KR101356740B1

KR101356740B1 - 악성 미분화 종양줄기세포 표적 펩타이드

Info

Publication number: KR101356740B1
Application number: KR1020110018414A
Authority: KR
Inventors: 최윤재; 김형기; 백삼열; 강상기; 이남경; 김훈
Original assignee: 서울대학교산학협력단
Priority date: 2011-03-02
Filing date: 2011-03-02
Publication date: 2014-02-05
Also published as: KR20120099904A

Abstract

본 발명은 악성 뇌종양 미분화 줄기세포를 선별적으로 인지하여 결합할 수 있는 종양줄기세포 표적펩타이드 GICT 및 그 펩타이드를 이용한 뇌종양 진단 방법에 관한 것이다.

Description

악성 미분화 종양줄기세포 표적 펩타이드{A peptide binding undifferentiated glioma stem cell}

본 발명은 악성 미분화 종양줄기세포를 선별적으로 인지하여 결합할 수 있는 종양줄기세포 표적 펩타이드에 관한 것이다.

종양 조직은 발현된 종양 세포만으로 이루어진 단순한 조직이 아니다. 암 세포는 주변 섬유모세포, 내피 세포 및 면역 세포를 비롯하여 주위 환경과 계속적으로 소통한다.

뇌종양(GBM; glioblastoma)은 치사율이 매우 높고 생존기간이 매우 짧은 가장 악성인 종양의 하나이다. 최근의 연구에 따르면 뇌종양 조직내에 일부 존재하는 종양줄기세포가 이러한 뇌종양을 야기할 수 있는 근원세포로서 역할을 한다고 알려지고 있다. 또한 이러한 뇌종양줄기세포가 항암제, 감마선치료 등의 기존 종양치료방법에 저항성을 지니고 있어 종양줄기세포의 재발에 가장 큰 원인으로 이해되고 있다.

뇌종양은 그 특성상 치료가 매우 어려운 질병이다. 뇌라는 조직의 특성상 넓은 범위의 제거가 어렵고 약물전달이 수월하지 않은 특징이 있다. 또 한가지 문제는 종양조직의 제거 이후에도 재발이 매우 빈번하다는 것인데, 이는 위에서 언급된 종양줄기세포 존재에 기인하는 것으로 알려져 있다. 기존의 항암제 치료는 분화되어 종양을 형성할 능력이 없는 세포들만을 사멸시키므로, 미분화 종양형성능을 갖는 세포를 제거하지 못할 뿐 아니라 더욱 악성으로 유도한다고 이해되고 있다.

교종-개시 세포(glioma-initiating cell: GIC)로 알려진 교종 세포 하위군(subpopulation)에 대하여 최근 밝혀진 바에 따르면, 이들은 독특한 세포 소양(cellular trait),즉, 비대칭적인 자기-재생, 종양 복제능 및 다수의 리니지(multi lineages)를 갖고 있다[Singh et al., 2004; Lee et al., 2006; Fomchenko et al., 2006; Vescovi et al., 2006]. 따라서, 이러한 자료로부터 GIC가 교종에 강한 이질성을 부여하는 주요 원인임을 알 수 있다.

또한, GIC는 분화 후대(progenies) 및 다수의 계통확립 교종세포주와 비교할 때, 활성 DNA 복구 조절 시스템 및 다양한 ATP-결합 카세트(ABC) 운반체의 높은 수준의 발현을 통해 방사선 및 화학요법에 대하여 강한 내성 양태를 나타낸다. 임상적으로, 이러한 세포 양상은 GIC가 여러 통상적인 치료 이후에 발생하는 종양 재발의 주요 원인임을 시사한다. 따라서, 종양전체(bulk target)를 표적으로 하는 통상적인 치료법이 GIC를 완벽하게 근절하지 못하는 치료적 한계를 극복하기 위해서는 GIC를 표적으로 하여 GIC-유도된 종양 후대 및 재발을 방지하는 신규한 치료법이 필요하다.

본 발명의 목적은 상기와 같은 점들을 감안하여 안출한 것으로, 악성 미분화 종양 줄기세포를 선별적으로 인지하여 결합할 수 있는 종양줄기세포 표적 펩타이드를 제공하는 것과 상기 펩타이드를 이용하여 종양세포를 표적으로 하는 효율적인 뇌종양 치료제를 제공하는데 있다.

본 발명의 상기 목적은 파지디스플레이 기법을 이용하여 종양줄기세포 결합 파지를 선별하고, 개별파지 결합양상 분석을 통한 종양줄기세포 표적 펩타이드를 동정하고, 이 펩타이드의 종양줄기세포주의 결합능, 결합단백질 선별능, 종양조직 전달 능력, 미분화 종양줄기세포 특이 표적능과 종양조직 성장억제능을 확인함으로써 달성하였다.

본 발명에 따른 펩타이드는 네스틴(Nestin) 단백질의 GIC-특이적인 짧은 아이소형에 결합되어 GIC를 표적화하고, 미분화 GIC에 내재화(internalized)되어, 종양 조직에 침윤되어서 종양의 네스틴-양성 세포를 표적화할 수 있다. 그 결과, 종양세포에 정확하게 항암제 등의 약물을 효과적으로 전달할 수 있는 뛰어난 효과가 있다.

도 1은 Ph.D.펩타이드 라이브러리를 이용한 바이오패닝의 개략적인 절차를 나타낸 것이다.
도 2는 랜덤 헵타펩타이드 g-III 융합된 N-말단 서열을 나타낸 것이다.
도 3은 CM-ELISA 방법을 개략적으로 나타낸 것이다.
도 4는 미분화 및 분화된 세포 조건을 유도하기 위하여 NBE 배지(EGF 및 bFGF로 보충된 무혈청 배지) 또는 DMEM(10% FBS로 보충)에서 증식한 GIC 형태를 나타낸 것이다.
도 5는 면역형광 분석(상부 좌측 패널), RT-PCR(상부 우측 패널) 및 실시간 RT-PCR 분석(하부 패널)을 이용하여 줄기 마커 발현 측정을 나타낸 것이다.
도 6은 면역형광분석(우측 패널) 및 실시간 RT-PCR(좌측 패널)을 이용하여 측정한 리니지 특이적 분화 마커를 나타낸 것이다.
도 7은 3개의 인간 GIC 세포주에 대한 Ph.D.7 M13 파지 라이브러리의 시험관내 바이오패닝에 의해 분리된 GIC-표적 파지를 나타낸 것이다.
도 8은 바이오패닝으로부터 수렴된 파지 풀에서 수득한 개별 파지의 결합 친화도를 나타낸 것이다.
도 9는 클론 17번(GICT) 파지의 아미노산 서열, 및 미분화 GIC3 및 그의 분화된 대응 세포로부터 추출된 불용성 막 단백질에 대한 상대적인 결합 친화도를 나타낸 것이다.
도 10은 미분화 GIC에 대한 GICT 파지의 결합 특이성을 나타낸 것이다. 이들 미분화(NBE) 및 분화된(FBS를 함유한 DMEM) GIC (GIC1, GIC2 및 GIC3)에 대한 GICT 파지의 결합 친화도를 플락-형성 분석한 결과로 나타내었다. 고유 파지를 음성 대조군으로 사용하였다. * P<0.05.
도 11은 미분화(NBE) 및 분화된(FBS를 함유한 DMEM) GIC4 및 GIC5 세포에 대한 GICT 파지의 결합 친화도를 세포 ELISA에 의해 분석한 결과를 나타낸 것이다. ** P<0.05.
도 12는 NBE 배지(EGF 및 bFGF로 보충된 무혈청 배지) 또는 DMEM(10% FBS로 보충)에서 증식된 교종 세포주(U87MG, LN229 및 A1207)의 형태를 나타낸 것이다.
도 13은 NBE 배양 조건에서 U87MG가 tumor sphere를 형성하는 것을 나타낸 것이다. NBE 또는 FBS 배양 조건에서 증식한 교종 세포주에 대한 GICT 파지의 결합 친화도를 세포 ELISA 분석에 의해 정하였다(우측 그래프). 고유 파지는 음성 대조군으로 이용하였다. *P<0.05.
도 14는 합성 ‘AQYLNPS’GICT 펩타이드를 이용하여 미분화 GIC3 세포로부터 추출된 불용성 막 단백질에 대한 GICT 파지 결합 친화도의 경합 분석 결과를 나타낸 것이다. 미분화 또는 분화된 GIC중 어떠한 것에도 결합하지 않는 대조군 펩타이드(HPTLHTS)를 음성 대조군으로 사용하였으며, 합성 펩타이드와의 경합 부재하에서 GICT 파지의 상대적 결합 친화도를 1로 설정하였다. *P<0.05.
도 15는 GICT 펩타이드가 미분화 마우스 GIC에 선택적으로 결합함을 나타낸 그래프이다. 미분화(상단 패널) 및 분화된(하단 패널) 마우스 GIC 모델(Id4-과발현 Ink4a/Arf-/-성상세포; Jeon 등, 2008)에 대한 GICT 펩타이드의 결합 친화도를 FACS 분석에 의해 결정하였다.
도 16은 GICT 펩타이드-결합 단백질을 동정한 것이다.
도 17은 고성능 액상 크로마토그래피-탠덤 질량 분광분석법(HPLC-MS/MS)에 의해 약 60kDa의 마우스 네스틴 N-말단 아이소형이‘AQYLNPS’ GICT 펩타이드-결합 단백질임을 나타낸 것이다.
도 18은 N-네스틴 항체를 이용한 면역블롯 분석에 의해 ‘AQYLNPS' GICT 펩타이드-결합 단백질이 미분화(NBE) Id4-유도 마우스 GIC로부터 추출된 불용성 막 단백질에서 검출된 약 60kDa의 네스틴 N-말단 아이소형임을 나타낸 것이다 (PD: 풀-다운, IB: 면역블롯, 대조군 펩타이드: ’HPTLHTS').
도 19는 N-네스틴 항체를 이용한 면역블롯 분석에 의해 ‘AQYLNPS' GICT 펩타이드-결합 단백질이 미분화(NBE) GIC3 세포로부터 추출된 불용성 막 단백질에서 검출된 약 60kDa의 네스틴 N-말단 아이소형임을 나타낸 것이다 (PD: 풀-다운, IB: 면역블롯, 대조군 펩타이드: ’HPTLHTS').
도 20은 N-네스틴 항체를 이용하여 미분화된 GIC3, GIC4 세포로부터 추출된 불용성 막 단백질에 대한 GICT 펩타이드 결합 친화도의 경합 분석 결과를 나타낸 것으로, 래빗과 마우스 IgG 항체를 대조군 항체로서 사용하였다. *P<0.05. 대조군 펩타이드 ‘HPTLHTS'.
도 21은 미분화 마우스 GIC에 대한 N-말단 네스틴-상호작용 항체의 선택적 결합을 나타낸 것으로, 미분화(상단 패널) 및 분화된(하단 패널) 마우스 GIC 모델에 대한 네스틴 항체(시그마 알드리츠, N5413, 네스틴의 N-말단 에피토프를 인식함)의 결합 친화도는 FACS 분석에 의해 정하였다.
도 22는 네스틴 항체를 이용하여 미분화된 Id4 유도 GIC로부터 추출된 불용성 막 단백질에 대한 GICT 결합 친화도의 경합 분석을 나탄낸 것으로, 래빗 및 마우스 IgG 항체를 대조군 항체로서 사용하였다. *P<0.05. 대조군 펩타이드, ’HPTLHTS'.
도 23은 GICT가 인간 GBM 조직에서 네스틴-양성 종양 세포에 선택적으로 결합하는 것을 나타낸 것이다. 파라핀-포매된 인간 GBM 조직 절편을 비오틴화 GICT(B-GICT) 펩타이드(녹색) 및 네스틴 항체(적색)로 염색하였다. 상기 면역형광 분석에 따르면, 대부분의 B-GICT 펩타이드-표적화 종양 세포가 네스틴-양성 종양 세포와 함께 동시 존재함(colocalized)을 나타낸다.
도 24는 GICT 펩타이드가 미분화 GIC로 내재화된 것을 나타낸 것이다.
도 25는 Q-dot 800-결합된 GICT(Q-GICT) 또는 Id4-유도 마우스 GIC의 주사로부터 유도된 피하 종양을 갖는 마우스의 대조군 펩타이드를 정맥 주사하여 GICT 펩타이드의 생체내 생체분포를 연구 검사한 결과를 나타낸 것이다. 전신 바이오형광 이미지는 Q-GICT 및 Q-대조군 펩타이드 주사후 24시간째에 수득되었다.
도 26은 도 25에 나타낸 피하 종양 함유 마우스로부터 추출한 종양 및 기관에 있는 Q-GICT 펩타이드의 형광 이미지를 나타낸 것이다.
도 27은 피하내 종양 조직에 있는 GICT 펩타이드의 시간-의존적 누적량을 나타낸 것이다. Q-GICT 및 Q-대조군 펩타이드의 형광 신호는 정맥 주사후 1 및 4시간째에 피하 종양을 갖는 마우스의 간 및 방광에서 주로 검출되었다. Q-GICT 펩타이드 형광은 주사후 24시간째에 종양 조직에서 현저하게 누적되었으나, Q-대조군의 경우에는 그렇지 않았다.
도 28은 정위 뇌종양 모델에서 Q-Dot 800-결합된 GICT 또는 대조군 펩타이드의 생체내 생체분포를 나타낸 것이다. 전신 바이오형광 이미지는 Id4-유도 마우스 GIC 주사로부터 유래된 정위 뇌종양을 갖는 마우스에서 Q-GICT 및 Q-대조군 펩타이드 주사후 4일째에 수득하였다.
도 29는 도 28에 도시된 정위 종양을 갖는 마우스로부터 추출된 뇌에서 Q-GICT 펩타이드의 형광 이미지를 나타낸 것이다.
도 30에서 좌측 패널은 GICT 펩타이드가 생체내 종양 조직에 있는 GIC로 선택적으로 이동하여 누적됨을 나타낸 것이다. 면역형광 이미지는 정소 뇌종양모델로부터 유래된 종양조직에서 네스틴-양성 종양 세포 및 로다민 B-결합된 GICT (R-GICT) 펩타이드 표적화 세포의 공동 존재를 나타낸 것이고, 우측 패널은 각 개별 픽셀의 형광 강도를 유클리드 평면에 도시한 것이다.
도 31의 좌측 패널의 면역형광 이미지는 정소 뇌종양 모델로부터 유래된 종양 조직에서의 종양 세포 발현 분화 마커(뉴론, Tuj1-양성, 성상세포, S100β-양성, oligodendrocyte, O4-양성) 및 R-GICT 펩타이드-표적화 세포를 나타낸 것이고, 우측 패널은 각 개별 픽셀의 형광 강도를 유클리드 평면에 도시한 것이다.
도 32는 도 30 및 도 31에 도시된 면역형광 이미지를 이용하여 맨더(Mander) 중복계수를 분석한 결과를 나타낸 것이다. **P < 0.01.
도 33은 GICT 펩타이드 결합된 예비-세포사멸 펩타이드의 항종양 효과를 나타낸 그래프이다.

본 발명은 악성 미분화 종양 줄기세포를 선별적으로 인지하여 결합할 수 있는 종양줄기세포 표적펩타이드를 스크리닝 하기 위한 파지디스플레이 기법을 제공한다.

본 발명은 다음과 같은 단계로 이루어지며 종양줄기세포 표적 펩타이드를 효과적으로 선별, 검증하였다:

제1단계: 파지디스플레이 기법을 이용하여 종양줄기세포 결합 파지 선별 및 개별파지 결합양상 분석을 통한 종양줄기세포 표적 펩타이드의 동정;

제2단계: 동정된 종양줄기세포 표적 펩타이드의 다양한 세포에서의 결합능력 분석;

제3단계: 동정된 종양줄기세포 표적 펩타이드의 결합단백질 선별 및 검증;

제4단계: 종양모델 생쥐에서 종양줄기세포 표적 펩타이드의 종양조직 전달 능력 검증;

제5단계: 뇌종양조직에서 종양줄기세포 표적 펩타이드의 미분화 종양줄기세포 특이 표적능력 검증; 및

제6단계: 종양줄기세포 표적펩타이드의 종양모델 생쥐에서 종양성장 억제능 확인.

본 발명의 구체적인 내용은 이하 실시예를 통하여 상세히 설명한다. 이들 실시에는 오로지 발명을 실시하기 위한 것으로, 본 발명의 권리범위는 이에 한정하는 것은 아니다.

재료 및 방법

1. GIC 배양

(1) 시약 및 배지

GIC 분화의 유지 및 유도를 위한 배지 및 시약은 하기와 같다: Neurobasal 배지(인비트로겐(Invitrogen), 미국 소재), 둘베코 변형 이글 배지(하이클론(Hyclone), 미국 소재), 소태아혈청(하이클론, 미국 소재), B27 배지(인비트로겐, 미국), N2 배지(인비트로겐, 미국), bFGF 및 EGF(R&D, 미국 소재).

(2) 미분화 상태 GIC의 보관

시험관내 바이오패닝 분석, 개별 파지 스크리닝을 위한 단백질 분리, 경합(competition) 분석 및 펩타이드 풀-다운(pull-down) 분석을 위해, GIC를 B27, N2, bFGF 및 EGF(R&D)의 존재하에 neurobasal 배지에 현탁된 뉴로스피어(neurosphere)로 보관하였다(Lee 등, 2006). 세포에 근거한 파지 ELISA 분석 및 펩타이드 침투 분석을 위해서는 라미닌-피복된 플레이트 상에 세포를 보관하였다[Pollard et al,, 2009].

(3) GIC의 분화 유도

GIC를 분화시키기 위하여 10% 소태아 혈청(FBS; 하이클론)을 함유한 둘베코 변형 이글 배지(DMEM; 하이클론)에 세포를 2주 이상동안 보관하였다.

2. 시험관내 바이오패닝

(1) 파지 디스플레이트 펩타이드 라이브러리

일반적으로, 파지 디스플레이 방법은 세포, 기관 또는 조직을 비롯한 특정 표적에서 발현되는 특이적 수용체를 표적으로 하는 펩타이드 또는 단백질 리간드를 밝히는 방법이다. 본 발명에서는 미분화 GIC를 특이적으로 표적으로 하는 펩타이드 리간드를 밝히기 위해서 랜덤 7-mer 랜덤 펩타이드를 나타내는 파지 디스플레이 라이브러리를 사용하였다(Ph.D.-C7C^TM Phage Display Peptide Library Kit, New England Biolabs, 미국 소재). 상기 파지 라이브러리는 pIII 피복 단백질의 N-말단 단부에 랜덤 7-mer 펩타이드를 도 2에 기재된 바와 같이 나타낸다.

Ph.D.-C7C^TM 파지 디스플레이 펩타이드 라이브러리내 펩타이드 삽입물은 21-mer 뉴클레오타이드 형태로 발현된다. 랜덤 뉴클레오타이드 tRNA amber 정지 코돈(TAG) 돌연변이 숙주 E. Coli에서 예상치못한 정지 코돈을 회피하기 위해서 ER278을 사용하였다.

파지 라이브러리 바이오패닝을 위해 하기 화합물 및 배지를 사용하였다.

용액	성분	준비 및 보관
LB 배지	10g 박토-트립톤, 5g 효모 추출물, 1리터 탈염수 중 5g NaCl	오토클레이브, 실온 보관
LB/IPTG/Xgal 플레이트	LB 배지, 15g/L 아가, 1mL IPTG/Xgal	오토클레이브, 70℃ 미만으로 냉각, IPTG/Xgal을 부가. 암실 4℃에서 플레이트상에 보관
아가로즈 상면	10g 박토-트립톤, 5g 효모 추출물, 5g NaCl, 1g MgCl₂6H₂O, 7g 아가로즈	오토클레이브, 50mL 분액으로 디스펜싱. 실온에서 고형물로 보관, 필요시 오븐에서 용융
테트라사이클린 스톡(stock)	에탄올중 20mg/ml	암실에서 -20℃로 보관. 사용전 교반(vortex)
LB-Tet 플레이트	LB 배지, 15g/L 아가, 1mL 테트라사이클린 스톡	오토클레이브, 70℃ 미만으로 냉각, 테트라사이클린 스톡을 부가. 암실 4℃에서 플레이트상에 보관
블로킹 완충액	0.1M NaHCO₃ (pH 8.6), 5mg/mL BSA, 0.02% NaN₃	멸균 여과, 4℃ 보관
TBS	50mM 트리스-HCl (pH 7.5), 150mM NaCl	오토클레이트, 실온 보관
PEG/NaCl	20% (w/v) 폴리에틸렌 글리콜-8000, 2.5M NaCl	오토클레이브, 실온 보관
요오드화물 완충액	10mM 트리스-HCl (pH 8.0), 1mM EDTA, 4M NaI	암실에서 실온 보관

(3) 시험관내 파지 디스플레이 절차

미분화 GIC에 대하여 결합 친화도를 갖는 펩타이드 라이브러리를 밝히기 위해서 시험관내 바이오패닝을 하기와 같이 실시하였다.

종양 스피어(tumor sphere)를 기계적으로 단일 세포로 분해하고, 생존 세포수를 트립판 블루 염색법에 의해 정하였다. 죽은 세포로 수렴하는(converging) 파지 풀을 방지하기 위해서 바이오패닝은 10% 미만의 죽은 세포를 함유한 세포 개체군을 이용하여 실시하였다. 전체적으로, Ph.D.-7 파지 라이브러리(New England BioLabs) 1x10¹¹ 플락-형성 단위(PFU)를, 1% 소혈청 알부민(BSA)을 함유하는 칼륨-완충 식염수(PBS)에서 5 x 10⁵ GIC와 함께 4℃에서 30분동안 배양하였다. 세포 및 결합 파지를 3분동안 3,OOOrpm으로 원심분리하여서 펠릿화하였다. 상부 수성상을 제거한 후에 세포를 0.05% 트윈(Tween) 20을 함유하는 PBS로 3회 세척하였다. 생성된 결합 파지를 글리신-HCl 용액(pH 2.0)을 이용하여 세포로부터 분리시키고, 이어서 세포를 1분동안 14,000rpm으로 원심분리하여서 제거하였다. 분리된 파지는 2M 트리스계 용액으로 중화시키고(pH 7.0까지), 플락 형성 분석에 의해 적정하였다.

3. 개별 파지 스크리닝

개별 파지의 스크리닝 및 경합 분석을 위해, Tur 등의 방법을 하기와 같이 변형시켰다(도 3 참조).

ProteoExtract Native Membrane Protein Extraction Kit(Calbiochem)를 제조업체 설명서에 따라 사용하여 전체 단백질의 불용성 분획물을 추출하였다. 불용성 막 단백질(20μg/mL)을 96-웰 MaxiSorp High Protein-Binding Capacity ELISA 플레이트(Nunc) 상에 피복하였다. 3% BSA 및 3% 탈지유를 함유하는 PBS를 사용하여 플레이트를 30분동안 블로킹하였다. 파지 ELISA 분석을 위해서는 신선하게 제조된 개별 파지(1 x 10⁹)를 각 플레이트 웰에 적용하고, 1시간동안 결합하도록 하였다. 결합되지 않은 파지를 제거하고, 이어서 0.025% 트윈 20을 함유하는 PBS로 5회 세척한 후에, HRP-결합된 pVIII 항체(PBS중 1:1000으로 희석, GE Healthcare)를 30분동안 적용시켰다. 세척 이후에, 잔류 항체를 3,3‘,5,5'-테트라메틸벤지딘(TMB) 용액으로 정량하였다.

(4) 자료 분석

미분화 및 분화된 GIC의 불용성 분획물에 대한 44개 개별 파지의 상대적 결합 친화도를 하기 수학식에 따라 계산하였다. 여기서, Background는 파지를 갖지 않는 웰에서의 평균 흡착도를 의미한다.

[수학식 1]

상대적 결합 친화도 = (Abs_Testphage-Abs_Background)/(Abs_Nativephage-Abs_Background)

계산된 상대적 결합 친화도를 히트맵 히스토그램(heatmap histogram)으로 제공하였다(Heatmap builder 3.0 Heatmap development team, 미국 스탠포드 대학).

4. 개별적인 파지 결합 분석

(1) 파지 적정법의 절차

개별 파지 적정 분석을 위해 총 5 x 10⁵ 세포를 이용하였다. M13 파지 적정법은 하기와 같이 실시하였다.

ER2738 단일 콜로니를 LB 브로쓰 5 내지 10mL에 접종하고, mid-log 상(OD600~0.5)에 이를 때까지 진탕하에 배양하였다. 3mL Top 아가를 함유한 마이크로원심분리 튜브에 200μL배양물을 디스펜싱한 후에, 각각의 희석액 10mL(10⁸ 내지 10¹¹)을 각 튜브에 첨가하였다. 잠깐 교반하고 실온에서 1 내지 5분동안 배양한 후에, Top 아가를 예비 가온한 LB/IPTG/Xgal 플레이트에 부었다. 플레이트를 37℃에서 하룻밤 배양한 후에 청색 파지 플락의 개수를 정하였다.

(2) 파지의 세포 ELISA의 절차

파지의 세포 ELISA 분석을 하기와 같이 실시하였다[Kelly et al., 2009]. 라미닌(시그마 알드리츠)-피복된 96-웰 플레이트 상에서 증식된 콘플루언트 GIC를 4% PFA에 의해 고정시켰다. 세포를 1 x 10⁹(파지 ELISA 분석에 의해 결정됨) 파지와 함께 1시간동안 37℃로 배양하고, 0.05% 트윈 20을 함유하는 PBS로 3회 세척하고, 이어서 HRP-결합된 α-M13 pVIII 단백질 항체(1:1000)를 사용하여 검출하였다.

(3) 경합 분석

펩타이드 및 파지 경합 분석을 위해, CM-ELISA 분석을 지정된 펩타이드 존재 하에 실시하였다. 네스틴 항체 및 GICT 펩타이드 간의 경합 분석을 위해, 항체를 전배양(N5413; 시그마 알드리츠, 1:40, 실온에서 1시간)하고, CM-ELISA 분석을 전술한 바와 같이 실시하였다.

5. 펩타이드 카운터(peptide counter) 단백질의 동정

(1) 펩타이드 풀-다운 분석 절차

펩타이드 풀-다운 분석을 하기와 같이 실시하였다. 비오틴화 펩타이드 (40μg)를 PBS 중에서 1시간동안 아비딘 아가로즈 레진(Avidin Agarose Resin) (Pierce Biotechnology) 200μL 슬러리와 커플링시켰다. 불용성 막 단백질(1mg)을 PBS중 펩타이드-커플링된 수지 50μL와 함께 4℃에서 1일동안 적당한 교반하에 추가 배양하였다. 수지를 PBS로 6회 세척하고, 각 세척 단계 동안에 수지를 깨끗한 원심분리 튜브로 이동시켜서 튜브 벽에 대한 비특이적 결합을 최소화하였다. 펩타이드-결합된 수지를 세척 및 펠릿화한 후에, 4% β-머캅토에탄올을 함유한 1 x 소듐 도데실 설페이트(SDS) 샘플 완충액을 사용하여 생성된 결합 단백질을 용출시킨 후에 끓였다. 이어서, 샘플을 SDS-폴리아크릴아마이드 겔 전기영동(PAGE)으로 분리하고, 은 염색 키트(GE Healthcare Life) 또는 쿠마시에 블루(Coomasie Blue)를 이용하여 염색하였다.

(2) 풀-다운 단백질의 질량 분석

Tempo nano HPLC/QSTAR Elite system(Applied Biosystems)를 이용하여 농업과학기기공동센터(NICEM, 대한민국 서울 소재)에서 염색 밴드의 HPLC-MS/MS 분석을 실시하였다.

(3) 풀-다운 단백질에 의한 면역블롯 분석

네스틴 단백질(N5413; 시그마 알드리츠)의 N-말단 영역을 인식하는 항체를 이용하여 막-이동된 단백질을 면역블롯팅하였다.

6. 펩타이드 침윤 분석

펩타이드 침윤 분석을 하기와 같이 실시하였다.

라미닌-피복된 커버슬립 상에 씨딩한 후 1일째에, 세포를 로다민 B-결합된 펩타이드(2μg/mL)로 처리하고, 5% CO₂ 및 37℃로 4시간동안 유지하였다. 4% 파라포름알데하이드(PFA)로 세척 및 고정한 후에, 세포를 0.15% 트리톤-X 100으로 침투시키고, 4‘,6-다이아미디노-2-페닐인돌(DAPI)로 대조염색(counterstain)하였다. 공초점 레이저 현미경(LSM 5 Exciter system; Carl-Zeiss)를 이용하여 현미경 영상을 수득하였다. Metamorph programs(Molecular Devices)을 이용하여 데이터를 분석하였다.

7. 생체내 체내분포(biodistribution) 분석

(1) 동물 모델

피하 종양 마우스 모델은 다음과 같이 준비하였다. GIC-매개 종양의 피하 모델을 만들기 위해서 2 x 10⁶ 성상세포^Ink ^-4a/ ^ARF ^-/--Id4 세포를 Balb/c nu/nu 마우스(Jeon et al., 2009)에 피하 주사하였다. 주사후 한달째에 마우스를 생체내 체내분포 분석하였다.

교종 마우스 모델은 다음과 같이 준비하였다. GIC-매개 교종의 동소(orthotopic) 모델을 만들기 위해 5 x 10⁵ 성상세포^Ink ^-4a/ ^ARF ^-/--Id4 세포를 Balb/c nu/nu 마우스에 두개내 주사하였다(Jeon et al., 2009). 주사후 한달째에 마우스를 생체내 체내분포 분석하였다.

(2) 생체내 체내분포 분석

모든 마우스 실험은 서울국립대학교의 Animal care committee에서 승인받았고(승인번호: SNU-100525-2), 정부 및 관계기관 가이드라인에 따라 실시하였다. 생체내 체내분포 분석은 하기와 같이 실시하였다.

스트렙타비딘-결합된 Q-dot 800(인비트로겐)을 PBS 중에서 비오틴화 펩타이드에 1:1 몰비로 결합시켰다. 펩타이드 100μg을 함유하는 결합물을 종양-함유 Balb/c nu 마우스에 주사하였다. 주사한지 24시간(피하내 종양 모델) 또는 96시간(뇌종양 모델)째에 생체내 전신 다스펙트럼 감응성 Maestro II 시스템(CRI)를 이용하여 생체내 펩타이드 분포를 관측하였다.

8. 펩타이드 면역형광 분석

(1) GBM 환자 조직의 면역형광 분석

파라핀-포매된 인간 GBM 절편을 10% 당나귀 혈청을 이용하여 블로킹하고, 이어서 네스틴 항체(1:500 MAB1259, R&D Systems) 및 2μg/mL 비오틴화 펩타이드를 이용하여 동시 염색하였다.

(2) 펩타이드 위치(localization) 분석

로다민 B 결합된 GICT 펩타이드를 이용하여 펩타이드 위치를 관찰하였다. 마우스 이종이식 종양 염색의 경우에는 종양 동결절편을 10% 당나귀 혈청을 이용하여 블로킹하고, 이어서 하기 항체로 염색하였다: 네스틴(1:500, N5413; 시그마 알드리츠), S100β(1:500, S2644; 시그마 알드리츠), O4(1:500, MAB345; Chemicon) 및 Tuj1 (1:500, TUJ1; Covance). 형광 이소티오시아네이트(FITC)-결합된 2차 항체의 결합 후에, 공초점 레이저 현미경을 이용하여 형광 이미지를 수득하였다. 동시 염색 패턴을 Zeiss LSM Image Browser 소프트웨어를 이용하여 정량화하였다.

9. 통계

양측 꼬리검정 스튜던트 t-테스트를 이용하여 데이터를 분석하였다. 본 명세서에 기재된 통계적 유의도 수준은 P-값에 근거하였다. * P<0.05, ** P<0.01 또는 *** P<0.001이 통계적으로 유의한 것으로 간주되었다. Zeiss LSM Image Browser 소프트웨어를 이용한 Mander 중복계수 프로그램에 의하여 GICT 펩타이드 및 리니지 마커 간의 동시 존재(colocalization) 계수를 분석하였다.

실험 결과

1. 시험관내 파지 디스플레이에 의한 GIC-표적화 파지 및 펩타이드의 동정

(1) GIC 특징

GIC에 대한 특이 결합 친화도를 나타내는 파지인 일차 계통확립 세포주인 GIC1, GIC2 및 GIC3 세포를 준비하였다. 이들 세포는 EGF 및 bFGF로 보충된 무혈청 배지에서 tumor sphere를 형성하며 증식하는 반면, 혈청 함유 배지에서는 부착 상태로 있다(Lee 등, 2006)(도 4 참조).

이들 세포의 특징을 보다 분석하기 위해서 줄기 및 리니지 특이적 분화 마커 발현을 분석하였다. 도 4에서 알 수 있듯이, 상기 세포는 Neurobasal 배지에서 줄기 마커를 고도 발현하였다. 반면, 분화가 유도될 때, 성상세포의 경우 GFAP, 희돌기세포의 경우 O4, 뉴론의 경우 TuJ1 및 교질세포의 경우 S100B를 비롯한 리니지 특이적 분화 마커의 발현이 유의하게 유도되었다(도 6).

(2) 시험관내 바이오패닝

GIC에 결합하는 펩타이드를 동정하기 위해서 일차 계통확립 GIC 주 3개를 이용하여 Ph.D.-7 M13 파지 라이브러리와 함께 시험관내 파지 디스플레이를 실시하였다(Joo et al., 2008). 피부증식인자(EGF) 및 염기성 섬유모세포 증식인자(bFGF)로 보충된 무혈청 배지에서 종양 스페로이드(spheroid)로 증식하도록 상기 세포주를 자극하였다. GIC1 세포를 이용한 초기 바이오패닝에서, 1회 및 2회 라운드에 비해 연속 바이오패닝의 3회 라운드후에 결합 파지 적정량이 유의하게 증가하였으며, 이는 GIC에 대해 높은 친화도를 갖는 파지가 풍부함을 의미한다(도 7). 본 실험에서 이용가능한 모든 GIC에 대한 통상적인 결합 친화도를 나타내는 파지를 분리하기 위해서, 2개의 다른 GIC 세포주인 GIC2 및 GIC3의 추가 바이오패닝을 실시하였으며, GIC1 세포의 1회 바이오패닝에서 수렴 파지 풀이 수득되었다. GIC2 및 GIC3 세포의 각 1회 바이오패닝에서 수득된 회수 파지 적정량은 GIC1 세포의 3회 바이오패닝에서 수득된 파지 적정량에 비해 현저히 감소하였다. 그러나, 이들 파지 적정량은 2회 바이오패닝 후에 극적으로 증가하였다(도 7 참조).

(3) 개별 파지 스크리닝

분화된 대응물(counterpart)에는 결합하지 않으면서 미분화 GIC에 대하여 선택적 결합 친화도를 갖는 파지를 분리하고, GIC-결합 친화도에 근거한 바이오패닝 실험으로부터 분리된 파지가 비-종양형성 미분화 GIC 후대에 결합할 수 있는지 여부를 확인하였다. 따라서, 도 4에 나타낸 바와 같이, Tur 등의 문헌에 기재된 CM-ELISA 방법을 약간 변형하여 이용하였다. 즉, 미분화 및 분화된 GIC 세포로부터 생물학적 활성 막 단백질(불용성)을 추출하고, 96-웰 ELISA 플레이트 상에 상기 불용성 분획물을 피복하였다. 1 x 10⁹ 고유 파지(native phage)(파지 ELISA로 측정)에 상응하는 개별 파지를 각 웰에서 배양하였다. 결합되지 않은 파지를 세척하여 제거한 후에, 호스래디쉬 퍼옥시다아제-결합된 M13 파지 항체를 이용한 배양에 의해 결합 파지 양을 정하였다.

도 8에 나타난 바와 같이, 미분화 및 분화된 GIC의 불용성 분획물에 대한 44개 개별 파지의 상대적 결합 친화도가 히트맵 히스토그램(heatmap histogram)으로 제공되었다. 즉, 44개 개별 스크리닝된 파지중 4개(8.9%)가 미분화 GIC로부터 제조된 불용성 분획물에만 특이적 결합한 반면, 반 이상(25파지, 56.8%)이 미분화 및 분화된 GIC 둘다로부터의 불용성 분획물에 특이적 결합하였고, 나머지 15개 파지(34.3%)는 약한 결합 친화도를 나타내었다. 동일한 서열을 나타내지 않는 시퀀싱 분석된 4개 개별 파지 중에서 클론 17번 M13 파지의 pIII 단백질 태그를 갖는 ‘AQYLNPS' 펩타이드(별첨 아미노산 서열목록 참조)가 모든 시험한 GIC에 대하여 가장 높고 선택적인 결합 친화도를 나타내었다.

(4) GICT 파지의 분리

상기 클론 17번 및 그의 ‘AQYLNPS' 펩타이드를 각각 GIC-표적(GICT) 파지 및 펩타이드로 각각 명명하였다(도 9 참조).

도 8은 바이오패닝으로부터 수렴된 파지 풀로부터 수득한 개별 파지의 결합 친화도를 나타낸 것이다. 단백질 추출에 근거한 파지 ELISA 방법을 이용하여, NBE 배지(표피증식인자(EGF) 및 염기성 섬유모세포 증식 인자(bFGF)로 보충)에서 증식한 미분화 GIC3 및 DMEM(10% FBS로 보충)에서 증식한 분화 상대 세포에서 추출한 불용성 막 단백질과 함께 각각의 파지를 배양하였다. 고유 M13 파지의 배경 결합 친화도를 차감한 부호를 히트맵에 도시하였다.

도 9는 17번 클론(GICT) 파지의 아미노산 서열, 및 미분화 GIC3 및 그의 분화 대응 세포로부터 추출된 불용성 막 단백질에 대한 상대적 결합 친화도를 나타낸 것이다. 랜덤 펩타이드를 전혀 함유하지 않은 고유 파지를 음성 대조군으로 이용하였다.

2. 분화 GIC에 대한 GICT 파지의 선택적 결합 친화도

(1) 미분화 GIC에 대한 GICT 파지의 선택적 결합

미분화 GIC(EGF 및 bFGF로 보충된 무혈청 배지인 neurobasal medium (NBE)에서 증식) 및 그의 분화 대응 세포(10% 소태아혈청(FBS)으로 보충된 둘베코 변형 이글 배지(DMEM)에서 증식)에 대한 GICT 파지 펩타이드의 결합 친화도를 평가하기 위해서 통상적인 플락 형성 분석을 실시하였다(Lee 등, 2006). 고유 파지(임의의 디스플레이된 펩타이드가 없음)는 미분화 및 분화된 세포 둘다에 대해 특이적 결합 친화도를 나타내지 않았다. 역으로, GICT 파지-결합 친화도는 분화 대응 세포보다 모든 미분화 시험 GIC에서 유의하게 높았으며(도 10), 이는 미분화 GIC에 대한 GICT 파지의 특이적 결합 친화도를 의미한다.

또한, 미분화 및 분화된 GIC4 및 GIC5 세포(Joo 등, 2008)를 이용하여 세포에 근거한 ELISA 분석(Kelly et al., 2008)을 실시하였으며, 상기 세포는 EGFRvIII의 추가(엑손 2-7이 결손된 연속 활성화된 EGFR 돌연변이체)[Sugawa 등., 1990; Frederick et al., 2000] 및 게놈 결손에 의한 PTEN 손실을 각각 나타낸다(Steck 등, 1997; Sansal 등, 2004). 도 11에 나타낸 바와 같이, GICT 파지는 미분화된 GIC4 및 GIC5 세포에 결합할 수 있으나, 분화 대응 세포에는 결합할 수 없다.

(2) GBM 세포주에 대한 GICT 파지의 선택적 결합

GICT 파지는 NBE 배지에서 증식한 U87MN 교종세포로부터 유도된 tumorsphere에 결합하지만, NBE 또는 FBS-함유 DMEM에서 tumorsphere를 형성하지 못하였던, FBS-함유한 DMEM, LN229 및 A1207 교종 세포에서 증식한 U87MG 세포에는 부착하지 않았다(도 12 및 13).

(3) GICT 펩타이드-파지 경합 분석

미분화 GIC에 대한 GICT 파지의 결합이 펩타이드 리간드와 그의 추정 수용체(putative receptor) 간의 상호작용에 의해 조절되는지 여부를 연구하기 위해서, 합성 ‘AQYLNPS’GICT 펩타이드를 이용하여 경합 분석을 실시하였다. 미분화 및 분화된 세포에 대한 결합 친화도를 나타내지 않는 대조군 ‘HPTLHTS' 펩타이드는, 초기 파지 바이오패닝 실험에서와 마찬가지로, GICT 파지의 결합 친화도를 나타내지 않았다. 이와 대조적으로, GICT 펩타이드 농도가 증가할수록 미분화 GIC3 세포로부터 추출된 불용성 막 단백질에 대한 GICT 파지 결합 친화도는 투약량 의존적으로 현저히 감소하였으며(도 14), 이는 GICT 파지 또는 펩타이드가 특이적 대응 분자에 결합하고, 그 발현이 미분화 GIC에서 제한됨을 의미한다.

(4) 마우스 GIC 모델 세포에 대한 GICT 펩타이드의 결합 친화도

분화 4 억제제(Id4)는 종양 이질성과 함께 자기재생, tumor sphere 형성, 이상 분화, 종양-개시능 및 GBM 형성을 비롯한 여러 GIC 특징을 얻기 위하여 종양 억제제 유전자 Ink4a 및 Arf 유전자가 결손된 일차 마우스 성상세포를 유도하는 것으로 알려져 있다(Jeon et al., 2009).

따라서, 상이한 종으로부터 유래된 GIC에 대한 GICT 펩타이드의 결합 친화도 효과를 연구하기 위해서 상기 마우스 GIC를 이용하였다. FACS 분석에서 연구한 바와 같이, GICT 펩타이드는 Id4-유도된 미분화 마우스 GIC에 결합할 수 있었으나(즉, NBE 배지에서 tumorsphere를 형성할 수 있었다), 분화된 대응 세포에는 결합하지 않았다(FBS-함유 DMEM에서 부착 세포로 증식됨, 도 15). 이러한 데이터는 유전자 배경과 상관없이 GIC의 미분화 소양에 의해 GICT 파지의 결합 친화도가 결정됨을 증명한다.

3. GICT 펩타이드의 결합 대응 분자의 동정

(1) 펩타이드 풀-다운 분석

'AQYLNPS' GICT 펩타이드를 이용한 경합 분석에 의해 수득된 결과에 근거하여, NBE 또는 FBS-함유 DMEM에서 증식된 Id4-유도된 마우스 GIC로부터 제조된 불용성 막 및 가용성 단백질에서 펩타이드-결합 분자를 동정하는 펩타이드 풀-다운 분석을 실시하였다. NBE 배지에서 증식된 GIC에 대한 GICT 파지 및 펩타이드의 특이적 결합 친화도와 마찬가지로, 본 분석에서 수득된 단백질의 은염색법에 따르면, 약 60 kDa 단백질이 NBE 배지에서 증식된 마우스 GIC의 불용성 막 단백질에서 특이적으로 검출되었다(도 16).

(2) 풀-다운 단백질의 질량 분석

상기 약 60kDa 단백질의 용출물을 고성능 액상 크로마토그래피-탠덤 질량 분광분석법(HPLC-MS/MS)에 의해 분석하여서, 수득된 3가지 펩타이드 아미노산(a.a.) 서열이 마우스 네스틴 단백질의 N-말단 a.a. 서열과 동일함을 밝혀냈다(도 17).

(3) 풀다운 단백질에 의한 면역블롯 분석

네스틴은 세포골격(cytoskeleton) 성분으로 작용하는 약 200 내지 240 kDa 중간 필라멘트 단백질이며, 중성 줄기 세포 및 GIC를 비롯한 여러 정상 및 이상 조직-특이적 줄기 또는 전구체 세포에서 제한적으로 발현된다. GICT 펩타이드에 결합하는 약 60kDa 네스틴이 네스틴의 N-말단 아이소형일 수 있다.

본 실시예에서는 N-말단(N-5413) 또는 C-말단(MAB1259) 에피토프(epitope)를 인식하는 2개 네스틴 항체를 사용하는 GICT 펩타이드 풀-다운 분석으로부터 제조된 단백질을 면역블롯팅하여서 네스틴의 N-말단 아이소형에 대한 GICT 펩타이드의 결합 특이성을 추가 연구하였다.

N-말단 네스틴-상호작용 항체(N-네스틴 항체)는 Id4-유도 마우스 GIC(도 18) 및 인간 GIC3 세포(도 19)의 불용성 막 단백질에서 네스틴의 약 60kDa 아이소형과 반응하지만 C-말단 네스틴-상호작용 항체는 이들과 반응하지 않아서, 마우스 및 인간 네스틴단백질의 N-말단 영역 간의 높은 보존과 일치한다(상동성 > 80%).

(4) 네스틴 항체 - 펩타이드 풀-다운 분석

본 발명자들은 N-네스틴 항체가 미분화된 GIC3 세포의 분리된 불용성 막 단백질을 표적으로 하는 GICT 펩타이드와 경쟁할 수 있음이 밝혀졌다(도 20).

FACS 분석에 따르면, N-네스틴 항체는 마우스 GIC의 미분화 tumorsphere에 결합할 수 있으나, 분화된 부착성 대응 세포에는 결합할 수 없었다(도 21).

네스틴 항체와 GICT 펩타이드 간의 경합은 또한 항-마우스 네스틴 항체에 의해 발생할 수도 있으며, Id4 유도 마우스 GIC로부터의 막 단백질에서 네스틴 양성 세포(Rat-401)의 immunosorting에 대하여 경합하는 것으로 알려졌다(Rui 등, 2010)(도 22 참조).

상기로부터, 본 실험 데이터는 GICT 펩타이드가 미분화된 GIC의 막 구획물에 위치한 네스틴의 신규한 짧은 N-말단 아이소형에 결합하여서 GIC를 특이적으로 표적화함을 증명한다.

4. GICT 펩타이드의 진단능

GICT 펩타이드 및 네스틴 단백질 간의 결합 데이터에 따르면, GICT 펩타이드는 인간 GBM 조직에서 네스틴-양성 GIC에 결합할 수 있다. 따라서, 비오틴화-GICT (B-GICT) 펩타이드 및 네스틴 항체를 이용하여 파라핀-포매된 인간 GBM 조직 샘플을 이용한 면역형광 분석을 실시하였다. 놀랍게도, B-GICT 펩타이드에 결합한 대부분의 종양 세포는 네스틴 항체에 의해 특이적으로 인식되었고(도 23), 이는 뇌종양 환자의 GIC를 시각화하는데 있어서 GICT 펩타이드를 진단용으로 이용할 수 있음을 의미한다.

5. GICT 펩타이드의 세포 침윤

GIC가 그 줄기 소양을 부착 상태에서 유지하도록 하는 EGF 및 bFGF로 보충된 무혈청 NBE 배지에서 라미닌-피복된 커버슬립 상에서 증식된 미분화 GIC4 세포로 R-GICT 펩타이드를 처리하여서 펩타이드 내재화 분석을 실시하였다(Pollard et al,, 2009년). 로다민 B-결합된 대조군 펩타이드와 대조적으로, R-GICT 펩타이드는 미분화 GIC4 세포에서 내재화되었으나, 분화 대응 세포에서는 내재화되지 않았으며(도 24), 이는 GICT가 항암 약물 또는 영상화 분자 담체로서 이용될 수 있음을 나타낸다.

6. GICT 펩타이드의 생체내 생체분포

상기 펩타이드가 생체내에서 GBM를 검출할 수 있는지를 연구하기 위해서 Id4-유도 마우스 GIC를 이용한 생체내 GBM 모델을 제작하였는데, 선행 연구에 따르면 상기 마우스 GIC가 이종 세포 개체군을 갖는 GBM을 발생시키기 때문이다(Jeon 등, 2008). Quantum dot (Q-dot) 800-결합된 GICT (Q-GICT) 펩타이드를 종양-함유 마우스에 정맥 주사하여서 생체내 생체분포 분석을 실시하였다. GBM-함유 마우스의 전신 형광 이미지화에 따르면, 강한 특이적 신호가 Q-GICT 펩타이드 주사후 1일째 피하 종양 조직(도 25, 26) 또는 Q-GICT 펩타이드 주사후 4일째 정위 뇌종양(도 27)에서 관찰되었다. 또한, 피하내 및 뇌종양에서의 Q-GICT 펩타이드의 축적은 추출 종양으로부터 형광 신호가 검출될 때에 보다 명확하게 관찰되었으며(도 28), 이는 GICT 펩타이드가 종양을 표적화할 수 있음을 의미한다.

7. GICT 펩타이드 위치 분석

GICT 펩타이드가 생체내 마우스 GBM 모델에서 미분화 GIC를 표적으로하는지 여부를 연구하기 위해서, 뇌종양 절편에서 GIC(네스틴-양성), 성상세포(S100β-양성), 뉴론 세포(Tuj1-양성) 및 희소돌기아교세포(O4-양성)와 같은 다양한 뇌세포 리니지 마커와 함께 로다민 B-결합된 GICT(R-GICT) 펩타이드의 공동 존재(colocalization)를 연구하였다. 시험관내 실험 결과와 마찬가지로, R-GICT 펩타이드는 네스틴-양성 GIC와는 강하게 공동 존재하였으나(도 30), Tuj1-양성, S100β-양성 및 O4-양성 분화 종양 세포와는 공동 존재하지 않았다(도 31). 통계적으로, 네스틴-양성 GIC에 대한 GICT 펩타이드-표적화 특이성은 비교적 분화된 교종세포에 대한 표적 특이성과는 유의하게 달랐다(도 32).

8. 종양증식에서 GICT 펩타이드 결합된 모델 항암 약물의 효과

종양조직으로 항암 약물을 전달하는데 있어서 GICT 펩타이드 효과를 입증하기 위해서 하기 모델을 이용하였다: 항생 펩타이드 리간드로 알려져 있는 d(KLAKLAK)2 펩타이드. 상기 펩타이드는 지질 이중층의 조성 차이로 인해 원핵세포막을 통합시켜서(진핵세포막은 아님) 구멍을 만든다. 흥미롭게도, 상기 펩타이드가 진핵세포에 침윤될 때, 리보좀 막이 파괴되어 세포가 세포사멸된다. d(KLAKLAK)2 펩타이드의 침윤 의존적 작용은 세포의 약물 전달 시스템에 대해 이상적인 모델이다.

GICT 펩타이드는 d(KLAKLAK)2 펩타이드와 결합되며, 종양 함유 마우스에 정맥내 주입된다. GICT-d(KLAKLAK)2 결합물이 주입되면, 펩타이드 비-결합된 대조군에 비해 종양 증식이 유의하게 감소하였다(도 33).

서열목록 전자파일 첨부

Claims

서열번호1로 표시되는 아미노산 서열로 구성된 악성 미분화 종양줄기세포 표적 펩타이드.
서열번호1로 표시되는 아미노산 서열로 구성된 악성 종양 진단용 마커.