등급은 미세한 혼탁이 있어 홍채가 완전하게 보일 때, 2등급은 경도의 혼탁으로 홍채 혈관이 보이는 상태이며 3등급은 중등도의 각막혼탁과 동공연는 보이나 홍채혈관은 보이지 않으며, 4등급은 완전한 각막 혼탁으로 동공연이 보이지 않는 경우로 분류하였다.

각막 신생혈관은 촬영한 기준 사진에서 혈관이 자라난 부위를 각막 정점을 중심으로 1시간 간격의 쐐기모양의 구역으로 분류하여 면적을 계산하였는데, 면적은 A = C / 12 x 3.1416 [r ² -(r-l) ^2] 공식에 따라 계산하였다. ( A : 신생혈관면적, C : 12시간으로 나누었을 때 차지하는 시간, r : 각막의 지름, l : 혈관이 자라난 길이)

5. 역전사 중화효소연쇄반응을 이용한 반정량 분석

만성 안압상승모델과 각막화학화상모델에서 채취한 조직을 얼린 후, 미세칼을 이용하여 작은 조각으로 잘라준다. 조각 낸 조직에 TRI reagent (Molecular Research Center, Inc.) 1 ml을 가하고 homogenizer를 이용하여 조직 및 세포를 용해시켰다. 증폭시킬 각 cDNA 0.6 l 0.2 mM dNTP, 10×buffer, 10 pmols primer, 0.2 U Taq polymerase를 섞어서 20 ul 의 볼륨이 되게 믹스한 후, PCR thermal cycler (PCR 돌리는 기계) 에 사용하여 95℃에서 5분, 94℃ 40초, 48℃~64℃ 40초, 72℃ 40초 (35 cycles) 72℃ 에서 10분 반응 시킨다. 증폭된 중화효소연쇄반응 산물을 1% agarose gel 전기영동으로 확인하였다. 중화효소연쇄반응의 양성 대조로 베타엑틴 (β-actin)을 사용하였고, 베타엑틴 발현에 대한 타겟 유전자의 상대적인 발현양상을 비교하였다. 만성 안압 상승 모델의 쥐 망막조직에서는 단핵구에서 유래된 대식세포 표지자인 CD11b를 분석하였고, 각막 화학화상 모델의 쥐 각결막 조직에서는 IL-1α, TGF-β, SDF-1 및 caspase-3을 분석하였다.

< 실시예 1> 만성 안압 상승 쥐 모델에서 안지오제닌의 안압 하강 효과 검토

안지오제닌을 투여한 군 쥐 눈 10안과 투여하지 않은 대조군 쥐 눈 10안의 실험 전 평균 안압은 각각 20.6±1.9mmHg, 21.6±1.8mmHg로 두 군의 유의한 차이는 없었다. 안지오제닌 투여 군의 8주간의 평균 안압은 21.2±3.8mmHg 였으며, 대조군은 25.4±3.6mmHg 였다. 실험 3일, 1주, 2주, 4주, 8주째에 안지오제닌을 투여한 군의 평균 안압은 각각 20.7±2.6mmHg, 21.4±6.2mmHg, 20.8±4.0mmHg, 23.6±2.0mmHg, 21.7±3.4mmHg으로 측정되었으며, 대조군은 27.3±2.9 mmHg, 27.8±4.1 mmHg, 25±3.0 mmHg, 25.6±1.6mmHg, 23.0±2.4mmHg 로 나타났다. 결과 그래프를 도 1에 나타내었다.

도 1을 참조하면, 상공막정맥 손상 후 3일, 1주, 2주, 4째에 안지오제닌을 투여한 군의 평균 안압이 대조군의 평균 안압에 비해 유의하게 낮았으며, 그 차이는 실험 3일 째에 6.75±0.3mmHg로 가장 크게 나타났다.

< 실시예 2> 안지오제닌 투여에 따른 만성 안압상승 모델에서 신경절 세포 보호 효과 검토

상공막 정맥 전기 소작을 통한 만성 안압 상승 모델에서 채취한 쥐의 조직의 H-E 염색 상에서 망막의 위층에 분포하는 망막 신경절 세포의 밀도를 분석하였다. 결과를 도 2에 나타내었다.

도 2a의 (a)는 일반 망막세포이고, (b)는 안지오제닌처리군, (c)는 안지오제닌 비처리한 대조군이다. 도 2a를 참조하면, 손상 후 8주에는 대조군(c)의 전체적인 망막 두께와 망막신경절세포 밀도는 정상 쥐(a)에 비해 현저히 감소되어 있는 것을 확인할 수 있었고, 안지오제닌 투여 군(b)에서는 망막신경절세포의 밀도의 변화가 없음을 알 수 있었다.

도 2b은 망막 신경절 세포의 면역화학염색 실험 결과이다. (a)는 Brn-3a, (b)는 CD11b, (c)는 대조군을 나타낸다.

면역화학염색 상에서 Brn-3a로 표지되는 망막 신경절 세포의 밀도는 대조군에서 현저히 감소(c)되어 있었으며, 안지오제닌 투여군(a)에서는 Brn-3a로 표지되는 망막 신경절 세포의 밀도가 잘 유지되어 있었고, CD11b로 표지되는 대식세포(b)가 대조군에 비해 높은 빈도로 망막 신경절 층에 분포되어 있는 것을 확인할 수 있었다.

상공막 정맥 전기 소작 후 7일 째에 쥐의 안구에서 분리한 망막 조직으로 시행한 역전사 중화효소연쇄반응의 결과를 도 3에 나타내었다. 도 3을 참조하면, CD11b 수치가 안지오제닌 투여군에서 대조군과 정상 쥐의 망막에서보다 유의하게 증가된 것으로 나타났다.

최근 논문에서 글루타메이트(glutamate) 유리체내 주입 또는 안압 상승에 의한 쥐 망막 손상 모델에서 쥐의 손상된 망막에 단핵구에서 유래한 대식세포가 침윤하여 망막 신경절 세포의 생존을 증가시키는 효과와 망막 줄기 세포의 재생 (retinal progenital cell renewal) 효과를 보고하였고 이는 대식세포가 분비하는 IL-10, MHC-II에 의한 것으로 보고된 바 있다.

따라서 안지오제닌을 투여한 군에서 중화효소연쇄반응 검사 상 단핵세포에서 유래한 대식세포 표지자인 CD11b가 대조군에 비해서 높게 측정되었고, 신경절 세포 수의 감소가 적은 것으로 보았을 때, 안지오제닌의 안압 하강 효과와 신경보호효과가 단핵구에서 유래된 대식세포의 작용과 연관관계가 있을 것으로 판단된다. 안지오제닌은 화학 주성 인자처럼 작용하여 단핵구가 혈관에서 망막 내, 방수 유출로 모이는 것을 촉진시키고, 활성화된 대식세포가 망막 신경절 세포의 자멸사를 막고, 방수 유출로의 흐름을 증가시킬 것으로 판단된다.

< 실시예 3> 각막 화학화상 모델에서 안지오제닌의 항염증 효과 검토

본 발명의 발명자들은 각막 화학 화상 모델에서 안지오제닌에 의한 각막 혼탁과 각막 신생혈관 억제기능을 확인하였다.

각막 혼탁 억제는 전안부 사진촬영을 통해 알아보았고, 결과를 도 4에 나타내었다. 도 4a 는 전안부 사진촬영 결과, 도 4b는 이를 통한 등급 결과 그래프, 도 4c는 각막 신생혈관 면적 계산 결과 그래프이다.

도 4를 참조하면, 각결막 손상 후 3일 째에 전안부 사진 상 안지오제닌 투여군과 대조군에서 각막 윤부 허혈 소견이 관찰되었으며, 안지오제닌 투여군에 비해서 대조군에서는 심한 허혈과 함께 심한 염증성 분비물과 부분적 괴사소견이 관찰되었다. 각막 혼탁에 있어서 7일째까지는 두 군간의 유의한 차이는 없었으나, 손상 2주째부터 8주째까지 대조군에 비해 안지오제닌 투여군은 각막 혼탁이 유의하게 적었으며, 대부분 1 등급이나 2등급이었다(도 4a, 도 4b 참조). 반면 대조군에서는 대부분 손상 7일 이후부터 혼탁과 신생혈관이 실험 기간동안 계속 진행되는 양상을 관찰할 수 있었다.

각막신생혈관은 초기 3일째에는 두 군 모두 거의 관찰되지 않았지만, 2주째는 두 군 간에 뚜렷한 차이를 보였고, 안지오제닌을 투여했던 군은 각막신생혈관 발생한 면적 변화가 거의 없었다. 두 군에서 초기 7일째까지 발생한 각막 혼탁 중 각막신생혈관이 동반되지 않은 부위의 혼탁은 4주째에 대부분 희미해지거나 소실되었지만 신생혈관과 동반된 각막 혼탁은 점점 더 심해지는 양상을 보였다 (도 4a, 도 4c 참조).

두 군에서 초기 7일째까지 발생한 각막 혼탁 중 각막신생혈관이 동반되지 않은 부위의 혼탁은 일시적인 각막 부종과 여러 염증세포와 염증성 물질에 의한 염증 반응에 의한 것으로 판단되며, 4주째에 대부분 희미해지거나 소실되었지만 신생혈관과 동반된 각막 혼탁은 점점 더 심해지는 양상을 보였다.

상기 실험에서는 각막 손상 전 2일에서부터 손상 후 7일째까지만 안지오제닌을 투여하였는데, 이는 초기 창상 치유과정 중에 염증 반응기에서의 염증 반응을 줄여서 이차적인 각막 기질의 파괴를 방지하고, 이후 재생 과정에서는 각막 신생 혈관 생성을 촉진시키지 않기 위함이었다

또한 각결막 화학 손상 후 3일과 7일째에 채취한 손상 부위의 조직에서 시행한 역전사 중화효소연쇄반응 결과를 도 5에 나타내었다. 도 5a는 역전사 중화효소연쇄반응 실험 결과 사진이며, 도 5b는 손상 후 3일째의 결과 비교 그래프, 도 5c에서는 손상 후 7일째의 결과 비교 그래프이다.

도 5를 참조하면, IL-1α, TGF-β, SDF-1 및 caspase-3 모두 대조군에 비해 안지오제닌을 투여한 군에서 유의하게 낮게 측정된 것을 알 수 있다.

일반적으로 각막 화학 화상에 의해 각막 윤부 세포 결핍이 발생하여 정상적 세포 재생이 힘들게 되며, 손상 조직에서 유리된 인자에 의해 염증세포가 모이고 여기서 분비되는 각종 싸이토카인, 단백분해효소 등에 의해서 각막 실질의 콜라겐의 재배열이 일어나고, 창상 치유과정의 섬유화로 각막은 투명도를 잃게 되며 신생혈관과 함께 혈관에서 누출되는 여러 물질들의 각막 침착되어 각막 혼탁이 발생할 수 있다. 이 중 TGF-β 는 각막 실질 섬유모세포의 활성과 분화를 유발하고, 세포 자멸사와 창상 치유 시 섬유화를 유발시키는 주요 물질로써 각막 혼탁에 중요한 원인 중 하나이다. 또한 SDF-1 (stromal cell-derived factor -1) 은　CXC family에 속하는 화학 주성인자(chemotatic factor)로 lymphocyte　등의 염증 세포에 대한　화학주성(chemotaxis)기능과 endothelial progenitor cell을 골수로 부터　CXCR4 통한 작용 기전을 통해 내피세포를 유도 (endothelial recruiting) 하는 등의 작용을 통해서 혈관신생(angiogenesis)에 중요한 역할을 담당하며, 유방암을 비롯한 종양의 전이(metastasis)와도 연관되는 것으로 알려져 있다. 또한 Caspase-3은 세포자멸사의 표지자이다.

상기 실험에서는 각결막 화학 손상 후 3일과 7일째에 채취한 손상 부위의 조직에서 IL-1α, TGF-β, SDF-1 및 caspase-3 모두 안지오제닌을 투여한 군에서 낮게 나온 것을 확인하였는데, 따라서 안지오제닌의 면역학적인 작용에 의해서 염증성 싸이토카인인 IL-1α를 억제하고 각막 혼탁과 섬유화를 유발하는 TGF-β을 억제하며, 혈관 신생을 유발하고 염증을 유발하는 면역 조절 물질로 알려진 SDF-1 및 세포자멸사의 표지자인 caspase-3 을 억제하는 과정을 통해 염증을 줄이고, 각막혼탁과 각막 신생혈관을 억제하는 작용이 발생한 것으로 판단된다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시예일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims

안지오제닌을 유효성분으로 포함하는 만성 안구 염증 또는 면역학적 기전이 관련하는 정상 안압 녹내장의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
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제1항에 있어서,
상기 안지오제닌은 염증반응 초기에 각막의 신생혈관 형성을 억제하고 신경절 세포를 보호하며, 염증부위의 IL-1α, TGF-β, SDF-1 및 caspase-3 양을 감소시키는 것인 만성 안구 염증 또는 면역학적 기전이 관련하는 정상 안압 녹내장의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제1항 또는 제5항에 있어서,
담체, 부형제, 붕해제, 감미제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제, 향미제, 항산화제, 완충액, 정균제, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 첨가제를 추가로 포함하는 만성 안구 염증 또는 면역학적 기전이 관련하는 정상 안압 녹내장의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제1항 또는 제5항에 있어서,
상기 약학 조성물의 제형은 과립제, 산제, 피복정, 정제, 환제, 캡슐제, 좌제, 겔, 시럽, 즙, 현탁제, 유제, 점적제 및 액제로 이루어진 군에서 선택되는 것인 만성 안구 염증 또는 면역학적 기전이 관련하는 정상 안압 녹내장의 예방 또는 치료용 약학 조성물.