KR101349188B1 - Ｃｃｌ27/ｃｔａｃｋ의 발현을 억제시키는 방법 - Google Patents

Ｃｃｌ27/ｃｔａｃｋ의 발현을 억제시키는 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 스핑고실포스포릴콜린 (sphingosylphosphorylcholine; SPC)의 조절제 (modulator)를 이용하여 CCL27/CTACK (Cutaneous T-cell-attracting chemokine)의 발현을 억제시키는 방법 및 CCL27/CTACK 발현의 억제정도를 측정하여 SPC의 조절제 후보 물질을 스크리닝하는 방법에 관한 것으로, SPC가 아토피 피부염, 건선 및 염증성 피부 질환 환자들에서 발현 증가 양상을 보이고 있는 CCL27/CTACK의 발현을 증가시키므로, 본 발명에 따라 SPC 조절제를 투여하여 CCL27/CTACK의 발현을 억제시킴으로써 CCL27/CTACK 발현 증가 관련 질환의 치료 및 예방 효과를 얻을 수 있으며, CCL27/CTACK 유전자 또는 이들 단백질의 발현 억제 정도를 분석하여 SPC 조절제를 효율적으로 검색 (screening)할 수 있다.

Description

ＣＣＬ27/ＣＴＡＣＫ의 발현을 억제시키는 방법 {METHOD FOR INHIBITING THE EXPRESSION OF CCL27/CTACK}
도 1은 CCL27/CTACK가 TNF-α에 의해 발현이 증가되고, 또한 SPC(sphingosylphosphorylcholine)에 의해서는 농도 의존적으로 발현이 증가되는 것을 확인한 역전사 중합효소 연쇄 반응 (RT-PCR) 분석 결과이고,
도 2는 SPC의 조절제 후보 물질인 2-아미노-옥틸옥시메틸-프로판-1,3-디올 (2-amino-2-octyloxymethyl-propane-1,3-diol; AOOMP)을 처리하여, SPC로 유도된 CCL27/CTACK의 발현이 억제됨을 확인한 RT-PCR 분석 결과이며,
도 3은 AOOMP에 의한 CCL27/CTACK의 발현 억제 정도가 SPC 특이적인 것을 확인한 RT-PCR 분석 결과이다.
본 발명은 스핑고실포스포릴콜린 (sphingosylphosphorylcholine; 이하, SPC)의 조절제를 이용하여 CCL27/CTACK (Cutaneous T-cell-attracting chemokine)의 발현을 억제시키는 방법 및 CCL27/CTACK 발현의 억제 정도를 측정하여 SPC의 조절제 후보 물질을 스크리닝하는 방법에 관한 것이다.
하기 구조식으로 나타내어지는 SPC는 라이소스핑고리피드류 (lysosphingolipids)로서 스핑고미엘린 (sphingomyelin, SM)의 N-탈아실화된 형태로 인산기에 콜린이 결합되어 있는 것을 특징으로 하며, 스핑고미엘린 N-탈아실화 효소에 의해 스핑고미엘린으로부터 생성된다 (Higuchi K 등, Biochem J., 350, 747-56, 2000).
Figure 112006074712573-pat00001
상기 SPC는 여러 종류의 세포에 대해 미토겐 (mitogen)으로서 작용하고, 특정 사이토카인의 분비를 촉진하는 것으로 알려져 있으며 (Meyer 등, Biochim Biophys Acta., 1582: 178-89, 2002), 다양한 세포의 성장 및 증식 (Desai 등, Biochem . Biophys. Res. Commun., 181, 361-366, 1991), 혈관 신생 (Boguslawski 등, Biochem. Biophys. Res. Commun., 272, 603-609, 2000), 및 세포 사멸 (Jeon ES 등, Biochim Biophys Acta., 1 734(1); 25-33, 2005) 등에 깊이 관여하는 것으로 알려져 있다. 특히, 각질형성세포 및 섬유아세포의 증식을 촉진하여 상처를 치유하는 역할을 하기도 한다 (문헌 [Wakita 등, J. Invest. Dermatol., 110, 253-258, 1998]; 및 [Berger 등, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 92, 5885-5889, 1995] 참조). 한편, SPC는 세포의 소포체로부터 Ca2+를 유리시키고 (문헌 [Desai 등, J. Cell. Biol., 121, 1385-1395, 1993], 및 [Okajima 등, J. Biol. Chem., 270, 26332-26340, 1995] 참조), 다양한 세포에서 세포 골격 재구성 및 세포 이동 (문헌 [Seufferlein 등, J. Biol. Chem., 270, 24343-24351, 1995]; 및 [Rumenapp 등, Naunyn-Schmiedeberg's Arch. Pharmacol., 361, 1-11, 2000] 참조)에 관여한다.
이러한 SPC와 밀접하게 관련된 대표적 질환으로 아토피성 피부염을 들 수 있다. 아토피성 피부염은 각질층의 지질 함량 감소로 인하여 항균력이 감소되고 장벽 기능이 약화되어 외부 자극 물질에 대한 방어력이 떨어지게 되므로, 염증 반응이 일어나고 이에 따른 가려움증이 나타나게 된다. 또한, 가려움증은 2차 감염을 유발시키므로 과면역 반응으로 악순환하게 된다.
아토피의 병리에서 무엇보다 중요한 사실은 환부 또는 그 인근 부위에서 스핑고미엘린 탈아실화효소 (Sphingomyelin deacylase)의 활성이 증가되고, 아토피성 피부염 환자들의 피부에서 SPC가 정상인의 1000배 이상 증가된 양상을 보인다는 점이다 (문헌 [HiguchiK 등, Biochem. J., 350, 747-756, 2000]; 및 [Reiko Okamoto 등, Journal of Lipid Research, 44, 93-102, 2003] 참조). 이는 아토피성 피부염 환자의 각질층에서 세포간지질 (ceramide) 결핍 현상의 중요한 원인이 된다 (Junko Hara 등, J. invest. Dermatol., 115, 406-413, 2000). 또한, SPC는 아토피 질환에서 특징적으로 발생하는 비정상적 각질화 현상에도 중요한 역할을 담당한다 (Higuchi 등, J. Lipid Res., 42, 1562-1570, 2001). 이 같은 연구 결과들은 SPC가 아토피성 피부염의 대표적 증상 중 하나인 피부 장벽기능 장애의 직접적인 원인일 뿐만 아니라, 2 차적으로 나타나는 염증 반응의 원인이 될 수 있음을 시사하지만, SPC의 발현 증가가 정확히 어떠한 기작을 통해 아토피 피부염 등의 피부질환에 영향을 미치는 지는 밝혀진 바가 전혀 없다.
한편, 아토피 피부염, 건선 (psoriasis), 및 이와 유사한 염증성 피부 질환에 있어, 사이토카인 (cytokines) 혹은 케모카인 (chemokines)이 일부 과발현되는 것으로 알려져 있다.
그 중 케모카인은 약 100 여개의 아미노산으로 구성된 작은 단백질 (8 내지 11 kD)로서, 선택적으로 백혈구의 분화, 활성, 및 이동 등을 조절하며, 이러한 기능을 통하여 염증반응에서 중추적인 역할을 한다. 예를 들어, 케모카인은 림프 조직 뿐 아니라 비림프 조직에서도 만들어져 백혈구들이 이동하는 과정을 조절하고, 혈관을 통과하여 조직으로 침투한 백혈구를 농도의 차이를 이용하여 염증부위로 유인하는 작용을 하기도 한다.
이러한 케모카인은 2개의 시스테인 모티프 (cysteine motif)에 따라 CC-, CXC-, CX3C-, 및 C-케모카인의 4개의 패밀리 (family)로 분류되고, G-단백질 관련 수용체로 알려진 케모카인 수용체 또한, 결합하는 케모카인의 종류에 따라 CCR-, CXCR-, CX3CR-, 및 CR-케모카인 수용체로 분류된다 (Rollins BJ., Blood, 90, 909-28, 1997). 케모카인이 자신과 반응하는 케모카인 수용체와 결합하면, 연결된 GTP 결합 단백질 (GTP binding protein)이 활성화되고, 이어서 cAMP, IP3 등을 통하여 활성화 신호를 전달하여 상기와 같은 여러 작용들을 수행하게 되는 것이다.
아토피 피부염에서 그 발현 양상이 증가되는 케모카인으로는 CCL11, CCL17, CCL22, CCL26, CCL27, 및 CX3CL1 등이 있으며 (Homey B, Steinhoff M 등, J Allergy Clin Immunol., 118, 178-89, 2006), 특히 T 세포를 피부로 이동시키는데 중요한 역할을 하는 CCL27/CTACK이 염증성 피부 질환인 아토피 피부염, 건선, 그 외 피부염증질환에서 과발현되는 양상을 보임으로써 최근 주목 받고 있다 (Homey B, Alenius H., Nat Med., 8, 157-65, 2002).
CCL27/CTACK는 피부, 특히, 각질형성세포 (keratinocyte)에서 특이적으로 발현되는 CC-케모카인으로, CLA+ 림프구 (cutaneous lymphocyte associated antigen positive lymphocyte)에서 발현되는 케모카인 수용체인 CCR10과 결합하여, 결과적으로 T-림프구를 피부로 이동시킨다 (Morales J, Homey B 등, Proc Natl Acad Sci USA., 101(5), 1677-82, 2003). 또한, 상기 CCL27/CTACK은 각질형성세포에서 피부 상처나 감염에 의해 형성된 사이토카인인 TNF-α (Tumor Necrosis Factor-α)에 의해 유도되는 것임이 생체내 (in vitro)에서 밝혀졌고 (Homey B, Alenius H., Nat Med., 8, 157-165, 2002), 상기 CCL27/CTACK의 유도 과정은 TNF-α에 의해 활성화된 NF-κB를 매개로 하는 것이라는 연구 결과가 발표된 바 있다 (Christain V, Claus J., Cytokine., 29, 49-55, 2005).
또한, IL-4 유전자 도입을 통한 아토피성 피부염 마우스 모델에서 CCL27/CTACK이 T-세포의 피부 침윤을 증가시키며, 초기 피부 손상에서 항-CCL27/CTACK에 의해 염증 진행과 T-세포 및 비만 세포 (mast cells)의 피부 침윤이 감소되는 것을 확인하였다 (Chen L., Lin SX 등, Int Immunol., 18(8), 1233-42, 2006). 이 연구 결과는, CCL27/CTACK이 피부 염증 질환 및 아토피 피부염을 유발시킬 수 있음을 의미한다.
본 발명자들은 아토피 피부염 환자의 병리학적 기작에 대해 예의 연구한 결과, SPC가 CCL27/CTACK의 발현을 크게 증가시킴을 밝힘으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 염증성 피부 질환을 유도하는 CCL27/CTACK의 발현이 증가된 경우, 이를 효과적으로 감소시킬 수 있는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 SPC 조절제 후보 물질을 효율적으로 검색하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적에 따라, 본 발명에서는 CCL27/CTACK의 발현 감소가 요구되는 포유류에 스핑고실포스포릴콜린의 조절제를 유효량 투여하는 것을 포함하는, CCL27/CTACK의 발현을 억제시키는 방법을 제공한다.
상기 다른 목적에 따라, 본 발명에서는 1) 시험 세포에 SPC 또는 그 유도체를 처리하여 CCL27/CTACK의 과발현을 유도하는 단계; 및 2) CCL27/CTACK의 과발현을 유도한 세포에 후보 물질들을 처리하여 CCL27/CTACK 발현 억제 정도를 측정하는 단계를 포함하는, SPC 조절제를 검색하는 방법을 제공한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명의 CCL27/CTACK의 발현을 억제시키는 방법에서 사용되는 SPC의 조절제로는 SPC의 활성을 저해하거나, SPC가 CCL27/CTACK의 과발현을 유도하는 기작에 대해 길항작용을 하거나, SPC 자체의 발현을 억제함으로써, 결과적으로 CCL27/CTACK의 발현을 억제시킬 수 있는 물질이면 어느 것이나 사용 가능하다.
이때, SPC의 활성을 저해하거나 CCL27/CTACK의 과발현을 유도하는 기작에 대해 길항작용을 하는 물질의 예로는, SPC의 활성부위에 결합하는 경쟁적 저해제 (competitive inhibitor), SPC의 활성부위가 아닌 부위에 결합하여 활성부위의 기능을 방해하는 비경쟁적 저해제 (noncompetitive inhibitor), SPC의 세포 내 특정 위치로의 이동을 방해하는 물질, SPC를 분해하거나 분해를 유도하는 물질, SPC가 CCL27/CTACK의 과발현을 유도하는 기작에 대한 차단제 및 이들의 혼합물 등이 있다.
본 발명의 방법에서, 상기 SPC 조절제는 CCL27/CTACK의 발현 감소가 요구되는 대상, 예를 들면 아토피 피부염, 건선, 및 이와 유사한 염증성 피부 질환과 같 은 CCL27/CTACK의 과발현과 관련된 질환을 나타내는 인간 등의 포유류에 전신 또는 국소적으로 처리될 수 있으며, 처리되는 양은 치료되는 증상, 투여 경로, 환자의 연령 및 체중, 증상의 중증도와 같은 다양한 관련되는 인자들을 고려하여 결정할 수 있다.
또한, 본 발명에서는 1) 시험 세포에 SPC 또는 그 유도체를 처리하여 CCL27/CTACK의 과발현을 유도하는 단계; 및 2) CCL27/CTACK의 과발현을 유도한 세포에 후보 물질들을 처리하여 CCL27/CTACK 발현 억제 정도를 측정하는 단계를 포함하는, SPC 조절제를 검색하는 방법을 제공한다.
상기 시험 세포로는 각질형성세포 (keratinocytes), 마우스 배아 줄기세포-유발 수지상 세포 (mouse embryonic stem cell-derived dendritic cells)가 사용될 수 있으며, 바람직하게는 각질형성세포를 사용할 수 있다.
본 발명의 바람직한 실시예에 의하면, 검색 방법의 단계 1)에서는 SPC를 시험세포에 2 μM 내지 10 μM 농도 범위로 처리할 수 있으며, 이때 처리량이 2 μM 미만인 경우에는 CCL27/CTACK의 발현을 충분히 증가시킬 수 없고, 10 μM 초과인 경우에는 시험 세포의 모양이 변화될 수 있다.
또한, 상기 SPC 조절제를 검색하는 방법에서 바람직하게는, 시험 세포에 SPC 또는 그 유도체 외의 CCL27/CTACK 발현 유도물질을 처리하는 대조군을 포함시킴으로써 SPC에 특이적인 SPC 조절제를 검색하는 것이 가능하다.
상기 SPC 또는 그 유도체 외의 CCL27/CTACK 발현 유도물질로는 특별히 제한되지는 않으나 TNF-α, IL-1β, LIGHT (lymphotoxin-like inducible protein that competes with glycoprotein D for HVEM on T cells) 등이 사용가능하며, 바람직하게는 TNF-α를 사용하며, 상기 시험 세포에 10 ng/ml 내지 50 ng/ml 농도 범위로 처리하는 것이 바람직하다.
본 발명의 검색 방법의 CCL27/CTACK 발현 억제 정도를 측정하는 단계에서는 이전 단계에서 CCL27/CTACK의 발현을 증가시킨 세포에 후보 물질들을 처리한 후, CCL27/CTACK의 유전자 및 단백질의 발현 회복 정도를 확인하여 SPC에 대한 효과적인 조절제를 검색하게 되는데, 이때 상기 CCL27/CTACK의 유전자 또는 단백질의 발현정도를 확인하는 방법으로는 당 분야에서 유전자 또는 단백질의 발현 확인을 위해 사용되는 일반적인 기술들을 이용할 수 있다. 예를 들어, CCL27/CTACK의 유전자의 발현을 확인하는 방법에는 역전사 중합효소 연쇄반응 (RT-PCR), 및 노던 블럿 (northern blot) 분석과 같이 CCL27/CTACK들의 각 유전자 또는 그의 단편을 탐침자 (probe)로 이용하는 각종 블럿 분석 등이 있으며, CCL27/CTACK 단백질의 발현을 확인하는 방법에는 각 CCL27/CTACK 단백질에 대한 항체를 이용한 효소결합 면역흡착 분석법 (enzyme-linked immunosorbent assay; ELISA), 방사선 면역측정법 (radioimmunoassay; RIA), 샌드위치 측정법 (sandwich assay), 폴리아크릴아미드 겔 상의 웨스턴 블럿, 면역 블럿 분석, 면역 조직화학염색 (immunohistochemical staining), 및 이들의 조합 등이 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
참조예: CCL27/CTACK의 발현 정도 확인
하기 실시예들에서 CCL27/CTACK의 발현 정도는 역전사 중합효소 연쇄반응 (RT-PCR)을 하기와 같은 조건에서 수행함으로써 CCL27/CTACK의 mRNA 발현량을 통해 측정하였다.
하기 표 1의 프라이머쌍을 이용하여, 주형 DNA 1 ㎕, 10 pmol/㎕ 프라이머 각 1 ㎕, 2.5 mM dNTP 2.5 ㎕, Taq DNA 중합효소 (㈜ 코아바이오시스템) 0.5 유닛과 효소용 완충용액 2.5 ㎕를 혼합하여 총 25 ㎕의 반응액을 만든 후, 이를 95℃에서 5분간 변성시킨 후, 95℃ 30초, 59℃ 45초, 72℃ 1분의 반응으로 35회 반복한 후, 72℃에서 5분간 마지막으로 증폭시키고, 4℃에서 반응을 종결시켰으며, 각각 3번 이상 측정하여 확인하였다.
Figure 112006074712573-pat00002
각 mRNA 발현 결과의 유의성을 판단하기 위해, RT-PCR 결과 사진을 스캔한 후 각 밴드의 밀도 (density)를 측정하여 스튜던트 t-검정법을 이용하여 검정하였으며, 이때 대조군과 실험군의 산출된 P 값이 0.05보다 작을 경우에만 대조군과 실험군의 차이를 유의한 것으로 평가하였다.
실시예 1: SPC에 의한 CCL27/CTACK의 과발현 확인
각질형성세포주 HaCaT 세포 (Dr. N.E. Fusenig, 독일 암 연구센터(Deutsches Krebsforschungszentrum), 하이델베르크(Heidelberg), 독일)를 6 웰 플레이트 (6 well plate)에 약 1×105 세포수/웰의 밀도로 분주한 후, 10% 우태아 혈청 (FBS) 및 1% 항생제를 함유하는 DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium, CAMBREX, USA) 배지를 이용하여 37℃ 및 5% CO2에서 24시간 동안 배양하였다.
배양된 세포에 유도발현 (inducible expression)을 나타내는 CCL27/CTACK의 발현을 확인하기 위하여, ⅰ) 미처리 군; ⅱ) 20 ng/ml의 TNF-α만을 처리한 군; ⅲ) 20 ng/ml의 TNF-α 및 10 μM의 SPC를 처리한 군; 및 ⅳ) SPC만을 2, 5 및 10 μM로 각각 처리한 군으로 나누어 CCL27/CTACK의 mRNA의 발현 양상을 각각 확인하였다.
그 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이, 유도물질을 처리하지 않아도 약하게나마 CCL27/CTACK이 발현되고는 있지만 (도 1의 1열), TNF-α 처리시 그 발현이 증가되었으며 (도 1의 2 및 3열), SPC의 처리시에는 농도 의존적으로 발현이 증가됨 (도 1의 4 내지 6열)을 확인하였다.
실시예 2: SPC 조절제의 검색
(2-1) CCL27/CTACK의 유도 발현 억제 정도 분석을 통한 SPC 조절제의 검색
SPC 길항제로 확인된 AOOMP (특허출원 제2006-65840호)를 SPC 조절제 후보 물질로서 처리하여, SPC로 유도된 CCL27/CTACK의 발현을 억제할 수 있는 지 확인하기 위하여, 하기와 같은 실험을 실시하였다.
우선, 각질형성세포주 HaCaT 세포 (Dr. N.E. Fusenig, 독일 암 연구센터, 하이델베르크, 독일)를 6 웰 플레이트에 약 1×105 세포수/웰의 밀도로 분주한 후, 10% 우태아 혈청 및 1% 항생제를 함유하는 DMEM (CAMBREX, USA) 배지를 이용하여 37℃ 및 5% CO2에서 24시간 동안 배양하였다.
여기에 CCL27/CTACK의 발현을 유도하기 위하여 10 μM의 SPC를 처리하고, 또 다른 군에는 10 μM의 SPC와 함께 AOOMP를 1 ppm으로 처리하였다. 추가적으로 미처리 군 및 20 ng/ml의 TNF-α만을 처리한 군을 함께, 이들 각각의 CCL27/CTACK의 mRNA 발현 양상을 비교하여 발현 억제 정도를 확인하였다.
그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, SPC 조절제 후보 물질인 AOOMP를 처리한 군에서는 SPC에 의해 발현이 증가된 CCL27/CTACK의 mRNA 발현이 유의적으로 감소되는 것을 확인할 수 있었다 (도 2의 3열).
(2-2) SPC에 특이적인 SPC 조절제의 검색
상기의 방법을 통해 검출된 SPC 조절제가 SPC에 특이적으로 작용하는 지를 알아보기 위하여, SPC 대신 또 다른 유도물질인 TNF-α를 사용하여 하기와 같은 실험을 추가로 실시하였다.
각질형성세포주 HaCaT 세포 (Dr. N.E. Fusenig, Dr. N.E. Fusenig, 독일 암 연구센터, 하이델베르크, 독일)를 6 웰 플레이트에 약 1×105 세포수/웰의 밀도로 분주한 후, 10% 우태아 혈청 및 1% 항생제를 함유하는 DMEM (CAMBREX, USA) 배지를 이용하여 37℃ 및 5% CO2에서 24시간 동안 배양하였다.
여기에 CCL27/CTACK의 발현을 유도하기 위하여 20 ng/ml의 TNF-α를 처리하고, 또 다른 군에는 20 ng/ml의 TNF-α와 함께 AOOMP를 1 ppm으로 처리하였다. 추가적으로 미처리 군 및 1 ppm의 AOOMP만을 처리한 군을 함께 실험하였으며, 이들 각각의 CCL27/CTACK의 mRNA 발현 양상을 비교하여 발현 억제 정도를 확인하였다.
그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, SPC 조절제 후보 물질인 AOOMP의 처리 여부가 CCL27/CTACK의 mRNA 발현에 영향을 주지않는 것을 확인하였다 (도 3의 3 및 4열). 따라서, 본 실시예의 방법으로 SPC 조절제를 SPC 특이적으로 용이하게 검색할 수 있음을 알 수 있다.
상기에서 살펴본 바와 같이, SPC가 아토피 피부염, 건선 및 염증성 피부 질환 환자들에서 과발현 양상이 보고된 CCL27/CTACK의 발현을 유도하므로, SPC 조절제를 투여하여 CCL27/CTACK의 발현을 억제시킴으로써 아토피 피부염, 건선 및 염증성 피부 질환 등의 CCL27/CTACK 과발현 관련 질환의 치료 및 예방 효과를 얻을 수 있으며, CCL27/CTACK 유전자 또는 이 단백질의 발현 억제 정도를 측정하여 SPC 조절제를 효율적으로 검색할 수 있다.
<110> AMOREPACIFIC <120> METHOD FOR INHIBITING THE EXPRESSION OF CCL27/CTACK <130> FPD/200609-0001 <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CCL27/CTACK-F <400> 1 ctcagctcta ccgaaagcc 19 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CCL27/CTACK-R <400> 2 gcccattttc cttagcatcc 20

Claims (13)

  1. 삭제
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 1) 시험 세포에 스핑고실포스포릴콜린 (sphingosylphosphorylcholine; SPC)을 처리하여 CCL27/CTACK의 과발현을 유도하는 단계; 및
    2) CCL27/CTACK의 과발현을 유도한 세포에 후보 물질들을 처리하여 CCL27/CTACK 발현 억제 정도를 측정하는 단계를 포함하는, SPC 조절제를 검색하는 방법.
  7. 제 6 항에 있어서,
    상기 시험 세포가 각질형성세포 (keratinocytes)임을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 6 항에 있어서,
    상기 단계 1)에서 SPC를 2 μM 내지 10 μM 농도 범위로 처리하는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제 6 항에 있어서,
    상기 시험 세포에 SPC 외의 CCL27/CTACK 발현 유도물질을 처리하는 대조군을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제 9 항에 있어서,
    상기 SPC 외의 CCL27/CTACK 발현 유도물질이, TNF-α, IL-1β, 및 LIGHT (lymphotoxin-like inducible protein that competes with glycoprotein D for HVEM on T cells)로 이루어진 군으로부터 선택된 것임을 특징으로 하는 방법.
  11. 제 9 항에 있어서,
    상기 CCL27/CTACK 발현 유도물질을 10 ng/ml 내지 50 ng/ml 농도 범위로 처리하는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제 6 항에 있어서,
    상기 CCL27/CTACK의 발현 억제 정도를 CCL27/CTACK의 유전자 또는 단백질의 발현 정도를 측정하여 확인하는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제 12 항에 있어서,
    상기 CCL27/CTACK의 유전자 또는 단백질의 발현 정도를 역전사 중합효소 연쇄반응 (RT-PCT), 노던 블럿 (northern blot) 분석, 효소결합 면역흡착 분석법 (enzyme-linked immunosorbent assay; ELISA), 방사선 면역측정법 (radioimmunoassay; RIA), 샌드위치 측정법 (sandwich assay), 폴리아크릴아미드 겔 상의 웨스턴 블럿, 면역 블럿 분석, 면역 조직화학염색 (immunohistochemical staining) 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 방법에 의해 확인하는 것을 특징으로 하는 방법.
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