KR101351331B1 - 표적지향적 약물전달을 위한 자성나노입자 및 이를 이용한 약물전달체의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 표적지향적 약물전달을 위한 자성나노입자 및 이를 이용한 약물전달체의 제조방법에 관한 것으로서, 자세하게는 수용액 상에서 형성시킨 Fe³⁺이 함침된 리포좀 표면을 실리카로 코팅하고 환원함으로써 구형의 자성나노입자를 제조하고, 상기제조된 자성나노입자 표면을 온도-감응성(temperature-responsive) 폴리머와 결합시켜 표적지향적 약물전달시스템을 구축하는 방법에 대한 것이다.

Description

표적지향적 약물전달을 위한 자성나노입자 및 이를 이용한 약물전달체의 제조방법{Synthesis method of magnetic nanoparticles for targetable drug delivery system and drug delivery vector using the same}

본 발명은 표적지향적 약물전달을 위한 자성나노입자 및 이를 이용한 약물전달체의 제조방법에 관한 것으로서, 자세하게는 수용액 상에서 형성시킨 Fe^{3 +}이 함침된 리포좀 표면을 실리카로 코팅하고 환원함으로써 구형의 자성나노입자를 제조하고, 상기 제조된 자성나노입자 표면을 온도-감응성(temperature-responsive) 폴리머와 결합시켜 표적지향적 약물전달시스템을 구축하는 방법에 대한 것이다.

약물전달시스템 (Drug Delivery System : DDS)이란 치료부위에 질병 치료용 약물을 효율적으로 전달함으로서 약물의 부작용을 줄이고, 약물에 대한 환자의 순응도를 높이며 효능 및 효과를 극대화 할 수 있도록 제형을 설계하고 약물치료를 최적화하는 기술을 총칭한다.

약물전달시스템은 지속성 약물방출 시스템, 제어방출 시스템, 표적 지향적 약물전달 시스템으로 분류할 수 있는데, 지속성 약물방출 시스템은 생체 이용률이 낮거나 약물이 너무 서서히 흡수되거나 지나치게 빨리 소실되는 경우에 약물의 방출 속도를 늦춤으로써 문제점을 보완하고자 설계된 제형이고, 제어방출 시스템은 표적부위의 농도를 제어함으로써 실제의 치료효과를 조절하고자 설계된 제형이다.

표적 지향적 약물 전달 시스템은 원하는 부위에 약물을 전달하여 생체의 다른 부분에 대한 부작용을 최소화하고 그 효율성을 극대화하기 위해 개발되었으며, 특히 독성이 강한 항암제의 부작용을 줄이기 위해 많이 이용된다. 표적 지향적 약물전달시스템은 능동형과 수동형 시스템의 두 가지 방식으로 나뉘는데 수동형은 암세포 주변의 혈관 조직의 느슨함을 이용하고 능동형은 암세포가 발현하는 특이적인 단백질을 인식하는 항체나 앱타머와 같은 리간드를 이용한다.

약물전달시스템을 위해 시도되는 수단으로는 피부를 통해 약물을 전달하는 패치 (patch) 제조기술, 인체 내 특정부에만 효력을 갖도록 지질로 마이크로캡슐을 만드는 기술, 비수용성 약물을 주사액으로 만드는 기술 그리고 고체 분산체 (solid dispersion), 겔제 (Gel), 나노입자(Nanoparticles), 리포좀 (Liposomes), 마이크로에멀젼 (Microemulsions), 펠렛(Pellets), 매트릭스정제 (Matricx tablets), 삼투압제제 (Osmotic pressure) 등이 있다.

한편, 리포좀(liposome)은 1960년대 초반 Bangham 등이 전자 현미경을 통해 그 구조를 발견한 이후 생체막 모사연구와 약물전달 기구의 개발에 있어서 상당히 주목받는 연구 분야가 되어왔다. 리포좀의 구조는 도 1에 도시된 바와 같이 극성 지질이 물에 분산되었을 때 자발적으로 형성되는 밀폐형 이중층막 (closed bilayer membrane)과 막 내부의 수용성 공간으로 이루어져 있다. 리포좀의 이중층막은 분자성 물질들과 상호 작용하고 이들을 투과시키거나 포획할 수 있다. 소수성 분자들은 리포좀의 이중층막 사이에 분포하여 극성 부분에 까지 길게뻗은 사슬들에 의해 마치 닻을 내린 것처럼 고정되어 있고, 친수성 분자들은 리포좀의 수용성 공간에 포획되어 그 안에서 비교적 자유롭게 움직인다.

이러한 포획능력은 수 일에서 수 주일 동안 리포좀 내에 물질을 잡아 둘 수 있게 해주며, 작은 이온들은 이중층막 사이로 확산하거나, 전달체 (carriers)의 도움이나 기공(pores)을 통해 이중층막을 통과할 수 있다. 특히 리포좀은 여러 약물들과 호르몬, 효소 등을 쉽게 포획할 수 있고 이렇게 포획된 약제들은 구강이나 근육 또는 혈관주사에 의하여 신체에 투입되었을 때, 지속적으로 약물을 방출하는 지속성제제로 이용하거나, 표적부위에 약물이 도달되도록 하여 독성발현을 줄이며 약효를 증가시키는 등의 포획되지 않았을 때와는 다른 약리학적 성질을 갖는다. 따라서 리포좀은 생체막의 모사연구 외에도 약물전달체 (drug carrier) 및 적중화 (targeting) 분야에서 그 이용성이 연구되고 있다.

한편,‘온도-감응성 폴리머'란, 온도 변화에 따라 폴리머의 상이 전이되는 폴리머를 말하며, 졸(sol)에서 겔(gel) 또는 겔에서 졸로 변한다. 이때, 일정 온도 이하에서는 졸이고 그 온도를 초과하면 겔로 변할 때 이때의 온도를 LCST(Low Critical Solution Temperature)라고 한다. 도 2에서 나타낸 것처럼 LCST를 갖는 고분자 하이드로 겔은 LCST 이상으로 온도가 증가할 때 응축하여 겔이 되며 이러한 부류를 승온 하이드로 겔이라 한다.

이러한 온도-감응성 폴리머는 지난 10 여년 간 광범위하게 연구되어 왔으며, 많은 고분자들은 수용액 상에서 저임계 용액온도(LCST)가 나타나며, 친수성기와 소수성기가 균형을 이루고 있다. 온도 감응성 고분자는 온도의 변화에 민감하게 반응하는 성질을 가지고 있기 때문에 약물 전달 시스템에 있어서 매우 중요한 고분자이다. 온도에 의해 민감한 반응을 보이는 고분자 중에서 작용그룹에 따른 예를 하기 표 1에 나타내었다.

Functional Group	Polymer
Ester Group	Poly(ethylene oxide)(PEO) Poly(EO-propylene oxide) random copolymer PEO-PPO-PEO triblock surfactants Alkyl-PEO block surfactant Poly(vinyl methyl ether)
Alcohol Group	Hydroxypropyl acrylate Hydroxypropyl methylcellulose Hydroxypropyl cellulose Hydroxyethyl cellulose Methylcellulose Poly(vinyl alcohol) derivatives
Amide Group	Poly(N-substituted acrylamide) Poly(N-acryloyl pyrrolidine) Poly(N-acryloly piperidine) Poly(acryl-L-amino acid amides) Poly(ethyl oxazoline)

대표적인 온도감응성 폴리머인 PNIPAm은 30~35℃ 정도의 체온 부근에서 소수성 상호작용에 의해 저임계 용액온도를 나타내 고분자가 침전되고, 그 이하의 온도에서는 투명한 수용액으로 변한다. 일반적으로 PNIPAm을 이용하여 약물 전달로서의 응용이 가능하며, PNIPAm 수화겔은 저임계 용액온도 이하에서는 팽윤되어진 상태에서 약물을 담지 시킨 후, 저임계 용액온도 이상으로 온도를 상승시켜 겔이 응축되는 현상을 이용하여 담지하고 있던 약물을 방출시킬 수 있다.

온도-감응성 폴리머는 폴리머 골격에 결합되어 있는 소수성기와 친수성기의 균형에 따라 LCST가 변하며 일반적으로 친수성기의 함량이 증가하면 상전이 온도가 올라가고 소수성기가 증가하면 반대로 상전이 온도가 내려간다. 이러한 온도-감응성 폴리머는 약물 전달 시스템을 중심으로 하는 의료용 재료분야, 환경 분야, 화장품 분야 등 다양한 분야에서 응용 연구가 활발히 진행되고 있다.

본 발명에서는 약물전달체로서 유용한 리포좀과 온도 감응성 폴리머를 이용하여 표면에 다양한 기능기를 결합시켜 특정한 물질과의 상호작용을 통해 원하는 물질의 흡착 또는 탈착이 가능할 뿐만 아니라 원하는 물질을 원하는 표적 부위로 이동시켜 온도 변화에 따른 약물의 로딩 및 방출을 용이하게 할 수 있는 표적지향적 약물전달체를 개발하였다.

본 발명의 목적은 표면에 원하는 다양한 기능기를 결합시켜 특정한 물질과의 상호작용을 통해 원하는 물질의 흡착 또는 탈착이 가능하며, 자성을 띠고 있어 결합한 특정 물질을 운반해서 특정한 장소에 방출시킬 수 있는 표적지향적 약물전달을 위한 자성나노입자 및 이를 이용한 약물전달체의 제조방법을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 목적은 자성나노입자에 온도 변화에 따라 폴리머의 상이 전이되는 폴리머를 결합시켜 온도 변화에 따른 약물의 로딩 및 방출을 용이하게 하는 표적지향적 약물전달을 위한 자성나노입자 및 이를 이용한 약물전달체의 제조방법을 제공하는 것이다.

상술한 바와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 i) 인지질(phospholipid) 용액과 Fe³⁺이 함유된 수용액을 혼합하여 Fe³⁺이 함침된 리포좀 분산액을 제조하는 단계; ⅱ) 상기 Fe^{3 +}이 함침된 리포좀 분산액과 실리카 전구체를 반응시켜 실리카가 코팅된 Fe^{3 +} 함침 리포좀 입자를 제조하는 단계; 및 ⅲ) 상기 실리카가 코팅된 Fe^{3 +} 함침 리포좀 입자를 수소 분위기에서 환원시키는 단계;를 포함하는 자성 나노입자의 제조방법을 제공한다.

이때, 상기 인지질로는 일 실시예로 레시틴(lecithin)이 사용될 수 있으며, 상기 리포좀 분산액과 실리카 전구체의 반응은 리포좀의 파괴를 줄이기 위하여 pH 2~4의 산성조건 하에서 이루어지는 것이 바람직하고, 상기 실리카가 코팅된 Fe^{3 +} 함침 리포좀 입자는 충분한 자성특성을 나타내기 위하여 600~1000℃에서 환원시키는 것이 바람직하다.

또한, 본 발명은 상기 제조방법을 통하여 특정 물질을 운반해서 특정한 장소에 방출시킬 수 있는 자성 나노입자를 제공한다. 이때 상기 자성나노입자의 크기는 300~500nm이며, 상기 자성나노입자의 포화자화(Ms) 값은 20~30emu/g인 것이 바람직하다.

한편, 본 발명은 i) 상기 제조된 자성 나노입자의 표면을 개질시켜 이중결합을 부여하는 단계; 및 ⅱ) 상기 이중결합이 부여된 자성 나노입자의 표면에 온도감응성 폴리머를 결합시키는 단계;를 포함하는 표적지향적 약물전달체의 제조방법을 제공한다.

상기 자성 나노입자 표면에 이중결합을 부여하는 개질은 실란 커플링 시약인 3-MOP(3-(trimethoxysilyl)propyl methacrylate)을 사용하여 이루어질 수 있다. 또한, 상기 온도감응성 폴리머는 온도 변화에 따라 폴리머의 상이 졸-젤 상호 간에 전이되어 약물을 체내에서 방출할 수 있는 물질로서, 일 실시예로 PNIPAm(poly(N-isopropylacrylamide))가 사용될 수 있으며, 상기 PNIPAm는 NIPAm(N-isopropylacrylamide) 단량체, NMBA(N,N'-Methylenebisacrylamide) 가교제, KPS(Potassium persulfate) 개시제를 사용하여 자성 나노입자 표면에 결합될 수 있다. 이때, 상기 온도감응성 폴리머가 충분히 중합되도록, 상기 NMBA/NIPAm 농도는 3~11%인 것이 바람직하다.

본 발명의 자성나노입자는 표면이 실리카로 쌓여 있어 원하는 다양한 기능기를 결합시켜 특정한 물질과의 상호작용을 통해 원하는 물질의 흡착 또는 탈착이 가능하고, 자성을 띠고 있어 결합한 특정 물질을 운반해서 특정한 장소에 방출시킬 수 있다. 또한, 본 발명은 자성나노입자에 온도 변화에 따라 폴리머의 상이 전이되는 폴리머를 결합시켜 온도 변화에 따른 약물의 로딩 및 방출을 용이하게 하는 표적지향적 약물전달체를 구현할 수 있다.

도 1 - 리포좀의 구조를 이중막 형성 과정을 보여주는 모식도
도 2 - 온도감응성 폴리머의 상 전이 메커니즘을 보여주는 모식도
도 3 - MNPs의 합성과정을 보여주는 모식도
도 4 - PNIPAm이 결합된 MNPs의 합성과정을 보여주는 모식도
도 5, 6 - PNIPAm이 결합된 MNPs의 제조공정을 보여주는 반응식 및 모식도
도 7 - (a) Fe^{3 +}이 함침된 리포좀, (b) 실리카 코팅된 Fe^{3 +} 함침 리포좀의 FT-IR 스펙트라
도 8 - (a) Fe^{3 +}이 함침된 리포좀, (b) Fe^{3 +}이 함침된 리포좀, (c) 실리카 코팅된 Fe^{3 +} 함침 리포좀 및 (d) 실리카 코팅된 Fe^{3 +} 함침 리포좀의 TEM 이미지
도 9, 10 - 실리카 코팅된 Fe^{3 +} 함침 리포좀의 다양한 환원 온도에 따른 FT-IR 및 TGA 스펙트라
도 11 - 실리카 코팅된 Fe^{3 +} 함침 리포좀의 환원 반응 후의 이미지
도 12 - (a) 실리카 코팅된 Fe^{3 +} 함침 리포좀의 SEM 이미지, (b) 실리카 코팅된 Fe^{3 +} 함침 리포좀 및 (c) MNPs의 TEM 이미지
도 13 - (a) 실리카 코팅된 Fe^{3 +} 함침 리포좀 및 (b) MNPs의 EDAX 분석데이터
도 14 - (a) 실리카 코팅된 Fe^{3 +} 함침 리포좀 및 (b) MNPs의 XRD 패턴
도 15 - (a) MNPs, (b) 3-MOP modified MNPs 및 (c) PNIPAm이 결합된 MNPs의 TEM 이미지
도 16 - (a) MNPs 및 (b) PNIPAm이 결합된 MNPs의 SQUID 결과
도 17, 18 - NIPAm/3-MOP-MNPs의 weight ratio변화에 따른 PNIPAm이 결합된 MNPs의 FT-IR 및 TGA 스펙트라
도 19, 20 - NMBA 농도변화에 따른 PNIPAm이 결합된 MNPs의 FT-IR 및 TGA 스펙트라

상기 본 발명의 일 양상에 따른 표적지향적 약물전달을 위한 자성나노입자 및 이를 이용한 약물전달체의 제조방법을 첨부한 도면을 참조하여 상세하게 설명하면 다음과 같다.

본 발명의 자성 나노입자는 도 3에 도시된 바와 같이 i) 인지질 용액과 Fe³⁺ 이 함유된 수용액을 혼합하여 Fe^{3 +}이 함침된 리포좀 분산액을 제조하는 단계, ⅱ) 상기 Fe^{3 +}이 함침된 리포좀 분산액과 실리카 전구체를 반응시켜 실리카가 코팅된 Fe³⁺ 함침 리포좀을 제조하는 단계, 및 ⅲ) 상기 실리카가 코팅된 Fe^{3 +} 함침 리포좀입자를 수소 분위기에서 환원시키는 단계를 통하여 제조된다.

이때, 상기 인지질로는 일 실시예로 레시틴(lecithin)이 사용될 수 있으며, 본 발명은 리포좀을 틀로 이용한 자성나노 입자를 제조하기 위해 Fe³⁺이 함침된 리포좀에 TEOS (tetraethyl orthosilicate) 등의 실리카 전구체를 사용하여 가수분해와(hydrolysis)와 축합반응(condensation)을 통해 실리카 코팅을 하는 것을 특징으로 한다.

상기 Fe³⁺이 함침된 리포좀은 리포좀을 구성하고 있는 인지질 분자 내의 인산 음이온 간의 정전기적 반발력을 감소시킬 수 있는 Na⁺을 Fe^{3 +}으로 대체하여 제조할 수 있으며, 상기 실리카를 코팅하는 과정에 흔히 사용되는 암모니아수를 이용한 염기성 조건하에서의 반응은 생성된 리포좀 자체를 파괴하는 경향이 있었으므로 리포좀 용액을 에탄올 용액 등에 분산시켜 pH 2~4의 산성용액에서의 반응시키는 것이 바람직하다.

상기 코팅된 실리카 물질에 유기 기능성을 부여함으로써 표면 극성(친수성, 소수성, 게스트 분자와의 결합)의 조절, 표면 반응성의 변화, 외부 공격으로부터 표면 보호, 물질의 벌크 특성(기계적, 과학적 특성) 변화 등을 가져올 수 있다. 상기 실리카는 비정질 실리카와 같이 표면에 많은 실라놀(Si-OH) 그룹이 존재하는데, 이는 유기 기능성을 고정할 수 있는 지점으로서의 역할을 한다.

상기 실리카가 코팅된 Fe³⁺이 함침된 리포좀은 수소 분위기 하에서 환원함으로써, 최종적으로 자성 나노입자를 얻을 수 있다. 상기 실리카가 코팅된 Fe³⁺ 함침 리포좀은 충분한 자성특성을 나타내기 위하여 600~1000℃에서 환원시키는 것이 바람직하며, 600℃이하에서는 자성을 나타내기 어려우며, 1000℃에서는 나노입자 자체의 구조가 붕괴될 수 있다. 제조된 나노입자는 함유된 약물을 원하는 장소로 전달하기에 적합하도록 300~500nm의 입자크기, 20~30emu/g의 포화자화(Ms) 값을 가질 수 있다.

이와 같이 제조된 자성 나노입자는 실리카로 쌓여 있어 원하는 기능기를 결합시켜 특정한 물질과의 상호작용을 통해 원하는 물질의 흡착 또는 탈착이 가능하고 자성을 띠고 있어 결합한 물질을 운반해서 특정한 장소에 방출시킬 수 있다.

한편, 본 발명의 표적지향적 약물전달체는 도 4에 도시된 바와 같이 i) 상기와 같이 제조된 자성 나노입자의 표면을 개질시켜 이중결합을 부여하는 단계, 및 ⅱ) 상기 이중결합이 부여된 자성 나노입자의 표면에 온도감응성 폴리머를 결합시키는 단계를 통하여 제조할 수 있다.

상기 자성 나노입자 표면에 이중결합을 부여하는 개질은 실란 커플링 시약인 3-MOP(3-(trimethoxysilyl)propyl methacrylate)을 사용할 수 있으며, 상기 온도감응성 폴리머는 온도 변화에 따라 폴리머의 상이 졸-젤 상호 간에 전이되어 약물을 체내에서 방출하는 다양한 물질을 사용할 수 있으며, 일 실시예로 PNIPAm(poly(N-isopropylacrylamide))가 사용될 수 있다.

상기 PNIPAm는 NIPAm(N-isopropylacrylamide) 단량체, NMBA(N, N'-Methylenebisacrylamide) 가교제, KPS(Potassium persulfate) 개시제를 사용하여 자성 나노입자 표면에 결합될 수 있으며, 이때 상기 온도감응성 폴리머가 충분히 중합되도록, 상기 NMBA/NIPAm 농도는 3~11%인 것이 바람직하다. 도 5와 도 6은 자성나노입자에 3-MOP (silane coupling agent)를 사용하여 입자표면에 이중결합을 부여시킨 후, NIPAm (monomer)과 NMBA (cross linker), KPS (initiator)를 사용하여 PNIPAm이 결합된 자성나노입자의 합성 원리를 나타낸 것이다.

이하, 본 발명에 따라 제조되는 표적지향적 약물전달을 위한 자성나노입자 및 이를 이용한 약물전달체의 실시예 및 실험예를 상세히 살펴본다. 다만, 하기 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

한편, 하기 실시예의 실험들은 하기의 방법들로 이루어졌다.

1) Fourier transform-infrared (FT-IR) spectroscopy : FT-IR은 Wavenumber 4000cm^-1와 650cm^-1 범위에서 KBr법을 사용하여, FT-IR-460 PLUS spectrometer (JASCO, Tokyo, Japan)로 분석하였다

2) Transmission electron microscopy (TEM) : 입자의 형태를 JEM-2000EX (JEOL, Tokyo, Japan) 이용하여 측정하였다. 시편은 분말 상태에서 에탄올에 분산 시킨 후, microgrid(Cu)에 떨어뜨려 건조시켜 사용하였다.

3) Field-emission scanning electron microscopy/Energy-dispersive X-ray spectroscopy (FE-SEM/EDX) : FE-SEM (JSM-6700F, JEOL, Tokyo, Japan)과 연결된 EDX는 15KV 교류 전압으로 원소분석 하였다. 샘플은 Cressington scientific instruments 108Auto sputter coater (Cranbery Tep., PA, USA)에서 Pt로 코팅하여 사용하였다.

4) X-ray diffraction (XRD) : Rigaku D/MAX-RB apparatus (Tokyo, Japan) powder diffractometer을 사용하여, CuKa(λ=1.1542Å) radiation으로 10^o에서 80^o범위에서 2^o/min으로 측정하였다

5) Thermogravimetric analysis (TGA) : SDT Q-600 (TA Instruments, Delaware, USA)을 사용하여 상온에서 1000 까지 10/min, N2 분위기에서 측정하며 열적특성을 알아보았다.

6) Scanning electron microscopy (SEM) : SM-300 (Topcon)을 사용하여 실리카 코팅된 Fe³⁺ 함침 리포좀의 형태를 관찰하였다.

7) Superconducting quantum interference device (SQUID) : MPMS-7 (Quantum design, USA)을 이용하여 Field range: -1 T ~ +1 T, 300 K에서 자기적 특성을 측정하였다.

[ 실시예 1] Fe ³⁺ 이 함침된 리포좀 제조

메탄올 50g에 레시틴 5g을 넣어 녹인후, 상기 레시틴 용액에 0.1 M FeCl₃ 수용액 45g을 가한 후 교반시킨 후 정치시킨다.

[ 실시예 2] Fe ³⁺ 이 함침된 리포좀의 실리카 코팅

제조한 Fe^{3 +}이 함침된 리포좀 분산액 20g(pH 2)에 에탄올 100mL을 넣고 자석교반기로 잘 교반시켜준다. 이 혼합용액을 상온에서 격렬하게 교반하면서 tetraethyl orthosilicate (TEOS) 4mL를 한방울씩 적가한다. 실리카를 코팅하는 과정에 흔히 사용되는 암모니아수를 이용한 염기성 조건하에서의 반응은 생성된 리포좀 자체를 파괴하는 경향이 있었으므로 리포좀 용액을 에탄올에 분산시켜 산성용액(pH 3)에서의 반응과정을 채택하였다.

반응용액을 상온에서 6시간 동안 교반하였으며, 반응이 끝난 후 용액의 pH는 3 정도였다. 교반이 완료된 후 원심분리기로 3000rpm에서 10분 동안 원심분리한 후 여액은 버리고 침전물을 에탄올로 3번 세척해 반응하지 않은 TEOS를 제거해준 후, 세척한 생성물을 실온에서 건조시켜 실리카가 코팅된 Fe³⁺ 함침 리포좀을 얻었다.

[ 실시예 3] 실리카 코팅된 Fe ^{3 +} 함침 리포좀의 수소화 반응

실리카가 코팅된 Fe^{3 +} 함침 리포좀을 600℃에서 수소가스를 1시간 동안 흘려 Fe³⁺을 환원시킨다. 이후 상온으로 냉각시킨다. 이때 나노입자는 Fe^{3 +}의 환원으로 엷은 갈색에서 검은색으로 변한다

[ 실시예 4] 3- MOP 를 이용한 자성나노입자의 수정

제조한 자성나노입자의 표면을 3-MOP로 개질시키기 위하여, 자성나노 입자를 톨루엔에 분산 시킨 후 2,6-Lutidine과 3-MOP (Silane coupling agent)를 첨가한다. 110℃에서 6시간 동안 reflux 시킨 후, 메탄올로 세척하여 반응하지 않은 3-MOP를 제거한다. 그리고 상온에서 진공 건조시킨다.

[ 실시예 5] PNIPAm 이 결합된 자성나노입자의 제조

3-MOP로 표면이 개질된 자성나노입자를 소량의 에탄올에 분산시킨 후, NIPAm(monomer)과 NMBA(cross linker)를 함유하고 있는 수용액을 첨가시키고 교반한다. 그 후 KPS(initiator)를 첨가하고 N₂ bubbling을 30분 시켜준다. 상온에서 12시간 교반 후 온도를 70℃로 올려 중합시킨다.

중합이 완료된 후 메탄올로 세척하여 반응하지 않은 NIPAm을 제거한다. 세척을 끝낸 후 상온에서 24시간 진공 건조시켜 PNIPAm이 결합된 자성나노입자를 제조한다. 실험 조건은 하기 표 2에 나타내었다. KPS/NIPAm의 분자비(%)는 1.05이다.

Condition	NIPAm / 3MOP-MNPs (Weight Ratio)	NMBA / NIPAm (Molar Ratio)(%)
1	4	5.5
2	2	5.5
3	8	5.5
4	4	2.75
5	4	11.0

[ 실험예 1] Fe ^{3 +} 이 함침된 리포좀과 실리카 코팅된 Fe ^{3 +} 함침 리포좀의 FT - IR 및 TEM 결과

도 7은 Fe³⁺이 함침된 리포좀과 실리카 코팅된 Fe³⁺ 함침 리포좀의 FT-IR (Fourier transform-infrared spectroscopy) spectrum 결과이다. (a) Fe³⁺이 함침된 리포좀의 2921cm^-1, 1467cm^-1, 1416cm^-1 에서 C-H, 1744cm^-1 에서 C=O 결합이 확인되었다. 또한 1647cm^-1 에서 N-H, 1236cm^-1 에서 C-O, 1014cm^-1 P-O 결합이 확인되었다. Fe-O 결합 peak 은 580cm^-1 에서 나타나기 때문에 도 7에는 나타나지 않았다. (b) 실리카 코팅된 Fe³⁺ 함침 리포좀은 1061cm^-1 에서의 Si-O-Si 결합을 나타내는 strong peak을 확인함으로써 실리카가 코팅되었다는 것을 확인 할 수 있었다.

도 8은 TEM (Transmission electron microscopy)을 이용하여 Fe³⁺이 함침된 리포좀과 실리카 코팅된 Fe³⁺ 함침 리포좀을 관찰한 사진이다. Fe³⁺이 함침된 리포좀 (a),(b)에서 리포좀을 구성하고 있는 레시틴이 bilayer 형태로 되어있음을 확인 할 수 있었다. (c),(d)는 실리카 코팅된 Fe^{3 +} 함침 리포좀의 형태로 실리카 코팅 전과 후의 차이를 확인 할 수 있었다.

[ 실험예 2] 실리카 코팅된 Fe ^{3 +} 함침 리포좀의 다양한 수소반응 온도에 따른 FT - IR 및 TGA 결과

실리카 코팅된 Fe³⁺ 함침 리포좀을 수소기체를 이용하여 Fe³⁺을 환원시켜 자성을 띄게 하는 특징을 확인하기 위해 25℃, 200℃, 400℃, 600℃에서 각각 수소환원반응시켰다.

도 9는 실리카 코팅된 Fe³⁺ 함침 리포좀을 각각의 수소반응 온도로 환원 시켰을 때의 FT-IR spectrum이다. 수소반응 온도가 올라갈수록 2920cm^-1, 1460cm^-1 부근에서의 C-H 결합과 1647cm^-1 부근에서의 N-H 결합 peak이 점차 감소됨을 확인할 수 있었다. 또한 1740cm^-1 부근에서의 C=O 결합 peak은 400℃에서 수소반응시킨 이후부터는 소멸됨을 확인 할 수 있었다. 이는 리포좀을 구성하고 있는 레시틴 성분이 수소반응 온도가 올라갈수록 소멸됨을 확인할 수 있었다.

도 10은 실리카 코팅된 Fe³⁺ 함침 리포좀을 각각의 수소반응 온도로 환원 시켰을 때, 질소분위기에서 상온에서 1000℃(10℃/min)까지 온도를 증가함에 따른 열중량 분석(TGA)을 나타내고 있다.

고온에서 수소환원반응시킨 샘플일수록 중량감소가 적게 일어남을 확인 할 수 있었다. 600℃에서 수소환원반응시킨 샘플의 경우 10.81% 중량감소를 나타내고, 25℃에서 수소환원반응의 경우 56.78% 중량감소를 나타낸다. 200℃에서 급격한 열중량 감소를 나타내며 800℃까지 중량감소가 일어난다. 이는 레시틴으로 구성된 리포좀 구조가 붕괴되어서 나타나는 것이다.

도 11은 실리카 코팅된 Fe^{3 +} 함침 리포좀을 각각의 수소반응 온도로 환원 시켰을 때 샘플의 색상변화를 나타내고 있다. 반응온도가 올라갈수록 엷은 갈색에서 검은색으로 변화함을 확인할 수 있었고, 자성은 400℃까지는 나타나지 않았으며 600℃부터 자성특성을 나타내었다.

[실험예 3] 실리카 코팅된 Fe ³⁺ 함침 리포좀의 수소반응 전/후의 SEM, TEM, FESEM-EDX, XRD 결과

도 12(a)는 SEM (Scanning electon microscopy)을 이용하여 실리카 코팅된 Fe³⁺ 함침 리포좀의 형태를 관찰하였다. 합성한 리포좀은 400nm 정도의 크기를 갖으며 균일한 입자들로 생성됨을 확인 할 수 있었다. 도 12 (b)와 (c)는 실리카 코팅된 Fe³⁺ 함침 리포좀의 수소반응 전/후의 TEM (Transmission electron microscopy) image이다. 수소반응 후 입자의 변화를 확인할 수 있으며, 입자의 크기는 350nm정도로 줄어듦을 확인 할 수 있었다.

도 13은 FESEM-EDX (Field-emission scanning electron microscopy /Energy-dispersive X-ray spectroscopy)를 이용하여 실리카 코팅된 Fe^{3 +} 함침 리포좀의 수소반응 전/후를 원소 분석 하였다. 원소의 wt%로 볼 때, 수소반응 후에 Fe성분의입자내 분포가 증가함을 확인할 수 있었다.

실리카 코팅된 Fe³⁺ 함침 리포좀에서 중요한 점은 수소환원 여부에 따른 자성의 생성 유무이다. 자성을 띠고 있지 않은 실리카 코팅된 Fe^{3 +} 함침 리포좀입자가 600℃에서의 수소환원처리로 자성을 갖게 되고, 자성으로 인해 다양한 분야에서 이용가능하며 특히, 자성을 이용하여 원하는 부위에 이동시켜 약물 전달을 시킬 수 있다는 장점이 있다.

도 14는 실리카 코팅된 Fe3+ 함침 리포좀의 수소반응 전/후의 XRD분석을 나타낸 것이다. 도 14(a)에서 나타난 바와 같이 실리카 코팅된 Fe^{3 +} 함침 리포좀입자는 자성의 특징이 없이 비정질인 Si의 peak인 2θ=22°를 확인할 수 있으며, 도 14(b)에서 볼 수 있듯이 비정질인 Si의 peak인 2θ=22°에서 확인할 수 있고 Fe의 peak를 2θ=44.76°, 65.16°에서 확인할 수 있었다. 또한 Fe와 Si의 화합물에서 나타나는 peak인 2θ=35°역시 확인 가능 하다는 것을 알 수 있었다. 이를 통해 실리카 코팅된 Fe^{3 +} 함침 리포좀입자의 수소환원을 통해 자성을 가질 수 있음을 확인 할 수 있었다.

[ 실험예 4] NIPAm 단량체와 자성나노입자의 비율에 따른 효과

도 15는 자성나노입자, 3-MOP로 수정된 자성나노입자 그리고 PNIPAm이 결합된 자성나노입자를 TEM으로 관찰한 것이다. (a) 자성나노입자, (b) 3-MOP로 수정된 자성나노입자, (c) PNIPAm이 결합된 자성나노입자를 나타내고 있다. 3-MOP 결합 전/후 입자의 표면은 큰 차이가 없음을 확인할 수 있었고, PNIPAm 결합 후에는 자성나노입자 표면에 PNIPAm의 존재를 확연하게 확인 할 수 있었다.

도 16은 자성나노입자와 PNIPAm이 결합된 자성나노입자를 SQUID (Super conducting quantum interference device)로 측정한 결과이다. heating run과 cooling run이 같아서 super-paramagnetic의 성질을 유지하는 것을 확인할 수 있었다. 300K에서 측정한 SQUID의 자성나노입자와 PNIPAm이 결합된 자성나노입자의 자기이력곡선 변화를 보면 포화자화(Ms) 값이 자성나노입자는 25.57emu/g, PNIPAm이 결합된 자성나노입자의 경우는 3.38emu/g으로 나타났다. PNIPAm 결합 후 포화자화(Ms)값이 감소함을 알 수 있었다. 이는 자성나노입자의 고유자화율에서 PNIPAm 층으로 코팅이 두껍게 되면서 감소하게 되는 것으로 해석된다.

도 17은 자성나노입자, 3-MOP로 수정된 자성나노입자, 그리고 NIPAM과 3-MOP-MNPs를 weight ratio 조건별(condition 1~3)로 합성한 PNIPAm이 결합된 자성나노입자를 FT-IR spectrum으로 나타낸 것이다. FT-IR 분석을 통해 자성나노입자에 3-MOP 결합 여부와, PNIPAm의 결합여부를 확인하였다. 자성나노입자에 3-MOP를 결합시킨 결과 1720cm^{- 1} 에서 3-MOP의 carbonyl peak (C=O)가 확인됨으로써 자성나노입자에 3-MOP가 성공적으로 결합된 것을 확인할 수 있었다. 자성나노입자에 PNIPAm을 NIPAm/3MOP-MNPs (weight ratio)의 조견별로 합성한 결과 2972cm^-1 와 2882cm^-1 는 C-H 결합을 나타내었고, 1360cm^{- 1} 에서 C-C 결합을 확인하여 isopropyl를 나타내었다. 3320cm^-1 에서의 N-H 결합 1650cm^{- 1} 에서의 C=O 결합, 1570cm^-1 C-N-H 혼합 결합은 amides를 나타내었다. 따라서 NIPAm/3MOP-MNPs (weight ratio) condition 1∼3 모두 PNIPAm이 자성나노입자에 결합되었음을 확인할 수 있었다.

도 18은 자성나노입자, 3-MOP로 수정된 자성나노입자, 그리고 NIPAM과 3-MOP-MNPs를 weight ratio 조건별(condition 1~3)로 합성한 PNIPAm이 결합된 자성나노입자를 질소분위기에서 상온에서 1000℃ (10℃/min)까지 온도를 증가함에 따른 열중량 분석(TGA)를 나타 내고있다. TGA 분석으로 3MOP로 수정된 자성나노입자에 결합된 PNIPAm의 양을 알 수 있다. 110℃∼1000℃까지 자성나노입자, 3-MOP로 수정된 자성나노입자, PNIPAm이 결합된 자성나노입자 (condition 1,2,3)의 중량 감소율은 각각 9.56%, 15.23%, 68.39%, 58.1%, 75.98%를 나타낸다.

25℃~110℃까지의 중량손실은 PNIPAm이 결합된 자성나노입자가 결합전 자성나노입자보다 더 큰 것으로 확인되었다. 이는 자성나노입자의 표면에 결합된 PNIPAm이 결합전 자성나노입자보다 더 많은 물 분자를 가지고 있다고 생각할 수 있다. 그 이유는 PNIPAm은 교차된 네트워크 구조에 물 분자를 함유하는 특징을 가지고 있기 때문이다.

[ 실험예 5] 가교제 NMBA 의 농도에 따른 효과

도 19는 가교제 NMBA의 농도에 따른 합성결과를 FT-IR spectrum으로 나타내었다. 2970cm^-1, 2875cm^-1 은 C-H 결합을 나타내었고, 1380cm^-1에서 C-C결합을 확인하여 isopropyl을 나타내었다. 3430cm^-1에서의 N-H 결합, 1644cm^-1에서의 C=O 결합, 1568cm^-1 C-N-H 혼합 결합은 amide를 나타내었다. 따라서 가교제 NMBA의 농도별 condition 1, 4, 5 모두 PNIPAm이 자성나노입자에 결합되었음을 확인 할 수 있었다.

도 20은 가교제 NMBA의 농도에 따른 합성결과를 열중열중량분석(TGA)을 통해 결합된 PNIPAm의 양을 분석하였다. 중량손실은 110℃이전까지는 샘플마다 함유하고 있는 수분의 양이 다르므로 110℃부터 1000℃까지 측정하였다. NMBA / NIPAm의 농도가 11% (condition 5)일 때 중량손실은 79.97% 였으며, NMBA / NIPAm의 농도가 5.5% (condition 1), 2.75%(condition 4) 일 때 각각 68.39%, 62.26%의 중량손실을 보여주었다. 따라서 NMBA / NIPAm 농도가 11%일 때 PNIPAm의 중합이 가장 많이 이루어졌음을 확인 할 수 있었다.

상기 실시예 및 실험예들에서 볼 수 있듯이, 본 발명에서는 인지질 분자들이 자기조립과정에 의해 형성하는 구형의 리포좀에 Fe^{3 +}을 함침시켜 제조하고, 리포좀 표면을 실리카로 코팅하는 방법과 실리카가 코팅된 Fe^{3 +} 함침 리포좀 입자를 수소기체로 환원시켜 자성을 띤 나노입자를 제조하는 간단하고 용이한 방법을 제시하였다. 또한, 본 발명의 자성 나노입자는 실리카로 쌓여 있어 원하는 다양한 기능기를 결합시켜 특정한 물질과의 상호작용을 통해 원하는 물질의 흡착 또는 탈착이 가능하고 자성을 띠고 있어 결합한 특정 물질을 운반해서 특정한 장소에 방출시킬 수 있다.

상기 자성나노입자에 온도 변화에 따라 폴리머의 상이 전이되는 PNIPAm을 결합시켜 온도-감응성을 부여할 수 있다. PNIPAm과 결합 후에도 자성을 지니고 있었으며, 합성시 NIPAm의 양과 가교제 NMBA의 양에 따라 서로 다른 합성율을 나타낸다. 이와 같이 제조한 PNIPAm이 결합된 자성나노입자는 의약품, 항체등의 전달물질에 사용하기 위한 소재이며, 의학 분야뿐만 아니라 중금속의 분리 같은 환경분야 등에도 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명은 상술한 특정의 실시예 및 설명에 한정되지 아니하며, 청구범위에서 청구하는 본 발명의 요지를 벗어남이 없이 당해 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 누구든지 다양한 변형 실시가 가능하며, 그와 같은 변형은 본 발명의 보호 범위 내에 있게 된다.

Claims (12)

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8. a) 레시틴(lecithin) 용액과 Fe³⁺이 함유된 수용액을 혼합하여 Fe³⁺이 함침된 리포좀 분산액을 제조하는 단계, b) 상기 Fe³⁺이 함침된 리포좀 분산액과 실리카 전구체를 pH 2~4의 산성조건 하에서 반응시켜 실리카가 코팅된 Fe³⁺ 함침 리포좀 입자를 제조하는 단계, c) 상기 실리카가 코팅된 Fe³⁺ 함침 리포좀 입자를 수소 분위기 및 600~1000℃에서 환원시키는 단계를 포함하는 제조방법에 의하여 제조된 자성 나노입자를 이용하는 표적지향적 약물전달체의 제조방법에 있어서,
   i) 상기 자성 나노입자 표면을 개질하여 이중결합을 부여하는 단계; 및
   ⅱ) 상기 이중결합이 부여된 자성 나노입자의 표면에 온도감응성 고분자로서 PNIPAm(poly(N-isopropylacrylamide))를,
   NIPAm(N-isopropylacrylamide) 단량체, NMBA(N,N'-Methylenebisacrylamide) 가교제, KPS(Potassium persulfate) 개시제를 사용하고, 상기 NMBA/NIPAm 농도(몰비)를 3~11%로 하여 결합시키는 단계;
   를 포함하는 표적지향적 약물전달체의 제조방법.
9. 제8항에 있어서,
   상기 자성 나노입자의 개질이 실란 커플링 시약인 3-MOP(3-(trimethoxysilyl)propyl methacrylate)을 사용하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 표적지향적 약물전달체의 제조방법.
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