KR101316998B1 - 피부 노화 진단 키트 및 피부 노화 진단 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 피부 노화 진단 키트 및 피부 노화 진단 방법에 관한 것으로서, 구체적으로는 연령 증가에 따라 발현 패턴이 변화되는 유전자를 확인하여 피부의 노화 정도를 진단하기 위하여, 상기 유전자 서열의 폴리뉴클레오티드와 혼성화하는 프로브로서 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드; 상기 유전자 서열의 폴리뉴클레오티드의 프라이머 쌍; 또는 상기 유전자에 의하여 코딩되는 폴리펩티드에 대한 모노클로날 항체를 하나 이상 포함하는 피부 노화 진단 키트 및 그를 이용하는 피부 노화 진단 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따르면 연령 증가에 따라 피부 유래 각질형성세포에서 발현이 증가되는 20종의 유전자 및 발현이 감소되는 21종의 유전자, 연령 증가에 따라 피부 유래 섬유아세포에서 발현이 증가되는 3종의 유전자 및 발현이 감소되는 16종 유전자를 노화 마커 유전자로 하여 피부에서의 노화 정도를 빠르게 진단할 수 있다. 또한, 상기 유전자들의 프로모터 영역에 존재하는 전사인자 결합 부위로부터 생물정보학 기술을 이용해 추출한 전사 조절인자 12종을 노화 마커 유전자로 하여 피부에서의 노화 정도를 진단할 수 있다.

Description

피부 노화 진단 키트 및 피부 노화 진단 방법 {Method and kit for diagnosis of skin aging}
본 발명은 피부 노화 진단 키트 및 피부 노화 진단 방법에 관한 것으로서, 구체적으로는 연령 증가에 따라 발현 패턴이 변화되는 유전자를 확인하여 피부의 노화 정도를 진단하기 위하여, 상기 유전자 서열의 폴리뉴클레오티드와 혼성화하는 프로브로서 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드; 상기 유전자 서열의 폴리뉴클레오티드의 프라이머 쌍; 또는 상기 유전자에 의하여 코딩되는 폴리펩티드에 대한 모노클로날 항체를 하나 이상 포함하는 피부 노화 진단 키트 및 그를 이용하는 피부 노화 진단 방법에 관한 것이다.
사람의 유전체는 3x109개의 염기쌍으로 구성되어 있고, 대략 5 만개의 유전자를 가지고 있는 것으로 추측되며, 하나의 세포에서 발현되는 기능성 유전자의 개수는 대략 10,000개 정도로 추정된다. 즉 하나의 세포는 50,000개의 유전자 중 약 10,000개의 단백질만을 선택적으로 만들어내고 있으며, 어떤 단백질을 만들어내느냐에 따라 그 세포의 기능적 특성이 결정된다.
세포의 유전자 발현 특성의 차이는 서로 다른 세포 간에 나타날 뿐만 아니라, 동일한 세포의 병적인 상황, 예를 들면 젊은 세포와 노화된 세포 간에도 나타난다. 종래의 생명과학은 이러한 유전자 발현의 변화를 일대일의 관계로부터 찾는 것이 관례였으나, 특정 단백질의 작용은 하나의 단백질에 국한되는 것이 아니고, 다양한 단백질의 발현에 관여하며, 세포의 특성은 특정 단백질 하나에 의하여 결정되는 것이 아니라 다양한 단백질들의 특성이 총체적으로 조화를 이룸으로써 결정된다고 판단되기 때문에 과거의 접근은 매우 제한적일 수밖에 없었다. 피부의 노화 과정 또한 다른 생리 현상과 마찬가지로, 외부 자극 (UV, ROS 등) 및 세포 내에 내재적으로 존재하는 인자 (유전자, 단백질)의 상호작용에 의해 결정되므로, 이런 여러 인자들을 아울러 관찰할 필요가 있지만, 지금까지 피부 노화에 대한 연구는 노화를 유도하는 외적 인자에 의한 세포/조직 내의 내재적 인자의 변화를 모니터링하는 것에 그쳤으므로, 연령 증가에 따른 내재적 인자 변화를 이해하는데 한계가 있었다.
지금까지 보고된 바에 의하면, 연령 증가에 따라 피부가 얇아지고 건조해지며 탄력이 떨어진다는 점, 조직 수준에서 세포외기질의 위축, 섬유아세포 수의 감소, 콜라겐 및 엘라스틴의 감소와 구조 이상이 관찰된다는 점, 구조 이상의 원인으로 타입 I, III 콜라겐 합성이 감소하고 분해가 증가된다는 점이 거론되고 있다. 또한 연령 증가에 따른 ROS의 증가, 고분자의 당화 증가, 단백질 변성 증가 및 분해 감소, DNA 손상 증가 및 DNA 수복(repair) 감소 등이 보고되었다. 그러나 상기와 같이 밝혀진 여러 현상과 노화 사이의 인과 관계가 명확하지 않기 때문에 효과적인 노화 조절 방법이 개발되지 못하고 있는 실정이다. 노화 세포의 특성을 총체적으로 이해하기 위해 다양한 단백질들의 특성을 이해하려는 시도 또한 효능 물질 (RA, 진세노사이드 등) 또는 자극원 (UV, ROS)을 세포에 처리한 배양 시스템에서 의 연구에만 국한되어 그 한계를 가지고 있다.
Hennings et al. (1980) Cell 19:245-254
이에, 본 발명자들은 각 연령별 인체 피부 조직을 제공 받아 연령 증가에 따라 변화되는 유전자의 발현 패턴을 분석함으로써, 외부 자극이 최대한 배재된 상태에서 피부 내재적 노화 과정에 관련된 주요 유전자 발현 패턴을 추적하고, 이들 유전자의 발현을 조절하는 전사인자를 생물정보학 기법으로 추출한 결과, 이를 노화 진단 마커로 사용할 수 있다는 사실을 밝혀내었다.
따라서 본 발명은 연령 증가에 따라 발현이 증가 혹은 감소하는 유전자와 이를 조절하는 전사인자 유전자를 찾아내어, 이를 마커로 하는 피부 노화 정도 진단 키트 및 피부 노화 정도 진단 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다. 또한, 시험 화합물이 상기 유전자로부터 코딩된 단백질의 작용을 촉진 또는 억제하는지를 확인하여 노화 억제제를 스크리닝하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 BOLA1, C16orf28, BCL2L2, CKS2, KIF26A, PRF1, STMN1, ORC6L, UBE2C, MELK, MAP3K14, CD59, ENC1, NDC80, TUBB6, K-ALPHA-1, HNRPA2B1, COL12A1, C16orf33 및 LDHA로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 또는 그 단편으로서 10개 이상의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드, 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드; 및 상기 폴리뉴클레오티드를 표면에 결합시킨 고상 지지체를 포함하며, 진단 대상 피부 유래 각질형성세포의 전사체 중에서 상기 폴리뉴클레오티드에 혼성화된 전사체의 양을 측정하여, 연령별 세포에서 상기 폴리뉴클레오티드에 혼성화된 전사체의 양과 비교하여, 진단 대상 피부가 어느 연령에 해당하는지 진단하는 것을 특징으로 하는 피부 노화 진단 키트를 제공한다.
본 발명은 DDIT3, C5orf26, GDF15, RAB38, MARK3, CEBPG, ABCA12, MKNK2, HSPA5, DUSP1, SLC25A6, AARS, NUCB2, C6orf48, MGC40157, TRIB3, BTG1, MGC35097, FLJ20186, COX7A2L 및 RPL39로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 또는 그 단편으로서 10개 이상의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드, 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드; 및 상기 폴리뉴클레오티드를 표면에 결합시킨 고상 지지체를 포함하며, 진단 대상 피부 유래 각질형성세포의 전사체 중에서 상기 폴리뉴클레오티드에 혼성화된 전사체의 양을 측정하여, 연령별 세포에서 상기 폴리뉴클레오티드에 혼성화된 전사체의 양과 비교하여, 진단 대상 피부가 어느 연령에 해당하는지 진단하는 것을 특징으로 하는 피부 노화 진단 키트를 제공한다.
본 발명은 PSMB7, EEF1A1 및 ABO로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 또는 그 단편으로서 10개 이상의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드, 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드; 및 상기 폴리뉴클레오티드를 표면에 결합시킨 고상 지지체를 포함하며, 진단 대상 피부 유래 섬유아세포의 전사체 중에서 상기 폴리뉴클레오티드에 혼성화된 전사체의 양을 측정하여, 연령별 세포에서 상기 폴리뉴클레오티드에 혼성화된 전사체의 양과 비교하여, 진단 대상 피부가 어느 연령에 해당하는지 진단하는 것을 특징으로 하는 피부 노화 진단 키트를 제공한다.
본 발명은 RAI16, NOX4, ALK, ANKS1, ANP32E, PSCD4, MGAT5, CLDND1, LRRK1, COL11A2, ABCF3, SV2B, ZC3H11A, CSDC2, PPP1R12B 및 CEBPZ로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 또는 그 단편으로서 10개 이상의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드, 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드; 및 상기 폴리뉴클레오티드를 표면에 결합시킨 고상 지지체를 포함하며, 진단 대상 피부 유래 섬유아세포의 전사체 중에서 상기 폴리뉴클레오티드에 혼성화된 전사체의 양을 측정하여, 연령별 세포에서 상기 폴리뉴클레오티드에 혼성화된 전사체의 양과 비교하여, 진단 대상 피부가 어느 연령에 해당하는지 진단하는 것을 특징으로 하는 피부 노화 진단 키트를 제공한다.
또한 본 발명은 BOLA1, C16orf28, BCL2L2, CKS2, KIF26A, PRF1, STMN1, ORC6L, UBE2C, MELK, MAP3K14, CD59, ENC1, NDC80, TUBB6, K-ALPHA-1, HNRPA2B1, COL12A1, C16orf33 및 LDHA으로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리뉴클레오티드의 단편으로서 18-23개의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드; 및 상기 군으로부터 선택된 폴리뉴클레오티드에 상보적인 폴리뉴클레오티드의 단편으로서 18-23개의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하며, 진단 대상 피부 유래 각질형성세포의 전사체에서 상기 폴리뉴클레오티드들을 프라이머로 하여 증폭된 양을 측정하여, 연령별 세포에서 상기 폴리뉴클레오티드들을 프라이머로 하여 증폭된 양과 비교하여, 진단 대상 피부가 어느 연령에 해당하는지 진단하는 것을 특징으로 하는 피부 노화 진단 키트를 제공한다.
본 발명은 DDIT3, C5orf26, GDF15, RAB38, MARK3, CEBPG, ABCA12, MKNK2, HSPA5, DUSP1, SLC25A6, AARS, NUCB2, C6orf48, MGC40157, TRIB3, BTG1, MGC35097, FLJ20186, COX7A2L 및 RPL39로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리뉴클레오티드의 단편으로서 18-23개의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드; 및 상기 군으로부터 선택된 폴리뉴클레오티드에 상보적인 폴리뉴클레오티드의 단편으로서 18-23개의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하며, 진단 대상 피부 유래 각질형성세포의 전사체에서 상기 폴리뉴클레오티드들을 프라이머로 하여 증폭된 양을 측정하여, 연령별 세포에서 상기 폴리뉴클레오티드들을 프라이머로 하여 증폭된 양과 비교하여, 진단 대상 피부가 어느 연령에 해당하는지 진단하는 것을 특징으로 하는 피부 노화 진단 키트를 제공한다.
본 발명은 PSMB7, EEF1A1 및 ABO으로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리뉴클레오티드의 단편으로서 18-23개의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드; 및 상기 군으로부터 선택된 폴리뉴클레오티드에 상보적인 폴리뉴클레오티드의 단편으로서 18-23개의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하며, 진단 대상 피부 유래 섬유아세포의 전사체에서 상기 폴리뉴클레오티드들을 프라이머로 하여 증폭된 양을 측정하여, 연령별 세포에서 상기 폴리뉴클레오티드들을 프라이머로 하여 증폭된 양과 비교하여, 진단 대상 피부가 어느 연령에 해당하는지 진단하는 것을 특징으로 하는 피부 노화 진단 키트를 제공한다.
본 발명은 RAI16, NOX4, ALK, ANKS1, ANP32E, PSCD4, MGAT5, CLDND1, LRRK1, COL11A2, ABCF3, SV2B, ZC3H11A, CSDC2, PPP1R12B 및 CEBPZ로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리뉴클레오티드의 단편으로서 18-23개의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드; 및 상기 군으로부터 선택된 폴리뉴클레오티드에 상보적인 폴리뉴클레오티드의 단편으로서 18-23개의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하며, 진단 대상 피부 유래 섬유아세포의 전사체에서 상기 폴리뉴클레오티드들을 프라이머로 하여 증폭된 양을 측정하여, 연령별 세포에서 상기 폴리뉴클레오티드들을 프라이머로 하여 증폭된 양과 비교하여, 진단 대상 피부가 어느 연령에 해당하는지 진단하는 것을 특징으로 하는 피부 노화 진단 키트를 제공한다.
또한 본 발명은 BOLA1, C16orf28, BCL2L2, CKS2, KIF26A, PRF1, STMN1, ORC6L, UBE2C, MELK, MAP3K14, CD59, ENC1, NDC80, TUBB6, K-ALPHA-1, HNRPA2B1, COL12A1, C16orf33 및 LDHA로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자에 의하여 코딩되는 폴리펩티드에 대한 모노클로날 항체를 하나 이상 포함하며, 진단 대상 피부 유래 각질형성세포에서 상기 항체에 결합된 항원의 양을 측정하여, 연령별 세포에서 상기 항체에 결합된 항원의 양과 비교하여, 진단 대상 피부가 어느 연령에 해당하는지 진단하는 것을 특징으로 하는 피부 노화 진단 키트를 제공한다.
본 발명은 DDIT3, C5orf26, GDF15, RAB38, MARK3, CEBPG, ABCA12, MKNK2, HSPA5, DUSP1, SLC25A6, AARS, NUCB2, C6orf48, MGC40157, TRIB3, BTG1, MGC35097, FLJ20186, COX7A2L 및 RPL39로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자에 의하여 코딩되는 아미노산 서열을 가변영역으로 가지는 하나 이상의 모노클로날 항체를 포함하며, 진단 대상 피부 유래 각질형성세포에서 상기 항체에 결합된 항원의 양을 측정하여 연령별 세포에서 상기 항체에 결합된 항원의 양과 비교하여, 진단 대상 피부가 어느 연령에 해당하는지 진단하는 것을 특징으로 하는 피부 노화 진단 키트를 제공한다.
본 발명은 PSMB7, EEF1A1 및 ABO로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자에 의하여 코딩되는 아미노산 서열을 가변영역으로 가지는 하나 이상의 모노클로날 항체를 포함하며, 진단 대상 피부 유래 섬유아세포에서 상기 항체에 결합된 항원의 양을 측정하여 연령별 세포에서 상기 항체에 결합된 항원의 양과 비교하여, 진단 대상 피부가 어느 연령에 해당하는지 진단하는 것을 특징으로 하는 피부 노화 진단 키트를 제공한다.
본 발명은 RAI16, NOX4, ALK, ANKS1, ANP32E, PSCD4, MGAT5, CLDND1, LRRK1, COL11A2, ABCF3, SV2B, ZC3H11A, CSDC2, PPP1R12B 및 CEBPZ로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자에 의하여 코딩되는 아미노산 서열을 가변영역으로 가지는 하나 이상의 모노클로날 항체를 포함하며, 진단 대상 피부 유래 섬유아세포에서 상기 항체에 결합된 항원의 양을 측정하여 연령별 세포에서 상기 항체에 결합된 항원의 양과 비교하여, 진단 대상 피부가 어느 연령에 해당하는지 진단하는 것을 특징으로 하는 피부 노화 진단 키트를 제공한다.
또한 본 발명은 피부 노화의 정도를 진단하기 위해 필요한 정보를 제공하는 방법으로서, 표피 중의 BOLA1, C16orf28, BCL2L2, CKS2, KIF26A, PRF1, STMN1, ORC6L, UBE2C, MELK, MAP3K14, CD59, ENC1, NDC80, TUBB6, K-ALPHA-1, HNRPA2B1, COL12A1, C16orf33 및 LDHA 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자의 발현량, 또는 진피 중의 PSMB7, EEF1A1 및 ABO 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자의 발현량을 측정하여, 연령별 발현량과 비교하여, 진단 대상 피부가 어느 연령에 해당하는지 판단하는 것을 특징으로 하는 피부 노화의 정도를 진단하기 위해 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
본 발명은 피부 노화의 정도를 진단하기 위해 필요한 정보를 제공하는 방법으로서, 표피 중의 DDIT3, C5orf26, GDF15, RAB38, MARK3, CEBPG, ABCA12, MKNK2, HSPA5, DUSP1, SLC25A6, AARS, NUCB2, C6orf48, MGC40157, TRIB3, BTG1, MGC35097, FLJ20186, COX7A2L 및 RPL39 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자의 발현량, 또는 진피 중의 RAI16, NOX4, ALK, ANKS1, ANP32E, PSCD4, MGAT5, CLDND1, LRRK1, COL11A2, ABCF3, SV2B, ZC3H11A, CSDC2, PPP1R12B 및 CEBPZ 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자의 발현량을 측정하여, 연령별 발현량과 비교하여, 진단 대상 피부가 어느 연령에 해당하는지 판단하는 것을 특징으로 하는 피부 노화의 정도를 진단하기 위해 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
본 발명은 노화 억제제를 스크리닝하는 방법으로서, 세포에 시험 화합물을 처리하는 단계; 및 시험 화합물 처리 후 세포 내 BOLA1, C16orf28, BCL2L2, CKS2, KIF26A, PRF1, STMN1, ORC6L, UBE2C, MELK, MAP3K14, CD59, ENC1, NDC80, TUBB6, K-ALPHA-1, HNRPA2B1, COL12A1, C16orf33 및LDHA 로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자, 또는 PSMB7, EEF1A1 및ABO로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자의 발현이 억제되는지를 확인하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 노화 억제제 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명은 노화 억제제를 스크리닝하는 방법으로서, 세포에 시험 화합물을 처리하는 단계; 및 시험 화합물 처리 후 세포 내 DDIT3, C5orf26, GDF15, RAB38, MARK3, CEBPG, ABCA12, MKNK2, HSPA5, DUSP1, SLC25A6, AARS, NUCB2, C6orf48, MGC40157, TRIB3, BTG1, MGC35097, FLJ20186, COX7A2L 및RPL39로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자, 또는 RAI16, NOX4, ALK, ANKS1, ANP32E, PSCD4, MGAT5, CLDND1, LRRK1, COL11A2, ABCF3, SV2B, ZC3H11A, CSDC2, PPP1R12B 및 CEBPZ로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자의 발현이 촉진되는지를 확인하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 노화 억제제 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명은 노화 억제제를 스크리닝하는 방법으로서, MEF-2, FOXD3 2, SREBP-1, CP2, Nkx2-5, c-Myb 4, CREB, CRE-BP1, NRF-2 3, Freac-4, GATA-1 및 NF-kB 3로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자 및 유니버설(universal) 프로모터를 포함하는 플라스미드, 및 상기 선택된 유전자에 의해 코딩되는 전사인자가 결합하는 DNA서열 및 리포터 유전자를 포함하는 플라스미드를 세포에 트랜스펙션시키는 단계; 상기 세포에 시험 화합물을 처리하는 단계; 및 상기 시험 화합물이 상기 리포터 유전자의 발현을 촉진하는지 여부를 확인하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 노화 억제제 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명에 따르면 연령 증가에 따라 피부의 각질형성세포 및 섬유아세포에서 발현이 증가되거나 감소되는 유전자, 및 이를 조절하는 전사인자 유전자를 노화 진단 마커로 하여 피부에서의 노화 정도를 민감하고 빠르게 진단할 수 있다. 또한, 본 발명의 상기 유전자로부터 코딩된 단백질 작용을 촉진 또는 억제하는지를 확인하여 노화 억제제 후보 화합물의 효능을 스크리닝할 수 있다.
도 1은 피부 유래 각질형성세포에서의 연령 증가에 따른 유전자 발현 패턴 및 각 연령별 유전자 발현 값의 상관성 (Pearson correlation coefficients)을 도시한 히트 맵 (heat map)이다.
도 2은 피부 유래 섬유아세포에서의 연령 증가에 따른 유전자 발현 패턴 및 각 연령별 유전자 발현 값의 상관성 (Pearson correlation coefficients)을 도시한 히트 맵이다.
도 3a-h는 피부 유래 각질형성세포에서 연령 증가에 따라 발현량이 변화된 노화 마커 유전자의 real-time PCR 결과를 도시한 그래프이다. 양성 대조군으로는 각 연령별 환자로부터 얻은 RNA 동량을 합친 것을 사용하였으며, 각 유전자에 대하여 양성 대조군을 기준 1로 정한 후 각 연령별 시료의 상대적인 mRNA 레벨을 30대 중반을 기준으로 클래스 1 및 클래스 2로 나누어 클래스별 평균을 내어 연령 증가에 따라 발현량의 변화를 확인하였다.
도 4a-c는 피부 유래 섬유아세포에서 연령 증가에 따라 발현량이 변화된 노화 마커 유전자의 real-time PCR 결과를 도시한 그래프이다. 양성 대조군으로는 각 연령별 환자로부터 얻은 RNA 동량을 합친 것을 사용하였으며, 각 유전자에 대하여 양성 대조군을 기준 1로 정한 후 각 연령별 시료의 상대적인 mRNA 레벨을 30대 중반 및 50대 중반을 기준으로 클래스 1, 클래스 2 및 클래스 3으로 나누어 클래스별 평균을 내어 연령 증가에 따라 발현량의 변화를 확인하였다.
도 5는 피부 유래 각질형성세포에서 연령 증가에 따라 발현이 증가하는 유전자와 그 프로모터에 과다 관찰되는 전사인자와의 상관 관계 매트릭스(히트 맵)(도 5a) 및 네트워크를 도시한 그래프(도 5b)이다.
도 6은 피부 유래 각질형성세포에서 연령 증가에 따라 발현이 감소하는 유전자와 그 프로모터에 과다 관찰되는 전사인자와의 상관 관계 매트릭스(히트 맵)(도 6a) 및 네트워크를 도시한 그래프(도 6b)이다.
도 7은 피부 유래 섬유아세포에서 연령 증가에 따라 발현이 증가하는 유전자와 그 프로모터에 과다 관찰되는 전사인자와의 상관 관계 매트릭스(히트 맵)(도 7a) 및 네트워크를 도시한 그래프(도 7b)이다.
도 8은 피부 유래 섬유아세포에서 연령 증가에 따라 발현이 감소하는 유전자와 그 프로모터에 과다 관찰되는 전사인자와의 상관 관계 매트릭스(히트 맵)(도 8a) 및 네트워크를 도시한 그래프(도 8b)이다.
이하 본 발명을 더욱 구체적으로 설명한다.
본 발명에서는 연령 증가에 따라 피부 유래 각질 형성세포에서 발현이 증가하는 20종의 유전자 및 피부 유래 섬유아세포에서 발현이 증가하는 3 종의 유전자를 발굴하였고, 또한 연령 증가에 따라 피부 유래 각질형성세포에서 발현이 감소하는 21종의 유전자 및 피부 유래 섬유아세포에서 발현이 감소하는 16종의 유전자를 발굴하였으며, 이들이 노화와 관련이 있다는 사실은 아직까지 보고되지 않았다. 하기 표 1은 각질형성세포에서 연령에 따라 발현이 증가한 유전자, 표 2는 각질형성세포에서 연령에 따라 발현이 감소한 유전자, 표 3은 섬유아세포에서 연령에 따라 발현이 증가한 유전자, 표 4는 섬유아세포에서 연령 증가에 따라 발현이 감소한 유전자를 나열한 것이다. GBAcc는 NCBI의 genebank accession ID를 의미하고 UGID는 unigene DB의 ID를 의미한다.
GBAcc UGID 유전자 이름 공식 유전자 심볼
NM_016074 Hs.13880 BolA-like 1 (E. coli) BOLA1
AK027013 Hs.161279 Chromosome 16 open reading frame 28 C16orf28
NM_004050 Hs.410026 BCL2-like 2 BCL2L2
NM_001827 Hs.83758 CDC28 protein kinase regulatory subunit 2 CKS2
AB033062 Hs.134970 Kinesin family member 26A KIF26A
NM_005041 Hs.2200 Perforin 1 (pore forming protein) PRF1
NM_005563 Hs.209983 Stathmin 1/oncoprotein 18 STMN1
NM_014321 Hs.49760 Origin recognition complex, subunit 6 homolog-like (yeast) ORC6L
NM_007019 Hs.93002 Ubiquitin-conjugating enzyme E2C UBE2C
NM_014791 Hs.184339 Maternal embryonic leucine zipper kinase MELK
AJ008159 Hs.404183 Mitogen-activated protein kinase kinase kinase 14 MAP3K14
M34671 Hs.278573 CD59 antigen p18-20 (antigen identified by monoclonal antibodies 16.3A5, EJ16, EJ30, EL32 and G344) CD59
NM_003633 Hs.104925 Ectodermal-neural cortex (with BTB-like domain) ENC1
NM_006101 Hs.414407 NDC80 homolog, kinetochore complex component (S. cerevisiae) NDC80
AK001295 Hs.193491 Tubulin, beta 6 TUBB6
NM_006082 Hs.334017 Tubulin, alpha, ubiquitous K-ALPHA-1
NM_002137 Hs.487774 Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A2/B1 HNRPA2B1
AL359627 Hs.101302 Collagen, type XII, alpha 1 COL12A1
AK026593 Hs.15277 Chromosome 16 open reading frame 33 C16orf33
NM_005566 Hs.2795 Lactate dehydrogenase A LDHA
GBAcc UGCluster_B187 유전자 이름 공식 유전자 심볼
NM_004083 Hs.505777 DNA-damage-inducible transcript 3 DDIT3
AB002437 Hs.12082 chromosome 5 open reading frame 26 C5orf26
NM_004864 Hs.515258 Growth differentiation factor 15 GDF15
AF235022 Hs.283148 RAB38, member RAS oncogene family RAB38
AK023963 Hs.35828 MAP/microtubule affinity-regulating kinase 3 MARK3
NM_001806 Hs.429666 CCAAT/enhancer binding protein (C/EBP), gamma CEBPG
AL080207 Hs.134585 ATP-binding cassette, sub-family A (ABC1), member 12 ABCA12
NM_017572 Hs.515032 MAP kinase interacting serine/threonine kinase 2 MKNK2
AF216292 Hs.522394 Heat shock 70kDa protein 5 (glucose-regulated protein, 78kDa) HSPA5
AJ227912 Hs.171695 Dual specificity phosphatase 1 DUSP1
AF076617 Hs.350927 Solute carrier family 25 (mitochondrial carrier; adenine nucleotide translocator), member 6 SLC25A6
NM_001605 Hs.315137 Alanyl-tRNA synthetase AARS
NM_005013 Hs.128686 Nucleobindin 2 NUCB2
NM_016947 Hs.109798 Chromosome 6 open reading frame 48 C6orf48
AJ012499 Hs.368934 Hypothetical protein MGC40157 MGC40157
AK026945 Hs.516826 Tribbles homolog 3 (Drosophila) TRIB3
NM_001731 Hs.255935 B-cell translocation gene 1, anti-proliferative BTG1
AK002164 Hs.13781 Hypothetical protein MGC35097 MGC35097
AK095051 Hs.62771 Hypothetical protein FLJ20186 FLJ20186
NM_004718 Hs.339639 Cytochrome c oxidase subunit VIIa polypeptide 2 like COX7A2L
NM_001000 Hs.300141 Ribosomal protein L39 RPL39
GB Acc UGCluster_B187 유전자 이름 공식 유전자 심볼
NM_002799 Hs.213470 Proteasome (prosome, macropain) subunit, beta type, 7 PSMB7
D17259 Hs.646223 Eukaryotic translation elongation factor 1 alpha 1
Full-length cDNA clone CS0DJ005YN17 of T cells (Jurkat cell line) Cot 10-normalized of Homo sapiens 		EEF1A1
U15197 Hs.495420 ABO blood group (transferase A, alpha 1-3-N-acetylgalactosaminyltransferase; transferase B, alpha 1-3-galactosyltransferase) ABO
GB Acc UGCluster_B187 유전자 이름 공식 유전자 심볼
AK001987 Hs.491223 Retinoic acid induced 16 RAI16
NM_016931 Hs.371036 NADPH oxidase 4 NOX4
AB032363 Hs.196534 Anaplastic lymphoma kinase (Ki-1) ALK
D86982 Hs.544636 Ankyrin repeat and sterile alpha motif domain containing 1 ANKS1
AK025624 Hs.385913 Acidic (leucine-rich) nuclear phosphoprotein 32 family, member E ANP32E
NM_013385 Hs.170944 Pleckstrin homology, Sec7 and coiled-coil domains 4 PSCD4
NM_002410 Hs.22689 mannosyl (alpha-1,6-)-glycoprotein beta-1,6-N-acetyl-glucosaminyltransferase MGAT5
AF161522 Hs.531371 claudin domain containing 1 CLDND1
AF086335 Hs.513207 Leucine-rich repeat kinase 1 LRRK1
J04974 Hs.390171 Collagen, type XI, alpha 2 COL11A2
NM_018358 Hs.361323 ATP-binding cassette, sub-family F (GCN20), member 3 ABCF3
AL110286 Hs.8071 Synaptic vesicle glycoprotein 2B SV2B
AF086224 Hs.532399 Zinc finger CCCH-type containing 11A ZC3H11A
AB027011 Hs.310893 Cold shock domain containing C2, RNA binding CSDC2
AB007972 Hs.444403 Protein phosphatase 1, regulatory (inhibitor) subunit 12B PPP1R12B
AK001814 Hs.135406 CCAAT/enhancer binding protein zeta CEBPZ
상기 연령 증가에 의해 발현 패턴이 변화하는 유전자들의 프로모터 염기 서열을 분석하여 과다 관찰되는 전사인자 결합 영역(transcription factor response element)을 정리하면 하기 표 5 내지 표 12와 같다. 즉, 표 5는 피부유래 각질형성세포에서 연령 증가에 따라 발현이 증가하는 유전자의 프로모터에 과다 관찰되는 전사인자 결합 영역 일부, 표 6은 표 5에서 p-value가 0.05이하인 TRE에 대해서만 프로모터 내 빈도를 기재한 것, 표 7은 피부유래 각질형성세포에서 연령 증가에 따라 발현이 감소하는 유전자의 프로모터에 과다 관찰되는 전사인자 결합 영역 일부, 표 8은 표 7에서 p-value가 0.05이하인 TRE에 대해서만 프로모터 내 빈도를 기재한 것, 표 9는 피부유래 섬유아세포에서 연령 증가에 따라 발현이 증가하는 유전자의 프로모터에 과다 관찰되는 전사인자 결합 영역 일부, 표 10은 표 9에서 p-value가 0.05이하인 TRE에 대해서만 프로모터 내 빈도를 기재한 것, 표 11은 피부유래 섬유아세포에서 연령 증가에 따라 발현이 감소하는 유전자의 프로모터에 과다 관찰되는 전사인자 결합 영역 일부, 표 12는 표 11에서 p-value가 0.05이하인 TRE에 대해서만 프로모터 내 빈도를 기재한 것을 나타낸다.
Figure 112012076102913-pat00001
Figure 112012076102913-pat00002
Figure 112012076102913-pat00003
Figure 112012076102913-pat00004
Figure 112012076102913-pat00005
Figure 112012076102913-pat00006
Figure 112012076102913-pat00007
Figure 112012076102913-pat00008
본 발명의 진단 키트에서 프로브로 사용되는 폴리뉴클레오티드는 연령 증가에 따라 발현이 증가하거나 감소하는 노화 마커 유전자의 전장(full length) 또는 그의 단편을 포함한다. 단편의 길이는 10개 이상의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 것이 바람직한데, 이는 프로브의 길이가 10bps이하이면 비특이적으로 결합되기 때문이다.
본 발명의 진단 키트에서 프라이머로 사용되는 폴리뉴클레오티드는 그 길이가 18-23개인 것이 바람직하다. 이는 프라이머의 길이가 18bps미만이면 비특이적으로 결합되고, 23bps를 초과하면 프라이머끼리 자체 결합하여 효율성이 떨어지며, 제작시에도 비용과 기술적인 면에서 비생산적이기 때문이다.
본 발명의 진단 키트에 포함된, 노화 마커 유전자에 의하여 코딩되는 폴리펩티드에 대한 모노클로날 항체는 일반적인 모노클로날 항체 제조방법으로 제조된다.
또한 상기 발현 패턴이 변화하는 유전자들의 프로모터에서 과다 관찰되는 전사인자 결합 부위로부터 생물정보학 기술을 이용해 추출한 전사인자인 MEF-2, FOXD3 2, SREBP-1, CP2, Nkx2-5, c-Myb 4, CREB, CRE-BP1, NRF-2 3, Freac-4, GATA-1 또는 NF-kB 3의 활성을 측정하여 노화 억제제를 스크리닝하는 리포터 유전자 분석(assay)법은 일반적인 분자생물학 기법에 의해 제조된 리포터 유전자 벡터를 이용한다. 구체적으로는 일반적인 배양 조건에서도 발현되는 유니버설(universal) 프로모터에 MEF-2, FOXD3 2, SREBP-1, CP2, Nkx2-5, c-Myb 4, CREB, CRE-BP1, NRF-2 3, Freac-4, GATA-1 또는 NF-kB 3 유전자가 결합된 플라스미드(플라스미드 1), 및 상기 전사인자들이 결합하여 전사를 활성화시킬 수 있는 DNA 서열인 TRE (Transcription Response Element)를 가지는 프로모터에 리포터 역할을 하는 반딧불(firefly) 루시퍼라제(luciferase) 유전자가 결합된 플라스미드(플라스미드 2)를 사용한다. 플라스미드 2의 TRE 부분은, MatInspector (Quandt et al., 1995) 및 Transfac (Knuppel et al., 1994)과 같은, 모티프(motif)를 예측, 발견, 분석하는 프로그램에 상기 표 1 내지 4의 유전자들의 accession ID를 입력하여 TRE 서열을 검색한 후 검색된 서열에 따라 올리고뉴클레오타이드 합성법으로 합성하여 준비한다. 플라스미드 1의 전사인자 유전자 부분은, 미국 NCBI 데이터베이스에 저장된 cDNA 서열을 참고하여, 인간 cDNA 라이브러리로부터 PCR 기법으로 증폭하여 준비한다. COS7 세포에 상기 전사인자 유전자를 지닌 플라스미드 1과 해당 TRE 프로모터-리포터 플라스미드 2를 동시에 트랜스펙션시킨 후 24시간 경과 시점에 노화 억제제 후보 약물을 처리하고 세포를 수확하여 루시퍼라제 활성을 측정하면, 노화 억제제 후보 약물이 상기 전사인자의 활성에 미치는 영향을 확인할 수 있다.
이하, 하기 구체예를 들어 본 발명을 더욱 구체적으로 설명한다. 하기 구체예는 본 발명을 설명하기 위한 것이고 한정하기 위한 것은 아니다.
<실시예 1: 노화 마커 유전자 확인>
1.인체 세포의 획득
8세에서 82세의 연령에 해당하는 사람의 둔부 피부에서 분리한 각질형성세포(NHEKs)를 1 ml 당 0.5 μg 하이드로코티손, 5 ng 표피성장인자, 5 μg 인슐린, 0.5% 우태아 뇌하수체 추출물을 함유한 무혈청 각질세포배양 배지 (Clonetics, Walkersville, MD)에서 배양하고, 섬유아세포 (NHF)는 10 % 우태아혈청을 포함한 DMEM 배지에서 배양한다. 실험에 사용된 모든 세포는 3~5차례 계대 배양된 것으로 한다.
2.인체 세포로부터 RNA 채취
3~5차례 계대 배양한 상기 세포로부터 RNA를 정제하기 위해 트리졸(trizol, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) )을 첨가해 세포를 분쇄시킨 후 클로로포름을 넣어 상층액의 RNA를 분리하였다. 얻어진 상층액의 RNA를 농축하기 위해 동량의 이소프로파놀을 넣고 원심분리하여 침전된 RNA를 얻고, 염기 제거를 위해 70% 에탄올로 침전된 RNA를 세척하였다.
3.마이크로어레이 실험
14,000 개의 인간 전사체(transcripts)가 집적된 올리고마이크로어레이 (Gaiagene, seoul, Korea)를 사용하여, 연령 증가에 따라 발현에 변화가 나타나는 유전자를 선택하고 그 발현 패턴을 확인하였다. 이 마이크로어레이 상에는 13,376 유전자와 704 개의 대조군 유전자가 집적되어 있다. 아미노-알릴 cDNA 표지(labeling) 키트 (Ambion, Austin, Texas, USA)를 이용하여 RNA 20 μg 으로부터 형광 염색된 cDNA 프로브를 제작하였다. 각 연령별 환자로부터 얻은 RNA 동량을 합친 후 Cy3로 표지하여 공통 대조군으로 활용하고, 각 연령별 환자로부터 얻은 RNA를 각각 Cy5로 표지하여 실험군으로 사용하여, 16 시간 동안 55℃에서 혼성화(hybridization)을 수행하였다. 이미지 분석을 위해 ImaGene 4.2 (Biodiscovery, Los Angeles, CA, USA)와 MAAS (Gaiagene, Seoul, Korea)를 사용하였고, SAM을 이용하여 발현 양상에 있어서 통계적으로 유의미한 변화를 보이는 유전자를 선택하였다. 그리고 Cluster 프로그램을 이용하여 발현 패턴 별로 분류하였다 (Kim S et al., 2005). 유전자 발현 패턴 및 각 연령별 유전자 발현 값의 상관성 (Pearson correlation coefficients)은 도 1 내지 도 2에 히트 맵(heat maps)으로 표현되어 있다. 도 1은 피부 유래 각질형성세포에 대한 히트 맵, 도 2는 피부 유래 섬유아세포에 대한 히트 맵이다.
유전자 발현 값의 상관성을 기준으로 할 때, 표피(각질형성세포)에서의 노화 프로세스의 전환점은 30대 중반, 진피(섬유아세포)에서의 노화 프로세스의 전환점은 30대 중반과 50대 중반에 존재하는 것으로 확인되었다. 유전자 발현 패턴 및 각 연령별 유전자 발현 값의 상관성을 기준으로 노화를 진단하는 데 활용될 수 있는 유전자 마커를 추출하여 리스트 한 결과가 상기 표 1 내지 4에 나열된 유전자이다.
4. Real-Time PCR
상기 결과를 재확인하기 위하여, 8세에서 82세의 연령에 해당하는 사람의 둔부 피부로부터 채취한 RNA 1 ㎍을 50mM 트리스-HCl(Tris-HCl, pH 8.3), 75mM KCl, 3mM MgCl2, 0.1M DTT, 10mM dNTP, 40유닛/μl RNase 저해제가 함유된 역전사 반응 완충액 25μl에 넣고, 0.5μg/μl 올리고(dT)16의 프라이머 및 200유닛 수퍼스크립트 II<SuperScript II, 집코비알엘(GiboBRL)>의 역전사 중합효소를 첨가하여 42℃에서 1시간 반응시킨다. 이후 역전사 반응 용액 2.5μl를 엠플리택(AmpliTaq)DNA 중합효소<0.04U, 퍼킨 엘멀, 쉘튼, 씨티(Perkin Elmer, Shelton, CT)>, 50mM 트리스(pH 8.3), 0.25mg/ml 우혈청알부민, 3mM MgCl2, 0.25mM dNTPs, SYBR 그린 I의 1/50,000 희석액<몰레큘라 프로브, 유진, 오알(Molecular Probes, Eugene, OR)>이 함유된 PCR 반응 완충액 50리터에 섞고, 상기 마이크로어레이 실험 결과 추출된 상기 표 1 내지 4의 유전자에 대한 프라이머 센스 및 안티센스(하기 표 13 참조)를 10μM의 첨가하여 94℃에서 30초, 53℃에서 30초, 72℃에서 1분인 사이클을 30사이클 수행하였다. 상대적인 mRNA 레벨은 아이사이클러(ICycler) 소프트웨어를 이용하여 SYBR 그린 I 형광 변화를 측정함으로써 분석하여 도 3 및 도 4에 나타내었다. 도 3은 피부 유래 각질형성세포에 대한 real-time PCR 결과를 도시한 그래프이고, 도 4는 피부 유래 섬유아세포에 대한 real-time PCR 결과를 도시한 그래프이다. 양성 대조군으로는 각 연령별 환자로부터 얻은 RNA 동량을 합친 것을 사용하였으며, 각 유전자에 대하여 양성 대조군을 기준 1로 정한 후 각 연령별 시료의 상대적인 mRNA 레벨을 측정하였다. 각 연령별 시료는, 표피(각질형성세포)에서는 30대 중반을 기준으로 클래스 1 및 클래스 2로 나누어 클래스별 평균을 내었으며, 진피(섬유아세포)에서는 30대 중반 및 50대 중반을 기준으로 클래스 1, 클래스 2 및 클래스 3으로 나누어 클래스별 평균을 내었다. Real-time PCR 결과는 마이크로어레이 결과와 일치함을 알 수 있다.
유전자 기호 프라이머 종류 프라이머 서열
BOLA1 센스(서열번호1) CTCTCGTTTCGAGGGACTGAG
안티센스(서열번호2) AGGGGGTTCCTAGAGTTTTCTT
C16orf28 센스(서열번호3) CATCCTCTTCGAGTGCAAGTC
안티센스(서열번호4) CCACTGCCGGATCTTCCTC
BCL2L2 센스(서열번호5) GCGGAGTTCACAGCTCTATAC
안티센스(서열번호6) AAAAGGCCCCTACAGTTACCA
CKS2 센스(서열번호7) ACTTCGACGAACACTACGAGT
안티센스(서열번호8) GGACACCAAGTCTCCTCCAC
KIF26A 센스(서열번호9) CGGTGACCCCGATTACTCCT
안티센스(서열번호10) CAGGCGGACCTTCGTTGTC
PRF1 센스(서열번호11) CGCCTACCTCAGGCTTATCTC
안티센스(서열번호12) CCTCGACAGTCAGGCAGTC
STMN1 센스(서열번호13) GCCCTCGGTCAAAAGAATCTG
안티센스(서열번호14) TGCTTCAAGACCTCAGCTTCA
ORC6L 센스(서열번호15) CCCGACATGCTGAGGAAAG
안티센스(서열번호16) CAAGGTCCAGGCACATGAC
UBE2C 센스(서열번호17) TGATGTCTGGCGATAAAGGGA
안티센스(서열번호18) AGCGAGAGCTTATACCTCAGG
MELK 안티센스(서열번호19) TGTGCAAAACCCAAGGGTAAC
센스(서열번호20) ACATCTGCCTCTGATCCAAGA
MAP3K14 안티센스(서열번호21) CCACCTTTTCAGAACGCATTTTC
센스(서열번호22) GACGCTTTCCCTTCCAACACA
CD59 안티센스(서열번호23) TCTGATTTTGATGCGTGTCTCA
센스(서열번호24) ATTTTCCCTCAAGCGGGTTGT
ENC1 안티센스(서열번호25) TCTGTTTCACAAGTCCTCCTACG
센스(서열번호26) GGAAGGTCCTATTTCCGGCAT
NDC80 안티센스(서열번호27) AAGACCTTGGGTATCCTTTTGC
센스(서열번호28) TGGCAGTATGTATCTTGATGCAG
DDIT3 안티센스(서열번호29) AGAACCAGGAAACGGAAACAGA
센스(서열번호30) TCTCCTTCATGCGCTGCTTT
C5orf26 안티센스(서열번호31) AAGCATTGTGGGACGGAAG
센스(서열번호32) CGAAGCTCCCCGTTTCCAA
GDF15 안티센스(서열번호33) ACCTGCACCTGCGTATCTCT
센스(서열번호34) CGGACGAAGATTCTGCCAG
RAB38 안티센스(서열번호35) GGGGAAGACCAGTATCATCAAGC
센스(서열번호36) ACCCTCGTCATGTTTCCAAATC
MARK3 안티센스(서열번호37) CTGGTCCATGTCCATCTCCT
센스(서열번호38) CGGAACCCAGTCTCCTAACA
CEBPG 안티센스(서열번호39) ACTCCAGGGGTGAACGGAAT
센스(서열번호40) CATGGGCGAACTCTTTTTGCT
ABCA12 안티센스(서열번호41) TCTTTTCTTCGCAATGGTTCCT
센스(서열번호42) GAGCTGGCATGACTTCTCTATC
MKNK2 안티센스(서열번호43) CAGAGGTGGGACAGTCACTTC
센스(서열번호44) CAGTAACGGTTCTGACCAGTC
HSPA5 안티센스(서열번호45) GCCGTCCTATGTCGCCTTC
센스(서열번호46) TGGCGTCAAAGACCGTGTTC
DUSP1 안티센스(서열번호47) CAGTACCCCACTCTACGATCA
센스(서열번호48) ACCCTCAAAATGGTTGGGACA
SLC25A6 안티센스(서열번호49) GGACTGCATTGTCCGCATC
센스(서열번호50) CGAAGTTGAGGGCTTGAGTG
AARS 안티센스(서열번호51) TCACCCAAGAGTTTGGCATTC
센스(서열번호52) CCTGGGAGGATTTTGGTGTCA
NUCB2 안티센스(서열번호53) AAGTGCGAAGATAGAACCACCA
센스(서열번호54) TCTGGAGCTTTTCTCTGAAGTGT
PSMB7 센스(서열번호55) CCAGAGTTGTGACAGCCAATC
안티센스(서열번호56) TCCAGTAACATCTACTCCCCCTA
ABO 센스(서열번호57) GCACTTCGACCTATGATCCTTTT
안티센스(서열번호58) CAGGTTCCCTAACAGCCATGC
RAI16_1 센스(서열번호59) AGGACTGGGAAGAGCATAGG
안티센스(서열번호60) GAGGTGGGAGACCCTCTGA
RAI16_2 센스(서열번호61) CTGGACCCCGCAGACATTG
안티센스(서열번호62) GCAGTAATCAAACCAGCCCAA
NOX4 센스(서열번호63) AAGCAACATTTGGGGTTCATCT
안티센스(서열번호64) GCAGAGGCTGACCTCATAGTT
ALK 센스(서열번호65) AATCGGGCGTCCAGACAAC
안티센스(서열번호66) GAGCCTGGGGATGTTCCTTC
ANKS1A 센스(서열번호67) AGAGGGCCAAATGTGAACTGT
안티센스(서열번호68) GCGCATCGTTCCTCAGAAGAA
ANP32E 센스(서열번호69) TGCCTGTGTGTCAATGGGG
안티센스(서열번호70) GCAGAGCTTCTACTGTACTGAGA
PSCD4 센스(서열번호71) CGAATCGTACCGCATCTCAG
안티센스(서열번호72) CCGAGTAGAGACCAGGTCGT
MGAT5 센스(서열번호73) AGCGCATTGGCAAGTTGGA
안티센스(서열번호74) TGCAACCAAGCTGGGAACAG
CLDND1 센스(서열번호75) GATCCCGGAAACCACAATAGC
안티센스(서열번호76) CCCCAAAGCACATCAAACCT
COL11A2 센스(서열번호77) GAACCTGGTATGCTCGTGGAG
안티센스(서열번호78) TGCCAAACCGGAATGGGAG
ABCF3 센스(서열번호79) AGCGAGTTCCCCGAAATTGAC
안티센스(서열번호80) TGCAATAGTTCCCCTACAGCTT
SV2B 센스(서열번호81) CTGGCTGATAAGCTGGGAAGG
안티센스(서열번호82) CCCAATACCGATGCCTGAGAT
ZC3H11A 센스(서열번호83) AGGGGTAAAGCTAAACCCAAAGT
안티센스(서열번호84) GGTTCCTGTAGGACACTGCTG
CSDC2 센스(서열번호85) AAGCGGACCAGGACCTATTCA
안티센스(서열번호86) CCCCTCGATGTCAGACACA
PPP1R12B 센스(서열번호87) ACCTCTGACCGATCATCAGTG
안티센스(서열번호88) ATGAGGGCACCATTTTCATCTT
CEBPZ 센스(서열번호89) TGATGCCGTTCACACACTTCA
안티센스(서열번호90) GCTTCCGATTGTCTGGCAAAAG
5. 프로모터 분석
NCBI Accession No 기준으로 상기 발현 패턴이 변화된 유전자의 프로모터 서열을 수집하였다. 업스트림(Upstream) 유전자 서열을 Ensembl 게놈 데이터베이스로부터 확보한 후 전사 개시 사이트(transcription start site)로부터 2000 bp 업스트림 영역을 포함하는 게놈 서열을 확보하였다.
MatInspector (Quandt et al., 1995) 및 Transfac (Knuppel et al., 1994) 와 같이, 모티프(motif)를 예측, 발견, 분석하는 프로그램을 이용하여, 상기 프로모터 서열 중 전사인자 결합 부위 (transcription factor binding site, TFBS)를 검색한 후, 하이퍼지오메트리 통계 방법으로 과다출현 혹은 과소출현하는 전사인자 결합 부위를 선별하였다. 그 후, 상기 전사인자 결합 부위로부터 생물정보학 기술을 이용하여 전사인자를 추출하였다.
도 5 내지 도 8은 피부 유래 각질형성세포 또는 섬유아세포에서 연령 증가에 따라 발현이 증가 또는 감소하는 유전자와 그 프로모터에서 과다 관찰되는 전사인자와의 상관 관계 매트릭스(히트 맵) 및 네트워크를 도시한 그래프이다. 상기 도 5 내지 도 8에 의하면, 발현 변화를 보이는 상기 유전자 클러스터(세로 변)와 그 유전자 클러스터를 조절한 것으로 예측되는 전사인자(가로 변) 간의 조절 네트워크의 연결 고리를 확인할 수 있다.
서열목록 전자파일 첨부

Claims (10)

  1. EEF1A1(D17259)의 폴리뉴클레오티드 또는 그 단편으로서 10개 이상의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드,
    또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드; 및
    상기 폴리뉴클레오티드를 표면에 결합시킨 고상 지지체를 포함하며,
    진단 대상 피부 유래 섬유아세포의 전사체 중에서 상기 폴리뉴클레오티드에 혼성화된 전사체의 양을 측정하여, 연령별 세포에서 상기 폴리뉴클레오티드에 혼성화된 전사체의 양과 비교하여, 진단 대상 피부가 어느 연령에 해당하는지 진단하는 것을 특징으로 하는 피부 노화 진단 키트.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 키트는 PSMB7(NM_002799) 및 ABO(U15197)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 또는 그 단편으로서 10개 이상의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드,
    또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드; 및
    상기 폴리뉴클레오티드를 표면에 결합시킨 고상 지지체를 포함하며,
    진단 대상 피부 유래 섬유아세포의 전사체 중에서 상기 폴리뉴클레오티드에 혼성화된 전사체의 양을 측정하여, 연령별 세포에서 상기 폴리뉴클레오티드에 혼성화된 전사체의 양과 비교하여, 진단 대상 피부가 어느 연령에 해당하는지 진단하는 것을 특징으로 하는 피부 노화 진단 키트.
  3. EEF1A1(D17259) 폴리뉴클레오티드의 단편으로서 18-23개의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드; 및
    상기 EEF1A1(D17259) 폴리뉴클레오티드에 상보적인 폴리뉴클레오티드의 단편으로서 18-23개의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하며,
    진단 대상 피부 유래 섬유아세포의 전사체에서 상기 폴리뉴클레오티드들을 프라이머로 하여 증폭된 양을 측정하여, 연령별 세포에서 상기 폴리뉴클레오티드들을 프라이머로 하여 증폭된 양과 비교하여, 진단 대상 피부가 어느 연령에 해당하는지 진단하는 것을 특징으로 하는 피부 노화 진단 키트.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 키트는 PSMB7(NM_002799) 및 ABO(U15197)로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리뉴클레오티드의 단편으로서 18-23개의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드; 및
    상기 PSMB7(NM_002799) 및 ABO(U15197)로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리뉴클레오티드에 상보적인 폴리뉴클레오티드의 단편으로서 18-23개의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 더 포함하며,
    진단 대상 피부 유래 섬유아세포의 전사체에서 상기 폴리뉴클레오티드들을 프라이머로 하여 증폭된 양을 측정하여, 연령별 세포에서 상기 폴리뉴클레오티드들을 프라이머로 하여 증폭된 양과 비교하여, 진단 대상 피부가 어느 연령에 해당하는지 진단하는 것을 특징으로 하는 피부 노화 진단 키트.
  5. EEF1A1(D17259) 유전자에 의하여 코딩되는 폴리펩티드에 대한 모노클로날 항체를 하나 이상 포함하며,
    진단 대상 피부 유래 섬유아세포에서 상기 항체에 결합된 항원의 양을 측정하여 연령별 세포에서 상기 항체에 결합된 항원의 양과 비교하여, 진단 대상 피부가 어느 연령에 해당하는지 진단하는 것을 특징으로 하는 피부 노화 진단 키트.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 키트는 PSMB7(NM_002799) 및 ABO(U15197)으로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자에 의하여 코딩되는 폴리펩티드에 대한 모노클로날 항체를 하나 이상 더 포함하며,
    진단 대상 피부 유래 섬유아세포에서 상기 항체에 결합된 항원의 양을 측정하여 연령별 세포에서 상기 항체에 결합된 항원의 양과 비교하여, 진단 대상 피부가 어느 연령에 해당하는지 진단하는 것을 특징으로 하는 피부 노화 진단 키트.
  7. 진단 대상 진피 중의 EEF1A1(D17259) 유전자의 발현량을 측정하여, 연령별 발현량과 비교하여, 진단 대상 피부가 어느 연령에 해당하는지 판단하는 것을 특징으로 하는 피부 노화의 정도를 진단하기 위해 필요한 정보를 제공하는 방법.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 방법은 진단 대상 진피 중의 PSMB7(NM_002799) 및 ABO(U15197) 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자의 발현량을 더 측정하여, 연령별 발현량과 비교하여, 진단 대상 피부가 어느 연령에 해당하는지 판단하는 것을 특징으로 하는 피부 노화의 정도를 진단하기 위해 필요한 정보를 제공하는 방법.
  9. 피부 노화 억제제를 스크리닝하는 방법으로서,
    세포에 시험 화합물을 처리하는 단계; 및
    시험 화합물 처리 후 세포 내 EEF1A1(D17259) 유전자의 발현이 억제되는지를 확인하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 피부 노화 억제제 스크리닝 방법.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 방법은 시험 화합물 처리 후 세포 내 PSMB7(NM_002799), 및 ABO(U15197)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자의 발현이 억제되는지를 확인하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 피부 노화 억제제 스크리닝 방법.
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Title
Exp. Gerontol, Vol. 41, No. 4, pp. 387~397 (2006.03.10.) *

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