KR101315592B1 - 다중모드 중합효소 연쇄반응-모세관 전기영동법을 이용한 유전자 복제수 변이의 분석방법 - Google Patents

다중모드 중합효소 연쇄반응-모세관 전기영동법을 이용한 유전자 복제수 변이의 분석방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 다중모드 중합효소 연쇄반응-모세관 전기영동법을 이용한 유전자 복제수 변이의 분석방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 프라이머를 설계하는 단계(단계 1); 실시간 정량적 중합효소 연쇄반응(qPCR)을 이용하여 최대 배가 주기(CMD)를 결정하는 단계(단계 2); 다중모드 중합효소 연쇄반응(PCR)을 수행하고 모세관 전기영동(CE)에 의해 검출하는 단계(단계 3); 및 검출된 피크를 통계분석하여 복제수를 결정하는 단계(단계 4)를 포함하는 다중모드 PCR-CE 방법을 이용한 유전자 복제수 변이의 측정방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 다중모드 PCR-CE 분석은 1-5의 다양한 복제 범위에서 염색체의 복제수를 신뢰적으로 결정할 수 있으며, 종래 수행되던 qPCR에 비하여 높은 신뢰성을 나타내고, 통상적으로 사용되는 CE 장치에도 적용할 수 있으므로, 임상적인 세팅에서 다중 질환-관련된 CNV의 정확한 분석에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

다중모드 중합효소 연쇄반응-모세관 전기영동법을 이용한 유전자 복제수 변이의 분석방법{Method for analyzing copy number variation in chromosome by multiplex PCR-CE Assay}
본 발명은 다중모드 중합효소 연쇄반응-모세관 전기영동법을 이용한 유전자 복제수 변이의 분석방법에 관한 것이다.
비교유전체보합법(Array-CGH)과 같은 진보된 유전자의 광분석은 일반적으로 복제수 변이(CNV)라 불리는 광범위한 유전자 구조 변이의 규명을 이끌어왔다. 비록 CNV의 생물학적 효과는 여전히 밝히기 어려우나, 많은 CNV들은 다양한 표현형 및 자가면역 질환 및 정신질환과 같은 질환에 다양한 비율로 관련되어 있음이 보고되어 왔다[Beckmann, J. S., Estivill, X., Antonarakis, S. E., Nat Rev Genet 2007, 8, 639-646.; McCarroll, S. A., Hum Mol Genet 2008, 17, R135-142.; Yim, S. H., Chung, Y. J., Jin, E. H., Shim, S. C., Kim, J. Y., Kim, Y. S., Hu, H. J., Shin, S.; H., Pae, H. O., Zouali, M., Chung, H. T., Mol Immunol, in press, DOI:10.1016.; 및 Cho SC, Yim SH, Yoo HK, Kim MY, Jung GY, Shin GW, Kim BN, Hwang JW, Kang JJ, Kim TM, Chung YJ. Psychiatr Genet 2009, 19, 177-185]. 따라서, CNV의 신뢰적이고 효율적인 측정은 CNV-관련 질환을 진단하는 도구의 개발에 필수적일 것이다.
DNA 복제수 측정을 위한 다양한 기술이 있다. 비교유전체보합법은 CNV 연구를 위한 주요 기술중 하나이나, 불가피한 비특이성 혼성 때문에 작은 배수 변화를 구분하는 것이 어렵다[Szantai, E., Elek, Z., Guttman, A., Sasvari-Szekely, M., Electrophoresis 2009, 30, 1098-1101]. 이런 이유로, 상기 비교유전체보합법에 의해 검출된 CNV는 실시간 정량화 중합효소 연쇄반응(qPCR)과 같은 독립적인 실험을 추가로 수행하여야 한다.
최근, 차세대 시퀀싱 기술이 유전자 복제수 분석에 사용되고 있다[Park, H., Kim et al., Nat Genet 2010, 42, 400-405.; Kidd, J. M. et al., Nature 2008, 453, 56-64]. 그러나 이 기술은 CNV 분석을 위한 높은 coverage reading을 요구하며, CNV 측정은 독립적인 입증(validation)을 또한 필요로 한다. 따라서 비용이 매우 높고, 결과를 이해하기 어려우므로, 그 당시 일반적인 유전자 검색분석으로서 적절하지 못하였다. 또한, CNV의 유전자 광 스크리닝은 신규 질환 관련 타겟의 발견에 필수적이나, 대량 샘플 세트에서 타겟 CNV 연구에 유용하지 못했다.
이러한 목적을 위해 실시간 qPCR이 현재 정량적인 유전자 분석용 첨단 기술로서 사용되는데, 이는 넓은 동역학범위(109의 크기)[Weaver, S. et al, Methods 2010, 50, 271-276], 및 역치 주기(threshold cycle)와 초기 타겟 양 사이에 선형적인 상관관계가 재현성 있게 관찰되기 때문이다[Deepak, S. et al., Curr Genomics 2007, 8, 234-251]. 그러나, 어떤 한계들이 극복해야 할 대상으로 여전히 남아있다. qPCR 분석의 민감도는 복제수 차이를 구별할 만큼 충분히 높지 않다. 이의 광범위한 동역학 범위에도 불구하고, qPCR 기반 분석의 고유 변수 때문에 1.5배 변화와 같은 작은 변화는 신뢰성 있게 측정되지 못한다. 또한, 유사한 DNA 복제수를 갖는 샘플들 사이의 신뢰성 있는 식별을 위해, 다중 시간적 반복 분석이 요구된다. 나아가, qPCR은 다중모드 분석에 적합하지 않다. 예컨대, 다중 타겟을 검출할 때, 다른 것들로부터 하나의 타겟을 구별하기 위해 각 타겟의 분리 반응이 요구된다[Bustin, S. A., J Mol Endocrinol 2002, 29, 23-39]. 또한, 형광 태그의 제한된 이용가능성 및 스펙트럼 겹침 때문에, qPCR은 한 분석당 최고 4개의 타겟만을 분리할 수 있다. 그러나, qPCR에서 성공적인 4중 분석을 위해 매 분석에 형광 태그의 주의 깊은 조합이 필수적이고[Bustin, S. A., J Mol Endocrinol 2002, 29, 23-39], 이는 임상적인 진단툴로서 qPCR의 중대한 결점이다.
이러한 한계점을 극복하기 위하여, 다중모드 PCR과 결합된 모세관전기영동(CE) 기반 방법이 개발되었다[Shin, G. W. et al., Biotechnol Bioeng 2010, 106, 167-172.; Shin, G. W. et al., Electrophoresis 2010, 31, 2405-2410.]. 이는 다중 타겟과 내부 대조군의 다중모드 증폭후에 개별적인 타겟들이 이들의 전기영동 이동도에 의해 식별되고, 내부 대조군에 대한 상대적인 피크 면적에 의해 정량화될 수 있기 때문이다. 그러나, 작은 동영학 범위 및 신호 포화가 문제점으로서 일반적으로 언급된다.
이 문제들은 검출 시간을 통해 제어될 수 있다. CE 분리 및 검출은 PCR 증폭의 말단에서 이루어지며, 이를 말단-점(end-point) 검출이라고 부른다. 말단-점 검출은 qPCR과 같이 광범위한 동역학 범위를 달성할 수 없다. 그러나, CNV 분석에서 광범위한 동역학 범위는 요구되지 않는다. 왜냐하면 10배 이상의 변화는 거의 유전자 복제수에서는 관찰되지 않기 때문이다. 예를들면, Hollox등의 보고서에서, 인간 게놈에서 가장 복제수가 다양한 유전자 중 하나인 β-defensin gene 유전자의 복제수는 1 내지 5 사이이며, 단지 8%의 이들의 연구 비율로 함유된 복제수가 6을 초과한다. 따라서, 작은 복제수 변화들 간의 민감한 구별은 CNV 분석 시스템에서 매우 중요하다. 한편, PCR에서 증폭 효율은 매 주기 감소되므로, 증폭은 거의 마지막에 포화되고, 말단-점 검출을 반정량적으로 만들수 있다. 검출이 신호 포화 전에 일어나기만 하면, 유전자 복제수 변화는 CE 장치에 의해 정확하게 측정될 수 있다. 따라서 관심있는 유전자의 CNV 검출을 위해 정확한 분석을 위한 최적 PCR 조건을 결정하는 것이 필수적이다.
다중모드 PCR 및 CE를 기반으로 하는 분석에 영향을 미치는 다양한 파라미터 가운데, 프라이머 설계 및 검출 주기는 모두 가장 중요한 것으로 알려져 있다. 왜냐하면 프라이머 설계는 분석의 특이성을 결정하고, 검출 주기는 정량적인 측정의 정확함에 영향을 미치기 때문이다. 이전의 다중모드 분석의 개발의 효과는 검출 주기 보다는 주로 프라이머 설계에 초점을 맞추었다. 다중모드 PCR용 타겟 특정 프라이머를 설계하기 위한 여러 계산 도구가 이용가능함에도 불구하고, 검출 주기는 실험적으로 결정되어야 하는 것으로 남아있다. 따라서, 다중모드 PCR 및 CE에 의한 정확한 측정을 위해, 검출 주기 또한 정확히 설계해야 한다.
이에, 본 발명자는 관심있는 유전자의 CNV 검출을 빠르고 정확하게 수행하기 위한 방법을 연구하던 중, 크기가 모두 다른 프라이머를 사용하고, CMD(Maximum double cycle)를 측정한 다음 다중모드 PCR-CE 방법을 이용함으로써 여러 개의 유전자에 대한 CNV(copy number variation)를 동시에 신속하고 정확하게 측정할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 다중모드 PCR-CE 방법을 이용한 유전자 복제수 변이의 측정방법을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
프라이머를 설계하는 단계(단계 1);
실시간 정량적 중합효소 연쇄반응(qPCR)을 이용하여 최대 배가 주기(CMD)를 결정하는 단계(단계 2);
다중모드 중합효소 연쇄반응(PCR)을 수행하고 모세관 전기영동(CE)에 의해 검출하는 단계(단계 3); 및
검출된 피크를 통계분석하여 복제수를 결정하는 단계(단계 4)
를 포함하는 다중모드 PCR-CE 방법을 이용한 유전자 복제수 변이의 측정방법을 제공한다.
본 발명에 따른 다중모드 PCR-CE 분석은 1X~5X의 미세한 복제 범위에서 염색체의 복제수를 신뢰적으로 결정할 수 있으며, 종래 수행되던 qPCR에 비하여 높은 신뢰성을 나타내고, 통상적으로 사용되는 CE 장치에도 적용할 수 있으므로, 임상적인 세팅에서 질환관련 CNV를 다중모드로 정확하게 분석할 필요가 있는 경우 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 본 발명에 따른 다중모드 PCR-모세관 전기영동(CE)법을 이용한 유전자 복제수 변이의 분석방법을 나타내는 흐름도이다.
도 2는 본 발명의 일실시예에 따른 유전자 qPCR법을 이용한 X 염색체(상부) 및 2배체 대조군(하부)의 최대 배가 주기(CMD) 결정용 그래프이다.
도 3은 본 발명의 일실시예에 따른 X 염색체 및 2배체 대조군의 다중모드 PCR 산물의 전기영동도이다.
도 4는 본 발명의 일실시예에 따른 다중모드 PCR-CE법을 이용한 X 염색체의 복제수 그래프의 상관계수 및 종래 qPCR법을 이용한 X 염색체의 복제수 그래프의 상관계수를 비교한 그래프이다.
도 5는 본 발명의 일실시예에 따른 상염색체 및 2배체 대조군의 다중모드 PCR 산물의 전기영동도이다.
도 6은 본 발명의 일실시예에 따른 다중모드 PCR-CE법을 이용한 상염색체의 복제수 및 종래 qPCR법을 이용한 상염색체의 복제수를 비교한 그래프이다.
도 7은 본 발명의 일실시예에 따른 다중모드 PCR-CE법을 이용한 상염색체의 복제수의 상관계수를 나타낸 그래프이다.
도 8은 본 발명의 일실시예에 따른 상염색체 및 2배체 대조군의 다중모드 PCR 산물을 ABI Prism 3130xl 유전자 분석기를 이용하여 CE 분석한 전기영동도이다.
도 9는 본 발명의 일실시예에 따른 다중모드 PCR-CE법을 이용한 상염색체의 복제수 및 다중모드 PCR 산물을 종래 CE 분석법을 이용하여 얻은 상염색체의 복제수를 비교한 그래프이다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명은
프라이머를 설계하는 단계(단계 1);
실시간 정량적 중합효소 연쇄반응(qPCR)을 이용하여 최대 배가 주기(CMD)를 결정하는 단계(단계 2);
다중모드 중합효소 연쇄반응(PCR)을 수행하고 모세관 전기영동(CE)에 의해 검출하는 단계(단계 3); 및
검출된 피크를 통계분석하여 복제수를 결정하는 단계(단계 4)
를 포함하는 다중모드 PCR-CE 방법을 이용한 유전자 복제수 변이의 측정방법을 제공한다.
먼저, 단계 1은 프라이머를 설계하는 단계이다.
본 발명에 따른 유전자 복제수 변이의 측정방법에 있어서, 상기 프라이머는 하기 세 조건을 만족시키는 것이 바람직하다.
첫째로, 각 PCR 산물의 크기는 CE 분리를 위해 달라야 한다.
둘째로, 열처리 온도는 다중모드 PCR을 위해 일정해야 한다.
셋째로, 각 프라이머는 qPCR 측정에 적합해야 한다.
따라서, 본 발명에서, 상기 프라이머는 크기가 모두 다른 프라이머를 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명에 따른 유전자 복제수 변이의 측정방법에 있어서, 상기 프라이머는 당분야에서 통상적으로 사용되는 프로그램을 이용하여 설계할 수 있으며, 예를 들면, PrimerQuest 프로그램(http://www.idtdna.com/Scitools/Applications/Primerquest) 등을 이용하여 설계할 수 있다.
상기 프라이머에 있어서 UCSC 데이터베이스(http://genome.ucsc.edu/)를 스크리닝함으로써 특정 시퀀스를 확인할 수 있다.
다음으로, 단계 2는 최대 배가 주기(CMD)를 결정하는 단계이다.
상기 단계에서 상기 CMD는 실시간 정량적 중합효소 연쇄반응(qPCR)을 이용하여 결정하는 것이 바람직하다.
다중모드 PCR 및 CE에 의한 정확한 측정을 위해, 검출은 모든 타겟들이 매 주기에 배가되는 동안 수행되어야 한다. 따라서, 검출 주기의 결정 전에 PCR 폭의 민감한 모니터링이 요구된다. qPCR은 원래 DNA 또는 RNA의 정량화를 위해 개발되었고, 매 주기에 증폭된 부분(fragment)을 모니터하기 때문에, 신호가 배가되는 주기를 찾을 수 있다. 따라서, qPCR은 다중모드 CNV 분석에서 최적 검출 주기의 결정에 효과적인 방법이 될 수 있다.
본 발명에 따른 유전자 복제수 변이의 측정방법에 있어서, 상기 qPCR은 당업계에서 통상적으로 사용되는 시스템을 이용하여 수행할 수 있으며, 예를 들면 유전자 Mx3000P qPCR 시스템(Stratagene, La Jolla, CA)을 이용하여 qPCR을 수행할 수 있다.
본 발명에 따른 유전자 복제수 변이의 측정방법에 있어서, 상기 qPCR 수행시 열 사이클링은 하기의 조건을 사용하는 것이 바람직하다: 처음 1 사이클은 90~100℃에서 25~35초 동안, 이후 90~100℃에서 5~10초 동안, 55~65℃에서 5~15초 동안 및 70~75℃에서 15~25초 동안 30~50 번 반복하는 것이 바람직하다.
PCR 반응 후에는 특정 증폭을 확인하기 위하여 55℃부터 95℃까지 0.2℃/초 간격으로 분해 곡선 분석을 수행할 수 있다. 모든 프라이머 쌍의 효율을 평가하기 위하여, 표준 곡선을 MxPro-3000P v4.10 소프트웨어(Stratagene, La Jolla, CA)를 이용하여 계산할 수 있다.
상대적인 정량화는 문헌[Yim, S. H. et al., Hum Mol Genet 2010, 19, 1001-1008]에 개시된 CT 법에 의해 수행될 수 있다.
본 발명에 따른 유전자 복제수 변이의 측정방법에 있어서, 상기 CMD는 먼저 각 타겟에 대한 CMD를 결정한 다음, 이중 최소값을 선택하여 최종 CMD를 결정하는 것이 바람직하다.
결정된 최대 배가 주기(CMD)를 가지고, 이후 다중모드 PCR-CE DNA 복제 수 분석 실험을 셋업할 수 있다.
다음으로, 단계 3은 다중모드 중합효소 연쇄반응(PCR)을 수행하고 모세관 전기영동(CE)에 의해 검출하는 단계이다.
본 발명에 따른 유전자 복제수 변이의 측정방법에 있어서, 주입하는 주형 DNA의 양은 예상되는 DNA 복제 수 변이(1-8 복제)를 고려하여 반응 혼합물의 20 ul 당 8~12 ng을 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명에 따른 유전자 복제수 변이의 측정방법에 있어서, 열 사이클링 조건은 상기 qPCR과 동일하게 수행될 수 있으며, 약간의 변형도 가능하나, 이에 제한되지는 않는다. 예를 들면, 처음 1 사이클은 95 ℃에서 4분 동안, 이후 95℃에서 30초, 60℃에서 30초 및 72℃에서 30초 동안 22-24회 반복, 마지막 사이클은 72℃에서 1분 동안 MyCycler thermocycler(Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA)를 이용하여 수행할 수 있다.
본 발명에 따른 유전자 복제수 변이의 측정방법에 있어서, 상기 CE는 PCR 산물을 가지고 고감도 DNA 키트(Agilent, Palo Alto, CA)에서 Agilent 2100 생물분석기(Agilent, Palo Alto, CA)를 이용하여 검출하는 방법 또는 POP7 고분자(Applied Biosystems, Foster City, CA)에서 ABI Prism 3130xl 유전자 분석기(Applied Biosystems, Foster City, CA)를 이용하여 검출하는 방법을 사용할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
다음으로, 단계 4는 검출된 피크를 통계분석하여 복제수를 결정하는 단계이다.
상기 분석기에서 얻은 기준선-수정된 피크 면적은 Agilent 2100 전문가 소프트웨어(Agilent, Palo Alto, CA), GeneMapper 소프트웨어(Applied Biosystems, Foster City, CA) 등을 이용하여 분석할 수 있고, 피크 면적의 비율(타겟/DC)를 계산하여 DNA 복제수를 결정할 수 있다.
이때, 상기 다중모드 PCR에서 적절한 검출 범위 내에 특정 밴드 및 신호 세기가 나타나지 않을 때, DNA 복제수로 결정된다.
본 발명에 따른 다중모드 PCR-CE 분석은 1-5의 다양한 복제 범위에서 염색체의 복제수를 신뢰적으로 결정할 수 있으며, 종래 수행되던 qPCR에 비하여 높은 신뢰성을 나타내고, 통상적으로 사용되는 CE 장치에도 적용할 수 있으므로, 임상적인 세팅에서 다중 질환-관련된 CNV의 정확한 분석에 유용하게 사용될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예들은 본 발명을 예시하는 것으로 본 발명의 내용이 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
< 제조예 > 세포주 및 유전자 DNA 추출
각각 1-5 복제의 X 염색체를 가지는 GM10851, GM15510, GM04626, GM01416 및 GM06061 세포주를 코리엘(Coriell) 의약 리서치 연구소(Camden, NJ)에서 구입하였다. 상기 세포주를 제공자의 지시에 따라 유지시켰다.
이후, 유전자 DNA를 DNeasy Blood & Tissue 키트(Qiagen, Valencia, CA)를 이용하여 사용법에 따라 분리하였다. 상기 유전자 DNA의 양과 질은 NanoDrop ND-1000 스펙트로포토미터(NanoDrop Technologies, Wilmington, DE)를 이용하여 측정하였다.
< 실시예 1> 본 발명의 다중모드 PCR 및 모세관 전기영동 기반의 X 염색체의 복제 수 측정
단계 1 : 프라이머 설계
PCR 프라이머들은 PrimerQuest 프로그램 (http://www.idtdna.com/Scitools/Applications/Primerquest)을 이용하여 설계하였다.
일정한 변성 온도(60℃) 하에서 PCR 반응 특이성을 증명하기 위하여, 각 프라이머 세트에 PCR 및 아가로스 겔 전기영동을 수행하였다. 또한, 프라이머에 있어서 시퀀스들을 반복하지 않고 특정 시퀀스를 확인하기 위하여 UCSC 데이터베이스( http://genome.ucsc.edu/)를 스크리닝하였다.
설계된 프라이머의 정보를 하기 표 1에 나타내었다.
프라이머 세트(Primer Set) X 염색체
코드/유전자(Code/Gene) Chr-X/TMEM164
사이토밴드(Cytoband) Xq22.3
프라이머 시퀀스 TCTACCAGTGCCGTTGACATCCAA(서열번호 1)
AACTGGTGAGGCAGGCTAGTTCAT(서열번호 2)
증폭 크기(bp) 189
변성 온도(℃) 60
프라이머의 PCR 효율(%) 106.0
단계 2 : 실시간 qPCR 수행하여 최대 배가 주기( C MD ) 결정
다음으로 유전자 Mx3000P qPCR 시스템(Stratagene, La Jolla, CA)을 이용하여 qPCR을 수행하였다.
유전자 qPCR을 위한 2배체 대조군(dipole control; DC)으로서, RNase P를 타겟팅하는 프라이머(Cat. No. 4316844, Applied Biosystems, Foster City, CA)를 사용하였다. 10μl의 반응 혼합물에는 1X Maxima SYBR green qPCR Master Mix (Fermentas, Eugene, OR), 5 ng의 주형 DNA 및 5 pmole의 프라이머들이 함유되었다. 열 사이클링은 하기의 조건으로 이루어졌다: 처음 1 사이클은 95℃에서 30초 동안, 이후 95℃에서 5초 동안, 60℃에서 10초 동안 및 72℃에서 20초 동안 40 번 반복하였다. PCR 반응 후에는 특정 증폭을 확인하기 위하여 55 ℃부터 95℃까지 0.2℃/초 간격으로 분해 곡선 분석을 수행하였다. 모든 프라이머 쌍의 효율을 평가하기 위하여, 표준 곡선을 MxPro-3000P v4.10 소프트웨어(Stratagene, La Jolla, CA)를 이용하여 40, 20, 10, 5, 2.5 및 1.25 ng의 주형 유전자 DNA(GM10851)의 6개의 순차적인 희석액으로 나누었다. 각 프라이머 세트의 실험적으로 결정된 프라이머 효율을 상기 표 1에 나타내었다.
상대적인 정량화는 문헌[Yim, S. H. et al., Hum Mol Genet 2010, 19, 1001-1008]에 개시된 CT 법에 의해 수행되었다. 모든 실험들은 3번 반복하였으며, 강도 비율의 평균값±표준편차(SD)로 플롯하였다.
상기 qPCR의 분석 결과를 도 2에 나타내었다.
도 2의 상부 그래프는 타겟인 Xq22.3 유전자위에 대한 qPCR 결과이고, 하부 그래프는 DC 유전자위에 대한 qPCR 결과이다. 상기 도 2에서 다이아그램 상의 숫자들은 주기 n 및 주기 n-1 사이의 dRn 비율을 나타내고, CMD는 증폭 곡선과 도트 라인의 교차점을 나타낸다.
세 번 반복 실험을 거쳐서 도 2에 나타낸 바와 같이, 23 PCR 주기에 의해 양쪽 타겟의 신호가 배가되는 것이 발견되었다. 그러나 PCR의 23 주기는 이후 생물분석기에 의해 CE의 이론적 정량화 범위를 초과하는 신호 세기를 야기하였다.
따라서, 최종적으로 CMD를 다중모드 PCR-CE 분석을 위한 적합한 신호 세기 범위를 형성하는 22 주기로 책정하였다.
이후, 상기 CMD를 바탕으로 다중모드 PCR-CE DNA 복제 수 분석 실험을 셋업하였다.
단계 3 : 다중모드 PCR -모세관 전기영동법 수행
다중모드 PCR-모세관 전기영동(CE)법을 착수하기 위하여 상기 유전자 qPCR 조건에서 다중모드 PCR을 수행하였다.
다중모드 PCR은 1X Maxima Hot Start PCR Master Mix (Fermentas, Foster, CA), 10 ng의 주형 DNA 및 10 pmole의 프라이머들(타겟 유전자위를 위한 4세트의 프라이머들 및 DC용 1세트의 프라이머)를 함유한 반응 혼합물 20μl를 가지고 수행하였다. 열 사이클링 조건은 하기와 같은 약간의 변형을 제외하고 유전자 qPCR과 동일하였다: 처음 1 사이클은 95℃에서 4분 동안, 이후 95℃에서 30초, 60℃에서 30초 및 72℃에서 30초 동안 22-24회 반복, 마지막 사이클은 72℃에서 1분 동안 MyCycler thermocycler(Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA)를 이용하여 수행하였다.
상기 CE는 1μl의 PCR 산물을 가지고 두 가지 형태의 시스템을 이용하여 수행하였다: 고감도 DNA 키트(Agilent, Palo Alto, CA)에서 Agilent 2100 생물분석기(Agilent, Palo Alto, CA)를 이용, 및 POP7 고분자(Applied Biosystems, Foster City, CA)에서 ABI Prism 3130xl 유전자 분석기(Applied Biosystems, Foster City, CA)를 이용하였다.
상기 2100 생물분석기에서 얻은 기준선-수정된 피크 면적은 Agilent 2100 전문가 소프트웨어 (Agilent, Palo Alto, CA)를 이용하여 분석하였고, 피크 면적의 비율(타겟/DC)를 계산하였다. 3130xl 유전자 분석기에서 얻은 피크 면적은 GeneMapper 소프트웨어 (Applied Biosystems, Foster City, CA)를 이용하여 분석하였다.
상기 다중모드 PCR에서 적절한 검출 범위 내에 특정 밴드 및 신호 세기가 나타나지 않을 때, 우리는 DNA 복제 수로 결정하였다.
상기 다중모드 PCR-CE 분석의 결과를 도 3에 나타내었다.
도 3은 본 발명에 따른 다양한 복제 수를 갖는 X 염색체에 대한 타겟들의 다중 PCR 산물을 나타내는 전기영동도이다.
도 3에 나타낸 바와 같이, 더 높은 X 복제는 투여 의존 방법에 따라 상대적으로 높은 피크를 나타내었으며, 이로부터 상기 다중모드 PCR-모세관 전기영동(CE)법을 통하여 X 염색체의 1 복제 수 내지 5 복제 수를 식별할 수 있음을 알 수 있다.
단계 4 : 통계적 분석
상관계수는 SPSS version 14.0.0 소프트웨어(SPSS Inc, Chicago, IL)를 이용하여 계산하였다.
계산 결과를 도 4에 나타내었다.
도 4에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 다중모드 PCR-CE법으로 분석한 X 염색체의 복제수 그래프는 직선형의 좋은 상관관계를 갖는 것으로 나타났으며, 이때 상관계수는 0.996으로 나타났다.
< 비교예 1> 종래 PCR 분석과 비교
다중모드 PCR-CE 분석에 의한 정확성 및 신뢰성을 검증하기 위하여, 통상적으로 사용되는 분석실험 중 하나인 종래 단일 qPCR 분석과 비교하여 도 4에 나타내었다.
도 4에 나타낸 바와 같이, 정확성에 있어서, 양쪽 실험은 복제 수 측정에 있어서 일관성 있는 상관관계를 나타냈으며, 본 발명은 다중모드 PCR-CE 분석은 상관계수는 0.996으로서 qPCR(0.898)에 비하여 더 높은 신뢰성을 나타내었다.
또한, 본 발명에 따른 다중모드 PCR-CE 분석에서 5 복제를 갖는 X 염색체의 복제 수는 4.604로 측정되었으며, 이는 qPCR을 사용하여 최근에 보고한 Weaver 등의 문헌(4.56)[Weaver, S. et al., Methods 2010, 50, 271-2]과 일치하였다.
그들은 또한 실시간 qPCR에 의해 4-복제 샘플로부터 5-복제 샘플을 구별하는데, 적어도 18번의 반복 실험이 수행되었다고 주장했다. 이러한 결과는 1 복제 차이의 구별에 있어서 본 발명의 다중모드 PCR-CE 분석법의 우수성을 나타낸다.
< 실시예 2> 본 발명의 다중모드 PCR 및 모세관 전기영동 기반의 상염색체의 복제 수 측정
상염색체에서 복제수 변이(CNV)를 분석하기 위한 본 발명의 다중모드 PCR-CE 적용가능성을 증명하기 위하여, Agilent 1M CNV 정렬을 사용하여 광범위한 유전자로부터 검출된 GM10851(참조) 및 GM15510(측정) 사이의 CNV들로부터 무작위로 선택된 상염색체를 가로지르는 4개의 CNV 지역 및 복제수 변화없는 2개 지역(NC-1 및 NC-2)의 복제수를 실시예 1과 동일한 방법으로 측정하였다.
6개의 타겟 및 상기 6개의 타겟에 대한 특정 프라이머를 설계하고 이들을 다중모드 PCR용 CMD에 따라 2개의 세트(세트 1 및 세트 2)로 그룹화하고, 이를 각각 표 2 및 표 3에 나타내었다. 상기 CMD에 있어서, 세트 1은 22 주기, 세트 2는 24 주기로 결정되었다.
프라이머 세트
(Primer Set)		 세트 1
코드/유전자
(Code/Gene)		 NC-1/SLC35F3 G-1/- L-1/PCDH15
사이토밴드
(Cytoband)		 1q42.2 4p15.1 10q21.1
프라이머 시퀀스 5'-ACAGAAGAGGCAACCAAGAGACCA-3'(서열번호 3) 5'-GCATTGCTCCACCAGAGTGCATTT-3'(서열번호 5) 5'-GTTCTTGCCCAGGTCCATATAA-3'(서열번호 7)
5'-TGGCTTCAACAGTGGCACAACATC-3'(서열번호 4) 5'-TGGGCTCCTCTTACTCAATTGCCA-3'(서열번호 6) 5'-AAATGGCAAACTGGACAGAAGT-3'(서열번호 8)
증폭 크기(bp) 113 176 138
변성 온도(℃) 60 60 60
프라이머의 PCR 효율(%) 100.9 100.4 100.0
복제 상태 변화 없음 얻음 잃음
프라이머 세트
(Primer Set)		 세트 2
코드/유전자
(Code/Gene)		 NC-2/KIAA1693,NBPF20 G-2/SDK1 L-2/SIGLEC14
사이토밴드
(Cytoband)		 1q21.1 7p22.2 19q13.33
프라이머 시퀀스 5'-ATCCAAACAGGATGGCTCCTTCA-3'(서열번호 9) 5'-TTGGCGTAGGCATCACTTCTGACT-3'(서열번호 11) 5'-GGTATGGGGCAGGAAGGAAAAGAG-3'(서열번호 13)
5'-ACCTACGCTGGCTGATGATGAACT-3'(서열번호 10) 5'-AGGCACTCTTATGTTGGGCTCACT-3'(서열번호 12) 5'-GAGGCCCCCAGCAGAGCAG-3'(서열번호 14)
증폭 크기(bp) 101 129 171
변성 온도(℃) 60 60 60
프라이머의 PCR 효율(%) 97.8 99.4 96.0
복제 상태 변화 없음 얻음 잃음
상술한 증명에 사용된 X 염색체 특정 프라이머 및 DC(RNase P)용 프라이머들을 양성 대조군으로서 각 다중모드 세트에 첨가하였다.
타겟 및 대조군의 다중모드 PCR 산물을 모세관 전기영동법으로 분리한 전기영동도를 도 5에 나타내었다.
도 5에 나타낸 바와 같이, 모든 상염색체 CNV 타겟의 피크들은 예상했던 변화를 나타내었으며, 구체적으로 복제 수를 얻은 타겟은 GM10851보다 GM15510에서 상대적으로 높은 신호를 나타내었고, 복제 수를 잃은 타겟은 상대적으로 낮은 신호를 나타내었다. 복제 수 변화가 없는(NC) 영역은 양쪽 다중모드 세트를 이용한 두 개의 DNA 분석에서 서로 동일한 신호 강도를 나타내었다.
< 비교예 2> 종래 PCR 분석과 비교
다중모드 PCR-CE 분석에 의한 정확성 및 신뢰성을 검증하기 위하여, 상기 동일한 6개의 타겟에 대하여 qPCR 분석을 수행하고, 그 결과를 상기 다중분석 PCR-CE 분석과 비교하여 도 6에 나타내었다.
도 6에 나타낸 바와 같이, 양쪽 분석 모두 대체로 일관적인 성능을 나타내었으며, 이는 본 발명의 다중모드 PCR-CE 분석방법이 복제 수를 결정하는데 신뢰성 및 적용가능성을 가짐을 나타낸다.
< 실시예 3> 본 발명의 다중모드 PCR 및 모세관 전기영동 기반의 X 염색체의 복제 수 측정 2
비록, GM15510 및 GM10851 간의 X 염색체의 1 복제 차이가 5 프라이머 세트로 이루어진 다중모드 PCR에 의해 성공적으로 검출되었다 하더라도, 이전 다중 CNV 검출이 신뢰성있음을 확인하기 위하여 추가적으로 X 염색체의 복제 수가 다른 3개의 다른 세포주 GM04626 (3X), GM01416 (4X) 및 GM06061(5X)를 GM10851(1X) 및 GM15510(2X)와 함께 세트 1의 프라이머들을 가지고 다중모드 PCR을 수행하고 그 결과를 도 7에 나타내었다.
도 7에 나타낸 바와 같이, X 염색체의 복제 수는 다중모드 PCR-CE 분석에 의해 정확히 결정되었다(1X~5X).
< 실시예 4> 본 발명의 다중모드 PCR 및 모세관 전기영동 기반의 X 염색체의 복제 수 측정
우리의 다중모드 PCR-CE 분석이 일반적으로 통상 CE 측정장치에 적용될 수 있음을 증명하기 위하여, 우리는 동일한 주형 DNA와 형광 표지된 세트 1 프라이머를 동일한 PCR 조건하에서 다중모드 PCR을 수행하였고, CE 측정장치로서 가장 통상적으로 사용되는 ABI Prism 3130xl 유전자 분석기를 이용하여 CE 분석을 수행하고 그 결과를 도 8에 나타내었다.
도 8에 나타낸 바와 같이, CE 분석에 의해 각 유전자의 복제수 변이가 검출되는 것을 확인하였다.
또한, 실시예 2의 생물 분석기에 의해 검출된 복제수 프로파일과 비교한 결과를 도 9에 나타내었다.
도 9에 나타낸 바와 같이, 생물 분석기에 의해 결정된 모든 복제 수 프로파일은 ABI system에 의해 검출된 것과 일치하였다. 이러한 결과는 인간 CNV를 분석하기 위한 이러한 분석방법의 신뢰성을 지지하며, 일반적으로 사용되는 CE 장치에 넓은 적용가능성이 있음을 암시한다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.
서열목록 전자파일 첨부

Claims (8)

  1. 프라이머를 설계하는 단계(단계 1);
    실시간 정량적 중합효소 연쇄반응(qPCR)을 이용하여 최대 배가 주기(CMD)를 결정하는 단계(단계 2);
    다중모드 중합효소 연쇄반응(PCR)을 수행하고 모세관 전기영동(CE)에 의해 검출하는 단계(단계 3); 및
    검출된 피크를 통계분석하여 복제수를 결정하는 단계(단계 4)
    를 포함하는 다중모드 PCR-CE 방법을 이용한 유전자 복제수 변이의 측정방법.
  2. 제1항에 있어서,
    단계 1의 프라이머는 크기가 모두 다른 프라이머로 설계하는 것을 특징으로 하는 다중모드 PCR-CE 방법을 이용한 유전자 복제수 변이의 측정방법.
  3. 제1항에 있어서,
    단계 1의 프라이머는 PrimerQuest 프로그램(http://www.idtdna.com/Scitools/Applications/Primerquest)을 이용하여 설계하는 것을 특징으로 하는 PCR-CE 방법을 이용한 유전자 복제수 변이의 측정방법.
  4. 제1항에 있어서,
    단계 2에서 qPCR의 열 사이클링은 처음 1 사이클은 90~100℃에서 25~35초 동안, 이후 90~100℃에서 5~10초 동안, 55~65℃에서 5~15초 동안 및 70~75℃에서 15~25초 동안 30~50 번 반복하는 것을 특징으로 하는 PCR-CE 방법을 이용한 유전자 복제수 변이의 측정방법.
  5. 제1항에 있어서,
    단계 2의 CMD는 먼저 각 타겟에 대한 CMD를 결정한 다음, 이중 최소값을 선택하여 최종 CMD를 결정하는 것을 특징으로 하는 PCR-CE 방법을 이용한 유전자 복제수 변이의 측정방법.
  6. 제1항에 있어서,
    단계 3에서 주입하는 주형 DNA의 양은 반응 혼합물의 20 ul 당 8~12 ng을 사용하는 것을 특징으로 하는 PCR-CE 방법을 이용한 유전자 복제수 변이의 측정방법.
  7. 삭제
  8. 제1항에 있어서,
    단계 4는 검출된 피크의 면적의 비율(타겟/DC)을 Agilent 2100 소프트웨어 또는 GeneMapper 소프트웨어를 이용하여 계산함으로써 복제수를 결정하는 것을 특징으로 하는 PCR-CE 방법을 이용한 유전자 복제수 변이의 측정방법.
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