KR101349295B1 - A producing method of biodiesel using a novel psychrophilic cyanobacterium oscillatoria sejongensis - Google Patents
A producing method of biodiesel using a novel psychrophilic cyanobacterium oscillatoria sejongensis Download PDFInfo
- Publication number
- KR101349295B1 KR101349295B1 KR1020110107670A KR20110107670A KR101349295B1 KR 101349295 B1 KR101349295 B1 KR 101349295B1 KR 1020110107670 A KR1020110107670 A KR 1020110107670A KR 20110107670 A KR20110107670 A KR 20110107670A KR 101349295 B1 KR101349295 B1 KR 101349295B1
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- knua009
- biodiesel
- oscillatoria
- sejongensis
- cyanobacteria
- Prior art date
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
- C12N1/205—Bacterial isolates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
- Y02E50/00—Technologies for the production of fuel of non-fossil origin
- Y02E50/10—Biofuels, e.g. bio-diesel
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P30/00—Technologies relating to oil refining and petrochemical industry
- Y02P30/20—Technologies relating to oil refining and petrochemical industry using bio-feedstock
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Virology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
본 발명은 신종 남조류 오실라토리아 세종엔시스 케이엔유에이009( Oscillatoria sejongensis KNUA009) KCTC 12034BP를 이용한 바이오디젤의 제조 방법에 관한 것이다. 본 발명에 의한 바이오디젤 제조 방법에 따르면, 신종 호냉성 남조류인 오실라토리아 세종엔시스 케이엔유에이009(Oscillatoria sejongensis KNUA009) KCTC 12034BP를 이용함으로서 극한환경에서도 성장이 빨라 충분한 바이오매스(biomass)를 얻을 수 있으며, 세포 내에 바이오디젤의 제조에 유리한 지방산들이 다량 함유되어 있어 바이오디젤 제조 수율을 효과적으로 향상시킬 수 있다.The present invention relates to a method for producing biodiesel using a new cyanobacteria oscillatoria sejong ensis KNUA009 KCTC 12034BP. According to the biodiesel manufacturing method according to the present invention, by using a new type of cold- cooled cyanobacteria Oscilltoria sejongensis KNUA009 KCTC 12034BP, it is possible to obtain sufficient biomass due to rapid growth in extreme environments. In addition, since the cell contains a large amount of fatty acids advantageous for the production of biodiesel, it is possible to effectively improve the biodiesel production yield.
Description
본 발명은 남극(Antarctica)에서 분리된 호냉성(psychrophilic) 신종 남조류(cyanobacterium) 오실라토리아 세종엔시스(Oscillatoria sejongesis)를 이용한 바이오디젤의 제조 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a method for producing biodiesel using a psychrophilic new cyanobacterium oscillatoria Oscillatoria sejongesis isolated from Antarctica.
남조류는 지구의 탄소 및 질소 순환에서 필수불가결한 역할을 하며, 광범위한 서식환경(niches)에 분포되어 있다. 남조류는 매우 다양한 범위의 환경 조건에 대한 뛰어난 내성으로 인해 극지방 및 고산지대를 포함하는 가능한 거의 모든 환경에서 발견되고 있다(Whitton and Potts 2000; Vincent 2007). 남조류는 광합성을 통해 빙권지역(cryosphere)에서 전체 생태계 생물량(biomass)의 구성에 큰 역할을 담당하고 있으며 극지방에서 남조류 생물량 축적은 정기적으로 관찰되고 있다(Broady 1996; Vincent 1988; Wynn-Williams 1996). 따라서, 고위도 및 고경도에 서식하는 남조류는 특별한 관심을 받고 있으며, 형태 및 분자적 접근 모두에 근거하여 극지방 호수 및 연못의 미생물 매트(microbial mats)에서의 남조류의 다양성에 대한 연구 또한 수행되어 왔다(Tang 등 1997; Nadeau 등 2001; Taton 등 2006a).Cyanobacteria play an indispensable role in the global carbon and nitrogen cycle and are distributed in a wide variety of niches. Cyanobacteria are found in almost every possible environment, including polar and alpine areas due to their excellent resistance to a wide range of environmental conditions (Whitton and Potts 2000; Vincent 2007). Cyanobacteria play a large role in the composition of the entire ecosystem biomass in the cryosphere through photosynthesis, and accumulation of cyanobacteria in the polar regions is regularly observed (Broady 1996; Vincent 1988; Wynn-Williams 1996). Thus, algae in high and high hardness are of special interest, and research has also been carried out on the diversity of cyanobacteria in microbial mats of polar lakes and ponds, based on both morphological and molecular approaches. Tang et al. 1997; Nadeau et al. 2001; Taton et al. 2006a).
남극의 생물상(生物相, biota)은 수백만 년 동안 세계의 다른 어떤 생물상보다도 더 동떨어져 있어서, 남극 생태계를 우점하는 매트형성 (mat-forming) 남조류는 큰 관심을 받고 있다. 흔들말목(oscillatorian) 남조류는 염주말목(nostocales)과 함께 남극 저생(底生, benthic) 미생물 매트 군집(群集, community)에서 가장 우점하는 미생물들 중 하나이다(Brody 1996; Wynn-Williams 1996; Jungblut 등 2005). 이러한 우점도(dominance)는 이들의 극한 조건에 대한 높은 내성에 따른 것이며, 동결-해빙 주기, 자외선 및 영양물질의 극심한 변화 등 의한 경쟁 종들의 사멸에 기인한 것이다.The Antarctic biota has been farther apart than any other world in the world for millions of years, so mat-forming algae dominating the Antarctic ecosystem are of great interest. Oscillatorian cyanobacteria, along with nostocales, are among the most predominant microbes in the Antarctic benthic microbial mat community (Brody 1996; Wynn-Williams 1996; Jungblut et al. 2005). ). This dominance is due to their high resistance to extreme conditions and due to the killing of competing species due to freeze-thaw cycles, extreme changes in ultraviolet light and nutrients.
최근 배양-독립적(culture-independent) 분자 기술들이 남극 생태계에서 남조류의 다양성을 평가하기 위해 성공적으로 적용되어 왔지만(Taton 등 2003; Wood 등 2008), 남극 남조류 균주들의 분리 및 특성연구는 많은 분야에서 아직도 중요한 역할을 담당하고 있다. 나아가, 균주은행(culture collections)에서 보유하고 있는 남극 남조류 균주들의 숫자 및 이용 가능한 공공 데이터베이스에서의 분자적 데이터는 여전히 매우 제한적이다(Taton 등 2006b).Although recent culture-independent molecular techniques have been successfully applied to assess the diversity of Antarctic algae in Antarctic ecosystems (Taton et al. 2003; Wood et al. 2008), the isolation and characterization of Antarctic algae strains is still in many fields. It plays an important role. Furthermore, the number of Antarctic Antarctic strains held in culture collections and the molecular data in the public databases available are still very limited (Taton et al. 2006b).
따라서, 배양 가능한 남극 남조류의 다상적인(多相的, polyphasic) 연구들은 남조류의 다양성, 생리학 및 생명 공학적 연구에 있어 더 나은 이해를 가능하게 할 수 있다. Thus, polyphasic studies of cultivable Antarctic algae may enable a better understanding of the diversity, physiology and biotechnological studies of Antarctic algae.
한편, 화석연료 기반의 산업이 현재 큰 위기를 맞고 있으며, 이는 화석연료는 결국 고갈된다는 사실과 이에 따른 공급 불안정 그리고 대기 중 이산화탄소 농도 증가 등의 문제에 기인한다. 그러므로 탄소 중립적 (carbon neutral)이고, 재생 가능한 대체에너지가 필요하며 이는 환경적, 경제적으로 지속 가능한 대안이어야 한다. Meanwhile, the fossil fuel-based industry is facing a major crisis, due to the fact that fossil fuels will eventually be exhausted, resulting in supply instability and increased atmospheric CO2 concentrations. Therefore, carbon neutral, renewable alternative energy is needed, which should be an environmentally and economically sustainable alternative.
신 재생에너지 중 바이오디젤(biodiesel)은 운송 연료로서 커다란 주목을 받고 있다. 그러나 일반적으로 유지 식물로부터 생산이 되는 바이오디젤로는 현재 운송 연료의 극히 일부만을 대체하고 있으며, 세계적인 운송 연료의 수요를 충족시키기 위해서 다양한 장점을 가지고 있는 미세조류(microalgae)의 바이오매스를 바이오디젤의 원료로서 사용하는 것이 최근에 화석연료의 대안으로 많은 사람들이 관심을 가지고 있다. Among the renewable energy, biodiesel is receiving great attention as a transportation fuel. However, biodiesel, which is generally produced from oil and fat plants, currently replaces only a fraction of the transportation fuel, and biodiesel biomass from microalgae has various advantages to meet the demand for transportation fuel. Use as a raw material has been of interest to many people as an alternative to fossil fuels in recent years.
하지만, 이를 실용화하기 위해서는 생산성을 높이기 위한 노력이 더욱 필요하며, 아직 더 많은 집중된 연구가 요구된다.However, in order to put this into practical use, more efforts are needed to increase productivity, and more intensive research is still required.
본 발명은 상기와 같은 남조류 연구 및 이로부터 대체에너지로서의 바이오디젤 제조에 대한 연구의 일환으로서 남극 서부지역 킹 조지 아일랜드(King George Island)에서의 남조류 매트로부터 호냉성 신종 남조류인 오실라토리아 세종엔시스(Oscillatoria sejongensis) KNUA009 KCTC 12034BP의 무균배양(axenic culture)을 성공적으로 완수하고, 형태학 및 분자계통학적 연구결과와, 온도, 염도 및 산도 테스트 등의 생리적 특성 그리고 화학계통적 분석결과에 의해 상기 무균배양된 균주를 신종으로 동정하였으며, 이러한 결과로부터 상기 신종 균주를 이용한 바이오디젤의 제조 방법을 제공하고자 한다.The present invention, as part of the research on the South algae and the biodiesel as an alternative energy from the algae mat from the algae mat in King George Island in the western Antarctic region of King George Island (Osilatoria sejong ensis) Oscillatoria sejongensis ) KNUA009 KCTC 12034BP successfully completed the asenic culture, and aseptic cultures based on the results of morphological and molecular systems, physiological characteristics such as temperature, salinity and acidity tests, and chemical system analysis. Was identified as a new species, and from these results, to provide a method for producing biodiesel using the new strain.
상기와 같은 과제를 해결하기 위하여,In order to solve the above problems,
본 발명은 미세조류를 이용한 바이오디젤의 제조 방법에 있어서, 미세조류 오실라토리아 세종엔시스 케이엔유에이009(Oscillatoria sejongensis KNUA009) KCTC 12034BP를 사용하는 것을 특징으로 하는 미세조류를 이용한 바이오디젤의 제조 방법을 제공한다.The present invention provides a method for producing biodiesel using microalgae in the method of producing biodiesel using microalgae, using microalgae oscillatoria sejongensis KNUA009 KCTC 12034BP. to provide.
상기 제조 방법에서, 미세조류의 배양 온도는 5~20℃인 것이 바람직하다.In the production method, the microalgal culture temperature is preferably 5 ~ 20 ℃.
상기 제조 방법에서, 미세조류의 pH 범위는 4.0~11.0인 것이 바람직하다.In the above production method, the pH range of the microalgae is preferably from 4.0 to 11.0.
상기 제조 방법에서, 미세조류의 염농도는 0.2M 이하인 것이 바람직하다.In the above production method, the salt concentration of the microalgae is preferably 0.2M or less.
본 발명에 의한 바이오디젤 제조 방법에 따르면, 호냉성 신종 남조류인 오실라토리아 세종엔시스 케이엔유에이009(Oscillatoria sejongensis KNUA009) KCTC 12034BP를 이용함으로써 극한 환경에서도 성장이 빨라 충분한 바이오매스를 얻을 수 있으며, 세포 내에 바이오디젤의 제조에 유리한 지방산들이 다량 함유되어 있어 바이오디젤 제조 수율을 효과적으로 향상시킬 수 있다.According to the method for producing biodiesel according to the present invention, by using Oscillatoria sejongensis KNUA009 KCTC 12034BP, which is a cold-cooled new cyanobacteria, sufficient biomass can be obtained due to rapid growth even in extreme environments. The fatty acid advantageously contained in the production of biodiesel can be contained in the biodiesel production yield can be effectively improved.
도 1은 오실라토리아 세종엔시스(Oscillatoria sejongensis) KNUA009의 광학 현미경 사진을 나타낸다.
도 2는 오실라토리아 세종엔시스(Oscillatoria sejongensis) KNUA009 및 16S rRNA의 염기서열 데이터로부터 해석된 오실라토리아 세종엔시스(Oscillatoria sejongensis) KNUA009와 밀접한 관련이 있는 종들의 계통 관계를 나타낸다. 여기에는 오실라토리아(Oscillatoria) 속을 대표하는 Oscillatoria sancta PCC7515(1 군), Oscillatoria nigroviridis PCC7112(2 군), Oscillatoria acuminate PCC6304(3 군), Oscillatoria formosa PCC6407(4 군) 및 Planktothrix agardhii CCAP1460/5(5 군)의 5가지 종들이 계통수에 포함되어 있다. Oscillatoria agardhii는 Planktothrix agardhii로 재명명되었다(Anagnostidis and Komarek 1988). Chloroflexus aurantiacus J-10-fl을 아웃그룹 (outgroup)으로 사용하였다. 부트스트랩 밸류 (Bootstrap values)를 각 분지점(node)에 나타내었다. 눈금자는 염기서열 1%의 차이를 나타낸다.
도 3은 오실라토리아 세종엔시스(Oscillatoria sejongensis) KNUA009의 ITS 염기서열 데이터로부터 해석된 오실라토리아 세종엔시스(Oscillatoria sejongensis) KNUA009와 밀접한 관련이 있는 종들의 계통 관계를 나타낸다. 별표로 나타낸 서열은 Wood 등(2008)에 의해 남극 대륙으로부터 채집된 비배양된 남조류 클론이다.
도 4는 다양한 온도(a)와 pH 범위(b)에서의 오실라토리아 세종엔시스(Oscillatoria sejongensis) KNUA009의 생장곡선을 나타낸다.
도 5는 오실라토리아 세종엔시스(Oscillatoria sejongensis) KNUA009의 흡수 스펙트럼을 나타낸다.1 shows optical micrographs of Oscillatoria sejongensis KNUA009.
Figure 2 shows the lineage of the species closely related to Oscillatoria sejongensis KNUA009 interpreted from the sequencing data of Oscillatoria sejongensis KNUA009 and 16S rRNA. This includes Oscillatoria Five species of genus Oscillatoria sancta PCC7515 (Group 1), Oscillatoria nigroviridis PCC7112 (Group 2), Oscillatoria acuminate PCC6304 (Group 3), Oscillatoria formosa PCC6407 (Group 4) and Planktothrix agardhii CCAP1460 / 5 (Group 5) Included in the tree. Oscillatoria agardhii was renamed Planktothrix agardhii (Anagnostidis and Komarek 1988). Chloroflexus aurantiacus J-10-fl was used as outgroup. Bootstrap values are shown at each node. Ruler shows the difference of 1% of the nucleotide sequence.
3 is coming la thoria three kinds of N-Sys (Oscillatoria sejongensis) shows a relationship between the longitudinal lines, which are closely related to the three kinds of N-Sys come la thoria (Oscillatoria sejongensis) KNUA009 analysis from the ITS sequences of data KNUA009. Asterisk sequences are uncultivated cyanobacteria clones collected from Antarctica by Wood et al. (2008).
4 shows the growth curve of Oscillatoria sejongensis KNUA009 at various temperatures (a) and pH ranges (b).
5 shows an absorption spectrum of Oscillatoria sejongensis KNUA009.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.
본 발명은 미세조류를 이용한 바이오디젤의 제조 방법에 있어서, 미세조류로서 오실라토리아 세종엔시스 케이엔유에이009(Oscillatoria sejongensis KNUA009) KCTC 12034BP를 사용하는 것을 특징으로 하는 미세조류를 이용한 바이오디젤의 제조 방법을 제공한다.In the present invention, a method for producing biodiesel using microalgae, a method for producing biodiesel using microalgae, characterized in that Oscilltoria sejongensis KNUA009 KCTC 12034BP is used as microalgae. To provide.
미세조류를 배양하고, 이로부터 지질 성분을 추출하여 바이오디젤을 제조하는 공정은 이미 잘 확립되어 있으며, 본 발명의 바이오디젤 제조 방법은 본 발명의 신종 미세조류를 이용하는 점을 제외하고는 공지의 미세조류를 이용한 바이오디젤의 제조 공정을 그대로 사용할 수 있다.The process of culturing the microalgae, extracting lipid components therefrom to produce biodiesel is well established, and the biodiesel manufacturing method of the present invention is well known except for using the new microalgae of the present invention. Algal biodiesel manufacturing process can be used as it is.
또한, 미세조류 대량배양을 위한 시스템은 개방형(open) raceway pond와 밀폐형(closed) 광생물반응기(photobioreactor)를 사용할 수 있다.In addition, systems for microalgal mass culture can use open raceway ponds and closed photobioreactors.
이하에서는, 미세조류를 이용한 바이오디젤의 제조 방법에 있어서, 본 발명의 특징인 신종 남조류 오실라토리아 세종엔시스 케이엔유에이009(Oscillatoria sejongensis KNUA009) KCTC 12034BP에 대하여 상세하게 설명한다.Hereinafter, in the method for producing biodiesel using microalgae, a new cyanobacteria algae oscillatoria sejong ensis KNUA009 KCTC 12034BP, which is a feature of the present invention, will be described in detail.
남극은 세계에서 가장 혹독한 생태계 중의 하나이다. 특히, 여름 몇 달 동안 남극 남조류는 해로운 자외선을 포함하는 일광에 지속적으로 노출되고 있지만 남극 생태계 곳곳에서 남조류들은 여전히 일반적으로 발견되고 있다. Antarctica is one of the harshest ecosystems in the world. In particular, during the summer months, Antarctic algae are constantly exposed to daylight, which includes harmful ultraviolet rays, but southern algae are still commonly found throughout the Antarctic ecosystem.
이들 남조류들 중 Oscillatoria 종들은 남극에서 대부분의 민물 생태계 중 주요한 성분 중의 하나로서 알려져 있다(Ellis-Evans 1996; Vincent 및 James 1996; Seckbach 및 Oren 2007). Oscillatoria species of these algae are known as one of the major components of most freshwater ecosystems in Antarctica (Ellis-Evans 1996; Vincent and James 1996; Seckbach and Oren 2007).
본 발명에서 본 발명자들은 호냉성 신종 남조류인 KNUA009 균주를 남극 서부지역의 킹 조지 아일랜드의 일시적 해빙수(解氷水, meltwater)에서 자라는 남조류 매트로부터 분리하였으며, 이를 형태학적, 분자적 및 생리학적 수준에서 동정(同定, identification)하여, 바이오디젤의 제조에 적합한 균주임을 확인하였다.In the present invention, the present inventors have isolated KNUA009 strain, a cold-cooled new alga, from a algae mat growing in meltwater of King George Island in western Antarctica, and at the morphological, molecular and physiological levels Identification was confirmed to be suitable strains for the production of biodiesel.
본 발명의 KNUA009 균주는 Oscillatoria의 형태학적 및 분자 계통발생적 특징들을 나타내었으며, 이는 세종기지 부근의 해빙수로부터 기원한 것으로 그 명칭은 오실라토리아 세종엔시스(Oscillatoria sejongensis) KNUA009로 제안되었다. The KNUA009 strain of the present invention exhibited the morphological and molecular phylogenetic characteristics of Oscillatoria , which originated from sea ice water near Sejong Station, and was named Oscillatoria sejongensis KNUA009.
따라서, 본 발명은 호냉성 신종 남조류 오실라토리아 세종엔시스 케이엔유에이009(Oscillatoria sejongensis KNUA009) KCTC 12034BP를 제공한다.Accordingly, the present invention provides a cold- cooled new cyanobacteria oscillatoria sejong ensis KNU U009 KCTC 12034BP.
본 발명의 신종 남조류는 성장 온도가 5~20℃, pH가 4.0~11.0, 0.2M 이하의 염농도에서 최적의 성장이 가능하다.The new cyanobacteria of the present invention can be optimally grown at a salt concentration of 5-20 ° C., a pH of 4.0-11.0, and 0.2M or less.
남조류는 대개 호냉성(好冷性,psychrophily)보다 온도 유연성(溫度 柔軟性, temperature flexibility)을 갖는 것이 일반적이기 때문에(Tang 등1997; Chevalier 등 2000), 대부분의 극지방 흔들말목 남조류들은 15℃ 이상의 온도를 생장 최적조건으로 갖고 있어, 15℃ 이하의 온도에서 최적의 성장을 하는 성장 최적을 갖는 엄밀한 호냉성 균주들은 상대적으로 흔치 않다(Tang 및 Vincent 1999; Nadeau 및 Castenholz 2000). Since cyanobacteria usually have more temperature flexibility than psychrophily (Tang et al. 1997; Chevalier et al. 2000), most polar rock algae cyanobacteria have temperatures above 15 ° C. Strict, cold-cooled strains with growth optimisation, which have optimal growth at temperatures below 15 ° C., are relatively uncommon (Tang and Vincent 1999; Nadeau and Castenholz 2000).
Nadeau 및 Castenholz (2000)은 남극 호냉성 남조류 균주들이 진화과정에서 다른 스트레스 인자들에 대한 광범위한 내성을 유지하는 것에 대한 보상으로 보다 높은 온도에서의 살 수 있는 능력을 잃은 것일 수 있다는 진화적 시나리오를 제안하였다. 본 발명자들은 이 호냉성 광독립영양생물이 유사한 방식으로 더욱 높은 온도에 대한 내성을 잃은 것일 수 있다는 것으로 추정한다.Nadeau and Castenholz (2000) propose an evolutionary scenario in which Antarctic cold-cooled algae strains may have lost their ability to live at higher temperatures as a reward for maintaining extensive resistance to other stressors during the evolution. It was. We estimate that this cold-cooled photoindependent nutrient may have lost resistance to higher temperatures in a similar manner.
한편, 리보솜 16S-23S 유전자간(intergenic) 스페이서 영역(ITS) 염기서열 분석결과에 따르면, KNUA009 균주는 배양되지 않은 남극 남조류 클론들과 가장 유사한 것으로 나타났으며, 97% 이상의 상동성(相同性, homology)을 보였다(도 3).Ribosome 16S-23S intergenic spacer region (ITS) sequencing analysis showed that KNUA009 strains were most similar to uncultivated Antarctic algae clones, with more than 97% homology. homology) (FIG. 3).
모든 유사한 클론 염기서열들은 남극 동부지역의 남조류 매트 또는 표토(表土, surface soil)로부터 Wood 등(2008)에 의해 분석된 샘플이었다. 그러나, 16S rRNA 염기서열 데이터에 근거한 결과에서는 KNUA009 균주는 상이한 지리적 위치에서 분리된 4개의 환경 클론들과 99%의 염기서열 상동성을 보이며 집합체(cluster)를 형성하였다(표 1, 도 2). All similar clone sequences were samples analyzed by Wood et al. (2008) from southern algal mats or surface soils in eastern Antarctica. However, based on 16S rRNA sequencing data, the KNUA009 strain formed a cluster with 99% sequence homology with four environmental clones isolated at different geographical locations (Table 1, Figure 2).
이들 환경클론들은 극지방인 캐나다의 마크햄 빙붕(Markham Ice Shelf, -氷棚) (클론 MIS92)과 남극 서부의 오닉스(Onyx) 강 (클론UOXA-b10) 그리고 고산지역인 스페인의 피레네 산맥(the Pyrenees) (클론 Llo_054) 및 중국의 톈산(Tianshan Mountain)(클론KuyT-ice-32)에서 각각 분리되었다. Castenholz (1992)는 극지방 고유의 종은 많지 않을 것이라는 가설을 제시하였다.These environmental clones include the Canadian Canadian Markham Ice Shelf (clone MIS92), the Western Onyx River (clone UOXA-b10) and the alpine Spanish Pyrenees. (Clone Llo_054) and China's Tianshan Mountain (clone KuyT-ice-32), respectively. Castenholz (1992) hypothesized that there would not be many species native to the polar region.
본 연구 또한 이 Oscillatoria 속 균주가 남극지역 전면에 분포되어 있기는 지만, 이 호냉성 남조류 역시 남극에만 국한되어 있는 고유의 종은 아닐 수 있음을 제안한다. The present study also suggests that the genus Oscillatoria is distributed throughout the Antarctic region, but this cold-cooled algae may not be native to the Antarctic.
도 1에 나타낸 바와 같이, KNUA009 균주는 Oscillatoria 속을 구성하는 5개의 대표균주들(reference strains)과도 관련성이 낮았다. 따라서, 유전정보 분석을 통해 얻어진 낮은 수준의 DNA-DNA 관련성은 본 분리균주의 신규성을 뒷받침하여 주는 것임을 결론지을 수 있다. As shown in FIG. 1, the KNUA009 strain was also low in relation to the five reference strains constituting the genus Oscillatoria . Therefore, it can be concluded that the low level of DNA-DNA association obtained through genetic information analysis supports the novelty of the isolate.
따라서, 이 분리균주는 Oscillatoria 속 내의 새로운 분류군을 나타내는 것으로 본 발명자들은 이를 Oscillatoria sejongensis (se.jong.en'sis. N.L. fem. adj.) sp. nov. 로 제안하고, Oscillatoria sejongensis KNUA009의 명칭으로 2011년 10월 14일자로 KCTC에 기탁번호 KCTC 12034BP로 기탁하였다.Thus, this isolate represents a new taxa in the genus Oscillatoria , which we have found to be Oscillatoria sejongensis (se.jong.en'sis. NL fem. Adj.) Sp. nov. It was proposed as, Oscillatoria sejongensis KNUA009 dated October 14, 2011 was deposited with KCTC accession number KCTC 12034BP.
남조류는 일반적으로 여러 가지 전략을 사용하여 과도한 자외선 조사로부터 자신을 보호하는데 이는 매트 또는 층상구조(crust) 형성 및 광보호-퀀칭(quenching) 색소들의 생산을 포함한다. Cyanobacteria generally use several strategies to protect themselves from excessive ultraviolet radiation, which includes the production of matt or crust formation and photoprotective-quenching pigments.
유사한 방식으로, KNUA009 균주는 여러 층으로 구성된 매트를 형성하므로써 과도한 광으로부터 보호될 수 있는 것으로 추측된다. In a similar manner, it is assumed that the KNUA009 strain can be protected from excessive light by forming a multi-layered mat.
Seckbach 및 Oren (2007)과 Vincent (2007)의 보고서에서 동결건조된 남극 남조류 매트가 재해동된 후 수 분 내지 수 시간 내에 광합성 및 다른 생리학적 과정들을 재개하는 것을 보여준 것과 같이, 이러한 매트형성 성질은 본 발명의 남조류에 연중 동결기간 동안 생존능력을 유지하는 능력을 부여하였을 가능성이 있다. As mates of Seckbach and Oren (2007) and Vincent (2007) have shown that lyophilized Antarctic algae mats resume photosynthesis and other physiological processes within minutes to hours after re-run, It is possible that the algae of the present invention have been endowed with the ability to maintain viability during the year-round freezing period.
남조류에서 관찰된 또 다른 일반적인 자기방어 시스템은 지방산 탈포화(fatty acid desaturation)로 이는 저온에서 유동성을 유지하기 위하여 감소된 사슬 길이를 갖는 불포화 지방산들의 생산을 증가시킨다. 예상된 바와 같이, KNUA009 균주의 세포 지방산 조성은 C16:1, C18:1 C18:2 및 C18:3 불포화 지방산들이 풍부하여 저온에서 막 유동성을 효과적으로 유지하였다. Another common self-defense system observed in cyanobacteria is fatty acid desaturation, which increases the production of unsaturated fatty acids with reduced chain length to maintain fluidity at low temperatures. As expected, the cellular fatty acid composition of the KNUA009 strain was rich in C16: 1, C18: 1 C18: 2 and C18: 3 unsaturated fatty acids, effectively maintaining membrane fluidity at low temperatures.
따라서, 본 발명의 신종 남조류는 세포 내 다량의 지방산을 함유하는 특징이 있으므로 바이오디젤 생산에 적용될 수 있다.Therefore, the new cyanobacteria of the present invention is characterized by containing a large amount of fatty acids in the cell and thus can be applied to biodiesel production.
남조류는 유해한 활성산소(Reactive oxygen species, ROS)에 대처하기 위하여 외막과 틸라코이드들(thylakoids)에 카로테노이드와 같은 산화방지제들을 갖는 것으로도 알려져 있다(Pattanaik 등, 2007). Oren 등(1995)은 높은 수준의 광에 노출된 남조류 군락들은 카로티노이드 대 엽록소 a의 비가 매우 높다는 것을 언급하였다. Cyanobacteria are also known to have antioxidants such as carotenoids in their outer membrane and thylakoids to cope with harmful reactive oxygen species (ROS) (Pattanaik et al., 2007). Oren et al. (1995) noted that cyanobacteria communities exposed to high levels of light had a very high ratio of carotenoids to chlorophyll a .
이러한 결과들로부터 본 발명의 남조류가 ROS에 의한 산화적 손상을 방지하기 위하여 β-카로틴 합성에 의한 방어 체계를 진화시켜 온 것일 수도 있는 것으로 추정된다.From these results, it is assumed that the cyanobacteria of the present invention may have evolved a defense system by β-carotene synthesis to prevent oxidative damage by ROS.
따라서 본 발명의 신종 남조류는 세포 내 다량의 β-카로틴을 함유하므로 이로부터 β-카로틴 분리에 적합하다. Therefore, the new cyanobacteria of the present invention contain a large amount of β-carotene in the cell, and thus are suitable for separating β-carotene from it.
이하에서는, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to examples.
<실시예><Examples>
1. 신규 미생물의 분리와 생리학적 특성 1. Isolation and Physiological Characteristics of New Microorganisms
재료 및 방법Materials and methods
샘플 채집 및 남조류 분리Sample Collection and Isolation of Cyanobacteria
남극 남조류 매트 샘플을 2010년 1월 남극 서부 킹 조지 아일랜드의 바톤(Barton) 반도에 위치한 세종과학기지(62°13'S, 58°47'W) 부근의 일시적인 해빙수로부터 채집하였다. 그 후, 1 ml의 남조류 샘플들을 250 μg·ml-1 농도의 사이클로헥시미드(Sigma, St. Louis, MO, USA)가 포함된 100 ml BG-11(+) 배지(Rippka 등, 1979)에 접종하였다. 상기 플라스크를 160 rpm 및 15℃로 설정한 오비탈(orbital) 진탕기(Vision Scientific Co. Ltd., 한국, 부천)에서 남조류 성장이 확연해질 때까지 낮:밤(16:8 시간) 주기로 약 70 μmole·m-2·sec-1의 광도에서 배양하였다.Antarctic algae mat samples were collected in January 2010 from transient sea ice near King Sejong Station (62 ° 13'S, 58 ° 47'W) on the Barton Peninsula in King George Island, West Antarctica. Thereafter, 1 ml of cyanobacterial samples were treated with 100 ml BG-11 (+) medium (Rippka et al., 1979) containing 250 μg · ml −1 of cycloheximide (Sigma, St. Louis, MO, USA). Was inoculated. The flask was set at 160 rpm and 15 ° C. in an orbital shaker (Vision Scientific Co. Ltd., Bucheon, Korea) until approximately 70 μmole in day: night (16: 8 hours) cycles until blue algae growth became evident. M -2 -sec -1 were incubated at a light intensity.
무균배양 생산Aseptic Culture Production
잘 자란 남조류 배양액 (1.5 ml)을 X 3,000 g에서 15분 동안 원심분리하고, 탈수된 펠렛을 사이클로헥시미드(20 μg·ml-1)가 포함된 BG-11 한천배지 상에 획선 접종(streaking)하였다. 그 후, 플레이트를 상기와 같이 동일한 조건 하에서 배양하고 사상체(絲狀體, filament)의 성장을 매일 관찰하였다. 육안으로도 확인할 수 정도로 생장했을 때, 바깥 쪽으로 자라나는 남조류 사상체를 새로운 BG-11 한천배지로 무균적으로 옮겨 다른 오염 박테리아로부터 남조류를 분리하였다. 이후, 남조류 사상체를 R2A 및 LB 한천 플레이트(Becton, Dickinson and Company, Sparks, MD, USA) 상에 획선 접종하고, 암 조건에서 배양하여 남조류의 무균상태를 14일 동안 체크하였다. 이 과정들을 무균상태의 남조류가 얻어질 때까지 반복하여 얻어진 순수 남조류 균주를 KNUA009로서 명명하였다. 이 분리균주는 Oscillatoria 속 내의 새로운 분류군을 나타내는 것으로 본 발명자들은 이를 Oscillatoria sejongensis (se.jong.en'sis. N.L. fem. adj.) sp. nov. 로 제안하고, Oscillatoria sejongensis KNUA009의 명칭으로 2011년 10월 14일자로 KCTC에 기탁번호 KCTC 12034BP로 기탁하였다.Centrifuge well grown algae culture (1.5 ml) at 3,000 g for 15 minutes and strayking dehydrated pellets on BG-11 agar medium containing cycloheximide (20 μg · ml −1 ) ). Thereafter, the plates were incubated under the same conditions as above and the growth of filaments was observed daily. When grown to the naked eye, the outgrowing cyanosa filament was aseptically transferred to a new BG-11 agar medium to isolate it from other contaminating bacteria. The cyanobacterial filaments were then inoculated on R2A and LB agar plates (Becton, Dickinson and Company, Sparks, MD, USA) and cultured in cancer conditions to check for aseptic conditions for cyanobacteria for 14 days. These procedures were repeated until a sterile cyanobacteria were obtained and named pure cyanobacteria strain KNUA009. This isolated strain represents a new taxa in the genus Oscillatoria , and the present inventors have identified it as Oscillatoria sejongensis (se.jong.en'sis. NL fem. Adj.) Sp. nov. It was proposed as, Oscillatoria sejongensis KNUA009 dated October 14, 2011 was deposited with KCTC accession number KCTC 12034BP.
형태학적 동정Morphological identification
균주KNUA009를 15℃에서 10일 동안 BG-11(+) 배지에서 배양하였다. 남조류 세포를 수확하여, 한 방울의 침지 오일 중에 현탁시키고, 미분간섭차(DIC: differential interference contrast) 광학이 장치된 Zeiss Axioskop 2 광현미경(Carl Zeiss, Standort Gottingen, Vertrieb, Germany) 상에서 X 1,000 배에서 관찰하였다. 분류학적 기술 및 형태적(morphotypic) 동정에 Bergey's Manual of Systematic Bacteriology (Castenholz 2001)를 참고하였다.Strain KNUA009 was incubated in BG-11 (+) medium at 15 ° C. for 10 days. Cyanobacteria cells were harvested, suspended in a drop of immersion oil, and loaded at X 1,000 times on a
분자적 동정Molecular Identification
DNA를 DNeasy Plant Mini kit (Qiagen, Hilden, Germany)를 사용하여 추출하였다. PCR 조건 및 프라이머 세트 CYA106F(서열번호 1) (5'-CGG ACG GGT GAG TAA CGC GTG A-3'), CYA781R(a)(서열번호 2) (5'-GAC TAC TGG GGT ATC TAA TCC CAT T-3') 및 CYA781R(b)(서열번호 3) (5'-GAC TAC AGG GGT ATC TAA TCC CTT T-3')를 Nubel 등(1997)에 의해 설명된 것과 같이 16S rRNA 서열 분석에 대해 사용하였다. 리보솜 16S-23S 유전자간(intergenic) 스페이서 영역(ITS)을 프라이머들 16S1407F(서열번호 4) (5'-TGT ACA CAC CGC CCG TC-3') 및 23S30R(서열번호 5) (5'-CTT CGC CTC TGT GTG CCT AGG T-3') (Taton 등 2003)을 사용하여 평가하였다. RuBisCO(리불로오스-1,5-비스포스페이트 카르복실라제/옥시게나제) rbcLX는 이전에 기술된 (Rudi 등 1998) 프라이머들 CW(서열번호 6) (5'-CGT AGC TTC CGG TGG TAT CCA CGT-3') 및 CX(서열번호 7) (5'-GGC GCA GGT AAG AAA GGG TTT CGT A-3')를 이용하여 증폭시켰다. 본 연구에서 사용된 프라이머들의 합성 및 DNA 염기서열분석은 마크로젠(Macrogen, Seoul, Korea)에서 수행되었다.DNA was extracted using DNeasy Plant Mini kit (Qiagen, Hilden, Germany). PCR conditions and primer sets CYA106F (SEQ ID NO: 1) (5'-CGG ACG GGT GAG TAA CGC GTG A-3 '), CYA781R (a) (SEQ ID NO: 2) (5'-GAC TAC TGG GGT ATC TAA TCC CAT T -3 ') and CYA781R (b) (SEQ ID NO: 3) (5'-GAC TAC AGG GGT ATC TAA TCC CTT T-3') were used for 16S rRNA sequence analysis as described by Nubel et al. (1997). It was. Ribosome 16S-23S intergenic spacer region (ITS) was transferred to primers 16S1407F (SEQ ID NO: 4) (5'-TGT ACA CAC CGC CCG TC-3 ') and 23S30R (SEQ ID NO: 5) (5'-CTT CGC CTC TGT GTG CCT AGG T-3 ') (Taton et al. 2003). The RuBisCO ( Ribuloose -1,5-bisphosphate carboxylase / oxygenase) rbc LX was previously described (Rudi et al. 1998) primers CW (SEQ ID NO: 6) (5'-CGT AGC TTC CGG TGG TAT Amplification using CCA CGT-3 ') and CX (SEQ ID NO: 7) (5'-GGC GCA GGT AAG AAA GGG TTT CGT A-3'). Synthesis and DNA sequencing of the primers used in this study were performed in Macrogen (Macrogen, Seoul, Korea).
계통발생 분석Phylogenetic analysis
본 연구에서 분석된 염기서열 및 이들과 유전적으로 가장 근접한 염기서열들을 ClustalW 를 이용하여 Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA) 소프트웨어 버전 4.0에서 수동으로 정렬(align)하였다(Tamura 등 2007). 정렬에 사용된 모든 염기서열들을 미국 국립생물정보센터(The National Center for Biotechnology Information, NCBI) 데이터베이스로부터 다운로드 하였다. Maximum composite likelihood method를 이용하여 진화적 거리를 계산하고, neighbour-joining tree-building algorithm을 이용하여 거리 매트릭스(matrixes)로부터 계통발생도를 생성하였다(Saitou 및 Nei 1987). 해석된 계통도는 MEGA 4.0에서 부트스트랩(bootstrap) 시험(1,000회 부트스트랩 반복)기능을 이용하여 평가하였으며(Felfenstein 1985), 부트스트랩 > 50% 초과의 부트스트랩 값들 만을 분지점에 표시하였다. 본 발명에서 분석된 DNA 서열을 accession number HQ201392-HQ201394로 NCBI 데이터베이스에 등록하였다(표 1).The sequences analyzed in this study and the sequences closest to them genetically close were manually aligned in Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA) software version 4.0 using ClustalW (Tamura et al. 2007). All sequences used for sorting were downloaded from the National Center for Biotechnology Information (NCBI) database. Evolutionary distances were calculated using the Maximum composite likelihood method, and phylogeny was generated from distance matrices using a neighbor-joining tree-building algorithm (Saitou and Nei 1987). The analyzed schematic was evaluated using the bootstrap test (1,000 bootstrap repetition) function in MEGA 4.0 (Felfenstein 1985) and only bootstrap values> bootstrap> 50% were displayed at the branch points. DNA sequences analyzed in the present invention were registered in the NCBI database as accession number HQ201392-HQ201394 (Table 1).
성장 실험Growth experiment
10일 간 배양한 KNUA009 (1 ml) 균주를 BG-11(+) 배지로 각각 3반복하여 접종하고, 20일 동안 배양하였다. 분리균주의 최적 성장온도를 알아내기 위하여, KNUA009의 생존 및 성장을 5, 10, 15, 20, 25 및 30℃에서 검사하였다. 염도 및 산성 내성 시험은 15℃에서 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5 및 0.6M NaCl 및 pH 2.0, 3.0, 4.0, 5.0, 6.0, 7.0, 8.0, 9.0, 10.0, 11.0, 12.0 및 13.0의 범위에서 각각 수행하였다. Miura and Yokota (2006)에 설명된 것과 같이, 글루코오스, 수크로오스, 프룩토오스, 리보오스, 나트륨 아세테이트, 글리세롤 및 글리콜산을 사용하여 탄소 이용 시험을 실시하였다. Optimizer 2120UV 분광광도계(Mecasys Co. Ltd., 한국, 대전 소재) 상에서 750 nm에서 배양물의 광학 밀도를 측정하므로써 남조류 밀도를 결정하였다.KNUA009 (1 ml) strains cultured for 10 days were inoculated three times with BG-11 (+) medium and incubated for 20 days. To determine the optimal growth temperature of the isolate, the survival and growth of KNUA009 were examined at 5, 10, 15, 20, 25 and 30 ° C. Salinity and acid resistance tests were performed at 15 ° C. in the range of 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5 and 0.6M NaCl and pH 2.0, 3.0, 4.0, 5.0, 6.0, 7.0, 8.0, 9.0, 10.0, 11.0, 12.0 and 13.0 Each was performed. As described in Miura and Yokota (2006), carbon utilization tests were conducted using glucose, sucrose, fructose, ribose, sodium acetate, glycerol and glycolic acid. Cyanobacteria density was determined by measuring the optical density of the culture at 750 nm on an Optimizer 2120UV spectrophotometer (Mecasys Co. Ltd., Daejeon, Korea).
색소 동정Pigment Identification
색소 추출을 Azua-Bustos 등(2010)의 방법에 의해 수행하였다. 100 nm와 800nm 사이의 흡수 스펙트럼은 Optizen View 3.02 소프트웨어(Mecasys Co. Ltd., 한국, 대전)을 이용하여 Optimizer 2120UV 분광광도계 상에서 측정하였다.Pigment extraction was performed by the method of Azua-Bustos et al. (2010). Absorption spectra between 100 nm and 800 nm were measured on an Optimizer 2120UV spectrophotometer using Optizen View 3.02 software (Mecasys Co. Ltd., Daejeon, Korea).
GC 함량 분석GC content analysis
DNA G+C 함량을 KCCM (Seoul, Korea)의 Shin 등(1996)에 설명된 것과 같은 HPLC 방법에 의하여 결정하였다.DNA G + C content was determined by HPLC method as described in Shin et al. (1996) by KCCM (Seoul, Korea).
지방산 분석Fatty acid analysis
미세조류의 지질성분 추출은 표준 프로토콜(Sasser, 1990)에 따라 수행되었다. 배양된 남조류 세포 약 40 mg을 원심분리하여 펠렛을 만들어 깨끗한 13x100 mm 배양 시험관으로 옮겼다. NaOH와 메탄올을 포함하는 Reagent 1 용액 1 ml을 시험관에 넣고 간략히 vortex한 후 항온수조에서 100℃로 약 5분간 끓여준 다음, 다시 5-10초간 vortex한 후 25분간 항온수조에서 100℃로 비누화반응(saponification)을 수행하였다. 시험관이 식고나면 염산과 메탄올을 함유하고 있는 Reagent 2 용액 2 ml을 시험관에 넣고 간단히 vortexing한 후 80℃에서 10분간 열을 가해 메틸화(methylation) 시킨 뒤 급속히 식혀 주었다. 헥산과 methyl tert-butyl ether를 포함하는 Reagent 3 용액 1.25 ml을 시험관에 넣고 약 10분간 가볍게 교반해 준 뒤 아래쪽 수용층을 피펫으로 뽑아내어 버렸다. NaOH를 함유한 Reagent 4 용액 3 ml을 시험관에 남아있는 유기용매 층에 첨가하고 5분간 교반시켜 준 다음 유기용매 층의 약 2/3을 취해서 KBSI 대구 지점에서 Hewlett-Packard GC 6890 시리즈 가스 크로마토그래피 상에서 지방산 조성을 분석하였다.Lipid extraction of microalgae was performed according to standard protocols (Sasser, 1990). Approximately 40 mg of cultured cyanobacterial cells were centrifuged to pellet and transferred into clean 13 × 100 mm culture test tubes. Put 1 ml of Reagent 1 solution containing NaOH and methanol into the test tube, briefly vortex, boil at 100 ℃ in a constant temperature water bath for 5 minutes, vortex again for 5-10 seconds, and saponify at 100 ℃ in a constant temperature water bath for 25 minutes. saponification) was performed. After the test tube was cooled, 2 ml of
결과result
형태학적 동정Morphological identification
물리적 분리방법에 의거 Oscillatoria sejongensis KNUA009의 순수배양을 달성하였다. 상기 미생물은 사상체를 이루며 디스크 형태의 영양세포들로 구성된 직선 또는 약간 굽은 세포사(細胞絲, trichome)로 이루어져 있었다(도 1). 세포사들은 너비 약 3 μm 및 길이 >20 μm 내지 수백 μm였다. 이의 말단 세포들은 돔(dome) 형태였다. 이형세포(異形細胞, heterocyst)은 발견되지 않았으나 KNUA009 균주에서 격벽(隔壁, cross-wall)을 명확하게 볼 수 있었다. 그 색상은 갈색에서 올리브색을 띄고 있었으며, 조밀하게 모인 세포사들은 육안으로 보이는 매트를 형성하고 있었다. 균주 KNUA009의 형태학적 특징들을 종합한 결과 이 분리균주는 Oscillatoria 속에 속한다는 결론을 얻을 수 있었다.Pure culture of Oscillatoria sejongensis KNUA009 was achieved by physical separation method. The microorganisms consisted of straight or slightly curved cell death (細胞 絲, trichome) consisting of disk-shaped vegetative cells forming filaments (Fig. 1). Cell deaths were about 3 μm wide and> 20 μm to hundreds of μm long. Its terminal cells were dome shaped. Heterocysts were not found, but the cross-walls were clearly visible in the KNUA009 strain. The color ranged from brown to olive, with the densely packed cell deaths forming a visible mat. Combining the morphological characteristics of strain KNUA009, it could be concluded that this isolate belongs to Oscillatoria .
분자수준 동정Molecular Level Identification
16S rRNA 염기서열 데이터에 근거하여, 균주 KNUA009는 각종 빙권 영역들로부터 유래된 환경 클론들에 가장 근접한 연관성을 보였으며, 이의 가장 가까운 배양 가능한 균주는 단지 90%의 염기서열 상동성을 갖는 Phormidium pristleyi ANT.LH66.1 (AY493581)이었다(표 1, 도 2). ITS 염기서열 분석 또한 KNUA009 균주에 대해 가장 가까운 염기서열 매치가 남극 동부지역 마이어스 계곡(Miers Valley)의 표토로부터 분리된 배양되지 않은 남조류 클론 N184-8 (EU032395)로 99%의 염기서열 상동성을 갖는 것을 보여주었다(표 1). 나아가, KNUA009 균주는 마이어스 계곡의 표토 또는 남조류 매트로부터 유래한 남극 남조류 클론과 함께 밀접하게 집합체를 형성하였다(도 3). Leptolyngbya sp. CCALA 094 (AM398976)가 KNUA009 균주와 가장 근접한 염기서열을 가진 배양 가능한 미생물이었으나, 그 상동성은 단지 86%(표 1)이었다. rbcLX 염기서열 비교에 근거, Prochlorothrix hollandica rbcL 및 rbcS 유전자(X57359)가 KNUA009 균주에 대해 가장 가까운 매치인 것임을 밝혔으나, 조회 적용범위(query coverage)는 단지 29%였다(표 1). 이는 남극 남조류 rbcLX 유전자에 대한 GenBank 내 염기서열 데이터의 부재로 인한 것일 수 있으며, 따라서 이 결과에 의해서는 확인될 수 없었다.Based on 16S rRNA sequencing data, strain KNUA009 showed the closest association with environmental clones derived from various ice cap regions, the closest cultivable strain of which was Phormidium pristleyi ANT with only 90% sequence homology. .LH66.1 (AY493581) (Table 1, FIG. 2). ITS sequencing also showed a 99% sequence homology to the uncultured cyanobacteria clone N184-8 (EU032395) isolated from the topsoil of the Meers Valley in eastern Antarctica, with the closest sequence match for the KNUA009 strain. (Table 1). Furthermore, the KNUA009 strain closely formed aggregates with Antarctic algae clones derived from the topsoil or algae mat of the Meyers valley (FIG. 3). Leptolyngbya sp. CCALA 094 (AM398976) was a culturable microorganism with the closest nucleotide sequence to KNUA009 strain, but its homology was only 86% (Table 1). Based on the rbc LX sequence comparison, the Prochlorothrix hollandica rbc L and rbc S genes (X57359) were the closest match for the KNUA009 strain, but the query coverage was only 29% (Table 1). This may be due to the lack of sequencing data in GenBank for the Antarctic algae rbc LX gene, and thus could not be confirmed by this result.
KNUA009의 생리학적 특성Physiological Characteristics of KNUA009
도 4A에 나타낸 바와 같이, 균주 KNUA009의 최적성장 온도는 15℃ 였으나, 10 및 20℃에서도 생장이 가능하였다(도 4a). 그러나, 이 미생물은 25℃와 그 초과온도에서는 생존할 수 없었으며, 이는 이의 호냉성 특징들을 나타낸다. 그러나, 5℃에서 배양 시 현저하게 지연된 생장이 관찰되었으며, 이는 24일간의 배양 후에 정지상(靜止相, stationary phase)에 도달하였다. KNUA009 균주는 최대성장에 도달하고 나면 대부분의 경우에 급속하게 소멸하기 시작하였으나 이러한 현상은 고체배지에서 배양된 경우에는 발생하지 않았다. 생장 pH 범위는 pH 4.0부터 pH 11.0까지였던 반면, 분리균주의 최적생장은 pH 7.0에서 수득되었다(도 4b). pH 3 이하 및 pH 12.0 이상에서는 생장이 관찰되지 않았다. 균주 KNUA009는 0.2M까지의 NaCl 농도는 견딜 수 있었다. 본 연구에서 시험된 다른 대체 탄소원들을 KNUA009 균주가 이용하지 않았기 때문에, 이 남조류는 절대적인 광독립영양 생물(photoautotroph)인 것으로 결론이 지어졌다. KNUA009 균주는 질소원이 포함되어 있지 않은 BG-110 배지에서는 생장할 수 없었다. KNUA009 균주의 생리학적 특성들은 표 2에 요약되어 있다.As shown in FIG. 4A, the optimum growth temperature of strain KNUA009 was 15 ° C., but growth was possible at 10 and 20 ° C. (FIG. 4A). However, this microorganism could not survive at 25 ° C. and above, indicating its quenching characteristics. However, markedly delayed growth was observed upon incubation at 5 ° C., which reached a stationary phase after 24 days of incubation. The KNUA009 strain began to disappear rapidly in most cases after reaching maximum growth, but this phenomenon did not occur when cultured in solid medium. Growth pH ranged from pH 4.0 to pH 11.0, while the optimum growth of the isolate was obtained at pH 7.0 (FIG. 4B). No growth was observed below pH 3 and above pH 12.0. Strain KNUA009 was able to withstand NaCl concentrations up to 0.2M. Since the KNUA009 strain did not utilize the other alternative carbon sources tested in this study, it was concluded that this cyanobacteria is an absolute photoautotroph. KNUA009 strain could not grow in BG-11 0 medium without nitrogen source. Physiological characteristics of KNUA009 strains are summarized in Table 2.
화학분류학적 특성Chemical classification
균주 KNUA009의 DNA의 G+C 함량은 47.5몰%로 이는 Pasteur Culture Collection(Castenholz 2001)에 기탁된 Oscillatoria 속의 평균 DNA 염기서열 조성 (40-50몰% G+C) 내에 속하는 것이다. 균주 KNUA009의 지방산 조성은 16:0(34.6%), 16:1(24.9%), 16:2(0.8%), 18:0(1.2%), 18:1(5.2%), 18:2(15.5%) 및 18:3(17.8%)으로 구성되어 있었다. 흡수 스펙트럼들은 432 및 664 nm에서 엽록소a 의 흡수피크 그리고 485 nm에서 β-카로틴 피크를 나타내었다(도 5).The G + C content of DNA of strain KNUA009 is 47.5 mol%, which belongs to the average DNA sequence composition (40-50 mol% G + C) of the genus Oscillatoria deposited in Pasteur Culture Collection (Castenholz 2001). The fatty acid composition of strain KNUA009 was 16: 0 (34.6%), 16: 1 (24.9%), 16: 2 (0.8%), 18: 0 (1.2%), 18: 1 (5.2%), 18: 2 ( 15.5%) and 18: 3 (17.8%). Absorption spectra showed absorption peaks of chlorophyll a at 432 and 664 nm and β-carotene peaks at 485 nm (FIG. 5).
2. 미세조류의 배양 및 지질 성분의 추출2. Culture of Microalgae and Extraction of Lipid Components
KNUA009 균주를 16 L 용량의 BG-11(+) 배지를 포함하고 있는 18 L 크기의 투명 polycarbonate 재질의 광생물반응기에 접종한 후 광독립영양적(autotrophically)으로 배양하였다. 배양조건은 15℃에서 낮:밤(16:8 시간) 주기로 약 70 μmole·m-2·sec-1의 광도에서 약 2 L·min-1의 공기를 주입하는 조건에서 배양하였다. 약 2주 후, 미세조류 배양액을 3,220 g에서 10분간 원심분리하여 바이오매스를 수확한 뒤 추출 수율을 높이기 위해 동결건조 처리를 하였다. 동결건조된 바이오매스를 클로로포름:메탄올(2:1) 혼합액과 잘 섞은 후, 분별 깔때기(separation funnel)에 넣고 정치시켜 8시간 이상 지질추출을 수행하였다.KNUA009 strains were inoculated into an 18 L photobioreactor made of transparent polycarbonate containing 16 L of BG-11 (+) medium and then cultured autotrophically. Cultivation conditions were incubated at a temperature of about 2 L · min −1 at 15 ° C. day and night (16: 8 hours) at a light intensity of about 70 μmo · m −2 · sec −1 . After about two weeks, the microalgal culture was centrifuged at 3,220 g for 10 minutes to harvest biomass and subjected to lyophilization to increase the extraction yield. The lyophilized biomass was mixed well with the chloroform: methanol (2: 1) mixed solution, placed in a separatory funnel, and allowed to stand for more than 8 hours to perform lipid extraction.
3. 바이오디젤의 제조 3. Preparation of Biodiesel
상기 2.로부터 분리된 클로로포름 추출물을 회전 증발기(rotary evaporator)에서 건조시킨 뒤 transesterfication 반응을 촉진시키기 위해 메탄올과 KOH 처리를 해 주었고 바이오디젤 분리를 돕기 위해 헥산을 다시 첨가해 주었다. 이 혼합물을 교반시켜 주며 10시간 동안 30℃에서 가열해 주었고, 그 후 혼합물이 정치되어 메탄올 층과 헥산 층이 분리되면 헥산 층을 취해서 최종적으로 바이오디젤을 제조하였다. Chloroform extract isolated from 2. was dried on a rotary evaporator and treated with methanol and KOH to promote transesterfication reaction and hexane was added again to help biodiesel separation. The mixture was stirred and heated at 30 ° C. for 10 hours. After that, the mixture was allowed to stand and the methanol layer and the hexane layer were separated, and the biohexane was finally prepared by taking the hexane layer.
서열목록 전자파일 첨부Attach an electronic file to a sequence list
Claims (4)
Oscillatoria sejongensis KNUA009 ( Oscillatoria sejongensis KNUA009) strain (Accession No .: KCTC 12034BP), characterized in that the culture of biodiesel using microalgae, characterized in that at a temperature of 12 ℃ to 18 ℃, pH 6.5 to 7.5 Manufacturing method.
0.2M 이하의 염농도에서 배양하는 것을 특징으로 하는 미세조류를 이용한 바이오디젤의 제조 방법.The method of claim 1,
Method for producing biodiesel using microalgae, characterized in that the culture at a salt concentration of 0.2M or less.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
KR1020110107670A KR101349295B1 (en) | 2011-10-20 | 2011-10-20 | A producing method of biodiesel using a novel psychrophilic cyanobacterium oscillatoria sejongensis |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
KR1020110107670A KR101349295B1 (en) | 2011-10-20 | 2011-10-20 | A producing method of biodiesel using a novel psychrophilic cyanobacterium oscillatoria sejongensis |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
KR20130043491A KR20130043491A (en) | 2013-04-30 |
KR101349295B1 true KR101349295B1 (en) | 2014-01-10 |
Family
ID=48441717
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
KR1020110107670A KR101349295B1 (en) | 2011-10-20 | 2011-10-20 | A producing method of biodiesel using a novel psychrophilic cyanobacterium oscillatoria sejongensis |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
KR (1) | KR101349295B1 (en) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US10036046B2 (en) | 2015-10-22 | 2018-07-31 | Korea Institute Of Science And Technology | Transformed Synechococcus elongatus having capability of producing biodiesel from carbon dioxide and method for producing biodiesel using the same |
-
2011
- 2011-10-20 KR KR1020110107670A patent/KR101349295B1/en active IP Right Grant
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
J Appl Phycol. 2009, Vol.21, pp.493-507 * |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US10036046B2 (en) | 2015-10-22 | 2018-07-31 | Korea Institute Of Science And Technology | Transformed Synechococcus elongatus having capability of producing biodiesel from carbon dioxide and method for producing biodiesel using the same |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
KR20130043491A (en) | 2013-04-30 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Patel et al. | A perspective on biotechnological applications of thermophilic microalgae and cyanobacteria | |
Gupta et al. | New insights into the biodiversity and applications of cyanobacteria (blue-green algae)—Prospects and challenges | |
CN102492626B (en) | Intend Nannochloropsis oceanica and application thereof | |
CN106916747B (en) | Chlorella sorokiniana strain and culture method and application thereof | |
KR20120006520A (en) | Micro-alga belonging to genus navicula, process for production of oil by culture of the micro-alga, and oil collected from the micro-alga | |
WO2014083534A1 (en) | Mixotrophic cultivation of microalgae for the production of biofuel | |
Bagwell et al. | A diverse assemblage of indole-3-acetic acid producing bacteria associate with unicellular green algae | |
KR101424852B1 (en) | Chlorella vulgaris CV-16 producing biodiesel, and method for producing biodiesel using the strain | |
Eddie et al. | Characterization and growth response to temperature and salinity of psychrophilic, halotolerant Chlamydomonas sp. ARC isolated from Chukchi Sea ice | |
KR101525319B1 (en) | Novel Micractinium inermum NLP-F014 and use thereof | |
CN101892159B (en) | Chlamydomonas strain and application thereof | |
CN102911872B (en) | Scenedesmus sp. strain and application thereof | |
CN103160440B (en) | The one algae strain of strain grid algae and application thereof | |
KR101349295B1 (en) | A producing method of biodiesel using a novel psychrophilic cyanobacterium oscillatoria sejongensis | |
KR101424853B1 (en) | Chlorella vulgaris CV-18 producing biodiesel, and method for producing biodiesel using the strain | |
CN102978114A (en) | Scenedesmus sp. and applications thereof | |
US9102972B2 (en) | Microorganism Rhizobium sp. KB10 having properties of promoting growth of Botryococcus braunii and increasing fatty acid content | |
Bhatt et al. | Isolation and characterization of a halophilic cyanobacterium Euhalothece SLVH01 from Sambhar salt lake, India | |
KR101349286B1 (en) | A PRODUCING METHOD OF β-CAROTENE USING A NOVEL PSYCHROPHILIC CYANOBACTERIUM OSCILLATORIA SEJONGENSIS | |
KR101239261B1 (en) | A novel psychrophilic cyanobacterium oscillatoria sejongensis from antarctica | |
KR101576480B1 (en) | Novel Chlorella vulgaris KNUA007 strain and method for producing fatty acid, fatty alcohol, and ergosterol from the same | |
CN102943044A (en) | Scenedesmus sp. and use thereof | |
KR20140013105A (en) | Novel microalgae chlamydomonas reinhardtii knua021 and method for producing fatty alcohol and fatty acid from the same | |
CN106467894B (en) | One plant height produces single needle algae and its culture application of starch and grease | |
KR101692695B1 (en) | Thraustochytriidae sp. mutant strain GA containing high content of polyunsaturated fatty acid and uses thereof |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A201 | Request for examination | ||
E902 | Notification of reason for refusal | ||
E701 | Decision to grant or registration of patent right | ||
GRNT | Written decision to grant | ||
FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20161219 Year of fee payment: 4 |
|
FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20171208 Year of fee payment: 5 |
|
FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20200102 Year of fee payment: 7 |