KR101339767B1 - 철-아미노점토의 유사 과산화효소 활성을 이용한 면역학적 검정법 - Google Patents

철-아미노점토의 유사 과산화효소 활성을 이용한 면역학적 검정법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 철-아미노점토의 유사 과산화효소 활성을 이용한 면역학적 검정법에 관한 것으로 보다 상세하게는 폴산을 철-아미노점토에 컨쥬케이션시켜 얻은 폴산이 컨쥬케이션된 철-아미노점토(폴산-철-아미노점토)를 면역학적 검정법에 사용하는 방법에 관한 것이다.

Description

철-아미노점토의 유사 과산화효소 활성을 이용한 면역학적 검정법{Effective peroxidase-like activity of Fe-aminoclay for use in immunoassay}
본 발명은 철-아미노점토의 유사 과산화효소 활성을 이용한 면역학적 검정법에 관한 것으로 보다 상세하게는 폴산을 철-아미노점토에 컨쥬케이션시켜 얻은 폴산이 컨쥬케이션된 철-아미노점토(폴산-철-아미노점토)를 면역학적 검정법에 사용하는 방법에 관한 것이다.
효소(enzyme)는 바이오 나노기술과 환경적 책임분야에서 다양하고 강력하게 떠오르고 있다.
효소는 상온상압 조건에서의 높은 기질 특이성과 높은 효율과 같은 장점에도 불구하고 효소의 유기질 구성성분들은 pH와 온도 조건에 여전히 취약하다. 이들은 환경적인 변화와 프로테아제의 소화에 의해 단백질 구조의 변형을 초래한다. 게다가 효소 생산은 여러 정제 과정과 시간이 많이 소요되기 때문에 노동력 지향적이고 비용이 많이 소요되는 단점이 있다.
최근에 이러한 단점들은 과학자로 하여금 유사한 효소 모방형, 예를 들어, 헤민, 헤모글로빈, 사이클로덱스트린과 많은 나노입자 (Au@Pt, MnFe2O4, Cu 복합체, 양자점, Fe3O4, CeO2)들이 면역학적 검정법 사용하고 있다. 이러한 나노입자들은 유사 과산화효소 활성이 넓은 pH 범위와 높은 온도범위에서 가능하게끔 하고 있다.
2007년에 수용성 아미노점토가 점토 판상이 박리되어 양이온성 유기빌딩 블락 거동을 보여주는 내용이 처음으로 보고되었다. 이들의 고유 특성에 기인하여 수용성 아미노점토는 높은 밀도의 아미노기를 가지고 있다. 그 결과, 수용액에서 양성화에 의해 양이온화 된 나노입자(∼30nm)가 DNA, 지질, 단백질과 같은 바이오물질과 상호작용하거나 둘러싸서 생성된 유기-무기 (나노)복합체의 기계적이고 열적 안정성이 향상된 자가 조립(self-assembly)을 보여주었다. 게다가 이러한 아미노점토들은 최근에 세정제로써 중금속으로 오염된 토양을 복원하는데 사용되었으며 약물 전달 시스템에서 낮은 세포독성을 보여주기도 하였다. 하지만 이러한 아미노점토들 가운데 마그네슘 이온이 가운데 자리를 잡고 아미노(amino), 티올(thio), 페닐(phenyl), 하이드록실(hydroxyl) 등의 유기실레인으로 기능기화되어 있다.
본 발명에서는 양이온 메탈이 중심에 있는 전구체, 예를 들면 Fe3+Cl3 전구체를 사용하여 3-아미노프로필 트리에톡시실레인(APTES)을 에탄올 미디어에서 촉매없이 졸-겔 반응을 통하여 얻어 아미노기는 아미노점토 입자가 수용액에서 넓은 pH 범위에서 쉽게 분산이 되도록 하였다. 아미노점토 중심에 위치하는 Fe3+ 이온은 유사 과산화효소 활성 모방에 대한 가능성을 이용하게끔 하였다.
한편, 아미노점토 시리즈의 유사 과산화효소 활성의 증거는 여태 보고된 바가 없다.
본 발명의 목적은 아미노점토의 유사 과산화효소 활성으로 폐암 면역 검정에세이를 개발할 수 있는 가능성을 조사하였다. 철-아미노점토의 합성과 특성평가에 기반하여, 면역검정 에세이를 디자인하여 폴산이 컨쥬게이트 된 철-아미노점토는 TMB(3,3',5,5'-tetramethylbenzidine) 염료 산화가 용이하도록 하여 푸른색을 띠게 하여 검출되도록 함으로써 폴산을 철-아미노점토에 컨쥬케이션시켜 얻은 폴산이 컨쥬케이션 된 철-아미노점토를 면역학적 검정법에 사용하는 방법에 관한 것이다.
한편 본 발명과 관련된 선행기술로서 한국공개특허 제2011-0100625호에 냉동보존된 세포 배양물, 세포를 냉동 보존하는 방법, 및 상기 세포에 대한 세포 검정을 수행하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 냉동보존된 세포 배양물은 폴리-리신으로 코팅된 적어도 하나의 표면을 갖는 용기 및 표면상에 지지된 냉동된 세포를 포함하는 것을 나타내는 세포 검정 수행 방법이 있다.
그러나 본 발명과 상기 선행기술은 발명의 기술적 특징이 서로 달라 발명의 구성이 서로 다른 발명이다.
본 발명은 철-아미노점토의 유사 과산화효소 활성을 이용한 면역학적 검정법을 제공하고자 한다.
본 발명은 철-아미노점토의 유사 과산화효소 활성을 이용한 면역학적 검정법을 제공할 수 있다.
본 발명은 폴산을 철-아미노점토에 컨쥬케이션시켜 얻은 폴산이 컨쥬케이션된 철-아미노점토를 면역학적 검정법에 사용하는 방법을 제공할 수 있다.
본 발명에 의해 철-아미노점토가 유사 과산화효소 활성을 지니고 있음을 알 수 있으며, 이를 이용한 면역학적 검정법을 제공할 수 있으며, 특히 폴산을 철-아미노점토에 컨쥬케이션시켜 얻은 폴산이 컨쥬케이션된 철-아미노점토를 이용하여 폐암 세포의 여부를 확인할 수 있어 폐암 진단 및/또는 검정에 이용할 수 있다.
도 1은 수용액에서 저결정성 철-아미노점토의 TEM 이미지로써 (a)저배율, (b)고배율, (c)준비된 철-아미노점토의 분말의 사진, (d)3개월 후의 수용성 철-아미노점토(0.5mg/mL)의 사진, (e)DLS(dynamic light scattering, 동적광산란법)법으로 분석한 수용액에 분산된 철-아미노점토(0.5mg/mL)의 입자 크기 분포, 여기서 분홍과 갈색 화살표는 수력학적 지름의 밀도와 적층 확률을 나타낸다.
도 2는 철-아미노점토의 EDX(Energy dispersive X-ray Spectroscopy, 에닥스) 분석을 나타낸 것이다.
도 3은 준비한 철-아미노점토의 XRD(X-ray diffraction) 패턴(a)과 FTIR(Fourier transform infrared spectroscopy) 스펙트럼(b)을 나타낸 것이다.
도 4는 철-아미노점토를 기반으로 한 샌드우치 ELISA(Enzyme-linked immunosorbent assay)의 개요 설명을 나타낸 것이다.
도 5는 철-아미노점토의 유사과산화효소 활성: (1)과산화수소 없이 철-아미노점토(0.5mg/mL)이고, (2)철-아미노점토 없이 과산화수소(10mM)이고, (3)과산화수소(10mM)와 철-아미노점토가 TMB(3,3',5,5'-tetramethylbenzidine) 염료의 기질로 사용되었다. 삽입물은 튜브에서 색변화를 보여주는 사진이다.
도 6a는 pH에 대한 철-아미노점토의 유사 과산화효소 활성 최적화를 나타낸 것이고, 도 6b는 온도에 대한 철-아미노점토의 유사 과산화효소 활성 최적화를 나타낸 것이고, 도 6c는 과산화수소 농도에 대한 철-아미노점토의 유사 과산화효소 활성 최적화를 나타낸 것이다.
도 7은 폴산이 컨쥬게이션된 철-아미노점토(폴산-철-아미노점토)에서 폴산의 양에 따른 363nm에서의 흡광도의 변화, 즉 검량선(calibration curve)을 나타낸 것으로 폴산이 컨쥬게이션된 철-아미노점토의 양이 증가함에 따라 폴산의 흡수 파장인 363nm에서 상관관계를 가지며 비례적으로 증가함을 알 수 있었다.
도 8은 철-아미노점토(Fe-aminoclay) 및 폴산이 컨쥬게이션된 철-아미노점토(Folic acid-Fe-aminoclay)의 잔류 유사 과산화 효소 활성을 나타낸 것이다.
도 9는 철-아미노점토에 폴산이 컨쥬게이션된 특이적 연구에 관한 것으로 (a)철-아미노점토에 폴산이 컨쥬게이션되는 양의 영향, (b)A549와 WI-38의 색변화 산물의 사진이다.
도 10은 폐암 세포 A549에 대한 철-아미노점토 기반의 면역학적 검정법을 나타낸 것으로 (a)A549 세포수에 대한 색변화 산물 사진이고, (b)폴산이 컨쥬케이션된 철-아미노점토(1mg/mL)에서의 A549 세포의 일직선 상관관계를 나타낸 것으로 에러 바는 3번 측정한 것에 대한 표준편차를 나타내준다.
본 발명은 철-아미노점토의 유사 과산화효소 활성을 이용한 면역학적 검정법을 나타낸다.
본 발명은 폴산이 컨쥬케이션된 철-아미노점토를 면역학적 검정법에 사용하는 방법을 나타낸다.
상기에서 철-아미노점토는 상온(20∼25℃)에서 Fe3 +Cl3·6H2O 8.4g(31.08mmol)을 에탄올 200mL에 녹인 후 3-아미노프로필 트리에톡시실레인 (APTES) 13ml(58.73mmol)을 넣어 100∼500rpm으로 1∼24시간 동안 반응시키고 침전된 슬러리를 6∼18시간 동안 혼합시키는 단계; 상기의 혼합 후 얻은 생성물은 1000∼5000rpm으로 5∼15분 동안 원심분리로 분리하고 반응 후 잔류하는 Fe3+Cl3를 에탄올에 세척하고 40∼45℃에서 6시간∼48시간 동안 건조시켜 얻은 것을 사용할 수 있다.
상기에서 폴산이 컨쥬케이션된 철-아미노점토를 폐암 세포에 대한 면역학적 검정법에 사용하는 방법을 나타낸다.
상기에서 폴산이 컨쥬케이션된 철-아미노점토는 폴산이 용해된 버퍼에 EDC, sulfo-NHS를 넣은 후 혼합시켜 혼합물을 얻는 단계; 상기의 혼합물에 철-아미노점토를 넣고 교반시켜 폴산이 컨쥬케이션된 철-아미노점토를 얻은 후 원심분리하여 미반응된 폴산을 제거하는 단계에 의해 얻는 것을 사용할 수 있다.
상기에서 폴산이 컨쥬케이션된 철-아미노점토는 폴산 2.5mg을 PBS 버퍼 250㎕에 용해시킨 후 1M NaOH로 pH를 7로 맞춘 다음 EDC(1-ethyl-3-(3'-dimethylaminopropyl) carbodiimide, 1.1mg, 5.6μmol), sulfo-NHS(N-hydroxysulfosuccinimide, 1.2mg, 5.6μmol)를 넣은 후 상온에서 30분 동안 암소(暗所)하에서 혼합시켜 혼합물을 얻는 단계; 상기의 혼합물 750㎕에 철-아미노점토 10mg를 넣고 상온에서 3시간 동안 200rpm으로 교반시켜 폴산이 컨쥬케이션된 철-아미노점토를 얻은 후 10000g으로 5분 동안 1∼5회 원심분리하여 미반응된 폴산을 제거하는 단계에 의해 얻는 것을 사용할 수 있다.
상기에서 검정하고자 하는 세포에 폴산이 컨쥬케이션된 철-아미노점토, TMB 염료 및 과산화수소를 넣고 상기 검정하고자 하는 세포를 배양시켜 세포에 대한 TMB 변색에 의해 세포를 검정할 수 있다.
상기에서 폐암 세포 4×104 세포를 96-웰 플레이트(96-well plate)에 접종하고 24시간 동안 성장시킨 후 PBS 용액으로 세척하고 3％ BSA PBS 용액에 2시간 동안 37℃에서 배양 후 폴산이 컨쥬케이션된 철-아미노점토 100㎕, 5mM 농도의 TMB 염료 70㎕ 및 1M 농도의 과산화수소(H2O2) 10㎕를 넣고 40℃에서 30분 동안 배양시켜 폐암 세포에 대한 TMB 변색에 의해 폐암 세포를 검정할 수 있다.
본 발명의 철-아미노점토의 유사 과산화효소 활성을 이용한 면역학적 검정법에 대해 다양한 조건으로 실시한바, 본 발명의 목적을 달성하기 위해서는 상기에서 언급한 조건에 의해 철-아미노점토의 유사 과산화효소 활성을 이용한 면역학적 검정법을 제공하는 것이 바람직하다.
이하 본 발명의 내용을 실험 예를 통하여 구체적으로 설명한다. 그러나, 이의 실험 예는 본 발명을 보다 상세하게 설명하기 위한 것으로 본 발명의 권리범위가 이들에 의해 한정되는 것은 아니다.
<실험예>
[1]재료 및 실험방법
(1)재료
Fe3 +Cl3·6H2O, TMB, 폴산, APTES, EDC, sulfo-NHS는 시그마 알드리치에서 구입하였다. 에탄올은 삼천 순수 화학에서 구입하였다. 물 및/또는 증류수는 3차 증류수를 사용하였다.
(2)친수성 철-아미노점토의 합성
하기의 언급한 방법에 의해 철-아미노점토를 합성하였다.
철-아미노점토는 상온(25℃)에서 Fe3+Cl3 (8.4g, 31.08mmol)을 에탄올 200mL에 녹인 후에 3-아미노프로필 트리에톡시실레인(APTES)(13mL, 58.73mmol)을 넣어서 300rpm으로 6시간 동안 반응을 시키고 침전된 갈색 슬러리는 12시간 동안 혼합하였다.
상기 반응 후 생긴 생성물은 원심분리(3000rpm, 10분)로 분리하고 반응 후 잔류하는 Fe3+Cl3를 에탄올 100mL로 2번 세척하여 40℃에서 24시간 동안 건조시켜 막자사발로 갈아서 사용하였다. 유기실레인(APTES) 대 금속 전구체(Fe3 +Cl3)의 몰비는 약 2.0로 하였다. 이러한 조건에 합성한 건조중량은 대략 4.67g이었다.
철-아미노점토의 대량생산은 화학 반응물을 비례적으로 증가시킴으로써 가능하며, 물론 아미노점토의 특성은 그대로 유지되었다. 나아가 Fe(철)뿐만 아니라, Mn (망간), Cu (구리), Ce (세륨), Co (코발트), Ni (니켈), Zn (아연), Al (알루미늄)으로 상기방법으로 합성이 가능함을 확인하였다.
(3)합성한 철-아미노점토의 특성평가
샘플의 표면 모폴로지는 EDX가 장착된 전자투과현미경으로 관찰하였다.
세부적으로 증류수로 희석시킨 샘플을 카본(carbon)으로 코팅된 구리 그리드 위에 떨어뜨려 건조한 후, 전자투과현미경 홀더(holder)에 넣어서 측정하였다.
철-아미노점토의 조성은 성분분석기로 측정하되, 유기성분 대한 측정은 EA(elemental analyzer, 성분분석기)로 실시하고, 반면 XRF(X-ray fluorescence, 형광 X-선 분석법)는 무기성분에 대해서 분석하였다. 질소 흡착/탈착 데이터는 가스 흡착 분석기로 분석하였다.
철-아미노점토의 비표면적은 BET(Brunauer, Emmett, and Teller) 식으로 계산하였으며 기공크기는 BJH 모델로 결정하였다.
XRD 패턴으로 Rigaku D/max-2500(18kW)를 사용하였으며 이때
Figure 112012058194699-pat00001
고니오미터는 CuKα 방출기가 장착된 40kV와 30mA 조건에서 측정하였다. 샘플은 분당 1.2℃, 3℃에서 65℃까지 스캔하였으며 0.5g의 각 샘플을 막자사발로 곱게 갈아서 준비하여 holder에 균일하게 채웠다.
수용액에서의 철-아미노점토의 입자크기 분포는 동적광산란법 입자 분석기로 수행하였다. KBr 펠렛으로 디스크 방식을 이용한 FTIR 분광학적 방식으로 4000cm-1에서 540cm-1에서 측정하였으며 펠렛 디스크는 10％ 샘플과 90％ KBr 무게비로 제조하였다.
(4)비색 과산화수소 검출
철-아미노점토의 유사 과산화효소 활성을 조사하기 위하여, 비색 기질의 촉매적 산화를 과산화수소의 농도에 따라 수행하였다.
5㎕의 TMB(3,3',5,5'-tetramethylbenzidine, 500mM), 25㎕의 철-아미노점토 (10mg/mL) 그리고 420㎕ 나트륨 아세테이트 버퍼(0.2M, pH 4.0)과 50㎕의 H2O2 (100mM)으로 37℃ 워터 배쓰(water bath)에서 5분간 인큐베이션(incubation) 하였다. 인큐베이션 반응 후, 철-아미노점토는 원심분리(10,000g, 5분간)를 수행하여 반응용액으로부터 제거하였다. 이때 상등액은 반응 진전을 보여주는 이미지를 얻기 위해 사용하였다. 용액의 흡착 강도는 800㎕ 물에서 200㎕ 반응용액을 희석하여 측정하였다. 분광학적 측정은 Cary 100 Conc UV-Vis 분광학기로 측정하였다.
(5)폴산 컨쥬게이션 철-아미노점토
폴산이 컨쥬게이션 된 철-아미노점토(이하 "폴산-철-아미노점토"라고 약칭함)는 하기와 같은 방법에 의해 얻었다.
2.5mg 폴산을 250㎕ PBS 버퍼에 녹인 후 여 1M NaOH으로 pH는 7로 맞추었다. 이 용액에 EDC 1.1mg(5.6μmol)과 sulfo-NHS 1.2mg(5.6μmol)를 넣은 후 상온에서 30분 동안 어둠 분위기에서 혼합하였다. 연이어, 철-아미노점토 10mg을 상기의 폴산 용액에 넣고 상온에서 3시간 동안 혼합하였다. 얻어진 폴산-철-아미노점토는 5번의 원심분리(10,000g, 5분)로 반응하지 않은 폴산을 정제하였으며, 초기 PBS 용액에 펠렛을 재분산하여, 사용하기 전까지 4℃에서 보관하였다.
폴산의 양은 363 nm에서 폴산의 흡수 피크 측정을 통하여 정하였다. 철-아미노점토에서 최종 폴산 로딩양은 초기용액과 로딩 후 상등액 사이의 폴산 양의 차이로 계산하였다.
(6)폴산-철-아미노점토의 면역학적 검정법
인간 폐암세포(A549)와 인간 정상세포(WI-38)는 ATCC에서 구입하였다.
각각의 세포 라인은 RPMI-1640 미디어(입수처:Roswell Park Memorial Institute, PAAS laboratories, Pasching, Austria)에서 10％ fetal bovine serum과 100 unit/mL 페니실린-스트렙토마이신을 5％ CO2가 포함된 37℃에서 24시간 동안 배양하였다.
폴산-철-아미노점토의 면역학적 검정을 위하여, 각 세포 라인의 4×104 세포를 96-웰 플레이트(well-plate) 각각에 접종하였다. 연이어 세포들을 각 웰의 표면에 붙이고 24시간 동안 성장시켰다. 성장시킨 이후에 세포는 PBS 용액으로 세척하여 100％ 아이스-냉동 메탄올에 10분간 -20℃에서 고정하였다. 고정 시약은 PBS 용액으로 2번 세척 후 제거하여 세포를 3％ BSA PBS 용액에 비특이적 결합을 막기 위해 2시간 동안 37℃에서 배양하였다. 블락 과정을 이후에 남겨진 BSA는 철저히 PBS 용액으로 3번 세척하였다. 0mg/ml, 0.05mg/ml, 0.1mg/ml, 0.2mg/ml, 0.5mg/ml, 1.0m g/ml의 폴산-철-아미노점토의 100㎕씩을 각각의 웰에 처리하고 37℃에서 2시간 동안 특이적으로 A549 세포를 컨쥬게이션하였으며, 이는 표면에 폴산 리셉터가 과발현되는 것이다. 결합하지 않은 폴산-철-아미노점토는 연이어 PBS 용액으로 세척하였으며 반응 혼합물은 70㎕의 TMB(3,3',5,5'-tetramethylbenzidine, 5mM)과 10㎕의 H2O2(1M)을 20㎕의 PBS 용액에 넣은 후 이들을 각각의 웰에 넣었다. 웰 플레이트는 40℃에서 30분간 배양하였다. 그 흡수는 650 nm 파장에서 마이크로타이터 플레이트 리더로 측정하였다.
[2]결과 및 고찰
(1)철-아미노점토 입자의 특징
박리되고 수용액에 분산된 철-아미노점토 판상들이 명암 차이로 적층된 나노입자 판상을 보여주고 있으며(도 1의 (A),(B) 참조), 30 nm 또는 100 nm의 지름을 보여주고 있다(도 1(A) 및 도 1(B)의 흰 화살표 참조). 높은 배율의 이미지는 무정형의 낮은 결정성 구조를 보여주고 있으며 Fe(45.43wt％), Si(29.00wt％), Cl(25.57wt％)을 주로 나타낸다(도 2 참조). 이는 성분분석기에 의한 XRF 분석(하기 표 1, 표 2 참조)에 의해 결정된 Fe 함량과 상응한다. 여기서 철-아미노점토는 N이 대략 4.44wt％를 차지한다. Cl-1 이온은 양성화된 -NH2기들, 즉 -NH3 +을 안정화시킨다. 예상하다시피, 철-아미노점토는 간단한 졸-겔 방식으로 직접적인 원-팟 방식으로 상온상압 조건에서 촉매없이 합성을 하였다. 이는 대량생산이 가능함을 의미한다(도 1의 C 참조). 3-아미노프로필 트리에톡시실레인(APTES)로 기능화 된 철-아미노점토는 수용액에서 굉장히 안정된 분산을 보이는데 이는 박리된 철-아미노점토 판상의 양이온성 유기 빌딩 블락 사이의 정전기적 반발력에 기인하며, 심지어 3개월이 지나도 분산도가 좋게 유지됨을 알 수 있었다(도 1의 D 참조).
도 1의 E는 수용액에서의 수력학적 지름을 보여주는 데이터이며, 단분산 분포를 보여준다. 수용액상에서 분산된 철-아미노점토의 평균 지름(nm)은 X10=72.70nm, X50=92.42nm, X90=117.03nm, X99=141.67nm이여 여기서 Xn은 n％에서 적층된 입자크기의 수력학적 평균 지름을 의미한다. 이 사실들에 기반하여, 평균 표면/부피 지름은 각각 90.93nm와 94.02nm이다. 평균 표면 지름을 평균 부피 지름으로 나눈 비(Sv)는 65.99m2/cm3이다. Sv값이 클수록 철-아미노점토 나노입자는 더 작고 더 구형이다.
철-아미노점토의 결정성 구조, 상 구조, 불순물을 더 알아보기 위해, XRD 연구는 필수적이다(도 3 참조). 일반적으로, 철-아미노점토는 낮은 각도에서 상호층간 d001 반영은 1.5-1.8nm를 보여주며 이는 전형적인 층상(라멜라) 유기점토 구조임을 말해준다. 내부층간 반영은 넓은 피크의 d020,110=0.39nm, d130,200=0.27nm, d060,330=0.15nm을 보여주는데 이는 1:1 층상 필로실리케이트 패밀리의 특성을 보여주는 것이며 무기-유기 하이브리로써, [H2N(CH2)3]4[Si4Fe6O8(OH)2]의 화학구조를 보여준다 (도 3의 A 참조).
FTIR 분광학은 철-아미노점토 구조의 공유결합 상호작용을 보여준다(도 3의 B 참조). 철-아미노점토는 Fe-O(477/697cm-1), Si-O-Si(1,040cm-1), Si-O-C(1,116cm-1), CH2 bending(1,489cm-1), NH2 bending(1,611cm-1), -NH3 +(1,999cm-1), CH2(3,042cm-1), OH(3,392cm-1)의 진동 모드는 보고된 결과와 일치한다. 그 결과 유기기능기 NH2의 한 측면은 물에 대한 분산성과 ??COOH 기능기에 대한 컨쥬게이션 자리를 제공한다. 반면에 표면의 Fe3+ 원자면은 유사과산화효소 모방 활성을 보여준다. 이는 Fe3O4도 같은 기능이라고 볼 수 있다. 이러한 하이브리드 물질의 거동은 야누스 입자 또는 두 가지 기능을 지닌 나노입자들과 유사하다 (도 4 참조).
EA에 의한 철-아미노점토의 조성
C(％) H(％) O(％) N(％)
12.23 4.30 20.84 4.44
XRF에 의한 철-아미노점토의 조성
100％
Fe(％) Si(％) Cl(％)
45.43 29.00 25.57
(2)철-아미노점토의 유사 과산화효소 활성 예비조사
도 5에서 보듯, 철-아미노점토 판상에 의한 과산화수소 활성화는 TMB(3,3',5,5'-tetramethylbenzidine)를 푸른색 생성물로 전환한다. 이 연구에서 우리는 Fe3 + 기반의 아미노점토가 과산화수소를 활성화시키는 역할을 한다는 것을 발견하였으며, 이는 Fe3O4 입자처럼 촉매적 유사 과산화효소 활성을 보였다. 더욱이, 망간 페라이트 나노입자에서 Mn2+ 원자가 오히려 Fe3+ 원자보다 유사 과산화효소 활성이 지배적이었다. 이러한 고유 반응은 수용액에서 넓은 pH 범위에서, 중성 pH에서 철-아미노점토 나노입자들의 높은 분산 안정성과 연관이 있다. 더욱 더 중요하게는, 다른 금속 산화물 접근법과 같이 비색 에세이에서 다른 나노입자 크기를 조절할 필요성이 없다는 것이다. 비색 기작의 측면에서, 철-아미노점토의 강한 루이스 산 자리가 Fe3+ 표면을 매개체로 하는 공정이 가능하며 이는 철-아미노점토 판상의 박리된 마이크로구조에서 기인한다.
(3)pH, 온도, 과산화수소의 최적화
본 발명의 철-아미노점토는 Fe3O4 입자의 대체로 제공할 수 있다. 참고로 Fe3O4는 입자 크기에 따라 유사과산화효소 활성에 영향을 미친다. 철-아미노점토는 주로 pH 2.0∼12.0, 온도(4℃∼75℃), 과산화수소 농도(0∼1.0M)에 의존한다(도 6a, 도 6b, 도 6c 참조). 알려진 Fe3O4 입자의 경우와 같이 유사한 범위에서보다 철-아미노점토는 훨씬 안정된 활성을 보였다. 최적 pH와 온도는 4.0∼6.0와 45℃였다. 그리하여 본 발명의 발명자는 철-아미노점토의 활성을 이 조건에서 분석하였다. 나아가 철-아미노점토에서 과산화수소 농도의 유사과산화효소 활성을 조사하기 위해, 우리는 최적 과산화수소 농도를 테스트하였다. 철-아미노점토의 유사 과산화효소 활성은 과산화수소 농도 0.3M이상에서 거의 100％ 유지되었다. 과산화수소 농도가 증가함에 따라 Fe3O4 입자에서 관찰되는 과량 과산화수소에 의해 발생하는 라디칼 스캐빈징 효과에도 불구하고. 이는 높은 이온 강도를 보이는 바닷물을 제외하고 대부분의 수용액에서 철-아미노점토가 보이는 높은 안정성에 기인한다. 추가적으로, 철-아미노점토의 양이온성 아미노기는 (1) 양성화된 아미노기는 정전기적 반발력에 의하여 버퍼 용액에서 높은 분산도를 보이며, (2) 분산된 철-아미노점토의 양이온 차지는 음이온성 기질 (염료)에 빠른 물질 전달을 유도하는 등의 2가지 기능을 가지고 있다.
(4)면역학적 검정법으로의 적용
본 발명의 중요하면서 즉각적인 적용처는 새로운 시그널 프루브(signal probe)로써 철-아미노점토를 사용하여 훨씬 더 튼튼하고 재현성 있는 면역검정법의 디자인에 있다. 전형적인 ELISA에서 이차 항체에 컨쥬게이트 된 HRP(horseradish peroxidase)는 자주 특정 타겟 또는 표면 리셉터에 특이적인 일차 항체의 결합을 평가하기 위해 사용된다. 이 결합 이벤트는 과산화수소 존재하에서 TMB(3,3',5,5'-tetramethylbenzidine)와 같은 색변환 기질을 산화시키는 HRP(horseradish peroxidase)의 능력에 의해 평가하는데 이용되었다. 하지만 고유한 HRP (horseradish peroxidase)의 불안정성, 이는 다양한 환경적인 파라미터, 즉 온도, pH, 저장시간에 의존하며 자주 부정적인 센싱 결과를 만들어낸다. 본 발명의 발명자는 가정하기를, 철-아미노점토 기반의 면역학적 검정법은 튼튼한 철-아미노점토에서 불안정한 HRP(horseradish peroxidase)에 의한 전형적인 ELISA을 대체가 가능할 수 있다. 철-아미노점토의 유사 과산화효소 활성은 대응하는 컬러 발현의 산화를 용이하게 해야 하며, 철-아미노점토의 풍부한 잔류 아민기는 또한 생물학적 리셉터와 컨쥬게이션이 용이하게 한다. 이 에세이를 이용하여 우리는 전형적인 ELISA를 사용하는 것보다 훨씬 더 빠르게, 낮은 비용으로 타겟 분자를 검출하고 정량할 수 있다.
여기서 철-아미노점토는 EDC-NHS 화학을 이용하여 폴산에 먼저 컨쥬게이션시켜 폴산이 컨쥬게이션된 철-아미노점토를 가리킨다(도 7 참조). 폴산은 폴산염 리셉터의 리간드이다. 폴산은 많은 종양 및 암세포의 표면에서 과발현된다. 본 발명의 발명자는 가정하기를, 철-아미노점토를 항폴산염 리셉터 항체 대신에 폴산을 컨쥬게이션시켜 면역학적 검정법에 훨씬 더 튼튼한 나노프로브를 만드는 것이다(도 8 참조). 실험은 폐얌 세포 라인(A549)를 이용하여 수행하였으며 폴산염 리셉터가 과발현된다. 대조 실험으로 인간 정산 세포 라인(WI-38)을 사용하였으며 이는 폴산염 리셉터의 발현이 부족하다.
본 발명의 발명자는 먼저 폴산염 리셉터에 긍정적인 A549 세포를 검출하는 특이성을 평가하기 위해 면역학적 검정법을 수행하였다. 도 9에 보듯 웰 이미지와 산화된 TMB에 상응하는 최대 흡수는 명백히 A549 세포 웰에서 WI-38 세로보다 훨씬 더 뚜렷한 색변화를 보였다. 이는 폴산이 컨쥬게이션된 철-아미노점토(폴산-철-아미노점토)가 특이적으로 A549 세포에 결합하는 것이라는 걸 보여준다. 직접적인 색 변화와 동시에 흡수 강도에 기반하여 세포의 수에 따른 폴산 철-아미노점토의 역량을 평가하기 위하여, 최적양의 폴산 철-아미노점토(0.5 mg/mL)를 A549 세포 라인의 다양한 양으로 배양하였다(도 10 참조). 도 10에서 나타낸 바와 같이 이 결과는 명확히 A549 세포를 폴산 철-아미노점토와 배양한 것이 세포 양(2만 세포까지)에 비례적으로, 점진적인 색 차이를 보여주었다. 이는 맨눈으로도 확인할 수 있었다. 흡수 측정은 비색 결과와 일직선 상관관계를 보여주며, A549 세포의 LOD값은 대략 500개의 세포였다.
(5)결론
전체적으로, 본 발명의 발명자는 성공적으로 철-아미노점토가 유사 과산화효소 활성을 나타내는 것을 알 수 있었다. 게다가 이러한 면역학적 검정법은 튼튼한 철-아미노점토에서 불안정한 HRP(horseradish peroxidase)를 대체하는 전형적인 ELISA의 잠재적인 대체제로 개발될 수 있다. 이러한 결과는 다른 양이온성 금속, Cu2+, Mn2+, Ce3+, Co2+ 등을 이용하여 다양한 튼튼한 아미노점토를 만들 수 있다. 기대하길, 본 발명의 발명자는 진단, 특히 바이오테크놀로지, 환경화학 및 바이오매스 연관 분야에서 중성 pH에서 유사-펜톤 반응 사용의 가능성을 열어준다고 하겠다.
상술한 바와 같이, 본 발명의 바람직한 실험예를 참조하여 설명하였지만 본 발명의 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 통상의 기술자라면 하기의 특허청구범위에 기재된 본 발명의 사상 및 영역으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서 본 발명을 다양하게 수정 및 변경시킬 수 있음을 이해할 수 있을 것이다.
<참고문헌>
(1)Demarche, P.; Junghanns, C.; Nair, R. R.; Agathos, S. N. Biotechnol. Adv. 2011, doi:10.1016/j.biotechadv.2011.05.013.
(2)He, W.; Liu, Y.; Yuan, J.; Yin, J.-J.; Wu, X.; Hu, X.; Zhang, K.; Liu, J.; Chen, C.; Ji, Y.; Guo, Y. Biomaterials 2011, 32, 1139-1147.
(3)Figueroa-Espㅽ, V.; Alvarez-Paneque, A.; Torrens, M.; Otero-Gonzㅱlez, A. J.; Reguera, E. Colloid Surf. A-Physicochem. Eng. Asp. 2011, 387, 118-124.
(4)Wei, H.; Wang, E. Anal. Chem. 2008, 80, 2250-2254.
(5)Guo, Y.; Li, J.; Dong, S. Sens. Actuator B-Chem. 2011, 160, 295-300.
(6)Tang, Y.; Zhou, L.; Li, J.; Luo, Q.; Huang, X.; Wu, P.; Wang, Y.; Xu, J.; Shen, J.; Liu, J. Angew. Chem., Int. Ed. 2010, 49, 3920-3924.
(7)Sigel, H. Angew. Chem., Int. Ed. 1969, 8, 167-177.
(8)Pugia, M. J.; Lott, J. A.; Wallace, J. F.; Cast, T. K.; Bierbaum, L. D. Clin. Biochem. 2000, 33, 63-70.
(9)Zhao, W.-W.; Ma, Z.-Y.; Yu, P.-P.; Dong, X.-Y., Xu, J.-J.; Chen, H.-Y. Anal. Chem. 2012, 84, 917-923.
(10)Gao, L.; Zhuang, J.; Nie, L.; Zhang, J.; Zhang, Y.; Gu, N.; Wang, T.; Feng, J.; Yang, D.; Perrett, S.; Yan, X. Nat. Nanotechnol. 2007, 2, 577-583.
(11)Park, K. S.; Kim, M. I.; Cho, D.-Y.; Park, H. G. Small 2011, 7, 1521-1525.
(12)Kim, M. I.; Shim, J.; Li, T.; Lee, J.; Park, H. G. Chem. Eur. J. 2011, 17, 10700-10707.
(13)Kim, M. I.; Shim, J.; Li, T.; Woo, M.-A.; Cho, D.; Lee, J.; Park, H. G. Analyst 2012, 137, 1137-1143.
(14)Asati, A.; Santra, S.; Kaittanis, C.; Nath, S.; Perez, J. M. Angew. Chem., Int. Ed. 2009, 48, 2308-2312.
(15)Ornatska, M.; Sharpe, E.; Andreescu, D.; Andreescu, S. Anal. Chem. 2011, 83, 4273-4280.
(16)Datta, K. K. R.; Eswaramoorthy, M.; Rao, C. N. R. J. Mater. Chem. 2007, 17, 613-615.
(17)Mann, S. Nat. Mater. 2009, 8, 781-792.
(18)Lee, Y.-C.; Kim, E. J.; Ko, D. A.; Yang, J.-W. J. Hazard. Mater. 2011, 196, 101-108.
(19)Holmstrㆆm, S. C.; Patil, A. J.; Butler, M.; Mann, S. J. Mater. Chem. 2007, 17, 3894-3900.
(20)Han, H.-K.; Lee, Y.-C.; Lee, M.-Y.; Patil, A. J.; Shin, H.-J. ACS Appl. Mater. Interfaces 2011, 3, 2564-2572.
(21)Martin, J. E.; Patil, A. J.; Butler, M. F.; Mann, S. Adv. Funct. Mater. 2011, 21, 674-681.
(22)Mann, S.; Burkett, S. L.; Davis, S. A.; Fowler, C. E.; Mendelson, N. H.; Sims, S. D.; Walsh, D.; Whilton, N. T. Chem. Mater. 1997, 9, 2300-2310.
(23)Solanki, P. R.; Kaushik, A. Agrawal, V. V., Malhotra, B. D. NPG Asia Mater. 2011, 3, 17-24.
(24)Henne, W. A.; Doorneweerd, D. D.; Lee, J.; Low, P. S.; Savran, C. Anal. Chem. 2006, 78, 4880-4884.
(25)Ulbrich, K.; Michaelis, M.; Rothweiler, F.; Knobloch, T.; Sithisarn, P.; Cinatl, J.; Kreuter, J. Int. J. Pharm. 2011, 406, 128-134.
(26)Xiong, L.-Q.; Chen, Z.-G.; Yu, M.-X.; Li, F.-Y.; Liu, C.; Huang, C.-H. Biomaterials 2009, 30, 5592-5600.
(27)Patil, A. J.; Li, M.; Dujardin, E.; Mann, S. Nano Lett. 2007, 7, 2660-2665.
(28)Yuan, H.; Miao, J.; D, Y.-Z.; You, J.; Hu, F.-Q.; Zeng, S. Int. J. Pharm. 2008, 348, 137-145.
(29)Nelson, M. E.; Loktionova, N. A.; Pegg, A. E.; Moschel, R. C. J. Med. Chem. 2004, 47, 3887-3891.
(30)Han, G.; Ghosh, P.; Rotello, V. M. Nanomedicine 2007, 2, 113-123.
(31)Dixit, V.; den Bossche, J. V.; Sherman, D. M.; Thompson, D. H.; Andres, R. P. Bioconjugate Chem. 2006, 17, 603-609.
본 발명에 의해 철-아미노점토가 유사 과산화효소 활성을 지니고 있음을 알 수 있으며, 이를 이용한 면역학적 검정법을 제공할 수 있으며, 특히 폴산을 철-아미노점토에 컨쥬케이션시켜 얻은 폴산-철-아미노점토를 이용하여 폐암 세포의 여부를 확인할 수 있어 폐암 진단 및/또는 검정에 이용할 수 있으므로 산업상 이용 가능성이 있다.

Claims (7)

  1. 검정하고자 하는 세포에 폴산이 컨쥬케이션된 철-아미노점토, TMB(3,3',5,5'-tetramethylbenzidine) 염료 및 과산화수소를 넣고 상기 검정하고자 하는 세포를 배양시켜 세포에 대한 TMB 변색에 의해 세포를 검정하는 것을 특징으로 하는, 폴산이 컨쥬케이션된 철-아미노점토를 면역학적 검정법에 사용하는 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    철-아미노점토는 상온에서 Fe3 +Cl3·6H2O 8.4g(31.08mmol)을 에탄올 200ml에 녹인 후 3-아미노프로필 트리에톡시실레인(APTES) 13ml(58.73mmol)을 넣어 100∼500rpm으로 1∼24시간 동안 반응시키고 침전된 슬러리를 6∼18시간 동안 혼합시키는 단계;
    상기의 혼합 후 얻은 생성물은 1000∼5000rpm으로 5∼15분 동안 원심분리로 분리하고 반응 후 잔류하는 Fe3+Cl3를 에탄올에 세척하고 40∼45℃에서 6시간∼48시간 동안 건조시켜 얻은 것임을 특징으로 하는 방법.
  3. 삭제
  4. 제1항에 있어서,
    폴산이 컨쥬케이션된 철-아미노점토는 폴산이 용해된 버퍼에 1-에틸-3-3'-디메칠아미노프로필 및 히드록시술포숙신이미드를 넣은 후 혼합시켜 혼합물을 얻는 단계;
    상기의 혼합물에 철-아미노점토를 넣고 교반시켜 폴산이 컨쥬케이션된 철-아미노점토를 얻은 후 원심분리하여 미반응된 폴산을 제거하는 단계에 의해 얻는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제1항에 있어서,
    폴산이 컨쥬케이션된 철-아미노점토는 폴산 2.5mg을 PBS 버퍼 250㎕에 용해시킨 후 1M NaOH로 pH를 7로 맞춘 다음 1-에틸-3-3'-디메칠아미노프로필 1.1mg(5.6μmol), 히드록시술포숙신이미드 1.2mg(5.6μmol)를 넣은 후 상온에서 30분 동안 암소(暗所)하에서 혼합시켜 혼합물을 얻는 단계;
    상기의 혼합물 750㎕에 철-아미노점토 10mg를 넣고 상온에서 3시간 동안 200rpm으로 교반시켜 폴산이 컨쥬케이션된 철-아미노점토를 얻은 후 10000g으로 5분 동안 1∼5회 원심분리하여 미반응된 폴산을 제거하는 단계에 의해 얻는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 삭제
  7. 삭제
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Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107903400A (zh) * 2017-11-13 2018-04-13 北京科技大学 一种超分子聚合物及其制备和应用方法
WO2019045203A1 (ko) * 2017-08-30 2019-03-07 가천대학교 산학협력단 세륨-아미노클레이 나노입자 함유 자외선 차단 조성물 및 그 제조방법
KR102373979B1 (ko) 2021-02-25 2022-03-11 박병국 Cnc 가공 장치
CN115487813A (zh) * 2022-08-16 2022-12-20 中国地质大学（武汉） 一种蛭石纳米酶及其制备方法和应用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Biomaterials. 2009 Oct;30(29):5592-600 *
Chem Commun (Camb). 2011 Jul 21;47(27):7719-21 *
Sensors & Actuators: B. Chemical, Volume 160, issue 1 (December 15, 2011), p. 650-655. *

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2019045203A1 (ko) * 2017-08-30 2019-03-07 가천대학교 산학협력단 세륨-아미노클레이 나노입자 함유 자외선 차단 조성물 및 그 제조방법
KR20190023772A (ko) * 2017-08-30 2019-03-08 가천대학교 산학협력단 세륨-아미노클레이 나노입자 함유 자외선 차단 조성물 및 그 제조방법
KR101968307B1 (ko) 2017-08-30 2019-04-11 가천대학교 산학협력단 세륨-아미노클레이 나노입자 함유 자외선 차단 조성물 및 그 제조방법
CN107903400A (zh) * 2017-11-13 2018-04-13 北京科技大学 一种超分子聚合物及其制备和应用方法
CN107903400B (zh) * 2017-11-13 2020-09-11 北京科技大学 一种超分子聚合物及其制备和应用方法
KR102373979B1 (ko) 2021-02-25 2022-03-11 박병국 Cnc 가공 장치
CN115487813A (zh) * 2022-08-16 2022-12-20 中国地质大学（武汉） 一种蛭石纳米酶及其制备方法和应用

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