KR101349198B1 - 항균성 펩티드의 발현을 회복시키기 위한 스핑고실포스포릴콜린 길항제의 용도 - Google Patents

항균성 펩티드의 발현을 회복시키기 위한 스핑고실포스포릴콜린 길항제의 용도 Download PDF

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Abstract

SPC는 아토피성 피부염 환자에게서 인간 베타 디펜신(HBD-1, HBD-2, HBD-3 및 HBD-4), 카텔리시딘(LL-37) 및 덤시딘의 발현을 억제시키므로, SPC 길항제는 AMPs의 발현 감소 관련 질환의 예방 및 치료에 유용하다.

Description

항균성 펩티드의 발현을 회복시키기 위한 스핑고실포스포릴콜린 길항제의 용도{USE OF SPHINGOSYLPHOSPHORYLCHOLINE ANTAGONIST FOR RESTORING THE EXPRESSION OF ANTIMICROBIAL PEPTIDES}
본 발명은, 예를 들어 아토피성 피부염 환자의 피부에서 스핑고실포스포릴콜린(sphingosylphosphorylcholine, SPC) 길항제를 이용하여 항균성 펩티드(antimicrobial peptides, AMPs)의 발현 수준을 회복시키는 방법, AMPs 발현 회복용 약제의 제조를 위한 SPC 길항제의 용도, 및 후보 화합물의 AMPs 발현 수준을 회복시키는 능력을 분석함으로써 SPC 길항제를 스크리닝하는 방법에 관한 것이다.
하기 구조식의 스핑고실포스포릴콜린(sphingosylphosphorylcholine, SPC)은 라이소스핑고리피드류(lysosphingolipids)에 속하며, 스핑고미엘린(sphingomyelin, SM)의 N-탈아실화된 형태를 갖는다:
Figure 112008087138863-pct00001
SPC는 스핑고미엘린 N-탈아실화효소에 의해 스핑고미엘린으로부터 생성되는 미토겐이고(Higuchi K et al., Biochem J., 350, 747-56, 2000), 세포의 소포체로부터 Ca2+가 유리되는데 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있으며, 또한 세포 성장, 세포 증식(Desai et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., (1991), 181, 361-366), 및 세포 사멸(Jeon ES et al., Biochim Biophys Acta. (2005), 1734(1), 25-33)에 관여한다. 특히 SPC는 다양한 세포에서 세포 재구성 또는 세포 이동에 영향을 미친다고 보고되고 있다. 예를 들면 섬유 아세포에서의 창상치유효과, 및 각질형성세포에서의 염증반응, 표피분화, 형태형성 및 멜라닌 형성을 조절한다(Berger et al., Proc. Natl. Acad. ScL U. S. A. (1995), 92, 5885-5889). 최근에는 1) 아토피성 피부염 환자들로부터 수득한 각질에서 건강한 대조군 대상과 비교할 때 SPC의 발현이 유의적으로 증가된 양상을 나타내고(Reiko Okamoto et al., Journal of Lipid Research (2003), 44, 93-102), 2) 이러한 환자들의 상피세포에서 스핑고미엘린 탈아실화효소의 활성이 비정상적으로 높아지며(Higuchi K et al., Biochem. J. (2000), 350 747-756), 3) 스핑고미엘리나아제에 의한 감소된 세라마이드(ceramide) 합성 수준으로 인해 일부 피부장벽 기능장애가 일어난다는 것이 보고되었다(Junko Hara et al., J. Invest. Dermatol. (2000), 115, 406-413). 그러나, 이러한 SPC의 발현 증가가 아토피성 피부염 등의 피부질환을 유발한다는 기작은 밝혀진 바가 전혀 없다.
항균성 펩티드(AMPs)는 작은 분자량을 가진 단백질로 박테리아, 바이러스 및 곰팡이와 같은 병원균에 의한 감염을 예방하는 항균 활성을 갖는다(Ganz T et al., Cwrr. Opin. Immunol. (1994), 6, 584-589). AMPs는 혈관신생, 창상치유 및 화학주성을 유도하는 것으로 보고되고 있으며(Izadpanah A et al., J. Am. Acad. Dermatol. (2005), 52, 381-390), 양전하를 띠면서 친수성 및 소수성 부위를 동시에 가지고 있는 구조적인 특징이 있다.
최근, AMPs로 알려진 인간 베타-디펜신-2(Human beta-defensin, HBD-2) 및 카텔리시딘(cathelicidin, LL-37)의 발현 감소로 인해 아토피성 피부염 환자의 피부에 포도상 구균(S. aureus)이 비정상적으로 증식한다는 것과, 특히 건선 환자와 비교하여 아토피성 피부염 환자에서 인간 베타-디펜신-2 및 카텔리시딘의 발현이 현저히 줄어든다는 것이 보고되었다(Ong P. Y. et al., N. Engl. J. Med. (2002), 347, 1151-1160).
인간 디펜신은 그 구조적 특징에 따라 알파 디펜신과 베타 디펜신으로 나뉠 수 있다. 알파 디펜신은 아르기닌이 풍부한 각각 약 30-35개의 아미노산으로 이루어진 단일 폴리펩티드이고, 인간에서 총 6개의 아형(HNP-1 내지 -4, HD-5 및 HD-6)이 동정되었다. 베타 디펜신의 경우, 각각 약 41-50개의 아미노산으로 이루어져 있으며 인간 혈청에서 11개의 아형이 생화학적으로 동정되었고(Biochemistry and Molecular Biology News, 1-7, 2006), 인간 유전체 프로젝트의 완성 후 총 28개의 인간 베타 디펜신 및 43개의 생쥐 베타 디펜신 유전자가 동정되었다(B.C. Schutte 등, Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 99, 2129-2133, 2002).
한편, 아토피성 피부염 환자의 피부에서 발현 감소가 보고된 인간 베타 디펜신(HBDs) 중에서 HBD-1은 주로 신장, 여성 생식기, 호흡기, 췌장, 잇몸, 혀 및 중이 등의 상피세포에서 발현되는 반면, HBD-2는 피부, 폐, 기도, 잇몸 및 중이에서 발현되나 신장, 방광 등의 비뇨기관 및 침샘에서는 전혀 발현되지 않는다(J. Harder 등, Nature, 387, 861, 1997). 또한, HBD-3은 피부 등에 발현되는 반면, HBD-4는 남성의 생식기 및 위장에서 발현된다.
HBD-1 및 HBD-3은 항상적으로 발현(constitutive expression)되는 반면, HBD-2 및 HBD-4를 포함하는 대부분의 HBDs는 감염과 같은 특정 조건에서만 유도 발현되는 것으로 알려져 있다(J.M. Schroder et al., Int. J. Biochem. Cell Biol. 31, 645-651, 1999). 이러한 유도 발현을 나타내는 HBDs중 HBD-2의 발현은 HBD-2의 유전자의 프로모터에 NF-κB 부착서열이 존재하기 때문에, MEK1/2-ERK1/2 신호전달경로를 거쳐 NF-κB에 의해 발현이 상향 조절될 것으로 예상되고(Tsutsumi-Ishii Y 등, J. Leukoc. Biol., 71,154-162, 2002), 이외 TNF-α, IL-1α, IL-1β 또는 LPS에 의해 발현이 유도되는 것으로 보고된다(KW Cha et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (2000), 97, 3016-3021). 또한, HBD-4의 발현은 S. 뉴모니애(S. pneumoniae)와 같은 미생물에 의해 PMA-PKC 신호전달경로를 거쳐 발현 유도되는 것으로 보고되며(J.R. Garcia et al., FASEB J. (2001), 15, 1819-1821), HBD-3의 발현 수준은 TNF-α, IL-1β 및 IFN-γ에 의해 향상되는 것으로 알려져 있다.
본 발명자들은 아토피성 피부염 환자의 병리학적 기작에 대해 예의연구한 결과, SPC가 AMPs의 발현, 특히 아토피성 피부염 환자의 피부에서 발현 감소가 보고 된 인간 베타 디펜신의 패밀리인 HBD-1 내지 HBD-4, 카텔리시딘(LL-37) 및 덤시딘(dermcidin)의 발현을 현저히 감소시킴을 발견하였다.
발명의 내용
해결하고자 하는 과제
따라서, 본 발명의 목적은 AMPs의 발현이 감소된 포유동물에서, AMPs의 발현을 효과적인 수준으로 회복시키는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 포유류에서 AMPs의 발현 회복용 약제를 제조하기 위한 스핑고실포스포릴콜린(SPC) 길항제의 용도를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 AMPs의 발현을 회복시키기 위한 후보물질을 스크리닝(screening)하는 효율적인 방법을 제공하는 것이다.
과제 해결수단
상기 목적을 달성하기 위해 본 발명에서는, AMPs의 발현 회복이 요구되는 포유동물에 유효량의 SPC 길항제를 투여하는 단계를 포함하는, AMPs의 발현을 회복시키는 방법을 제공한다.
상기 또 다른 목적을 달성하기 위해 본 발명에서는, AMPs의 발현 회복이 요구되는 포유동물에서, AMPs의 발현을 정상 수준으로 회복시키기 위한 약제를 제조하기 위한 SPC 길항제의 용도를 제공한다.
상기 또 다른 목적을 달성하기 위해 본 발명에서는, 1) 피검체에 SPC 또는 이의 유도체를 처리하여 AMPs의 발현을 억제시키는 단계; 및 2) 상기 피검체에 SPC 길항제 후보 물질들을 처리하고, 상기 피검체에서 AMPs의 발현 회복 수준을 분석하는 단계를 포함하는, SPC 길항제를 검색하는 방법을 제공한다.
도면의 간단한 설명
도 1: HaCaT 세포에서 항상적으로 발현되거나 또는 TNF-α에 의해 유도된 HBD-1 내지 -4, hCAP-18/LL-37, 및 DCD의 mRNA 발현 수준이 SPC 농도-의존적으로 억제되었음을 나타내는 RT-PCR 분석 결과이다.
도 2: HaCaT 세포에서 항상적으로 발현되거나 또는 PMA에 의해 유도된 HBD-2 및 -3, 및 DCD에의 mRNA 발현 수준이 SPC 농도-의존적으로 억제되었음을 나타내는 RT-PCR 분석 결과이다.
도 3: HaCaT 세포에서 TNF-α에 의해 유도되고 SPC에 의해 억제된 HBD-2 및 HBD-3의 mRNA 발현 수준이 2-아미노-2-옥틸옥시메틸-프로판-l,3-디올(#13) 또는 N-(2-(나프탈렌-2-일옥시)에틸)프로프-2-엔-l-아민(#14)을 처리함으로써 회복되었음을 나타내는 RT-PCR 분석 결과이다.
도 4: ICR 마우스에서 TNF-α에 의해 유도되고 SPC에 의해 억제된 HBD-1 및 HBD-2의 단백질 발현이 2-아미노-2-옥틸옥시메틸-프로판-l,3-디올(#13) 또는 N-(2-(나프탈렌-2-일옥시)에틸)프로프-2-엔-l-아민(#14)을 처리함으로써 정상 수준으로 회복되었음을 나타내는 면역조직화학분석 결과이다.
본 발명의 AMPs의 발현을 정상 수준으로 회복시키는 방법에서 사용되는 SPC 길항제로는 SPC의 활성을 저해하거나, SPC가 AMPs의 발현을 억제하는 기작에 대해 길항작용을 함으로써 AMPs의 발현을 회복시킬 수 있는 물질이면 어느 것이나 사용 가능하다.
상기 SPC 길항제의 대표적인 예로는, SPC의 활성부위에 결합하는 경쟁적 저해제, SPC의 활성부위가 아닌 부위에 결합하여 활성 부위의 기능을 방해하는 비경쟁적 저해제, SPC의 세포내 특정 위치로의 이동을 방해하는 억제제, SPC를 분해하거나 또는 분해를 유도하는 물질, 및 SPC가 AMPs 발현을 억제하는 기작에 대한 차단제 등이 있다.
본 발명의 방법에서, 상기 SPC 길항제는 AMPs의 발현 회복이 요구되는 피검체, 예를 들면 아토피성 피부염(AD)과 같은 AMPs 발현 감소 관련 질환을 나타내는 인간을 포함하는 포유동물에, 전신 또는 국소적으로 투여될 수 있다. 본 발명의 방법에서 SPC 길항제의 적합한 단독 투여량은 치료되는 증상, 투여 경로, 환자의 연령 및 체중, 및 증상의 중증도와 같은 다양한 관련 인자들을 고려하여 결정할 수 있다.
또한, 본 발명에서는 1) 피검체에 SPC 또는 이의 유도체를 처리하여 AMPs의 발현을 억제시키는 단계; 및 2) 상기 피검체에 SPC 길항제 후보 물질들을 처리하고, AMPs의 발현 회복 수준을 분석하는 단계를 포함하는, SPC 길항제를 검색하는 방법을 제공한다. 본 발명의 방법에서 상기 피검체는 시험 세포 또는 포유동물일 수 있다. 상기 시험 세포로는 AMPs를 발현하거나 또는 유도 물질에 반응하여 AMPs를 발현할 수 있는 세포라면 어느 것이나 사용 가능하고, 각질형성세포(keratinocytes)가 바람직하다. 또한 상기 포유동물은 마우스, 래트 또는 모르모트와 같은 설치류일 수 있으며, 무모 마우스가 바람직하다.
본 발명의 바람직한 실시예에 의하면, 단계 1)에서는, 피검체에 SPC 또는 이의 유도체를 약 1nM 내지 약 40mM(약 0.002%(w/w) 내지 약 2%(w/w))의 농도로 투여할 수 있다. 이때 농도가 1nM 미만인 경우에는 AMPs의 발현을 충분히 억제할 수 없고, 40mM 초과인 경우에는 시험 세포의 모양이 변하거나, 시험 동물에서는 고용량에 따른 부작용이 초래될 수 있다. 또한, 유도 발현을 나타내는 AMPs, 예를 들어 HBD-2 및 HBD-4를 본 발명의 방법의 분석에 적용하는 경우에는, 상기 단계 1)에서 피검체에 SPC를 처리하기 전 또는 처리하는 동시에 AMPs의 발현 유도 물질을 처리하는 단계를 포함할 수 있다. AMPs의 발현 유도 물질은 Ca2+, TNF-α, IL-1β, IFN-γ 및 PMA(phorbol 12-myristate 13-acetate)로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으며, TNF-α 및 PMA가 바람직하다.
단계 2)에서는, 상기 단계 1)에서 AMPs의 발현이 억제된 피검체에 SPC 길항제 후보 물질들을 처리하고, AMPs의 발현 회복 수준을 분석할 수 있다. 상기 AMPs의 발현 수준은 당 분야에서 유전자 또는 단백질의 발현 확인을 위해 사용되는 일반적인 기술들을 이용하여 분석할 수 있다. 예를 들어, AMPs의 유전자의 발현을 확인하는 방법으로는, 역전사 중합효소 연쇄반응(RT-PCR) 및 노던 블롯(northern blot) 분석과 같이 AMPs들의 각 유전자 또는 그의 단편을 프로브를 이용하는 각종 블롯 분석 등이 있으며, AMPs의 단백질의 발현을 확인하는 방법으로는, AMPs 단백질에 대한 항체를 이용한 효소결합 면역흡착 분석법(enzyme-linked immunosorbent assay; ELISA), 방사선 면역측정법(radioimmunoassay; RIA), 샌드위치 측정법, 웨스턴 블롯(western blot), 면역 블롯(immunoblot) 또는 면역조직화학염색법(immunohistochemical staining) 등이 있다.
SPC는 아토피성 피부염 환자들에서 발현 감소 양상이 보고된 인간 베타 디펜신(HBD-1, HBD-2, HBD-3 및 HBD-4), 카텔리시딘(LL-37) 및 덤시딘의 발현을 현저히 감소시킨다. 따라서 SPC 길항제는 아토피성 피부염과 같이 AMPs 발현 감소 관련 질환을 예방 및 치료하는데 유용하며, 상기 AMPs의 유전자 또는 단백질의 발현의 회복 수준을 분석함으로써 SPC 길항제 물질을 유용하게 스크리닝할 수 있다.
하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.
또한 달리 언급되지 않는 한, 하기에 기재된 고체 혼합물 중 고체, 액체 중 액체, 및 액체 중 고체의 비율은 각각 wt/wt, vol/vol 및 wt/vol에 근거하며, 모든 반응은 실온에서 수행되었다.
참조예: AMPs의 발현 수준 분석
하기 실시예들에서, 실험 및 대조군 세포의 AMPs의 mRNA 발현 정도는 인간 베타 디펜신 패밀리(HBD-1 내지 HBD-4), 카텔리시딘(hCAP-18/LL-37), 덤시딘(DCD) 및 대조군으로서 GADPH의 유전자에 특이적인 프라이머를 사용하여, RT-PCR({94℃ 1분, 51-60℃ 1분 및 72℃ 2분} 50 사이클; 프라이머 농도 5pmol/반응; 주형 농도 50ng/반응)을 3회 이상 수행함으로써 분석하였다. 사용된 프라이머 서열은 하기 표 1에 나타낸 바와 같다.
Figure 112008087138863-pct00002
AMPs의 각 mRNA 발현 수준은, RT-PCR 결과 사진을 스캔한 후 각 밴드의 밀도(density)를 측정하고, 스튜던트 t-검정법을 이용하여 산출된 밀도값으로 검정하였다. 대조군과 실험군의 산출된 P-값이 0.05보다 작을 경우에만 대조군과 실험군의 차이를 유의한 것으로 평가하였다.
실시예 1: SPC에 의한 AMPs의 발현 감소 분석
(1) 시험 세포에서의 분석
인간 각질형성세포주 HaCaT 세포(입수처: Dr. N.E. Fusenig, Duetsches Krebs-forschungszentrum, 독일 하이덴베르그)를 6-웰 플레이트에 약 1×105 세포수/웰의 양으로 접종한 후, 10% 우태아 혈청(FBS) 및 1% 항생제(페니실린-스트렙토마이신, Gibco(깁코), USA)를 함유하는 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium; 깁코 BRL, USA) 배지에서 37℃ 및 5% CO2 조건 하에 24시간 동안 배양하였다.
상기에서 배양된 세포의 일부에 20ng의 TNF-α, 또는 40 또는 80nM의 PMA를 처리하여 AMPs의 발현을 유도하고, 이와 동시에 SPC를 0, 1, 10 또는 20μM로 처리하였다. 배양된 세포의 일부는 아무것도 처리하지 않았다(대조군). 참고 실시예의 방법에 따라, 시험 세포 및 대조군 세포를 RT-PCR하여 SPC 처리 농도에 따른 AMPs의 mRNA의 발현 수준을 분석하였다. 그 결과를 도 1 및 도 2에 나타내었다.
도 1 및 도 2에 나타낸 바와 같이, HaCaT 세포에서 HBD-1 내지 HBD-4, hCAP-18/LL-37 및 DCD의 mRNA의 발현 수준은 SPC 농도-의존적으로 유의적으로 억제되었다. 특히 HBD-2, HBD-3 및 DCD의 mRNA 발현 수준은 SPC 처리에 따라 유의하게 억제되었다
(2) 시험 동물의 분석
AMPs의 발현을 유도하기 위해, 25-30g의 8주령의 ICR 마우스(Charles River Laboratories, MA, USA)의 귀, 등 및 배의 피부에 아세톤 중의 PMA 20μl(2.5μg/μl)를 적용하고, 이와 동시에 이들 중 일부 마우스에게 각각 20μl의 0.1% 또는 1%의 SPC를 처리한 후, 그로부터 6시간 후에 동일한 SPC 처리를 수행하였다. PMA를 처리하지 않은 일부 마우스에는 아세톤만 처리하였다(대조군).
24시간 후, 적용된 피부로부터 수득한 조직 시료를 6mm로 펀치하여 잘라내고, 각각의 시료를 O.C.T(optimal cutting temperature) 화합물에 심고 -20℃에서 얼렸다. 각각의 얼린 피부 조각을 4μM의 두께로 잘라 슬라이드 글라스에 고정시킨 후, 항-HBD-1 또는 항-HBD-2 항체(산타크루즈, USA)를 이용하여 상온에서 1시간 이상 배양하였다. 수득한 시료들을 엔비젼 키트(Envision Kit, 다코(DAKO), USA)를 사용하여 면역조직화학분석을 실시하였다. 그 결과를 도 4의 (a) 내지 (d)에 나타내었다.
도 4의 (a) 내지 (d)에 나타낸 바와 같이, ICR 마우스의 피부에서 HBD-1 및 HBD-2의 단백질의 발현이 SPC 농도-의존적으로 유의적으로 감소됨을 확인할 수 있었다.
실시예 2: AMPs의 발현 회복 수준 분석을 통한 SPC 길항제의 스크리닝
(1) 시험 세포에서의 분석
HaCaT 세포(입수처: Dr. N.E. Fusenig, Duetsches Krebs-forschungszentrum, 독일 하이덴베르그)를 6-웰 플레이트에 약 1×105 세포수/웰의 양으로 접종한 후, 10% 우태아 혈청(FBS) 및 1% 페니실린-스트렙토마이신(깁코)을 함유하는 DMEM 배지에서 37℃ 및 5% CO2 조건 하에 24시간 동안 배양하였다.
상기에서 배양된 세포에 HBD-2의 발현을 유도하기 위해, 20ng의 TNF-α를 처리하고, 이와 동시에 AMPs의 발현을 억제하기 위해 10μM의 SPC를 처리하였다. 그리고 각각에 0, 0.1, 1 및 10ppm의 2-아미노-2-옥틸옥시메틸-프로판-l,3-디올(#13) 또는 N-(2-(나프탈렌-2-일옥시)에틸)프로프-2-엔-l-아민(#14)을 처리하였다. 배양된 세포의 일부는 아무것도 처리하지 않았고(대조군 세포), 또는 20ng의 TNF-α만을 처리하거나 또는 10μM의 SPC만을 처리하였다. 참고 실시예의 방법에 따라 시험 세포 및 대조군 세포를 RT-PCR하여 HBD-2 및 HBD-3의 mRNA 발현 수준을 분석하였으며, 그 결과를 도 3에 나타내었다.
도 3에 나타낸 바와 같이, 2-아미노-2-옥틸옥시메틸-프로판-l,3-디올(#13) 또는 N-(2-(나프탈렌-2-일옥시)에틸)프로프-2-엔-l-아민(#14)을 처리한 시험 세포에서 HBD-2 및 HBD-3의 mRNA의 발현이 유의적으로 회복되었다.
따라서, 상기의 결과를 통해 본 발명의 방법은 SPC 길항제를 용이하게 검색할 수 있음을 알 수 있다.
(2) 시험 동물에서의 분석
HBD-1 또는 HBD-2의 발현을 유도하기 위해 25-30g의 8주령의 ICR 마우스(Charles River Laboratories, MA, USA)의 귀, 등 및 배의 피부에 20μl의 PMA(2.5μg/μl)를 적용하고, 이와 동시에 AMPs의 발현을 억제하기 위해 20μl의 1% SPC를 처리하였다. 이들 중 일부 마우스에 20μl의 1%의 2-아미노-2-옥틸옥시메틸-프로판-l,3-디올(#13) 또는 N-(2-(나프탈렌-2-일옥시)에틸)프로프-2-엔-l-아민(#14)을 처리하고, 그로부터 6시간 후에 동일한 SPC 처리를 수행하였다.
24시간 후, 적용된 피부로부터 수득한 조직 시료를 6mm로 펀치하여 잘라내고, 각각의 시료를 O.C.T 화합물에 심고 -20℃에서 얼렸다. 각각의 얼린 피부 조각을 4μM의 두께로 잘라 슬라이드 글라스에 고정시키고, 항-HBD-1 또는 항-HBD-2 항체(산타크루즈, USA)를 이용하여 상온에서 1시간 이상 배양하였다. 각 시료들을 엔비젼 키트(다코, USA)를 사용하여 면역조직화학분석을 실시하였다. 그 결과를 도 4의 (d) 내지 (f)에 나타내었다.
도 4의 (d) 내지 (f)에 나타낸 바와 같이, 2-아미노-2-옥틸옥시메틸-프로판-l,3-디올(#13) 또는 N-(2-(나프탈렌-2-일옥시)에틸)프로프-2-엔-l-아민(#14)을 처리한 시험군에서, SPC에 의해 발현이 억제된 HBD-1 및 HBD-2의 발현 수준이 정상 수준으로 회복되었다.
따라서, 상기의 결과를 통해 본 발명의 방법은 SPC 길항제를 용이하게 검색할 수 있음을 알 수 있다.
본 발명을 상기 특정 실시양태를 참고하여 기술하였지만, 다양한 개질 및 변경이 당업자에 의해 이루어질 수 있으며 본 발명의 범주내에 속하는 것으로 인정되어야 한다.
SPC는 아토피 피부염 환자들에서 발현 감소 양상이 보고된 인간 베타 디펜신(HBD-1, HBD-2, HBD-3 및 HBD-4), 카텔리시딘(LL-37) 및 덤시딘의 발현을 현저히 감소시킨다. 따라서 SPC 길항제는 아토피 피부염과 같이 항균성 펩티드 발현 감소 관련 질환을 예방 및 치료하는데 유용하게 사용될 수 있으며, 상기 항균성 펩티드의 유전자 또는 단백질의 발현의 회복 정도를 분석함으로써 SPC 길항제 물질을 유용하게 검색할 수 있다.
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Claims (15)

1) 시험 세포 및 인간을 제외한 포유동물로 이루어진 군으로부터 선택된 피검체에 스핑고실포스포릴콜린 또는 이의 유도체를 처리하여, 인간 베타 디펜신, 카텔리시딘 및 덤시딘으로 이루어진 군에서 선택되는 항균성 펩티드의 발현을 억제시키는 단계; 및
2) 상기 피검체에 스핑고실포스포릴콜린 길항제 후보 물질들을 처리하고, 상기 피검체에서 항균성 펩티드의 발현 회복 수준을 분석하는 단계
를 포함하는, 스핑고실포스포릴콜린 길항제를 스크리닝(screening)하는 방법.
제 1 항에 있어서,
상기 시험 세포가 항균성 펩티드를 발현하거나 또는 유도 물질에 반응하여 항균성 펩티드를 발현할 수 있는 세포인 방법.
제 2 항에 있어서,
상기 시험 세포가 각질형성세포(keratinocyte)인 방법.
제 1 항에 있어서,
상기 포유동물이 마우스, 래트 또는 모르모트인 방법.
제 1 항에 있어서,
상기 단계 1)에서 스핑고실포스포릴콜린 또는 이의 유도체를 피검체에 1nM 내지 40mM의 농도로 투여하는 방법.
제 1 항에 있어서,
상기 단계 1)에서 피검체에 스핑고실포스포릴콜린을 처리하기 전 또는 처리하는 동시에 항균성 펩티드의 발현 유도 물질을 처리하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제 6 항에 있어서,
상기 유도 물질이 Ca2+, TNF-α, IL-1β, IFN-γ, PMA(phorbol 12-myristate 13-acetate) 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 물질인 방법.
제 1 항에 있어서,
상기 단계 2)에서 항균성 펩티드 발현 회복 수준이 항균성 펩티드의 유전자 또는 단백질의 발현 수준을 측정함으로써 분석되는 방법.
제 8 항에 있어서,
상기 항균성 펩티드의 유전자 또는 단백질의 발현 수준이 역전사 중합효소 연쇄반응(RT-PCR) 및 노던 블롯(northern blot) 분석, 효소결합 면역흡착 분석법(enzyme-linked immunosorbent assay; ELISA), 방사선 면역측정법(radioimmunoassay; RIA), 샌드위치 측정법, 웨스턴 블롯(western blot), 면역 블롯(immunoblot), 면역조직화학염색법(immunohistochemical staining) 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 방법에 의해 측정되는 방법.
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