KR101343324B1 - 황색 포도알균 장독소(ｊ, ｋ, ｌ, ｍ, ｎ, ｏ, ｐ, ｑ)를 멀티플렉스 pcr로 검출하기 위한 황색 포도알균 장독소 검출세트 및 검출방법 - Google Patents

황색 포도알균 장독소(ｊ, ｋ, ｌ, ｍ, ｎ, ｏ, ｐ, ｑ)를 멀티플렉스 pcr로 검출하기 위한 황색 포도알균 장독소 검출세트 및 검출방법 Download PDF

Info

Publication number
KR101343324B1
KR101343324B1 KR1020130047136A KR20130047136A KR101343324B1 KR 101343324 B1 KR101343324 B1 KR 101343324B1 KR 1020130047136 A KR1020130047136 A KR 1020130047136A KR 20130047136 A KR20130047136 A KR 20130047136A KR 101343324 B1 KR101343324 B1 KR 101343324B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
staphylococcus aureus
seq
enterotoxin
detection
aureus enterotoxin
Prior art date
Application number
KR1020130047136A
Other languages
English (en)
Inventor
조성학
신은경
김수복
강연호
정경태
남용석
Original Assignee
주식회사 코젠바이오텍
대한민국(관리부서 질병관리본부장)
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 주식회사 코젠바이오텍, 대한민국(관리부서 질병관리본부장) filed Critical 주식회사 코젠바이오텍
Priority to KR1020130047136A priority Critical patent/KR101343324B1/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101343324B1 publication Critical patent/KR101343324B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2537/00—Reactions characterised by the reaction format or use of a specific feature
    • C12Q2537/10—Reactions characterised by the reaction format or use of a specific feature the purpose or use of
    • C12Q2537/143—Multiplexing, i.e. use of multiple primers or probes in a single reaction, usually for simultaneously analyse of multiple analysis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2565/00—Nucleic acid analysis characterised by mode or means of detection
    • C12Q2565/60—Detection means characterised by use of a special device
    • C12Q2565/625—Detection means characterised by use of a special device being a nucleic acid test strip device, e.g. dipsticks, strips, tapes, CD plates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/16—Primer sets for multiplex assays

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)

Abstract

본 발명은 황색 포도알균 장독소 검출방법 및 검출세트에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 멀티플렉스 PCR 방법에 의한 8종의 황색 포도알균 장독소를 동시에 신속 정확하게 검출하는 방법 및 상기 방법을 실시하기 용이한 검출 키트에 관한 것이다.

Description

황색 포도알균 장독소(Ｊ, Ｋ, Ｌ, Ｍ, Ｎ, Ｏ, Ｐ, Ｑ)를 멀티플렉스 PCR로 검출하기 위한 황색 포도알균 장독소 검출세트 및 검출방법{DETECTION SET FOR DETECTING STAPHYLOCOCCUS AUREUS ENTEROTOXIN USING MULTIPLEX PCR AND DETECTION METHOD THEREOF}
본 발명은 황색 포도알균 장독소 검출방법 및 검출세트에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 멀티플렉스 PCR로 황색 포도알균 장독소 종류를 신속, 정확하게 검출할 수 있는 방법 및 검출세트에 관한 것이다.
황색 포도알균(Stapylococcus aureus)은 자연 환경에 대한 저항성이 강하기 때문에 자연계에 광범위하게 분포하고 있으며 사람이나 동물의 화농성 병소에 존재할 뿐만 아니라 건강한 사람과 동물의 피부 등에도 상재하고 있어 식품과 인체에 오염될 가능성이 매우 높다.
황색 포도알균이 생성하는 병원성 인자는 외독소(exotoxin), 장독소(enterotoxin), 세포 용해성 독소(hemolysin toxin), 백혈구 사멸독소(leucodicin), 피부용해 독소(epidermolytic toxin) 이외에 독소성 쇼크 증후군 독소(toxin shock syndrome toxin, TSST) 등의 세포외 산물을 생성함으로써 인간에게 식중독 등의 중요한 각종 질병을 유발한다.
황색 포도알균에 의해 발생되는 질병은 감염증과 독소 중독증으로 구분된다. 감염증은 사람에서 감염, 괴사 또는 농양을 형성하는 화농성 염증을 유발하고 독소 중독증은 사람이 황색 포도알균에 발생하는 장독소(enterotoxin)에 오염된 식품을 섭취한 경우 식중독을 일으키는 경우이다. 황색 포도알균에 의해 식중독이 걸리면 독소유발 후 2~6시간의 잠복기 후에 구토, 발열, 복부 경련과 설사를 동반하며 심하면 고열과 쇼크를 일으킨다. 이러한 황색 포도알균에 의한 식중독은 국내에서도 발생 빈도가 매우 높다.
이러한 황색 포도알균 식중독 원인 식품은 어패류, 가공식품, 야채류, 곡류 등으로 다양하게 보고되고 있으며, 특히 육제품(가공육, 돈육, 우육)과 우유, 치즈, 크림 등의 유제품에서의 황색포도알균 식중독 발생 보고도 꾸준히 이루어지고 있다.
현재 황색 포도알균이 생성하는 장독소는 16가지(A, B, C1, C2, C3, D, E, G, H, I, J, K, L, M, N, O)가 확인된 상태이며 현재 18 종류가 알려져 있다. 장독소는 트립신, 키모트립신, 파파인 등의 단백 분해 효소에 불활성화 되지 않으며 펩신에 대해서는 pH 2 이하에서 불활성화된다.
식중독 발생의 주요 원인균이 황색 포도알균에 의한 식중독 발생 예방과 식중독 발생시 신속한 검사 및 역학조사를 위해 식중독 발생 식품에서 황색 포도알균을 신속하고 정확하게 검출할 수 있는 여러 가지 방법이 있다. 현재 한국식품의약품안전청의 식품공전 및 미국식품의약품안전청의 BAM에 등재된 표준 시험법은 증균 배양과 선택배지를 이용한 방법이다. 그러나, 표준 시험법인 배지법은 여러 배양단계와 생화학적 확인검사를 거쳐야 하므로 결과를 얻기까지 많은 시간과 노동력이 소요되며 위양성이나 위음성 결과를 얻을 수 있는 단점이 있다.
일예로 한국특허공개공보 제2011-0049140호는 식중독 원인균의 다중 실시간 검출방법에 관한 것으로, 식중독 원인균인 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium), 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)와 비브리오 파라해몰리티쿠스(Vibrio parahaemolyticus)를 동시에 실시간으로 검출할 수 있는 PCR 방법을 개시하고 있다. 그러나 상기 특허는 여러 종의 원인균의 검출방법으로서 황색 포도알균의 장독소 종류를 확인하기 어렵다.
따라서, 이러한 표준 시험법을 개선하고 보완할 수 있으며, 여러 종의 장독소를 동시에 검출하기 위한 추가적인 검출법이 요구된다.
한국특허공개공보 제2011-0049140호
이에 본 발명자들은 멀티플렉스 PCR을 이용하여 황색 포도알균 장독소 종류를 검출할 수 있는 방법 및 키트에 대하여 다각적 연구를 수행하던 중, 하나의 검사 반응물에서 8종의 장독소 유전자를 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머 쌍을 확립하게 되었으며, 이를 토대로 본 발명을 완성하였다.
상기 문제점을 해결하기 위해, 본 발명의 해결하고자 하는 과제는 황색 포도알균 장독소 종류를 정확하고 신속하게 검출할 수 있는 검출세트를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 과제는 황색 포도알균 장독소 종류를 정확하게 판단할 수 있는 검출방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 과제는 사용이 용이하며, 단시간에 신속 정확하게 황색 포도알균 장독소 종류를 검출할 수 있는 검출키트를 제공하는 것이다.
상기 과제를 달성하기 위하여, 본 발명은 (1) 서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 황색 포도알균 장독소 J 검출용 프라이머 쌍; (2) 서열번호 3 및 서열번호 4의 염기서열로 이루어진 황색 포도알균 장독소 K 검출용 프라이머 쌍; (3) 서열번호 5 및 서열번호 6의 염기서열로 이루어진 황색 포도알균 장독소 L 검출용 프라이머 쌍; (4) 서열번호 7 및 서열번호 8의 염기서열로 이루어진 황색 포도알균 장독소 M 검출용 프라이머 쌍; (5) 서열번호 9 및 서열번호 10의 염기서열로 이루어진 황색 포도알균 장독소 N 검출용 프라이머 쌍; (6)서열번호 11 및 서열번호 12의 염기서열로 이루어진 황색 포도알균 장독소 O 검출용 프라이머 쌍; (7) 서열번호 13 및 서열번호 14의 염기서열로 이루어진 황색 포도알균 장독소 P 검출용 프라이머 쌍; 및 (8) 서열번호 15 및 서열번호 16의 염기서열로 이루어진 황색 포도알균 장독소 Q 검출용 프라이머 쌍을 포함하는, 황색 포도알균 장독소를 멀티플렉스 PCR로 검출하기 위한 황색 포도알균 장독소 검출세트를 제공한다.
또한 본 발명은 시료로부터 추출한 DNA를 제1항의 검출세트를 이용하여 멀티플렉스 PCR로 증폭하는 단계; 및
상기 멀티플렉스 PCR 증폭 산물을 전기영동장치를 통해 확인하여 장독소 유전자를 검출하고 황색 포도알균 장독소 종류를 판단하는 단계를 포함하는 황색 포도알균 장독소 검출방법을 제공한다.
아울러, 본 발명은 상기 황색 포도알균 장독소 검출세트를 포함하는, 황색 포도알균 장독소 검출키트를 제공한다.
본 발명의 황색 포도알균 장독소 검출세트 및 검출방법은 멀티플렉스 PCR 방법에 의해 여덟 가지 황색 포도알균 장독소 종류를 동시에 신속 정확하게 판단할 수 있다. 따라서, 8종의 독소형을 검사하는 시간을 절반 이하로 단축하여 시간, 비용 그리고 노동력을 크게 단축하는 효과가 있다.
도 1은 본 발명의 일실시예에 따른 황색 포도알균 검출세트 1을 사용하여 황색 포도알균 장독소 J~Q 각각의 DNA와 이들의 혼합물을 주형으로 하여 실시한 멀티플렉스 PCR 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 일실시예에 따른 황색 포도알균 검출세트 2를 사용하여 황색 포도알균 장독소 A~I 각각의 DNA와 이들의 혼합물을 주형으로 하여 실시한 멀티플렉스 PCR 결과를 나타낸 것이다.
도 3 및 도 4는 본 발명에 따른 황색 포도알균 장독소 검출세트의 정확도를 알아보기 위해 수행한 황색 포도알균 장독소 DNA 혼합물과 식중독 유발 미생물 13종의 음성 균주에 대한 멀티플렉스 PCR 결과를 나타낸 것이다.
도 5 및 도 6은 본 발명에 따른 황색 포도알균 장독소 검출세트의 검출한계를 측정하기 위해 실시한 멀티플렉스 PCR 결과를 나타낸 것이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 8가지 종류의 황색 포도알균 장독소가 갖는 독소형 유전자를 8쌍의 프라이머 조합을 이용한 멀티플렉스 PCR을 통해 특이적으로 증폭시키고, PCR 산물의 크기를 분석함으로써, 황색 포도알균 장독소의 종류를 검출하는 방법에 관한 것이다.
특히, 본 발명은 8가지 독소형 유전자에 특이적인 프라이머 쌍을 검출세트로 하여, 황색 포도알균 장독소 종류 확인에 필요한 과정을 현저하게 단축시킨 신속 정확한 방법이다.
이러한 본 발명의 황색 포도알균 장독소 검출세트의 상세한 사항은 하기 표 1과 같다.
검출
장독소		 서열번호 염기서열 증폭산물
크기 (bp)
J
 1 CATGTATGTATGGTGGAGTAACAC 정방향 103
2 GGAACAACAGTTCTGATGCTATCAATC 역방향
K
 3 ATGGCGGAGTCACAGCTACT 정방향 146
4 GACATCAATCTCTTGAGCGGTA 역방향
L
 5 AAAAATGGTTACCGCACAAGA 정방향 220
6 GCTTTCTGGAAGACCGTATCC 역방향
M
 7 GCTGATGTCGGAGTTTTGAA 정방향 317
8 TGATGTTCTCCATTAACCCAAA 역방향
N
 9 CTTATGAGATTGTTCTACATAGCTG 정방향 390
10 CTCCTCCGTATAAGCATGATGT 역방향
O
 11 GCATATGCAAATGAAGAAGATCC 정방향 468
12 TTGTGCAGTAACTTTCTTTTTATCTG 역방향
P
 13 CTGAATTGCAGGGAACTGCT 정방향 538
14 ACCAACCGAATCACCAGAAG 역방향
Q
 15 CACTGTTAGCTTGTTTTTCTTCACA 정방향 609
16 TGACCAGTTCCGGTGTAAAA 역방향
본 발명에 따른 8쌍의 프라이머 조합은 하나의 PCR 반응물에서, 즉 동일한 PCR 조건하에서 각 프라이머쌍을 별도의 PCR 반응물에서 PCR할 경우와 동일하게, 균일한 PCR 증폭 결과를 형성할 수 있도록 특별히 고안된 것이며, 각각의 프라이머 쌍은 서로 다른 크기로 PCR 산물을 증폭하도록 고안된 것이다. 따라서, 증폭된 PCR 산물 크기를 확인함으로써 증폭에 작용한 프라이머 쌍을 쉽게 알 수 있으며, 상기 프라이머가 타겟으로 하는 장독소 유전자형을 파악하여, 황색 포도알균 장독소 종류를 용이하게 식별할 수 있다.
본 발명의 검출방법은 황색 포도알균이 오염되었을 것으로 예상되는 시료에 적용할 수 있다. 일예로, 사람의 대변, 식품이나 물 등 환경 검체도 가능하며, 이에 한정되는 것이다.
검출을 위한 DNA 추출은 다양한 방법을 통해 이루어질 수 있고, 이에 대한 구체적인 방법은 Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001)에 개시되어 있다.
본 발명의 검출방법에 있어, 멀티플렉스 PCR 반응 조건은 통상적인 조건을 취할 수 있다. 일예로 초기 변성(initial denaturation)을 95℃에서 10분간 수행한 후, 변성(denaturation, 95℃에서 30초), 결합(annealing, 58℃에서 30초), 중합(polymerization, 72℃에서 30초)을 총 35회 반복한 후, 최종적으로 중합단계를 72 ℃에서 10분 동안 실시하는 조건을 취할 수 있다.
다음으로, 멀티플렉스 PCR 증폭 산물의 크기를 분석함으로써 각각의 장독소 유전자형 존재 여부를 판정한다. 증폭 산물의 크기 분석은 예컨대 아가로즈 젤 또는 아크릴아미드 젤을 이용한 전기영동에 의해 수행될 수 있다.
본 발명의 황색 포도알균 장독소 검출세트 및 이를 이용한 검출방법을 통해, 8종의 황색 포도알균 장독소 종류를 각각 식별할 수 있다.
구체적인 식별 방법은 다음과 같다.
(1) 장독소 J: 서열번호 1 및 2의 프라이머 쌍에 의한 PCR 증폭 산물이 검출되는 경우 장독소 J로 판정한다.
(2) 장독소 K: 서열번호 3 및 4의 프라이머 쌍에 의한 PCR 증폭 산물이 검출되는 경우 장독소 K로 판정한다.
(3) 장독소 L: 서열번호 5 및 6의 프라이머 쌍에 의한 PCR 증폭 산물이 검출되는 경우 장독소 L로 판정한다.
(4) 장독소 M: 서열번호 7 및 8의 프라이머 쌍에 의한 PCR 증폭 산물이 검출되는 경우 장독소 M로 판정한다.
(5) 장독소 N: 서열번호 9 및 10의 프라이머 쌍에 의한 PCR 증폭 산물이 검출되는 경우 장독소 N로 판정한다.
(6) 장독소 O: 서열번호 11 및 12의 프라이머 쌍에 의한 PCR 증폭 산물이 검출되는 경우 장독소 O로 판정한다.
(7) 장독소 P: 서열번호 13 및 14의 프라이머 쌍에 의한 PCR 증폭 산물이 검출되는 경우 장독소 P로 판정한다.
(8) 장독소 Q: 서열번호 15 및 16의 프라이머 쌍에 의한 PCR 증폭 산물이 검출되는 경우 장독소 Q로 판정한다.
본 발명에 따른 검출방법에서, 추가로 하기 표 2에 기재된 8가지 독소형 유전자에 특이적인 프라이머쌍을 포함하는 황색 포도알균 장독소 검출세트를 사용하여 멀티플렉스 PCR을 수행할 수 있다. 이와 같이, 각각 8가지 독소형 유전자에 특이적인 프라이머쌍을 포함하는 검출세트를 사용하여 16종의 황색 포도알균 장독소 종류를 검출할 수 있다.
검출
장독소		 서열번호 염기서열 증폭산물
크기 (bp)
A
 17 GGTTATCAATGTGCGGGTGG 정방향 113
18 GCCATAAATTGATCGGCACT 역방향
B
 19 TGTTCGGGTATTTGAAGATGG 정방향 155
20 CCGTTTCATAAGGCGAGTTG 역방향
C
 21 GGAGGAATAACAAAACATGAAGG 정방향 216
22 TCCTGTTTCATATGGTGAACTG 역방향
D
 23 GAGGTGTCACTCCACACGAA 정방향 294
24 CGGGAAAATCACCCTTAACA 역방향
E
 25 GCATGTATGTACGGGGGTGT 정방향 372
26 CAAATCAATATGGAGGTTCTCTGA 역방향
G
 27 ACGTCTCCACCTGTTGAAGG 정방향 450
28 TCCAGATTCAAATGCAGAACC 역방향
H
 29 CGAAAGCAGAAGATTTACACGA 정방향 524
30 TCTAGGAGTTTTCATATCAAATTCAA 역방향
I
 31 AGGTGATATTGGTGTAGGTAAC 정방향 641
32 CATATGATATTTCGACATCAAGATG 역방향
상기 표 2의 검출세트를 이용한 검출방법을 통해, 8종의 황색 포도알균 장독소 종류를 각각 식별할 수 있다. 구체적인 식별 방법은 다음과 같다.
(9) 장독소 A: 서열번호 17 및 18의 프라이머 쌍에 의한 PCR 증폭 산물이 검출되는 경우 장독소 A로 판정한다.
(10) 장독소 B: 서열번호 19 및 20의 프라이머 쌍에 의한 PCR 증폭 산물이 검출되는 경우 장독소 B로 판정한다.
(11) 장독소 C: 서열번호 21 및 22의 프라이머 쌍에 의한 PCR 증폭 산물이 검출되는 경우 장독소 C로 판정한다.
(12) 장독소 D: 서열번호 23 및 24의 프라이머 쌍에 의한 PCR 증폭 산물이 검출되는 경우 장독소 D로 판정한다.
(13) 장독소 E: 서열번호 25 및 26의 프라이머 쌍에 의한 PCR 증폭 산물이 검출되는 경우 장독소 E로 판정한다.
(14) 장독소 G: 서열번호 27 및 28의 프라이머 쌍에 의한 PCR 증폭 산물이 검출되는 경우 장독소 G로 판정한다.
(15) 장독소 H: 서열번호 29 및 30의 프라이머 쌍에 의한 PCR 증폭 산물이 검출되는 경우 장독소 H로 판정한다.
(16) 장독소 I: 서열번호 31 및 32의 프라이머 쌍에 의한 PCR 증폭 산물이 검출되는 경우 장독소 I로 판정한다.
또한, 본 발명은 상기 황색 포도알균 장독소 검출세트를 포함하는 황색 포도알균 장독소 검출키트를 제공한다. 이때 검출세트의 프라이머 쌍은 하나의 반응 용기, 스트립 또는 마이크로플레이트에 패키징될 수 있으며, 당업계에 공지된 방법으로 패키징된다.
본 발명의 키트는 택 중합효소(Taq polymerase), MgCl2를 포함한 반응 완충액, dNTP 및 안정화제(stabilizer)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 더 포함할 수 있으며, 그 외에도 당업계에 공지된 다른 시약을 추가적으로 포함할 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예 및 실험예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 황색 포도알균 특이적 프라이머 제조
황색 포도알균의 장독소 유전자형을 비교하여 특이적 프라이머를 개발하였다. 각 독소형에 따른 염기서열의 비교에 사용된 염기서열 자료는 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/에서 얻었다. 또한 각 유전자의 염기서열 비교를 위해 http://bioinfo.genotoul.fr/multalin/multalin.html의 프로그램을 이용하여 각 독소형에 따른 유전자의 차이를 확인하여 황색 포도알균 장독소 검출을 위한 특이 프라이머를 제작하였다. 각 장독소에 따른 프라이머의 정보와 멀티플레스 구성은 상기 표 1 및 표 2에 나타내었다.
실시예 2: 멀티플렉스 PCR 프라이머 세트를 이용한 장독소 특이 증폭 확인
본 발명자들에 의해 고안된 상기 실시예 1의 프라이머 세트가 실제로 각 황색 포도알균 장독소의 특이 유전자들을 증폭시켜 이를 검출할 수 있는지 확인하기 위해 멀티플렉스 PCR(중합효소연쇄반응)을 수행하였다. 이때 멀티플렉스 PCR 프라이머 세트의 조성은 아래 표 3 및 4와 같고, 주형은 황색 포도알균 장독소 A, B, C, D, E, G, H 및 I 각각의 DNA와, 이들의 혼합물을 사용하였다.
# 장독소 정방향
(100 pmol/ul)		 역방향
(100 pmol/ul)
프라이머
세트 1









 J
(서열번호 1 및 2)		 5 ul 5 ul
K
(서열번호 3 및 4)		 5 ul 5 ul
L
(서열번호 5 및 6)		 5 ul 5 ul
M
(서열번호 7 및 8)		 5 ul 5 ul
N
(서열번호 9 및 10)		 5 ul 5 ul
O
(서열번호 11 및 12)		 5 ul 5 ul
P
(서열번호 13 및 14)		 5 ul 5 ul
Q
(서열번호 15 및 16)		 5 ul 5 ul
TE 버퍼 20 ul
총 100 ul
# 장독소 정방향
(100 pmol/ul)		 역방향
(100 pmol/ul)
프라이머
세트 2





 A
(서열번호 17 및 18)		 5 ul 5 ul
B
(서열번호 19 및 20)		 5 ul 5 ul
C
(서열번호 21 및 22)		 5 ul 5 ul
D
(서열번호 23 및 24)		 5 ul 5 ul
E
(서열번호 25 및 26)		 5 ul 5 ul
G
(서열번호 27 및 28)		 5 ul 5 ul
H
(서열번호 29 및 30)		 5 ul 5 ul
I
(서열번호 31 및 32)		 5 ul 5 ul
TE 버퍼 20 ul
총 100 ul
PCR 반응에 사용된 반응액 조제 성분은 아래 표 5와 같고, PCR 반응조건은 아래 표 6과 같다.
조성 부피
(μl)
프라이머 세트 1 또는
세트 2		 5
Template DNA or Control DNA 5
2XcPCR Master Mix 10
총 20
온도
(℃)		 시간 사이클
95 10 min 1
95 30 sec 35
58 30 sec
72 30 sec
72 10 min 1
황색 포도알균 장독소 J, K, L, M, N, O, P 및 Q 각각의 DNA와, 이들의 혼합물을 주형으로 하고, 상기 표 3의 멀티플렉스 PCR 프라이머 세트 1을 사용하여 상기 기재된 방법으로 멀티플렉스 PCR을 수행하고, 그 결과를 도 1 및 표 7에 나타내었다.
레인 유전자 크기
M 100 bp DNA ladder -
N 음성 대조군 -
1 J 103
2 K 146
3 L 220
4 M 317
5 N 390
6 O 468
7 P 538
8 Q 609
PC 양성 대조군
장독소 (J~Q 혼합물)		 -
도 1과 표 7은 황색 포도알균 장독소 유전자 검출을 위해 멀티플렉스용으로 제작된 프라이머 세트 1을 이용하여 각각의 장독소 유전자와 멀티 플티플렉스 프라이머 혼합액과의 반응성을 확인한 결과이다. 각 멀티플렉스 프라이머에서 위양성 없이 각각의 황색 포도알균 장독소 유전자만 검출되는 것을 확인하였다.
황색 포도알균 장독소 A, B, C, D, E, G, H 및 I 각각의 DNA와, 이들의 혼합물을 주형으로 하고, 상기 표 3의 멀티플렉스 PCR 프라이머 세트 2를 사용하여 상기 기재된 방법으로 멀티플렉스 PCR을 수행하고, 그 결과를 도 2 및 표 8에 나타내었다.
레인 유전자 크기
M 100 bp DNA ladder -
N 음성 대조군 -
1 A 113
2 B 155
3 C 216
4 D 294
5 E 372
6 G 450
7 H 524
8 I 641
PC 양성 대조군
장독소 (A~I 혼합물)		 -
도 2와 표 8은 황색 포도알균 장독소 유전자 검출을 위해 멀티플렉스용으로 제작된 프라이머 세트 2를 이용하여 각각의 장독소 유전자와 멀티 플티플렉스 프라이머 혼합액과의 반응성을 확인한 결과이다. 각 멀티플렉스 프라이머에서 위양성 없이 각각의 황색 포도알균 장독소 유전자만 검출되는 것을 확인하였다.
실시예 3: 멀티플렉스 PCR 프라이머 세트의 특이도 검증
상기 실시예 1에서 제조된 황색 포도알균 장독소 멀티플렉스 PCR 프라이머 세트 1과 세트 2를 각각 이용하여 하기 표 9에 기재된 황색 포도알균 장독소 DNA 이외에 식중독 유발 미생물과 반응하여 정확도를 확인하였다. 그 결과는 도 3 및 도 4에 나타내었다.
레인 대상
M 100 bp DNA ladder
N 음성 대조군
1 캠필로박터 제주니(Campylobacter jejuni)
2 살모넬라 티피무리(Salmonella Typhimurium)
3 여시니아 엔테로콜리티카(Yersinia enterocolitica)
4 리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes)
5 바실러스 세레우스(Bacillus cereus)
6 비브리오 파라헤모리티커스(Vibrio parahaemolyticus)
7 비브리오 불니피쿠스(Vibrio vulnificus)
8 비브리오 콜레라(Vibrio cholerae)
9 쉬겔라 소네이(Shigella sonnei)
10 장출혈성 대장균(EHEC)
11 장관독소원성 대장균(ETEC)
12 장관병원성 대장균(EPEC)
13 장관조직 침입성 대장균(EIEC)
P1 황색 포도알균 장독소 혼합물 (A, B, C, D, E, G, H, I)
P2 황색 포도알균 장독소 혼합물(J, K, L, M, N, O, P, Q)
도 3 및 도 4는 본 발명에 따른 황색 포도알균 장독소 검출세트의 정확도를 알아보기 위해 수행한 독소 혼합물과 13종의 식중독 유발 미생물에 대한 멀티플렉스 PCR 결과를 나타낸 것이다.
도 3 및 도 4에 나타낸 바와 같이, 레인 P2(도 3)과, 레인 P1(도 4)에서 황색 포도알균 장독소 혼합물의 증폭을 확인하였고, 다음 음성 대조군에서는 검출되지 않아 본 발명에 따른 멀티플렉스 PCR 프라이머 세트가 특정 장독소 유전자만 특이적으로 증폭함을 확인할 수 있었다.
실시예 4: 멀티플렉스 PCR 프라이머의 민감도 측정
상기 실시예 1에서 제조된 황색 포도알균 장독소 멀티플렉스 PCR 프라이머 세트 1과 세트 2의 민감도를 확인하기 위해 아래 표 10에 기재된 바대로 각 장독소 유전자를 클로닝하여 각 유전자의 copies를 동일하게 혼합하여 PCR 반응을 진행하였다. 사용된 주형은 앞서 서술한 것과 같이 클로닝된 유전자를 1*108 copies 로 제조하였다. 제조된 주형을 1*107~1*101 까지 copies 대비 10 배 단위로 희석하여 민감도를 확인하였다. 이때 PCR 반응에 사용된 반응액 조제 성분은 상기 표 5와 같고, PCR 반응조건은 상기 표 6과 같다. 그 결과는 도 5 및 도 6에 나타내었다.
레인 검출
M 100 bp DNA ladder
1 1*107 copies
2 1*106 copies
3 1*105 copies
4 1*104 copies
5 1*103 copies
6 1*102 copies
7 1*101 copies
도 5는 황색 포도알균 장독소 유전자 (J~Q)의 혼합액을 이용, 도 6은 황색 포도알균 장독소 유전자(A~I)의 혼합액을 이용한 것이다. 도 5에서는 1*102 copies, 도 6에서는 1*101 copies와 같은 민감도를 확인하였다. 본 발명에서 제조된 멀티플렉스의 검출한계는 위와 같이 대략 101 ~ 102 개의 copies에서 검출한계를 보였다.
서열목록 전자파일 첨부

Claims (5)

  1. (1) 서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 황색 포도알균 장독소 J 검출용 프라이머 쌍;
    (2) 서열번호 3 및 서열번호 4의 염기서열로 이루어진 황색 포도알균 장독소 K 검출용 프라이머 쌍;
    (3) 서열번호 5 및 서열번호 6의 염기서열로 이루어진 황색 포도알균 장독소 L 검출용 프라이머 쌍;
    (4) 서열번호 7 및 서열번호 8의 염기서열로 이루어진 황색 포도알균 장독소 M 검출용 프라이머 쌍;
    (5) 서열번호 9 및 서열번호 10의 염기서열로 이루어진 황색 포도알균 장독소 N 검출용 프라이머 쌍;
    (6)서열번호 11 및 서열번호 12의 염기서열로 이루어진 황색 포도알균 장독소 O 검출용 프라이머 쌍;
    (7) 서열번호 13 및 서열번호 14의 염기서열로 이루어진 황색 포도알균 장독소 P 검출용 프라이머 쌍; 및
    (8) 서열번호 15 및 서열번호 16의 염기서열로 이루어진 황색 포도알균 장독소 Q 검출용 프라이머 쌍
    을 포함하는, 황색 포도알균 장독소를 멀티플렉스 PCR로 검출하기 위한 황색 포도알균 장독소 검출세트.
  2. 시료로부터 추출한 DNA를 제1항의 검출세트를 이용하여 멀티플렉스 PCR로 증폭하는 단계; 및
    상기 멀티플렉스 PCR 증폭 산물을 전기영동장치를 통해 확인하여 장독소 유전자를 검출하고 황색 포도알균 장독소 종류를 판단하는 단계
    를 포함하는 황색 포도알균 장독소 검출방법.
  3. 삭제
  4. 중합효소연쇄반응(Polymerase chain reaction, PCR)을 이용하여 황색 포도알균 장독소를 검출하는 제1항의 검출세트, 반응완충액, dNTP 및 DNA 중합효소를 포함하는 황색 포도알균 장독소 검출키트.
  5. 제4항에 있어서, 상기 검출세트는 하나의 반응 용기, 스트립(strip) 또는 마이크로플레이트에 패키징 되는 것을 특징으로 하는 황색 포도알균 장독소 검출키트.
KR1020130047136A 2013-04-29 2013-04-29 황색 포도알균 장독소(ｊ, ｋ, ｌ, ｍ, ｎ, ｏ, ｐ, ｑ)를 멀티플렉스 pcr로 검출하기 위한 황색 포도알균 장독소 검출세트 및 검출방법 KR101343324B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020130047136A KR101343324B1 (ko) 2013-04-29 2013-04-29 황색 포도알균 장독소(ｊ, ｋ, ｌ, ｍ, ｎ, ｏ, ｐ, ｑ)를 멀티플렉스 pcr로 검출하기 위한 황색 포도알균 장독소 검출세트 및 검출방법

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020130047136A KR101343324B1 (ko) 2013-04-29 2013-04-29 황색 포도알균 장독소(ｊ, ｋ, ｌ, ｍ, ｎ, ｏ, ｐ, ｑ)를 멀티플렉스 pcr로 검출하기 위한 황색 포도알균 장독소 검출세트 및 검출방법

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR101343324B1 true KR101343324B1 (ko) 2014-01-23

Family

ID=50144112

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020130047136A KR101343324B1 (ko) 2013-04-29 2013-04-29 황색 포도알균 장독소(ｊ, ｋ, ｌ, ｍ, ｎ, ｏ, ｐ, ｑ)를 멀티플렉스 pcr로 검출하기 위한 황색 포도알균 장독소 검출세트 및 검출방법

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR101343324B1 (ko)

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20060106793A (ko) * 2003-04-02 2006-10-12 캐논 가부시끼가이샤 감염증 병원체 검출용 프로브 및 프로브 세트, 그리고,담체 및 유전자 확인방법

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20060106793A (ko) * 2003-04-02 2006-10-12 캐논 가부시끼가이샤 감염증 병원체 검출용 프로브 및 프로브 세트, 그리고,담체 및 유전자 확인방법

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Chen et al. Rapid detection of viable salmonellae in produce by coupling propidium monoazide with loop-mediated isothermal amplification
Jadhav et al. Methods used for the detection and subtyping of Listeria monocytogenes
Rodríguez-Lázaro et al. Rapid quantitative detection of Listeria monocytogenes in meat products by real-time PCR
Tang et al. Rapid and sensitive detection of Listeria monocytogenes by loop-mediated isothermal amplification
US20080160522A1 (en) Primer for Detecting Food Poisoning and Method for Rapid Detection of Food Born Pathogene
Ferrario et al. Next generation sequencing-based multigene panel for high throughput detection of food-borne pathogens
Zhao et al. Salmonella detection in powdered dairy products using a novel molecular tool
US11725252B2 (en) PCR detection kit for rapidly identifying Salmonella of specific serotypes
Peruzy et al. Detection and quantification of Campylobacter in foods: New analytic approaches to detect and quantify Campylobacter spp. in food samples
Zang et al. Can a visual loop-mediated isothermal amplification assay stand out in different detection methods when monitoring Campylobacter jejuni from diverse sources of samples?
Minami et al. Direct real-time PCR with ethidium monoazide: a method for the rapid detection of viable Cronobacter sakazakii in powdered infant formula
KR101156719B1 (ko) 병원성 대장균 검출방법 및 검출세트
Klancnik et al. PCR in food analysis
US11827945B2 (en) Multiplex PCR detection kit for listeria monocytogenes serotype 4H
Liu et al. Development of a Loop‐Mediated Isothermal Amplification Assay Based on lmo0460 Sequence for Detection of L isteria monocytogenes
CN116926214A (zh) 基于聚合酶螺旋扩增技术的副干酪乳酪杆菌检测引物、试剂盒及方法
Suwanampai et al. Evaluation of loop-mediated isothermal amplification method for detecting enterotoxin A gene of Staphylococcus aureus in pork
KR101343324B1 (ko) 황색 포도알균 장독소(ｊ, ｋ, ｌ, ｍ, ｎ, ｏ, ｐ, ｑ)를 멀티플렉스 pcr로 검출하기 위한 황색 포도알균 장독소 검출세트 및 검출방법
Li et al. Development and application of reverse transcription loop‐mediated isothermal amplification for detecting live Shewanella putrefaciens in preserved fish sample
KR101343321B1 (ko) 황색 포도알균 장독소(ａ,ｂ,ｃ,ｄ,ｅ,ｇ,ｈ,ｉ) 검출방법 및 검출세트
Cheng et al. An Advanced Visual Qualitative and EVA Green‐Based Quantitative Isothermal Amplification Method to Detect L isteria Monocytogenes
Rajabzadeh et al. A rapid method for separating and concentration of food-borne pathogens using elution from ready-to-eat vegetables
KR20030077790A (ko) 병원성 미생물의 유전자 증폭용 프라이머, 이를 이용한병원성 미생물의 검출방법, 및 검출키트
Salihah et al. A novel, rapid, and sensitive real-time PCR assay for cost-effective detection and quantification of Staphylococcus aureus in food samples with the ZEN™ doublequenched probe chemistry
JP2007189980A (ja) 黄色ブドウ球菌検出のためのプライマーおよびそれを用いた検出法

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
A302 Request for accelerated examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
N231 Notification of change of applicant
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20161028

Year of fee payment: 4

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20171120

Year of fee payment: 5

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20181018

Year of fee payment: 6

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20191023

Year of fee payment: 7