KR101332795B1 - Method for detection of multi-drug resistant hepatitis B virus - Google Patents
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Abstract
본 발명은 다양한 약제에 대한 내성 B형 간염 바이러스를 동시에 검출 하기 위한 방법에 관한 것으로, 1) 다약제 내성 B형 간염 바이러스를 검출하기 위한 표적 프로브와 2) 야생형과 변이종 바이러스에 대한 상대적인 양적 분석 및 비특이적 교차 혼성화반응에 의한 배경 측정으로 양성과 위양성 결정이 가능한 음성조절 프로브, 3) 마이크로어레이의 품질 관리를 위한 QC 프로브를 포함하는 마이크로어레이 및 이를 이용한 다약제 내성 B형 간염 바이러스의 검출 방법 및 진단 키트를 제공한다. 본 발명에 의한 검출방법은 다양한 약제에 의한 다수의 다양한 부위의 내성 변이들을 조기에 신속, 정확하고 간편하게 감지하고 임상에 유용한 검출 및 진단 방법을 제공한다.The present invention relates to a method for the simultaneous detection of resistant hepatitis B virus against a variety of drugs, 1) a target probe for detecting multi-drug resistant hepatitis B virus, and 2) relative quantitative analysis of wild-type and mutant virus and 3) Negative regulatory probe capable of positive and false positive determination by background measurement by non-specific cross hybridization reaction, 3) Microarray including QC probe for quality control of microarray and detection and diagnosis of multidrug resistant hepatitis B virus using the same Provide the kit. The detection method according to the present invention provides a method for detecting and diagnosing resistance variations of a large number of various sites by various drugs at an early stage quickly, accurately and simply, and useful for clinical use.
Description
본 발명은 B형 간염 바이러스(hepatitis B virus; HBV, 이하 'HBV'라 표기함)에 대한 약제 내성 변이 검출 방법에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 라미부딘, 팜시클로비어, 아데포비어와 엔테카비어의 다약제 내성 변이 HBV 검출용 표적 프로브, 마이크로어레이 제작과 혼성화반응 과정의 품질 관리를 위한 품질관리용(quality control) 프로브 (이하 'QC 프로브'라 표기함), 및 한 가지 이상의 야생형과 돌연변이 유형의 혼합 여부 및 혼합 정도와 비특이적 교차 혼성화반응(cross hybridization)의 배경(background) 측정을 통한 각 프로브에 대한 양성과 위양성 결정을 위한 음성 조절 (negative control) 프로브 (이하 'NC 프로브'라 표기함)를 포함하는 마이크로어레이와 이를 이용한 검출 방법 및 진단 키트에 관한 것이다.The present invention relates to a method for detecting drug resistance mutations against hepatitis B virus (HBV, hereinafter referred to as 'HBV'), and more specifically, to multidrug resistance mutations of lamivudine, famciclovir, adefovir and entecavir. Target probes for HBV detection, quality control probes (hereinafter referred to as 'QC probes') for quality control of microarray fabrication and hybridization processes, and mixing and mixing one or more wild type and mutation types Microarrays containing negative control probes (hereinafter referred to as 'NC probes') for the determination of positive and false positives for each probe by measuring the extent and background of nonspecific cross hybridization And a detection method and diagnostic kit using the same.
B형 간염 바이러스 감염에 의한 만성 간질환은 전 세계 인구의 적어도 5％가 만성 B형 간염 바이러스에 감염되어 있고 우리나라 5대 사망원인 중 하나이다(Chutima Pramoolsinsup. J Gastroenterol Hepatol, 17: S125-S145(2002), Evelien Libbrecht. J Clin Microbiol, 45: 3935-3941(2007)). 만성 B형 간염 치료의 궁극적인 목적은 강력하고 지속적인 HBV 증식 억제로 간경변증 및 간암의 발병 위험을 낮추는 것으로, 이를 위해 만성 B형 간염 바이러스의 관리와 치료가 중요하다. 적절한 치료 시기 및 치료제 선택은 치료에 따른 부작용, 내성 발현, 비용과 치료 효과에 대한 고려를 위해 중요한 부분으로, 특히 항바이러스 내성 발생 여부는 치료의 성패를 가름하는 가장 중요한 요소로 간주되고 있다.Chronic liver disease caused by hepatitis B virus infection is at least 5% of the world's population infected with chronic hepatitis B virus and is one of the five leading causes of death in Korea (Chutima Pramoolsinsup. J Gastroenterol Hepatol, 17: S125-S145 (2002). ), Evelien Libbrecht.J Clin Microbiol, 45: 3935-3941 (2007)). The ultimate goal of the treatment of chronic hepatitis B is to reduce the risk of developing cirrhosis and liver cancer by potent and persistent inhibition of HBV proliferation. Therefore, the management and treatment of chronic hepatitis B virus is important. Appropriate treatment timing and treatment choice are important factors for consideration of side effects, resistance development, cost and therapeutic effects of treatment. In particular, whether or not antiviral resistance occurs is considered the most important factor in determining the success or failure of treatment.
B형 간염 치료를 위해서는 경구 항바이러스제가 널리 사용되고 있으며, 현재 미국식품의약국안전청(FDA)에서 승인 받고 사용되고 있는 항바이러스제는 라미부딘(lamivudine, LMV), 아데포비어(adefovir dippivoxil, ADV), 엔테카비어(entacavir, ETV)와 텔비부딘 (telbivudine) 등이 있다. 이러한 경구 항바이러스제는 장기간 사용해야하며 이때 약제 내성 변이 바이러스의 발생은 만성 B형 간염의 임상경과를 악화시키고 다른 약제에 대한 감수성을 약화시킨다.Oral antiviral agents are widely used to treat hepatitis B. Antiviral agents currently approved and used by the US Food and Drug Administration (FDA) are lamivudine (LMV), adefovir dippivoxil (ADV), and entacavir (entacavir, ETV) and telbivudine. These oral antiviral agents should be used for a long time, and the occurrence of drug-resistant mutavirus worsens the clinical course of chronic hepatitis B and weakens the sensitivity to other drugs.
우리나라 의료 특성상 경구 항바이러스제의 순차 치료에 의해 여러 약제에 대한 내성이 흔하다. 따라서 한가지 이상의 약제에 노출된 환자에서 다약제 내성 발생 여부를 확인하는 것이 중요하다(Liu CJ. J Viral Hepat, 13:387-395(2006), 임형준, 대한간학회, 27-39(2007), Yim HJ. Hepatology, 44:703-712(2006), Lok AS. Hepatology, 46:254-265(2007)).Due to the medical characteristics of Korea, resistance to various drugs is common by sequential treatment of oral antiviral agents. Therefore, it is important to determine whether multi-drug resistance occurs in patients exposed to more than one drug (Liu CJ. J Viral Hepat, 13: 387-395 (2006), Hyung-Joon Lim, The Korean Academy of Medicine, 27-39 (2007), Yim HJ. Hepatology, 44: 703-712 (2006), Lok AS. Hepatology, 46: 254-265 (2007)).
항바이러스제에 대한 내성 변이 검출은 간염 바이러스가 충분히 증식하기 전에 조기 진단함으로써 간염의 악화를 예방하고 병합요법과 같은 다른 약제의 효과를 증대시킬 수 있기 때문에 매우 중요한 검사이다(Brunelle MN. Hepatology, 41:1391-1398(2005)). 또한, 장기간의 투약으로 약제 내성 바이러스가 출현하게 되면 일부의 환자는 심한 간기능 악화 및 부전을 경험하게 되며 또한 사망에 이르게 되는 경우도 있다. 따라서 치료중 환자 상태를 적절히 모니터하여 약제 내성 바이러스의 출현을 감지해야 할 필요가 있다(연종은. Medical Trubune. Weekly Report, (2005)).Detection of resistance to antiviral agents is a very important test because early diagnosis of the hepatitis virus can help prevent the exacerbation of hepatitis and increase the effectiveness of other drugs such as combination therapy (Brunelle MN. Hepatology, 41: 1391-1398 (2005). In addition, the emergence of drug-resistant viruses during long-term administration may cause some patients to experience severe deterioration of liver function and failure, and death. Therefore, it is necessary to properly monitor the patient's condition during the treatment to detect the emergence of drug-resistant viruses (Yon Jong-eun, Medical Trubune. Weekly Report, (2005)).
라미부딘은 대표적인 뉴클레오타이드 유사체로 부작용이 거의 없는 경구용 항바이러스제로서 강한 바이러스 억제작용이 있어서 1차 약제로 널리 사용되고 있으나 지속반응은 일부의 환자에서만 나타나고 장기간 시용할 때 높은 빈도의 YMDD(tyrosine-methionine-aspartate-aspartate) 변종의 발생을 야기한다(Lai CL. Clin Infect Dis, 26:687-696(2003), 장윤정, 대한간학회지, 8:397-404(2002), 류수형, 임상내과(2007)). 라미부딘 내성 변이종은 대부분 DNA 중합효소 유전자 C 도메인 내 YMDD 영역에서 출현하는데, 코돈 204번의 메티오닌(methionie)이 발린(valine) (rtM204V, YVDD) 또는 아이소류신(isoleucine) (rtM204I, YIDD)으로 치환되어 나타난다. 또한 B 도메인의 코돈 180번의 류신(leucine)이 메티오닌으로 치환된 변이(rtL180M)와 코돈 173번의 발린이 류신으로 치환된 변이(rtV173L)는 보상변이로서 특히 rtM204V와 함께 나타나며, rtM204I는 대개 단독으로 나타난다(류수형, 임상내과(2007), 임형준, 대한간학회지, 27-39(2007), 윤정환, 대한간학회지, 18-27(2006), Yim HJ. Hepatology, 44:703-712(2006), Lok AS. Hepatology, 46:254-265(2007)).Lamivudine is a representative nucleotide analogue and is an oral antiviral agent with few side effects.It is widely used as a first-line drug due to its strong antiviral effect.However, long-acting reactions occur only in some patients and have high frequency of YMDD (tyrosine-methionine-aspartate). -aspartate) (Lai CL. Clin Infect Dis, 26: 687-696 (2003), Jang Yun-Jung, Korean Journal of Hepatology, 8: 397-404 (2002), Ryu Soo-Hyung, Clinical Internal Medicine (2007)). Lamivudine resistant mutants appear mostly in the YMDD region of the DNA polymerase gene C domain, where codon 204 methionine is replaced by valine (rtM204V, YVDD) or isoleucine (rtM204I, YIDD). . In addition, mutations in which leucine of codon No. 180 in the B domain was replaced with methionine (rtL180M) and mutations in which valine of codon No. 173 was replaced with leucine (rtV173L) appeared as complementary mutations, especially with rtM204V, and rtM204I is usually present alone. (Ryu Soo-hyung, Clinical Internal Medicine (2007), Hyung-Joon Lim, Journal of the Korean Society of Hematology, 27-39 (2007), Jung Hwan Yoon, Journal of the Korean Society of Hematology, 18-27 (2006), Yim HJ. Hepatology, 44: 703-712 (2006), Lok AS. Hepatology, 46: 254-265 (2007).
아데포비어는 HBV 중합효소를 경쟁적으로 억제하고, 바이러스 DNA에 삽입되어 고리를 종료시켜 바이러스 증식을 억제한다. 아데포비어 내성은 DNA 중합효소 유전자 D 도메인의 코돈 236번의 아스파라긴(asparagine)이 트레오닌(threonine)으로 치환된 변이(rtN236T) 또는 B 도메인의 코돈 181번의 알라닌(alanine)이 트레오닌 또는 발린으로 치환된 변이(rtA181T/V)가 나타난다(류수형, 대한간학회지, 12:484-492(2006), 윤정환, 대한간학회지, 18-27(2006), Libbrecht E. J Clin Microbiol, 45:3935-3941(2007), Yim HJ. Hepatology, 44:703-712(2006), Lok AS. Hepatology, 46:254-265(2007), Chang UI. J Med Virol, 79:902-910(2007)).Adefovir competitively inhibits HBV polymerase and is inserted into viral DNA to terminate the ring to inhibit viral growth. Adefovir resistance is a mutation in which codon 236 asparagine in the DNA polymerase gene D domain is substituted with threonine (rtN236T) or in which alanine in
엔테카비어 내성 돌연변이는 DNA 중합효소 유전자 내 코돈 169번의 아이소류신이 트레오닌으로 치환된 변이(rtI169T), 코돈 180번의 류신이 메티오닌으로 치환된 변이(rtL180M), 코돈 184번의 트레오닌이 세린(serine) 또는 글라이신(glycine)으로 치환된 변이(rtT184S/G), 코돈 202번의 세린이 아이소류신으로 치환된 변이(rtS202I), 코돈 204번의 메티오닌이 발린 또는 아이소류신으로 치환된 변이(rtM204V/I)과 코돈 250번의 메티오닌이 발린으로 치환된 변이(rtM250V)가 나타난다(류수형, 대한간학회지, 12:484-492(2006), 윤정환, 대한간학회지, 18-27(2006), Libbrecht E. J Clin Microbiol, 45:3935-3941(2007), Yim HJ. Hepatology, 44:703-712(2006), Lok AS. Hepatology, 46:254-265(2007), Chang UI. J Med Virol, 79:902-910(2007)).The entecavir-resistant mutations include mutations in which codon 169 isoleucine is replaced with threonine in the DNA polymerase gene (rtI169T), mutations in which leucine codon 180 is replaced by methionine (rtL180M), serine or glycine (codon 184) as threonine. glycine-substituted mutation (rtT184S / G),
현재까지 보고된 약제 내성 변이 HBV 검출 방법은 라미부딘 내성 그리고/또는 아데포비어 내성 변이 검출을 위한 것으로 PCR 산물의 직접적인 염기서열 분석법(Direct sequencing), PCR 산물의 제한효소절편길이다양성 분석법(PCR-RFLP), 라인 프로브 분석법(Line Probe assay), PCR 산물의 제한효소절편질량다양성분석법(PCR-RFMP) 및 multiplex PCR 방법과 마이크로어레이를 이용한 검출 방법이 있다. 이들중 다수의 방법은 야생형과 변이종의 혼합 유무 및 혼합형에서의 상대량 비교 분석이 불용이한 한계를 가진다(Jang HJ. J Clin Microbiol, 42:4181-4188, 2004, 김철민 등, 국내특허등록, 제10-0650162호, 2006, Lok AS. Hepatology, 46:254-265, 2007). 이들 검출 방법 중 염기서열분석법을 제외하고 아직까지 엔테카비어 내성 변이 검출을 위한 방법 또는 키트는 개발되지 않았으며, 염기서열분석법의 경우 야생형과 변이종이 혼재하는 혼합형에 대해 상대량 분석이 불가능하여 정확한 엔테카비어 내성 변이 검출에 한계를 가진다.Drug-resistant mutant HBV detection methods reported to date are for direct detection of lamivudine-resistant and / or adefovir-resistant mutations, such as direct sequencing of PCR products, restriction enzyme fragment length analysis of PCR products (PCR-RFLP), Line Probe assay, restriction enzyme fragment mass diversity assay (PCR-RFMP) of PCR product, multiplex PCR method and detection method using microarray. Many of these methods have limitations in the analysis of the relative amounts of wild type and mutant mixed and relative amounts in mixed form (Jang HJ. J Clin Microbiol, 42: 4181-4188, 2004, Kim Chul Min et al. 10-0650162, 2006, Lok AS. Hepatology, 46: 254-265, 2007). Except for sequencing, no method or kit has been developed for the detection of entecavir-resistant mutations, and sequencing is not possible for relative quantitative analysis of mixed types of wild type and mutant species. There is a limit to detecting mutations.
최근 프로브 혼성화반응 원리를 이용한 다수의 유전물질을 지지체에 고밀도로 부착 가능하여 동시에 많은 유전자 또는 변이형을 검출 및 분석이 가능한 마이크로어레이가 아주 유용한 기술로 각광받고 있다. 마이크로어레이를 포함한 바이오칩은 스팟터(spotter)를 이용하여 표적 프로브를 지지체에 집적시키는 과정, 표적 산물과 표적 프로브의 혼성화반응 과정 및 스캐너를 통한 분석 과정을 거치게 된다. 바이오칩 제작시 이러한 과정을 거치는 많은 바이오칩 요소들의 품질관리는 바이오칩 제작에 매우 중요하며 그 중에서 프로브의 고정화가 바이오칩의 품질을 결정짓는 주요한 요인이다. 따라서 바이오칩을 이용한 실험 및 진단에서 신뢰도 높은 결과를 얻기 위해서는 혼성화반응 전에 바이오칩의 품질 특히 프로브의 고정화 여부를 확인해야한다. 또한, 바이오칩 제작과 혼성화반응 과정의 품질 관리를 위해 지지체 위에 표적 프로브와 QC 프로브를 함유하는 프로브를 함께 고정화하여 각각의 바이오칩 및 스팟에 대한 정확한 품질 관리가 가능하다(Jang HJ. J Clin Microbiol, 42:4181-4188, 2004, 김철민 등, 국내특허등록, 제10-0650162호, 2006, 김철민 등, 국내특허등록, 제10-0590901호, 2006).Recently, a microarray capable of attaching a large number of genetic materials using a probe hybridization principle to a support at a high density and simultaneously detecting and analyzing a large number of genes or variants has been spotlighted as a very useful technology. Biochips including microarrays undergo a process of integrating a target probe onto a support using a spotter, hybridization of the target product with the target probe, and analyzing through a scanner. Quality control of many biochip elements that go through this process in biochip manufacturing is very important for biochip manufacturing, and immobilization of probe is a major factor determining quality of biochip. Therefore, in order to obtain reliable results in experiments and diagnostics using biochips, it is necessary to check the quality of the biochips, especially whether the probes are immobilized before the hybridization reaction. In addition, it is possible to precisely control the quality of each biochip and spot by immobilizing the probe containing the target probe and QC probe together on the support for quality control of the biochip production and hybridization process (Jang HJ. J Clin Microbiol, 42 : 4181-4188, 2004, Kim Chul-min et al., Domestic patent registration, No. 10-0650162, 2006, Kim Chul-min et al., Korean patent registration, No. 10-0590901, 2006).
또한, 야생형 또는 변이종만 존재하는 경우와 야생형 및 변이종이 혼합되어 존재하는 경우에 대해 정확한 검출 및 진단을 위해 한 가지 이상의 유형에 대한 혼합 여부와 혼합 정도의 결정과 비특이적 교차 혼성화반응에 의한 배경 측정으로 각 프로브에 대한 양성과 위양성 결과를 구별할 필요성이 있다. 이에 대해, 본 발명자에 의해 개발된 NC 프로브를 이용하여 야생형 및 변이종의 혼합 여부와 양성 및 위양성 결과 구별 가능하였다. 이러한 NC 프로브는 야생형 및 변이종의 혼합 여부 및 보다 많은 유형(major type)과 보다 적은 유형(minor type)의 구별 등에 아주 유용한 방법이다(Jang HJ. J Clin Microbiol, 42:4181-4188(2004), 김철민 등, 국내특허등록, 제10-0650162호(2006)).In addition, to determine the degree of mixing and mixing of one or more types and the background of the nonspecific cross hybridization reaction for accurate detection and diagnosis of wild type or mutant species and mixed wild type and mutant species. There is a need to distinguish positive and false positive results for each probe. In this regard, the NC probe developed by the present inventors was used to distinguish between wild type and mutant species, and positive and false positive results. These NC probes are very useful for mixing wild and mutant species, and for distinguishing between more major and lesser types (Jang HJ. J Clin Microbiol, 42: 4181-4188 (2004), Kim Chul-min et al., Registered a domestic patent, No. 10-0650162 (2006).
이미 본 발명자에 의해 개발된 약제 내성 HBV 검출용 마이크로어레이는 품질관리용 QC 프로브와 NC 프로브를 본 발명에 이용하여 효율적이고 경제적인 마이크로어레이의 품질 관리와 혼합형에 대한 상대량 분석을 가능하도록 하였다.The microarray for drug-resistant HBV detection already developed by the present inventors can use the QC probe and the NC probe for quality control in the present invention to enable efficient and economical quality control of the microarray and relative amount analysis for the mixed type.
[발명의 상세한 설명]DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION [
[기술적 과제][Technical Challenges]
이에 본 발명자들은, 만성 B형 간염 바이러스의 치료를 위한 항바이러스제인 라미부딘, 팜시클로비어, 아데포비어와 엔테카비어에 대한 내성 변이 HBV를 검출하기 위해 각각의 약제 내성 관련 변이형에 특이적으로 혼성화반응 가능한 표적 프로브들을 모두 포함하고 있는 마이크로어레이 및 검출 방법을 개발하고자, 다약제 내성 변이 검출용 표적 프로브, 마이크로어레이의 제작 전과정에 대한 품질 관리를 위한 QC 프로브, 그리고 야생형 및 변이종에 대한 혼합 여부와 혼합형에 대한 상대량 분석, 양성과 위양성 반응 결정을 위한 NC 프로브로 구성되어 한번의 실험으로 다양한 위치에 분포한 라미부딘, 팜시클로비어, 아데포비어와 엔테카비어에 대한 내성 변이를 검출할 수 있는 마이크로어레이 및 이를 이용한 다약제 내성 변이 HBV 검출 및 진단법에 적용하여 경제적이고 신속, 정확, 간편한 검출 키트를 제공할 수 있으며, 이후 추가되는 B형 간염 치료를 위한 항바이러스제 내성 변이종 검출 방법으로 이용 가능하다.Therefore, the present inventors can target hybridization specific to each drug resistance-related variant in order to detect mutations HBV resistant to the antiviral agents lamivudine, famcyclovir, adefovir and entecavir, which are antiviral agents for the treatment of chronic hepatitis B virus. To develop microarrays and detection methods that include all probes, target probes for detecting multidrug resistant mutations, QC probes for quality control of the entire microarray manufacturing process, and mixing and mixing of wild and mutant species A microarray capable of detecting variation in resistance to lamivudine, famciclovir, adefovir and entecavir, which is composed of NC probes for relative quantity analysis, positive and false positive reactions, and distributed at various locations in one experiment. Resistance to HBV Detection and Diagnosis In addition, it is possible to provide an economical, rapid, accurate and simple detection kit, which can then be used as an antiviral resistant variant detection method for the treatment of hepatitis B.
따라서, 본 발명의 목적은 다약제 내성 변이 HBV를 신속, 정확하게 검출할 수 있는 DNA 칩 및 이를 이용한 약제 내성 변이 HBV 검출 방법을 제공하는데 있다.Accordingly, an object of the present invention is to provide a DNA chip capable of quickly and accurately detecting multi-drug resistant variant HBV and a method for detecting drug-resistant variant HBV using the same.
본 발명의 또 다른 목적은 HBV DNA 중합효소의 다양한 위치에 분포한 돌연변이를 최소한의 시료, 반응 시약과 실험적 조작으로 표적 산물을 증폭할 수 있는 방법을 제공하는데 있다.It is still another object of the present invention to provide a method for amplifying a target product with mutations distributed at various positions of HBV DNA polymerase with a minimum of samples, reaction reagents and experimental manipulations.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 본 발명의 마이크로어레이를 이용한 다약제 내성 변이 HBV 검출을 위한 진단키트를 제공하는데 있다.Still another object of the present invention is to provide a diagnostic kit for detecting multi-drug resistant variant HBV using the microarray of the present invention.
본 발명의 또 다른 목적은 QC 프로브를 함유하여 한번의 실험으로 다약제 내성 HBV 검출 및 진단과 마이크로어레이의 프로브 고정화 이후부터 혼성화반응 이후까지의 마이크로어레이에 대한 품질 검사가 용이한 마이크로어레이 및 방법을 제공하는데 있다.It is still another object of the present invention to provide a microarray and a method which contain a QC probe, which facilitates the detection and diagnosis of multi-drug resistant HBV and the quality inspection of the microarray from the immobilization of the microarray to the hybridization reaction in a single experiment. To provide.
본 발명의 또 다른 목적은 각 코돈에 대해 NC 프로브를 제공함으로써, 한 가지 이상의 야생형과 변이형에 대한 혼합 여부 및 혼합형에 대한 상대량 분석, 표적 산물과의 비특이적 교차 혼성화반응에 의한 양성 및 위양성 반응 결정과 동형 접합체와 이형 접합체 등의 양상의 결정, 및/또는 유전자형 확정을 가능하게 하는 마이크로어레이를 제공하는 데 있다.It is yet another object of the present invention to provide an NC probe for each codon, such as mixing of one or more wild type and variants and relative mass analysis for mixed types, positive and false positive reactions by nonspecific cross hybridization with the target product. The present invention provides a microarray that enables crystallization and / or determination of aspects such as homozygotes and heterozygotes, and / or genotyping.
[기술적 해결방법][Technical Solution]
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1 내지 4 중 어느 하나의 염기서열이나 이에 상보적인 염기서열을 포함하는 B형 간염 바이러스(HBV)의 DNA 중합효소 유전자 증폭을 위한 올리고뉴클레오티드를 제공한다. 상기 올리고뉴클레오티드는 HBV의 DNA 중합효소 유전자의 PCR 증폭을 위한 프라이머로 사용될 수 있다.In order to achieve the object of the present invention, the present invention provides an oligonucleotide for DNA polymerase gene amplification of hepatitis B virus (HBV) comprising the nucleotide sequence of any one of SEQ ID NOs: 1 or 4 to provide. The oligonucleotide may be used as a primer for PCR amplification of the DNA polymerase gene of HBV.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 5 내지 40 중 어느 하나의 염기서열이나 이에 상보적인 염기서열을 포함하는 B형 간염 바이러스의 약제 내성을 검출하기 위한 올리고뉴클레오티드를 제공한다. 상기 올리고뉴클레오티드는 약제 내성을 갖는 B형 간염 바이러스를 검출하기 위한 표적 프로브로 사용될 수 있다.In order to achieve another object of the present invention, the present invention provides an oligonucleotide for detecting the drug resistance of hepatitis B virus comprising a nucleotide sequence of any one of SEQ ID NO: 5 to 40 or complementary thereto. The oligonucleotide can be used as a target probe for detecting hepatitis B virus with drug resistance.
본 발명에 한 구체적인 양태에 있어서, 본 발명은 서열번호 7 내지 9, 서열번호 10 내지 12, 서열번호 23 내지 31 중 어느 하나의 염기서열이나 이에 상보적인 염기서열을 포함하는 라미부딘 내성 변이 HBV의 특이적 검출을 위한 올리고뉴클레오티드를 제공한다. 상기 올리고뉴클레오티드는 라미부딘 내성을 유도하는 HBV DNA 중합효소 유전자의 코돈 173, 180 또는 204 부위의 돌연변이 염기서열을 포함한다.In a specific embodiment of the present invention, the present invention provides the specificity of lamivudine resistant variant HBV comprising the nucleotide sequence of any one of SEQ ID NOS: 7-9, SEQ ID NOs: 10-12, SEQ ID NOs: 23-31 or complementary thereto Oligonucleotides are provided for redundancy detection. The oligonucleotide comprises a mutant sequence of the codon 173, 180 or 204 region of the HBV DNA polymerase gene that induces lamivudine resistance.
본 발명에 한 구체적인 양태에 있어서, 본 발명은 서열번호 13 내지 16과 서열번호 32 내지 35 중 어느 하나의 염기서열이나 이에 상보적인 염기서열을 포함하는 아데포비어 내성 변이 HBV의 특이적 검출을 위한 올리고뉴클레오티드를 제공한다.In a specific embodiment of the present invention, the present invention is an oligonucleotide for the specific detection of adefovir resistant mutant HBV comprising the nucleotide sequence of any one of SEQ ID NO: 13-16 and SEQ ID NO: 32-35 or complementary thereto To provide.
상기 올리고뉴클레오티드는 아데포비어 내성을 유도하는 HBV DNA 중합효소 유전자의 코돈 181 또는 236 부위의 돌연변이 염기서열을 포함한다.The oligonucleotide comprises a mutant sequence of the
본 발명의 한 구체적인 양태에 있어서, 본 발명은 서열번호 5 내지 6, 서열번호 10 내지 12, 서열번호 17 내지 22, 서열번호 23 내지 28과 서열번호 36 내지 37 중 어느 하나의 염기서열이나 이에 상보적인 염기서열을 포함하는 엔테카비어 내성 변이 HBV의 특이적 검출을 위한 올리고뉴클레오티드를 제공한다. 상기 올리고뉴클레오티드는 엔테카비어 내성을 유도하는 HBV DNA 중합효소 유전자의 코돈 169, 180, 184, 202, 204 또는 250 부위의 돌연변이 염기서열을 포함한다.In one specific embodiment of the present invention, the present invention is the base sequence of any one of SEQ ID NO: 5 to 6, SEQ ID NO: 10 to 12, SEQ ID NO: 17 to 22, SEQ ID NO: 23 to 28 and SEQ ID NO: 36 to 37 or complementary thereto Provided is an oligonucleotide for specific detection of entecavir resistant mutant HBV comprising a base sequence. The oligonucleotide comprises a mutant sequence of the
본 발명의 한 구체적인 양태에 있어서, 본 발명은 서열번호 38 내지 40 중 어느 하나의 염기서열이나 이에 상보적인 염기서열을 포함하는 팜시클로비어 내성 변이 HBV의 특이적 검출을 위한 올리고뉴클레오티드를 제공한다.In one specific embodiment of the present invention, the present invention provides oligonucleotides for specific detection of famciclovir-resistant mutant HBV comprising the nucleotide sequence of any one of SEQ ID NOs: 38 to 40 or complementary thereto.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 올리고뉴클레오티드 중 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 약제 내성 변이 HBV 검출을 위한 라미부딘 내성 변이 특이적 및 아데포비어 내성 변이 특이적 프로브 세트를 제공한다.In order to achieve another object of the present invention, the present invention provides a lamivudine resistance mutation specific and adefovir resistance mutation specific probe set for the detection of drug resistance mutation HBV comprising one or more of the oligonucleotides.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 올리고뉴클레오티드 중 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 약제 내성 변이 HBV 검출을 위한 라미부딘 내성 변이 특이적 및 엔테카비어 내성 변이 특이적 프로브 세트를 제공한다.In order to achieve another object of the present invention, the present invention provides a lamivudine-resistant variant specific and entecavir-resistant variant-specific probe set for the detection of drug-resistant variant HBV comprising one or more of the oligonucleotides.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 올리고뉴클레오티드 중 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 약제 내성 변이 HBV 검출을 위한 라미부딘 내성 변이 특이적 및 팜시클로비어 내성 변이 특이적 프로브 세트를 제공한다.In order to achieve another object of the present invention, the present invention provides a lamivudine-resistant variant specific and famcyclovir-resistant variant-specific probe set for the detection of drug resistance variant HBV comprising one or more of the oligonucleotides.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 올리고뉴클레오티드 중 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 약제 내성 변이 HBV 검출을 위한 아데포비어 내성 변이 특이적 및 엔테카비어 내성 변이 특이적 프로브 세트를 제공한다.In order to achieve another object of the present invention, the present invention provides a set of adefovir resistant mutation-specific and entecavir-resistant mutation-specific probes for the detection of drug resistance mutation HBV comprising one or more of the oligonucleotides.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 올리고뉴클레오티드 중 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 약제 내성 변이 HBV 검출을 위한 아데포비어 내성 변이 특이적 및 팜시클로비어 내성 변이 특이적 프로브 세트를 제공한다.In order to achieve another object of the present invention, the present invention provides a set of adefovir resistant mutation-specific and famcyclovir-resistant mutation-specific probes for the detection of drug-resistant variants HBV comprising one or more of the oligonucleotides.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 올리고뉴클레오티드 중 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 약제 내성 변이 HBV 검출을 위한 엔테카비어 내성 변이 특이적 및 팜시클로비어 내성 변이 특이적 프로브 세트를 제공한다.In order to achieve another object of the present invention, the present invention provides a set of entecavir-resistant and specific famciclovir-resistant mutations for the detection of drug-resistant variants HBV comprising one or more of the oligonucleotides.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 올리고뉴클레오티드 중 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 약제 내성 변이 HBV 검출을 위한 라미부딘, 아데포비어, 및 엔테카비어 내성 변이 특이적 프로브 세트를 제공한다. 본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 올리고뉴클레오티드 중 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 약제 내성 변이 HBV 검출을 위한 라미부딘, 아데포비어, 및 팜시클로비어 내성 변이 특이적 프로브 세트를 제공한다.To achieve another object of the present invention, the present invention provides a set of lamivudine, adefovir, and entecavir resistance specific probes for the detection of drug resistance mutation HBV comprising one or more of the oligonucleotides. In order to achieve another object of the present invention, the present invention provides a set of lamivudine, adefovir, and famciclovir-resistant mutation-specific probes for the detection of drug-resistant variant HBV comprising one or more of the oligonucleotides.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 올리고뉴클레오티드 중 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 약제 내성 변이 HBV 검출을 위한 라미부딘, 엔테카비어, 및 팜시클로비어 내성 변이 특이적 프로브 세트를 제공한다.In order to achieve another object of the present invention, the present invention provides a set of lamivudine, entecavir, and famcyclovir resistance specific probes for the detection of drug resistance variant HBV comprising at least one oligonucleotide of the oligonucleotides.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 올리고뉴클레오티드 중 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 약제 내성 변이 HBV 검출을 위한 라미부딘, 아데포비어, 엔테카비어, 및 팜시클로비어 내성 변이 특이적 프로브 세트를 제공한다.In order to achieve another object of the present invention, the present invention provides a lamivudine, adefovir, entecavir, and famciclovir resistance variant specific probe set for the detection of drug resistance mutation HBV comprising one or more of the oligonucleotides. .
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 B형 간염 바이러스(HBV)의 DNA 중합효소 유전자의 점돌연변이 부위에 정상(wild type)과 돌연변이(mutant)의 염기를 제외한 나머지 염기 또는 비염기물질을 위치시켜 디자인된 올리고뉴클레오티드로서, 야생형과 변이형의 혼합 유무 및 혼합형에 대한 상대량 분석과 혼성화반응결과에 대한 양성과 위양성 결과 구별을 위한 음성조절(NC) 프로브를 제공한다. 상기 비염기물질은 A,G,C,T가 아닌 3'nitropyrrole과 같은 비염기화합물을 의미한다.In order to achieve the other object of the present invention, the present invention is a base or non-base material except the base of the wild type and mutant in the point mutation region of the DNA polymerase gene of hepatitis B virus (HBV) The oligonucleotides are designed to provide a negative control (NC) probe for distinguishing between positive and false positive results for hybridization and relative amount analysis and hybridization results for the presence and absence of wild and mutant mixtures. The non-base material means a non-base compound such as 3'nitropyrrole, not A, G, C, or T.
본 발명의 한 구체적인 양태에 있어서, 바람직하게는 상기 음성조절 프로브는 서열번호 41 내지 56의 염기서열이나 이에 상보적인 염기서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 한다.In one specific embodiment of the invention, preferably the negative control probe is characterized in that it comprises an oligonucleotide comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 41 to 56 or a base sequence complementary thereto.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 상기와 같은 본 발명의 마이크로어레이를 이용하여 점돌연변이 검출과 homoplsamy와 heteroplasmy의 구별 중 하나 이상을 동시에 수행하는 것을 특징으로 하는 검출 방법을 제공한다.In order to achieve the another object of the present invention, the present invention provides a detection method characterized in that at the same time using the microarray of the present invention performs one or more of the point mutation detection and the distinction between homoplsamy and heteroplasmy.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 B형 간염 약제의 내성 변이의 특이적 검출을 위한 올리고뉴클레오티드 중 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 진단 키트를 제공한다.In order to achieve another object of the present invention, the present invention provides a diagnostic kit comprising one or more oligonucleotides of the oligonucleotides for the specific detection of resistance variants of the hepatitis B agent.
본 발명의 진단 키트에서, 상기 올리고뉴클레오티드는 방사성(radioactive) 또는 비방사성(non-radioactive) 표지될 수 있으며, 비방사성 표지는 통상의 바이오틴(biotin), Dig(digoxigenin), FRET(fluorescence resonance energy transfer), 형광(Cy5, Cy3 등)표지 등을 포함한다. 또한, 상기 올리고뉴클레오티드는 프라이머 또는 프로브로 사용될 수 있으며, 별도의 표적 DNA 증폭을 위한 프라이머가 포함될 수 있다.In the diagnostic kit of the present invention, the oligonucleotide may be radioactive or non-radioactive label, the non-radioactive label is a conventional biotin, Dig (digoxigenin), fluorescence resonance energy transfer ), Fluorescent (Cy5, Cy3, etc.) labels, and the like. In addition, the oligonucleotide may be used as a primer or a probe, and may include a primer for amplifying a separate target DNA.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 B형 간염 약제에 대한 내성 변이 검출을 위한 올리고뉴클레오티드를 프로브로 이용하여 이를 지지체에 부착하여 포함하는 마이크로어레이를 제공한다.In order to achieve another object of the present invention, the present invention provides a microarray comprising an oligonucleotide for detecting a mutation resistance to hepatitis B drug as a probe and attached to the support.
본 발명의 마이크로어레이에서, 상기 프로브는 상기 음성 조절 프로브 및/또는 마이크로어레이의 품질관리용 QC프로브를 더 포함할수도 있다. 상기 QC프로브(김철민 등, 국내특허등록, 제10-0590901호(2006), Jang HJ, et al., J Clin Microbiol., 42:4181-4188(2004), 김철민 등, 국내특허등록, 제10-0650162호, (2006))는 표적산물의 염기서열과 서로 상보적인 서열을 가지거나 또는 임의 염기서열을 가지는 올리고뉴클레오티드에 형광물질을 표지하되, 상기 형광물질은 표적산물에 표지된 형광물질과는 다른 여기/방출(excitation/emission) 파장을 가지는 것임을 특징으로 한다. 이로써, 표적 프로브와 표적 산물과의 혼성화 반응 전 또는 후에 상기 형광물질에서 발생하는 형광신호를 스캐닝함으로써 표적 프로브와의 상호 간섭(spectral interference)없이 지지체에 고정된 프로브 각각에 대한 고정화 여부와 고정화된 프로브의 모양과 농도 등에 대한 검증, 표적 프로브와 표적 산물의 결합 반응 또는 혼성화 반응에 대한 검증이 가능하다.In the microarray of the present invention, the probe may further include a voice control probe and / or a QC probe for quality control of the microarray. The QC probe (Kim Chul Min et al., Domestic patent registration, No. 10-0590901 (2006), Jang HJ, et al., J Clin Microbiol., 42: 4181-4188 (2004), Kim Chul Min et al., Domestic patent registration, No. 10 -0650162, (2006)) label a fluorescent substance on an oligonucleotide having a sequence complementary to each other or a base sequence of a target product, wherein the fluorescent substance is different from the fluorescent substance labeled on the target product. It is characterized in that it has a different excitation / emission wavelength. Thus, by scanning the fluorescence signal generated by the fluorescent material before or after the hybridization reaction between the target probe and the target product, whether the immobilization and immobilization of each of the probes immobilized on the support without spectral interference with the target probe It is possible to verify the shape and concentration of, and to verify the binding reaction or hybridization reaction between the target probe and the target product.
본 발명의 마이크로어레이에 있어서, 상기 프로브는 데옥시뉴클레오티드(DNA), 리보뉴클레오티드(RNA) 같은 전통적인 핵산뿐만 아니라, 펩타이드뉴클레오티드(PNA), 락크드뉴클레오티드(LNA) 및 디-헥시톨뉴클레오티드(HNA)에서 선택된 핵산유사체도 될 수 있다. 상기 핵산유사체는 핵산분해효소(nuclease)등 효소에 안정하고, 구조상으로 염기서열에 매우 특이적 결합을 하며, 열에 안정적인 장점이 있다. 즉, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 표적 서열과 혼성화할 수 있는 그 염기서열에 특징이 있으므로, 상기 염기서열과 동일한 염기서열을 가지는 한 상기 핵산유사체를 포함하는 개념으로 이해되어야 한다.In the microarray of the present invention, the probes are not only traditional nucleic acids such as deoxynucleotides (DNA), ribonucleotides (RNA), but also peptide nucleotides (PNA), lacquered nucleotides (LNA) and di-hexitol nucleotides (HNA). It may also be a nucleic acid analog selected from. The nucleic acid analog is stable to enzymes such as nucleases, has a very specific binding to a nucleotide sequence in structure, and has a heat stable advantage. That is, since the oligonucleotide of the present invention is characterized by its base sequence capable of hybridizing with the target sequence, it should be understood that the oligonucleotide includes the nucleic acid analogue as long as it has the same base sequence as the base sequence.
본 발명의 마이크로어레이에 있어서, 상기 프로브는 센스(sense) 또는 안티센스(antisense)용으로 제작될 수 있다. 따라서 상기 올리고뉴클레오티드는 상기 서열번호들의 염기서열 또는 이에 상보적인 서열을 가질 수 있다.In the microarray of the present invention, the probe may be manufactured for sense or antisense. Therefore, the oligonucleotide may have a nucleotide sequence of the sequence numbers or a sequence complementary thereto.
본 발명의 마이크로어레이에 있어서, 상기 지지체는 슬라이드글라스, 플라스틱, 멤브레인, 반도체 칩(semiconductive chip), 실리콘, 젤(gel), 나노(nano) 재료, 세라믹, 금속재료, 광섬유 또는 이들을 조합하여 만들어지는 것을 특징으로 한다.In the microarray of the present invention, the support is made of slide glass, plastic, membrane, semiconductor chip, silicon, gel, nano material, ceramic, metal material, optical fiber or a combination thereof. It is characterized by.
본 발명의 마이크로어레이는 당 업계에 알려진 통상의 핀 마이크로어레이(pin microarray) (McQuain MK, et al., Anal Biochem., 320:281-91, 2003), 잉크젯(ink jet) (Okamoto T, et al., Nat Biotechnol., 18;438-441, 2000), 포토리소그래피(photolithography) (Lipshutz RJ, et al., Nat Genet., 21:20-24, 1999), 또는 전기어레이(electronic array) (Sosnowski R, et al., Psychiatr Genet., 12:181-192, 2002) 방법 등으로 제작될 수 있다.The microarrays of the present invention are conventional pin microarrays known in the art (McQuain MK, et al., Anal Biochem., 320: 281-91, 2003), ink jet (Okamoto T, et. al., Nat Biotechnol ., 18; 438-441, 2000), photolithography (Lipshutz RJ, et al., Nat Genet., 21: 20-24, 1999), or electronic arrays ( Sosnowski R, et al., Psychiatr Genet ., 12: 181-192, 2002).
본 발명의 마이크로어레이는 진단키트의 형태로 제공될 때, 본 발명의 마이크로어레이 외에 표적 DNA를 분리하기 위한 추출용 시약, 표적유전자를 증폭하기 위한 프라이머가 포함된 PCR 키트, 혼성화 반응용액, 비혼성화 반응 DNA 세척용 용액, 커버슬립, 염료, 비염료 결합 세척용 용액 및 사용설명서 등을 더 포함할 수 있다.When the microarray of the present invention is provided in the form of a diagnostic kit, in addition to the microarray of the present invention, an extraction reagent for separating target DNA, a PCR kit including a primer for amplifying a target gene, a hybridization reaction solution, and a hybridization Reaction DNA washing solution, coverslip, dye, non-dye binding washing solution and instructions for use may be further included.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 시료에 존재하는 핵산을 분리하는 단계, 상기 분리된 핵산 중 표적 DNA를 증폭하는 단계, 상기 증폭된 DNA를 마이크로어레이 상의 프로브와 혼성화반응 시키는 단계, 및 상기 형성된 하이브리드의 시그날을 검출하는 단계를 포함하는 검출 방법을 제공한다. 상기 검출방법에 있어서, 본 발명자가 개발한 품질관리용 QC 프로브를 사용함으로써 마이크로어레이의 혼성화 반응 전후 모든 과정에서의 품질관리가 가능하다.In order to achieve another object of the present invention, the present invention comprises the steps of separating the nucleic acid present in the sample, amplifying the target DNA of the separated nucleic acid, hybridizing the amplified DNA with a probe on a microarray, And it provides a detection method comprising the step of detecting the signal of the formed hybrid. In the above detection method, quality control in all processes before and after the hybridization reaction of the microarray is possible by using the QC probe for quality control developed by the inventor.
본 발명의 검출 방법에 있어서, 상기 표적 DNA를 증폭하는 단계는 일반적인 PCR 반응뿐만 아니라, Hot-start PCR, Nested PCR, Multiplex PCR, RT-PCR(reverse transcriptase PCR), DOP(degenerate oligonucleotide primer) PCR, Quantitative RT-PCR, In-Situ PCR, Micro PCR, 또는 Lab-on a chip PCR 반응과 같은 변형된 PCR 반응과 RCA(rolling circle amplification) 등의 등온증폭(isothermal amplification)방법을 이용할 수도 있다.In the detection method of the present invention, the step of amplifying the target DNA, as well as a general PCR reaction, Hot-start PCR, Nested PCR, Multiplex PCR, reverse transcriptase PCR (RT-PCR), degenerate oligonucleotide primer (DOP) PCR, Modified PCR reactions such as Quantitative RT-PCR, In-Situ PCR, Micro PCR, or Lab-on a chip PCR reactions, and isothermal amplification methods such as rolling circle amplification (RCA) can also be used.
또한 위의 증폭단계를 거치거나 또는 거치지 않고 tyramide signal amplification(Nucleic Acids Res. 30;e4(2002))이나 gold nanoparticle probe와 Raman-active dye(Science, 297;1536-1540(2002)),.branched DNA와 같은 probe amplification과 signal amplification 반응을 이용할 수도 있다.Also, with or without the above amplification step, tyramide signal amplification (Nucleic Acids Res. 30; e4 (2002)) or gold nanoparticle probes and Raman-active dyes (Science, 297; 1536-1540 (2002)) ,. branched Probe amplification and signal amplification reactions such as DNA can also be used.
본 발명의 방법에서, 핵산의 분리는 통상의 DNA 또는 RNA 분리방법이나 키트를 사용하여 수행될 수 있으며, DNA 증폭은 통상의 PCR 방법으로 수행될 수 있으며, PCR 검출 방법은 통상의 아가로즈 겔을 이용하여 전기영동 분석 방법으로 수행하거나, 마이크로어레이 시그날 검출은 통상의 Cy5 또는 Cy3 등 형광 염료 결합 및 시그날 검출용 스캐너를 이용하여 수행될 수 있다.In the method of the present invention, nucleic acid separation may be performed using conventional DNA or RNA separation methods or kits, DNA amplification may be performed by conventional PCR methods, and PCR detection methods may be performed using conventional agarose gels. By using an electrophoretic analysis method, or microarray signal detection may be performed using a conventional fluorescent dye binding and signal detection scanner such as Cy5 or Cy3.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 라미부딘, 아데포비어, 엔테카비어 내성 변이 HBV를 포함한 돌연변이에 의한 약제 내성 변이 HBV 검출방법과 이를 이용한 진단법 및 진단키트를 제공한다.In order to achieve another object of the present invention, the present invention provides a method for detecting drug resistance mutation HBV by a mutation including a lamivudine, adefovir, entecavir resistance mutation HBV, and a diagnostic method and diagnostic kit using the same.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위해, 본 발명의 마이크로어레이를 이용하여 한번의 반응으로 하나의 마이크로어레이를 이용하여 다양한 위치에 분포한 다수의 내성 변이를 동시에 검출, 마이크로어레이의 제작 및 실험 전과정에 대한 품질관리, 및 한 가지 이상의 다른 유형에 대한 혼합 여부와 상대량 분석, 비특이적 교차 혼성화반응에 의한 양성과 위양성 프로브의 검출, 및 또는 homoplasamy와 heteroplasmy의 구별 중 하나 이상을 동시에 수행하는 것을 특징으로 하는 검출 방법을 제공한다.
In order to achieve the other object of the present invention, by using a microarray of the present invention in a single reaction using a single microarray at the same time a plurality of resistance mutations distributed in various positions, the fabrication of the microarray and the entire experiment Quality control, and mixing and relative mass analysis of one or more other types, detecting positive and false positive probes by nonspecific cross hybridization, or distinguishing between homoplasamy and heteroplasmy simultaneously. A detection method is provided.
본 발명을 더욱 구체적으로 설명하면 다음과 같다.The present invention is explained in more detail as follows.
본 발명은 지지체에 부착된 약제 내성 변이 HBV를 검출하기 위한 표적 프로브와 마이크로어레이의 품질관리를 위한 QC 프로브 및 야생형과 변이종의 혼합 여부(homoplasmy 또는 heteroplasmy) 및 상대량 분석을 위한 NC 프로브를 함유하는 마이크로어레이 및 이를 이용한 다약제 내성 변이 HBV 검출 및 진단법에 관한 것으로 자세하게는 하기 단계로 구성된다. :The present invention includes a target probe for detecting drug-resistant mutant HBV attached to a support, a QC probe for quality control of a microarray, and an NC probe for mixing (homoplasmy or heteroplasmy) and relative amount analysis of wild type and mutant species. The microarray and the multi-drug resistant mutation HBV detection and diagnostic method using the same are described in detail with the following steps. :
(i) 필요한 경우, 시료에서 HBV DNA의 분리,(i) if necessary, isolation of HBV DNA from the sample,
(ii) 필요한 경우, 표 1의 적합한 프라이머 쌍으로 DNA 중합효소 유전자 일부를 증폭,(ii) if necessary, amplify a portion of the DNA polymerase gene with suitable primer pairs in Table 1,
(iii) 단계 (i) 및/또는 (ii)에서 확보된 표적 산물과, 표 2와 표 3에 나타낸 약제 내성 변이 검출용 올리고뉴클레오티드 및 NC 프로브 즉, 프로브 서열, 프로브 역서열 또는 프로브 상보 서열로 반응할 수 있는 하나 이상의 프로브와의 혼성화반응,(iii) with the target product obtained in steps (i) and / or (ii) and the oligonucleotides and NC probes for detecting drug resistance mutations shown in Tables 2 and 3, ie probe sequences, probe inverse sequences or probe complement sequences Hybridization with one or more probes capable of reacting,
(iv) 단계 (iii)에서 형성된 하이브리드의 검출,(iv) detecting the hybrid formed in step (iii),
(v) 단계 (iv)에서 얻은 혼성화반응 시그날로부터, 상기 약제 내성 변이형 검출 및 이와 관련한 약제 내성 HBV 진단 가능성에 관한 추정.(v) From the hybridization signal obtained in step (iv) the estimation of the drug resistance variant and the likelihood of diagnosis of drug resistance HBV associated therewith.
마이크로어레이의 바람직한 구현 예에서 본 발명은, 단계 (iii)에서 지지체 위 각각의 스팟에 표적 프로브와 형광물질이 표지된 QC 프로브를 함께 혼합하여 함유하고, NC 프로브와 QC 프로브를 혼합하여 이를 한 세트로 하여 다수의 세트를 포함하는 것을 특징으로 한다. 보다 자세하게는, 동시에 라미부딘, 팜시클로비어, 아데포비어와 엔테카비어 내성 변이를 검출할 수 있으며, 이를 동일한 혼성화반응 및 세척 조건하에서, 상기 프로브들이 그들의 표적 부위들에 동시에 혼성화반응하도록 최적화된 것을 특징으로 한다.In a preferred embodiment of the microarray, the present invention, in step (iii), contains a target probe and a fluorescently labeled QC probe together at each spot on the support, and mixes the NC probe and the QC probe and sets it. It characterized in that it comprises a plurality of sets. More specifically, it is possible to simultaneously detect lamivudine, famcyclovir, adefovir and entecavir resistant variations, which are optimized to simultaneously hybridize to their target sites under the same hybridization and washing conditions.
상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명의 마이크로어레이의 하나의 지지체에는 커버씰을 이용하여 단 1회 실험으로 다수의 검체로부터 동시에 약제 내성 변이 검출 및 이를 이용한 약제 내성 HBV 진단이 가능한 것을 특징으로 한다.In order to achieve the above object, one support of the microarray of the present invention is capable of detecting drug resistance mutations from a plurality of specimens simultaneously and diagnosing drug resistance HBV using the same in only one experiment using a cover seal.
또한 임상 검체의 경우, 혈청에 포함된 HBV 카피(copy)가 다량으로 존재시 형광 표지된 프라이머에 의한 1회 PCR 반응을 통해 표적 산물을 확보하며, 소량의 HBV 카피로 존재시에 대해 nested PCR을 통해 프로브와 반응 되도록 표적 산물을 증폭하는 것을 특징으로 한다.In the case of clinical specimens, in the presence of a large amount of HBV copy contained in the serum (copy), the target product is secured by a single PCR reaction with a fluorescently labeled primer, and nested PCR is performed for the presence of a small amount of HBV copy. Amplifying the target product to react with the probe through.
도 1은 본 발명의 실시 예의 다약제 내성 B형 간염 바이러스 검출을 위한 라미부딘, 아데포비어, 엔테카비어와 팜시클로비어 내성 검출용 프로브를 한 세트로 하는 마이크로어레이의 도면이다.
도 2는 제작된 마이크로어레이의 품질관리를 위한 QC 프로브에 대한 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 모든 약제의 표적 코돈에 대해 야생형으로 확인된 약제 감수성 HBV에 대한 반응결과이다.
도 4는 엔테카비어 약제 내성을 검출하기 위한 코돈 169번의 변이형(rtI169T)에 대한 반응 결과를 나타낸다.
도 5는 라미부딘과 엔테카비어 약제 내성을 검출하기 위한 코돈 173번, 코돈 180번과 코돈 204의 변이형(rtV173L, rtL180과 rtM204V)에 대한 반응 결과를 나타낸다.
도 6은 아데포비어 약제 내성을 검출하기 위한 코돈 181번의 변이형(rtA181V)에 대한 혼성화반응 결과이다.
도 7은 엔테카비어 약제 내성을 검출하기 위한 코돈 184번의 변이형(rtT184S)에 대한 혼성화반응 결과이다.
도 8은 라미부딘과 엔테카비어 약제 내성을 검출하기 위한 코돈 204번의 변이형(rtM204I)에 대한 혼성화반응 결과이다.
도 9는 라미부딘 약제 내성을 검출하기 위한 코돈 204번의 변이형(rtM204S)에 대한 혼성화반응 결과이다.
도 10은 아데포비어 약제 내성을 검출하기 위한 코돈 236번의 변이형(rtN236T)에 대한 혼성화반응 결과이다.
도 11은 엔테카비어 약제 내성을 검출하기 위한 코돈 250번의 변이형(rtM250V)에 대한 혼성화반응 결과이다.
도 12는 팜시클로비어 약제 내성을 검출하기 위한 코돈 207번의 변이형(rtV207I)에 대한 혼성화반응 결과이다.BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS Fig. 1 is a diagram of a microarray comprising a set of lamivudine, adefovir, entecavir and famciclovir resistance detection probes for the detection of multi-drug resistant hepatitis B virus according to an embodiment of the present invention.
Figure 2 shows the analysis results for the QC probe for quality control of the fabricated microarray.
Figure 3 shows the response of the drug-sensitive HBV identified as wild type against the target codon of all drugs.
4 shows the results of response to variant (rtI169T) of codon 169 to detect entercavir drug resistance.
Figure 5 shows the results of response to the variants (rtV173L, rtL180 and rtM204V) of codons 173, codon 180 and codon 204 to detect lamivudine and entecavir drug resistance.
Figure 6 shows the results of hybridization for variant (rtA181V) of
Figure 7 shows the hybridization results for variant (rtT184S) of codon 184 to detect entercavir drug resistance.
Figure 8 shows the hybridization results for variant (rtM204I) of codon 204 to detect lamivudine and entecavir drug resistance.
9 shows hybridization results for variant (rtM204S) of codon 204 to detect lamivudine drug resistance.
10 shows hybridization results for variant (rtN236T) of codon 236 to detect adefovir drug resistance.
Figure 11 shows the hybridization results for variant (rtM250V) of codon 250 to detect entercavir drug resistance.
12 shows hybridization results for variant (rtV207I) of codon 207 to detect famciclovir drug resistance.
[발명의 실시를 위한 형태][Mode for Carrying Out the Invention]
이하, 실시 예를 기초로 하여 본 발명을 더욱 상세히 설명한다. 단, 이들 실시 예는 본 발명의 예시일 뿐, 본 발명의 범위가 이들 만으로 제한되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail based on examples. However, these examples are only illustrative of the present invention, and the scope of the present invention is not limited thereto.
실시 예 1 : DNA 분리Example 1 DNA Separation
본 발명에서 사용된 HBV의 DNA는 만성 B형 간염 환자의 혈액으로부터 분리된 것으로, 라미부딘을 복용 6개월 미만의 내성이 발생하지 않은 환자의 혈청으로부터 분리(도 3)된 것과 1년 이상의 장기간 복용중인 환자 혈청으로부터 분리(도 5, 도 8, 도 9), 아데포비어를 복용중인 환자 혈청으로부터 분리(도 6과 도 10)된 것과 엔테카비어를 복용중인 환자의 혈청으로부터 분리(도 4, 도 7, 도 11) 하였다. B형 간염 환자로부터 채혈한 혈액은 즉시 냉장 보관하여 한 시간 동안 혈액응고 후, 3000 rpm에서 5분간 혈청을 원심분리하였다. 확보된 혈청은 -70℃에서 보관하였으며, 이들의 DNA를 추출하기 위해서는 QIAamp DNA Blood Mini Kit(QIAGEN Inc., CA, USA)를 사용하였다. 키트를 이용하여 혈청에서 최종적으로 200 ㎕의 HBV DNA를 확보하였다. 이를 PCR 반응의 주형 DNA로 사용하였다. 분리된 DNA는 DNA chip과의 결과 비교를 위해 염기서열분석을 진행하였으며, 모두 정확히 일치 하였다.The DNA of HBV used in the present invention was isolated from the blood of patients with chronic hepatitis B, isolated from the sera of patients who did not develop resistance less than 6 months of taking lamivudine (FIG. 3), and long-term administration of 1 year or more. 5, 8, and 9 from the patient serum, from the serum of the patient taking adefovir (FIGS. 6 and 10) and from the serum of the patient taking entecavir (FIGS. 4, 7, 7, 11). ). Blood collected from hepatitis B patients was immediately refrigerated and coagulated for one hour, and then centrifuged for 5 minutes at 3000 rpm. The obtained serum was stored at -70 ℃, and to extract their DNA was used QIAamp DNA Blood Mini Kit (QIAGEN Inc., CA, USA). The kit was used to finally obtain 200 μl of HBV DNA in serum. This was used as template DNA of the PCR reaction. The separated DNA was subjected to sequencing to compare the results with the DNA chip, and all were exactly identical.
실시 예 2 : 프로브 고안Example 2 Probe Design
본 발명에서 HBV의 DNA 중합효소 유전자의 증폭을 위한 올리고뉴클레오티드는 표 1의 서열번호 1 내지 4와 같다. 약제 내성 변이 검출을 위한 프로브는 5' 말단에 Amino-Modifier C6-15개의 염기를 갖는 길이의 dT 스페이서 및 15-25개의 염기서열을 갖는 프로브를 합성하여 PAGE 정제하여 제작하였다. 본 발명에서 제작된 표적 프로브는 표2의 서열번호 5 내지 40과 같다.Oligonucleotides for amplification of the DNA polymerase gene of HBV in the present invention are shown in SEQ ID NOs: 1 to 4. A probe for detecting drug resistance mutations was prepared by synthesizing a PAGE purification by synthesizing a probe having a length of 5T terminal with an amino-Modifier C6-15 base and a 15-25 base sequence. The target probe prepared in the present invention is shown in SEQ ID NO: 5 to 40 in Table 2.
표 1에서, 서열번호 1 내지 2는 1차 PCR을 바깥쪽 프라이머(outer primer)이며, 서열번호 3 내지 4는 바이오틴이 표지된 프라이머로서 2차 PCR을 위한 안쪽 프라이머(inner primer)로 이용하였다.In Table 1, SEQ ID Nos. 1 to 2 are primary primers as outer primers, and
표 2의 서열번호 5 내지 40은 약제 내성 변이 검출용 표적 프로브로서, 라미부딘, 팜시클로비어, 아데포비어와 엔테카비어 내성 변이 검출을 위한 프로브들이다.SEQ ID NOs: 5 to 40 in Table 2 are target probes for detecting drug resistance mutations, and probes for detection of lamivudine, famcyclovir, adefovir, and entecavir resistance mutations.
실시 예 3 : 형광 염료로 표지된 QC 프로브 제작Example 3: Preparation of QC Probe Labeled with Fluorescent Dye
본 발명자가 직접 개발하여 이미 특허등록(김철민 등, 국내특허등록, 제10-0590901호(2006), Jang HJ, et al., J Clin Microbiol., 42:4181-4188(2004), 김철민 등, 국내특허등록, 제10-0650162호(2006))한 QC 프로브를 본 실험에 사용하였다.The inventors have already developed and registered patents (Kim Chul Min et al., Korean patent registration, No. 10-0590901 (2006), Jang HJ, et al., J Clin Microbiol ., 42: 4181-4188 (2004), Kim Chul Min et al., Korean Patent Registration No. 10-0650162 (2006)) QC probe was used in this experiment.
실시 예 4 : NC 프로브 제작Example 4 NC Probe Fabrication
본 발명에 사용된 음성조절 프로브의 디자인은 본 발명자가 직접 개발하여 이미 특허등록(김철민 등, 국내특허등록, 제10-0650162호(2006), Jang HJ, et al., J Clin Microbiol., 42:4181-4188(2004))한 발명 내용을 참고로 하였다.The design of the voice control probe used in the present invention has been developed by the present inventors and already registered a patent (Kim Chul-min et al., Korean patent registration, No. 10-0650162 (2006), Jang HJ, et al., J Clin Microbiol., 42 : 4181-4188 (2004)).
표 3의 서열번호 41 내지 56은 각 표적 코돈에 대한 NC 프로브로서, 서열번호 41 내지 42는 rt169 변이에 대한 NC 프로브, 서열번호 43은 rt173에 대한 NC 프로브, 서열번호 44은 rt1180에 대한 NC 프로브, 서열번호 45 내지 46은 rt181에 대한 NC 프로브, 서열번호 47 내지 48은 rt184에 대한 NC 프로브, 서열번호 49는 rt202에 대한 NC 프로브, 서열번호 50 내지 52는 rt204에 대한 NC 프로브, 서열번호 53 내지 54는 rt236에 대한 NC 프로브, 서열번호 55는 rt250에 대한 NC 프로브, 그리고 서열번호 56은 rt207에 대한 NC 프로브이다.SEQ ID NOS: 41-56 in Table 3 are NC probes for each target codon, SEQ ID NOs: 41-42 are NC probes for rt169 variation, SEQ ID NO: 43 is an NC probe for rt173, SEQ ID NO: 44 is an NC probe for rt1180 SEQ ID NOs: 45-46 are NC probes for rt181, SEQ ID NOs: 47-48 are NC probes for rt184, SEQ ID NO: 49 are NC probes for rt202, SEQ ID NOs: 50-52 are NC probes for rt204, SEQ ID 53 From 54 to NC probes for rt236, SEQ ID NO: 55 to NC probes for rt250, and SEQ ID NO: 56 to NC probes for rt207.
실시 예 5 : 지지체에 프로브 부착Example 5 Attaching a Probe to a Support
실시 예 2에서 제작된 각각의 표적 프로브와 실시 예 4에서 제작된 음성조절 프로브를 각각 30～100 pmol로 희석하고, 실시 예 3에서 제작된 QC 프로브 1～10 pmol 및 Micro-spotting 용액 또는 SSC 용액을 첨가하여 혼합하였다.Each of the target probes prepared in Example 2 and the negative control probes prepared in Example 4 were diluted to 30-100 pmol, respectively, and the QC probes 1-10 pmol and Micro-spotting solution or SSC solution prepared in Example 3, respectively. Was added and mixed.
슬라이드글라스 등의 지지체에 혼합된 프로브를 도 1의 유형으로 다수의 마이크로어레이가 제작되도록 마이크로어레이어(sciFLEXARRAYER S11, SCIENION AG., Germany)를 이용하여 프로브를 부착하였다. 한 종류의 프로브 당 3 개의 점(spot)을 지지체에 부착시킨 후, 실온에서 24시간 정도 정치 또는 50℃의 건조기(dry oven)에 약 5시간 정치하여 지지체 위의 표면에 고정시켰다.
A probe mixed on a support such as a slide glass was attached to the probe using a microarray (sciFLEXARRAYER S11, SCIENION AG., Germany) to produce a plurality of microarrays in the type of FIG. 1. Three spots per probe were attached to the support and then left at room temperature for about 24 hours or in a dry oven at 50 ° C. for about 5 hours to fix to the surface on the support.
실시 예 6 : 표적 산물 준비Example 6 Preparation of Target Product
다약제 내성 HBV의 검출을 위한 표적 산물의 증폭을 위해 표 1의 서열번호 1 내지 2의 바깥쪽 프라이머를 이용하여 1차 PCR을 실시한 후, 서열번호 3 내지 4의 바이오틴이 표지화된 안쪽 프라이머를 사용하여 실시 예 1에서 분리된 DNA의 HBV DNA 중합효소 유전자의 변이 관련 코돈 169번(rt169) 내지 250(rt250) 부위를 포함하도록 증폭하였다. 반응 조성물 21 ㎕에 HBV DNA 4 ㎕와 함께 총 25 ㎕가 되도록 PCR 준비하였다. 이 혼합액을 95℃에서 3 분간 반응시켜 미리 변성시킨 후 95℃에서 30초, 55℃에서 2분, 72℃에서 1분씩 35 회 반응시킨 후, 마지막으로 72℃에서 10 분간 연장하였다. 2차 PCR은 1차 PCR 산물 2 ㎕를 더하여 1차 PCR과 동일 조건하에서 시행하였다.For amplification of the target product for the detection of multi-drug resistant HBV, the first PCR was performed using the outer primers of SEQ ID NOS: 1 to 2 of Table 1, and then the inner primers labeled with biotins of SEQ ID NOs: 3 to 4 were used. By amplification to include the codon No. 169 (rt169) to 250 (rt250) site of the mutation of the HBV DNA polymerase gene of the DNA isolated in Example 1. PCR was prepared in a total of 25 μl with 21 μl of the reaction composition together with 4 μl of HBV DNA. The mixture was reacted for 3 minutes at 95 ° C., denatured in advance, and then reacted 35 times at 95 ° C. for 30 seconds, 2 minutes at 55 ° C., and 1 minute at 72 ° C., and finally extended at 72 ° C. for 10 minutes. The secondary PCR was performed under the same conditions as the primary PCR by adding 2 µl of the primary PCR product.
실시 예 7 : 프로브 고정화에 대한 품질 관리 조사Example 7: Quality Control Survey for Probe Immobilization
본 발명자가 직접 개발하여 이미 특허등록(김철민 등, 국내특허등록, 제10-0590901호(2006), Jang HJ, et al., J Clin Microbiol., 42:4181-4188(2004), 김철민 등, 국내특허등록, 제10-0650162호(2006))한 방법으로 실시하였다.The inventors have already developed and registered patents (Kim Chul Min et al., Korean patent registration, No. 10-0590901 (2006), Jang HJ, et al., J Clin Microbiol ., 42: 4181-4188 (2004), Kim Chul Min et al., Domestic patent registration, 10-0650162 (2006) was carried out by the method.
실시 예 8 : 고정화되지 않은 프로브 세척Example 8: Unimmobilized Probe Wash
실시 예 5 또는 실시 예 7의 과정을 마친 슬라이드에 고정화되지 않은 프로브를 세척하기 위하여 실시하였다. 실온에서 0.2％ SDS 완충액을 이용하여 세척한 후, dH2O를 이용하여 세척하였다. 다음 sodium borohydride 용액에 5분간 방치한 후, 100℃에서 세척하였다. 마지막으로 다시, 0.2％ SDS와 dH2O를 이용하여 세척한 후, 원심분리기를 이용하여 슬라이드를 완전하게 건조시켰다.Example 5 or Example 7 was carried out to wash the probe not immobilized on the slide. Wash with 0.2% SDS buffer at room temperature and then with dH 2 O. Next, it was left in sodium borohydride solution for 5 minutes and then washed at 100 ° C. Finally, after washing again with 0.2% SDS and dH 2 O, the slides were completely dried using a centrifuge.
실시 예 9 : 혼성화반응 및 염료(dye) 결합Example 9 Hybridization and Dye Binding
실시 예 6에서 제조된 바이오틴으로 표지화된 표적 산물을 열처리하여 단일 가닥으로 변성시킨 후, 4℃로 냉각시켰다. 1～5 ㎕의 표적 산물을 포함하는 혼성화반응 용액과 Cy5-streptavidin 또는 Cy3-streptavidin(Amersham pharmacia biotech, USA)을 포함하는 반응용액 총 10 ㎕ 또는 60 ㎕를 제조하였다. 실시 예 8을 마친 슬라이드에 혼성화반응 용액을 분주하고 기포가 생기지 않도록 커버슬립을 덮거나 혹은 커버씰을 덮은 슬라이드는 60 ㎕의 반응액을 분주한 뒤 빛을 차단한 후, 40℃에서 30분간 반응시켰다.The biotin-labeled target product prepared in Example 6 was heat treated to denature into single strands and then cooled to 4 ° C. A total of 10 μl or 60 μl of a hybridization solution containing 1 to 5 μl of the target product and a reaction solution containing Cy5-streptavidin or Cy3-streptavidin (Amersham pharmacia biotech, USA) were prepared. The hybridization solution was dispensed on the slide after Example 8 and the cover slip was covered so as not to generate bubbles, or the slide covered with the cover seal was dispensed with 60 μl of the reaction solution, blocked by light, and then reacted at 40 ° C. for 30 minutes. I was.
실시 예 10 : 비특이적 혼성화반응 표적 산물의 세척Example 10 Washing of Nonspecific Hybridization Target Products
혼성화 반응을 하지 않은 잔여의 표적 산물을 세척하기 위해 커버씰이 제거된 마이크로어레이를 2x SSC와 0.2x SSC 용액 순으로 슬라이드를 세척하였다.The slides were washed in a 2x SSC and 0.2x SSC solution in a microarray with the cover seal removed in order to wash the remaining target product which did not hybridize.
마지막으로 원심분리기를 이용하여 세척한 슬라이드를 완전하게 건조시켰다.Finally, the washed slides were completely dried using a centrifuge.
실시 예 11 : 결과 분석Example 11: Result Analysis
결합 반응 분석을 위해 비공초점 레이저 스캐너(laser scanner)인 GenePix 4000A(Axon Instruments, USA)를 이용하여 스캐닝하고 화상분석을 통해 결과를 분석하였다.For binding reaction analysis, a non-confocal laser scanner, GenePix 4000A (Axon Instruments, USA), was used for scanning and image analysis.
도 1은 본 발명의 실시예인 라미부딘, 아데포비어, 엔테카비어와 팜시클로비어의 다약제 내성 변이 HBV 검출을 위한 프로브를 한 세트로 하여 하나의 지지체를 구성하고 있는 마이크로어레이의 도면이다. 다약제 내성 변이 HBV 검출을 위한 각 코돈에 대한 야생형 및 변이형의 표적 프로브와 NC 프로브가 위치하며, 결과 분석 시에는 본 발명의 마이크로어레이에 포함된 QC 프로브에 의해 최초의 프로브 및 각 프로브들의 위치를 확인할 수 있다.BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS Fig. 1 is a diagram of a microarray constituting one support using a set of probes for detecting multi-drug resistant mutations of HBV of lamivudine, adefovir, entecavir and famciclovir which are embodiments of the present invention. The wild type and mutant target probes and NC probes are located for each codon for multi-drug resistant variant HBV detection, and the results of the analysis of the position of the first probe and each probe by the QC probe included in the microarray of the present invention. You can check.
도 2는 제작된 마이크로어레이의 품질 관리를 위한 QC 프로브에 대한 분석 결과를 나타낸 것으로, 표적 프로브 및 음성조절 프로브와 QC 프로브를 일정 비율로 혼합하여 지지체 위에 고정화된 프로브에 대한 스캐닝 이미지이다. 스팟팅 후, 세척전의 마이크로어레이에 대한 QC 프로브 스캐닝 결과와 세척 후의 마이크로어레이 품질관리 결과이다.Figure 2 shows the analysis results for the QC probe for quality control of the fabricated microarray, a scanning image of a probe immobilized on a support by mixing a target probe, a negative control probe and a QC probe in a certain ratio. After spotting, the results of QC probe scanning on the microarray before washing and microarray quality control after washing.
도 3은 모든 약제에 대해 야생형으로 확인된 약제 감수성 HBV에 대한 반응결과로, 야생형 표적 프로브(서열번호 5, 7, 10, 11, 13, 14, 17, 21, 23, 25, 29, 32, 33, 36, 38)의 시그날 세기(signal tensity, 이하 'SI' 라 표기함)는 NC 프로브 보다 높은 값의 양성 결과를 나타내며, 변이형 표적 프로브는 NC 프로브 SI 보다 같거나 낮은 값의 음성 결과를 나타낸다. 따라서, 약제 감수성을 확인할 수 있다.Figure 3 shows the response to the drug-sensitive HBV identified as wild-type for all drugs, wild-type target probes (SEQ ID NO: 5, 7, 10, 11, 13, 14, 17, 21, 23, 25, 29, 32, 33, 36, and 38), signal tensity (hereinafter referred to as 'SI') shows higher positive results than NC probes, and mutant target probes show negative results equal to or lower than NC probes SI. Indicates. Therefore, drug sensitivity can be confirmed.
도 4 내지 도 12는 각각의 표적 코돈에 대한 변이형에 대한 혼성화반응 결과를 나타낸 것이다.4-12 show the hybridization results for the variants for each target codon.
도 4는 코돈 169번의 I169T 변이에 대한 반응결과로서, 표적 프로브와 NC 프로브에 대한 시그날 세기(signal tensity, 이하 'SI' 라 표기함) 비교에서 169T의 변이형 프로브(서열번호 6)는 NC 프로브(서열번호 41 내지 42)의 SI 보다 큰 값을 나타내므로, 양성의 결과로 확인된다. 그러나 야생형의 I169(서열번호 5) 프로브의 SI는 NC 프로브 보다 낮은 SI를 나타내므로 음성으로 확인되므로 코돈 169번에 대해 변이형을 나타낸다. 코돈 169를 제외한 모든 표적 코돈에서는 야생형 프로브가 반응결과를 나타냈다.4 is a response of I169T mutation of codon No. 169. In comparison of signal tensity (hereinafter referred to as 'SI') for a target probe and an NC probe, a variant probe of SEQ ID NO: 669 (SEQ ID NO: 6) is an NC probe. Since it shows a value larger than SI of (SEQ ID NOS: 41-42), it confirmed with a positive result. However, since the SI of the wild type I169 (SEQ ID NO: 5) probe shows a lower SI than that of the NC probe, it is negative and thus shows a variant for codon 169. In all target codons except codon 169, wild-type probes showed reaction results.
도 5는 코돈 173번, 180번과 204번의 V173L, L180M과 M204V 변이에 대한 반응결과로서, 173L의 변이형 프로브(서열번호 8 내지 9)는 NC 프로브(서열번호 43) 보다 높은 SI를 나타내어 양성으로 확인되며, 야생형의 V173(서열번호 7) 프로브는 NC 프로브 보다 낮은 SI를 나타내어 음성으로 확인되었다. L180M 변이에 대해서는 180M의 변이형 프로브(서열번호 12)는 NC 프로브(서열번호 44) 보다 높은 SI를 나타내어 양성으로 확인되며, 야생형의 L180(서열번호 10 내지 11) 프로브는 NC 프로브 보다 낮은 SI를 나타내어 음성으로 확인되었다. 또한 M204V 변이에 대한 반응 결과는 204V의 변이형 프로브(서열번호 24)는 NC 프로브(서열번호 50) 보다 높은 SI를 나타내어 양성으로 확인되며, 야생형의 M204 프로브(서열번호 23, M204-W1)는 NC 프로브 보다 낮은 SI를 나타내어 음성으로 확인되었다.FIG. 5 shows reactions of V173L, L180M, and M204V mutations at codons 173, 180, and 204, wherein 173L variant probes (SEQ ID NOS: 8 to 9) exhibit higher SI than NC probes (SEQ ID NO: 43). The wild type V173 (SEQ ID NO: 7) probe showed a lower SI than the NC probe and was confirmed as negative. For the L180M mutation, the 180M variant probe (SEQ ID NO: 12) showed a higher SI than the NC probe (SEQ ID NO: 44) and was confirmed positive, while the wild type L180 (SEQ ID NOS: 10-11) probe had a lower SI than the NC probe. And negatively confirmed. In addition, the response to the M204V mutation was confirmed that the 204V variant probe (SEQ ID NO: 24) shows a higher SI than the NC probe (SEQ ID NO: 50), and the wild type M204 probe (SEQ ID NO: 23, M204-W1) It was confirmed negative by showing lower SI than NC probe.
도 6은 코돈 181번의 A181V 변이에 대한 반응결과로서, 181V의 변이형 프로브(서열번호 16)는 NC 프로브(서열번호 46) 보다 높은 SI를 나타내어 양성으로 확인되며, 야생형의 A181 프로브(서열번호 14, A181-W2)는 NC 프로브 보다 낮은 SI를 나타내어 음성으로 확인되었다. 즉, NC1은 A181-W1과 181T-M에 대한 NC 프로브이며, NC2는 A181-W2와 181V-M에 대한 양성 및 위양성 결정을 위한 NC 프로브로 사용된다. 따라서, NC1 프로브의 SI 보다 낮은 A181-W1과 181T-M은 모두 음성으로 확인되며, 또한 NC2 프롭의 SI 보다 낮은 A181-W2 역시 음성으로 확인되나, 181V-M 프로브는 NC2 프로브 보다 높은 SI를 나타내어 양성으로 확인된다. 따라서, 반응 결과는 A181V의 내성 변이로 확인되었다.Figure 6 is a reaction result for the A181V mutation of
도 7은 코돈 184번의 T184S 변이에 대한 반응결과로서, 184S의 변이형 프로브(서열번호 18 내지 19)는 NC 프로브(서열번호 47) 보다 높은 SI를 나타내어 양성으로 확인되며, 야생형의 T184(서열번호 17) 프로브는 NC 프로브 보다 낮은 SI를 나타내어 음성으로 확인되었다.7 is a reaction result for the T184S mutation of codon 184, the 184S variant probes (SEQ ID NO: 18 to 19) has a higher SI than NC probe (SEQ ID NO: 47) is confirmed positive, wild type T184 (SEQ ID NO: 17) The probe showed a lower SI than the NC probe and was confirmed as negative.
도 8은 코돈 204번의 M204I 변이에 대한 반응결과로서, 각각의 204I1의 변이형 프로브(서열번호 26), 204I2의 변이형 프로브(서열번호 27)와 204I3의 변이형 프로브(서열번호 28)는 NC 프로브(서열번호 51) 보다 높은 SI를 나타내어 각각에 대해 양성으로 확인되며, 각 반응에서 야생형의 M204 프로브(서열번호 25, M204-W2)는 NC 프로브 보다 낮은 SI를 나타내어 음성으로 확인되었다.FIG. 8 shows the response of the M204I mutation of codon 204, wherein each of the 204I1 variant probes (SEQ ID NO: 26), the 204I2 variant probes (SEQ ID NO: 27), and the 204I3 variant probes (SEQ ID NO: 28) Higher SI than probes (SEQ ID NO: 51) was confirmed positive for each, and wild type M204 probes (SEQ ID NO: 25, M204-W2) in each reaction showed lower SI than negative NC probes.
도 9는 코돈 204번의 M204S 변이에 대한 반응결과로서, 204S의 변이형 프로브(서열번호 30 내지 31)는 NC 프로브(서열번호 52) 보다 높은 SI를 나타내어 각각에 대해 양성으로 확인되며, 야생형의 M204 프로브(서열번호 29, M203-W3)는 NC 프로브 보다 낮은 SI를 나타내어 음성으로 확인되었다.9 is a response of the M204S mutation of the codon 204, 204S variant probes (SEQ ID NO: 30 to 31) shows a higher SI than NC probe (SEQ ID NO: 52) is confirmed positive for each, wild type M204 The probe (SEQ ID NO: 29, M203-W3) showed a lower SI than the NC probe and was confirmed negative.
도 10은 코돈 236번의 N236T 변이에 대한 반응결과로서, 236T의 변이형 프로브(서열번호 34 내지 35)는 NC 프로브(서열번호 53 내지 54) 보다 높은 SI를 나타내어 양성으로 확인되며, 야생형의 N236 프로브(서열번호 32 내지 33)는 NC 프로브 보다 낮은 SI를 나타내어 음성으로 확인되었다.10 is a reaction result for the N236T mutation of codon 236, 236T variant probes (SEQ ID NO: 34 to 35) is positive by showing a higher SI than NC probes (SEQ ID NO: 53 to 54), wild type N236 probe (SEQ ID NOS: 32-33) showed a lower SI than the NC probe and was confirmed negative.
도 11은 코돈 250번의 M250V 변이에 대한 반응결과로서, 250V의 변이형 프로브(서열번호 37)는 NC 프로브(서열번호 55) 보다 높은 SI를 나타내어 양성으로 확인되며, 야생형의 M250 프로브(서열번호 36)는 NC 프로브 보다 낮은 SI를 나타내어 음성으로 확인되었다.11 is a reaction result of the M250V mutation of the codon 250, the 250V variant probe (SEQ ID NO: 37) shows a higher SI than the NC probe (SEQ ID NO: 55) is confirmed as positive, wild type M250 probe (SEQ ID NO: 36 ) Has a lower SI than the NC probe and was confirmed as negative.
도 12는 코돈 207번의 V207I 변이에 대한 반응결과로서, 207I의 변이형 프로브(서열번호 39 내지 40)는 NC 프로브(서열번호 56) 보다 높은 SI를 나타내어 양성으로 확인되며, 야생형의 V207 프로브(서열번호 38)는 NC 프로브 보다 낮은 SI를 나타내어 음성으로 확인되었다.12 is a reaction result of the V207I mutation of codon 207, 207I variant probes (SEQ ID NO: 39 to 40) is confirmed positive by showing a higher SI than NC probe (SEQ ID NO: 56), wild type V207 probe (SEQ ID NO: 56) Number 38) was negative, indicating a lower SI than the NC probe.
[산업상 이용가능성][Industrial applicability]
이상에서 살펴 본 바와 같이, 본 발명은 하나의 지지체 위 각각의 스팟에 다약제 내성 변이 HBV를 검출할 수 있는 표적 프로브와 형광물질이 표지된 QC 프로브, 그리고 야생형 및 변이종의 혼합 유무 및 혼합형에 대한 상대량 분석, 반응결과에 대한 양성과 위양성을 구별할 수 있는 NC 프로브로 구성되어 있는 마이크로어레이로, 한번의 실험으로 다수의 검체에 대해 동시에 동일 조건으로 약제 내성 변이 검출이 가능한 방법으로 간단, 정확, 신속하게 약제 내성 변이 HBV 검출이 가능하다.As described above, the present invention relates to a target probe capable of detecting a multi-drug resistant variant HBV at each spot on one support, a QC probe labeled with a fluorescent substance, and the presence or absence and mixing of wild type and mutant species. It is a microarray composed of NC probes that can distinguish between positive and false positives for relative volume analysis and reaction results.It is simple and accurate in that it can detect drug resistance mutations under the same conditions on multiple samples in one experiment. In addition, drug-resistant mutations can be detected quickly.
또한, 본 발명의 약제 내성 검출 방법 및 키트를 통해, 만성 B형 간염 치료시의 여러 종류의 약제를 선택하여 투여하기 전에 내성 관련 변이 유형의 존재 여부 확인 후, 선택적으로 약제를 투여함으로써 약제 내성 획득으로 인한 불필요한 막대한 의료비용을 줄일 수 있다. 또한, 마이크로어레이에 의해 내성 획득이 예측되는 환자를 대상으로 병합요법을 실시하여 치료 효율을 증진시킬 수 있으며, 잘못된 약제의 선택으로 인한 내성 변이형의 출현을 방지함으로서 변이형 바이러스의 유행을 막을 수 있다.In addition, through the drug resistance detection method and kit of the present invention, before the selection and administration of various types of drugs in the treatment of chronic hepatitis B, the drug resistance obtained by selectively administering the drug after confirming the presence of resistance-related mutation type This can reduce unnecessary medical expenses. In addition, it is possible to improve the treatment efficiency by performing a combination therapy for patients predicted to acquire resistance by microarray, and to prevent the emergence of resistant variants due to the wrong choice of drugs to prevent the spread of the mutant virus. have.
본 발명에 의해, 추가 개발 및 적용되는 다양한 항바이러스제에 대한 내성 획득 여부에 대한 종합적 검출이 가능, 민감도와 특이도가 높은 마이크로어레이 방법으로 내성 획득 초기 검출이 가능하다.According to the present invention, comprehensive detection of whether to acquire resistance to various antiviral agents to be further developed and applied is possible, and early detection of resistance acquisition is possible by a microarray method having high sensitivity and specificity.
Claims (14)
표적산물의 염기서열과 서로 상보적인 서열을 가지거나 또는 임의 염기서열을 가지는 올리고뉴클레오티드에 형광물질을 표지하되, 상기 형광물질은 표적산물에 표지된 형광물질과는 다른 여기/방출(excitation/emission) 파장을 가지는 품질 관리용 QC 프로브,
를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 약제 내성 변이 HBV 검출용 마이크로어레이.10. The oligonucleotide of claim 9, wherein the oligonucleotide is designed by locating remaining bases or nonbases except for wild type and mutant bases at the point mutation regions of the DNA polymerase gene of hepatitis B virus (HBV). Negative regulation probe for distinguishing between positive and false positive results for the hybridization result, or
The fluorescent material is labeled on an oligonucleotide having a sequence complementary to the base sequence of the target product or having an arbitrary nucleotide sequence, wherein the fluorescent substance is different from the fluorescent substance labeled on the target product (excitation / emission). QC probe for quality control having a wavelength,
Drug-resistant mutant HBV detection microarray further comprising a.
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