KR101303746B1 - 클라비박터 미시가넨시 아종 스페도니쿠스 검출용 프라이머 세트 및 이를 이용한 검출 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 감자 둘레썩음병(Ring Rot)의 원인균인 클라비박터 미시가넨시 아종 스페도니쿠스(Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus) 검출용 프라이머 세트, 이를 이용한 클라비박터 미시가넨시 아종 스페도니쿠스의 검출방법, 이를 포함하는 클라비박터 미시가넨시 아종 스페도니쿠스 검출용 키트에 관한 것이다.
본 발명에 따른 프라이머 세트를 이용하면 감자 둘레썩음병의 원인균인 클라비박터 미시가넨시 아종 스페도니쿠스를 신속하고 정확하게 검출할 수 있어 감자 둘레썩음병의 감염 여부를 효과적으로 진단할 수 있으므로, 감자 둘레썩음병을 예방하고 방제하는데 기여할 수 있다.

Description

클라비박터 미시가넨시 아종 스페도니쿠스 검출용 프라이머 세트 및 이를 이용한 검출 방법 {Primer Set for Detecting Clavibacter michiganensis subsp. Sepedonicus and Method for Detecting Using the Same}
본 발명은 감자 둘레썩음병(Ring Rot)의 원인균인 클라비박터 미시가넨시 아종 스페도니쿠스(Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus) 검출용 프라이머 세트, 이를 이용한 클라비박터 미시가넨시 아종 스페도니쿠스의 검출방법, 이를 포함하는 클라비박터 미시가넨시 아종 스페도니쿠스 검출용 키트에 관한 것이다.
감자 둘레썩음병(Ring Rot)은 클라비박터 미시가넨시 아종 스페도니쿠스(Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus)라는 세균에 의해 발병된다. 클라비박터 미시가넨시 아종 스페도니쿠스는 그람양성균으로 괴경 내에서 월동하며, 토양에서는 월동하지 못하는 것으로 알려졌다.
감자 둘레썩음병의 병징은 잎·줄기·괴경에 나타나는데, 줄기 및 괴경의 관다발이 부패하는 것이 특징이다. 감염 초기에는 식물의 아래쪽 잎이 한낮에는 시들고 밤에는 회복되며 잎은 퇴색되고 가장자리가 약간 말린다. 병이 진전됨에 따라 시들음 증상이 심해지고 엽맥 사이가 황화되고 잎이 갈변된다. 나중에는 잎이 두드러지게 위로 말리고 하엽이 갈변되고 가장자리가 부서진다. 줄기의 지제부가 세로로 갈라지기도 하지만 외관에는 이상이 거의 나타나지 않는 편이고 지제부 줄기를 자른 후 누르면 유백색의 세균이 나온다.
월동 후 이듬해 전염원이 되며 주로 씨감자의 절단과 파종 작업 중에 전염되는데, 괴경형성기에 복지를 통해 신생 괴경에 전염되며 생육 중에는 곤충의 식충으로 병원균이 침입하고 저장 중에는 이병서와 접촉에 의해 감염된다. 토양온도 18~20 ℃에서 병 진전이 빠르다.
상기와 같이 유해한 감자 둘레썩음병의 원인균을 방제하기 위한 방법으로 무균 종자를 선별하여 파종하는 방법과 씨감자의 절단시 사용하는 칼과 저장고 등을 소독하는 방법이 알려져 있지만 그 효과가 미비하여 상기 병원균의 정확한 동정과 진단 방법이 절실히 요구되는 실정이다.
이에 본 발명자들은 감자 둘레썩음병 원인균의 효과적인 검출방법에 관하여 연구를 거듭하던 중, 유전자(DNA) 수준에서 생물종을 식별하는 방법을 이용하여 감자 둘레썩음병을 신속하고 정확하게 진단하고자 하였다.
본 발명은 감자 둘레썩음병의 원인균인 클라비박터 미시가넨시 아종 스페도니쿠스를 유전자 수준에서 효과적으로 검출할 수 있는 PCR용 프라이머 세트, 상기 프라미어 세트를 이용한 클라비박터 미시가넨시 아종 스페도니쿠스의 검출 방법 및 상기 프라미어 세트를 포함하는 검출 키트를 제공하고자 한다.
상기 과제의 해결을 위해, 본 발명은 서열번호 1의 핵산서열 및 서열번호 2의 핵산서열을 갖는 프라이머로 이루어진 클라비박터 미시가넨시 아종 스페도니쿠스 검출용 프라이머 세트를 제공한다.
또한 본 발명은 상기 프라이머 세트를 이용하여 식물체 검체로부터 추출한 DNA를 PCR 증폭하여 증폭산물의 존재여부를 확인하는 단계를 포함하는 클라비박터 미시가넨시 아종 스페도니쿠스의 검출 방법을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 프라이머 세트를 포함하는 클라비박터 미시가넨시 아종 스페도니쿠스 검출용 키트를 제공한다.
본 발명에 따른 프라이머 세트를 이용하면 감자 둘레썩음병의 원인균인 클라비박터 미시가넨시 아종 스페도니쿠스를 신속하고 정확하게 검출할 수 있어 감자 둘레썩음병의 감염 여부를 효과적으로 진단할 수 있으므로, 감자 둘레썩음병을 예방하고 방제하는데 기여할 수 있다.
도 1은 본 발명에 따른 프라이머 세트를 이용하여 PCR 반응을 수행한 결과를 보여주는 사진이다. (M: 사이즈 마커, 1-34: 표 1에 표시된 번호의 균주, 35: 대조군)
도 2는 본 발명에 따른 프라이머 세트를 이용하여 Real-time PCR 반응을 수행한 결과를 보여주는 사진이다. (1: 클라비박터 미시가넨시 아종 스페도니쿠스 NCPPB 2137의 genomic DNA, 2: 미처리 대조군, 3-7: 클라비박터 미시가넨시 아종 스페도니쿠스 감염된 감자, 8: no template 대조군)
본 발명은 서열번호 1의 핵산서열 및 서열번호 2의 핵산서열을 갖는 프라이머로 이루어진 클라비박터 미시가넨시 아종 스페도니쿠스(Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus) 검출용 프라이머 세트를 제공한다.
서열번호 1 및 서열번호 2의 핵산서열을 갖는 프라이머는 각각 클라비박터 미시가넨시 아종 스페도니쿠스의 hypothetical protein 서열의 89 bp의 단편을 증폭시키기 위한 정방향(CmsF) 및 역방향(CmsR) 프라이머이다.
본 발명자들은 NCBI(National Center for Biotechnology Information)의 GenBank와 blastn 프로그램을 이용하여 클라비박터 미시가넨시 아종 스페도니쿠스를 특이적으로 검출할 수 있는 핵산 서열정보를 탐색하고, 상기 특이 핵산 서열을 검출할 수 있는 프라이머를 제작하였다. 제작한 프라이머 세트를 이용하여 일반 PCR 및 Real-tim PCR 증폭 반응을 수행한 결과, 본 발명에 따른 프라이머 세트가 클라비박터 미시가넨시 아종 스페도니쿠스만을 특이적으로 검출할 수 있음을 확인하였다.
클라비박터 미시가넨시 아종 스페도니쿠스는 감자 둘레썩음병(Ring Rot)의 원인균이다. 본 발명에 따른 프라이머 세트를 이용하면 감자 둘레썩음병의 원인균인 클라비박터 미시가넨시 아종 스페도니쿠스를 특이적으로 검출할 수 있으므로, 이를 이용하면 진단하고자 하는 식물체 검체의 감자 둘레썩음병의 감염 여부를 정확하게 진단할 수 있다.
따라서 본 발명은 서열번호 1의 핵산서열 및 서열번호 2의 핵산서열을 갖는 프라이머로 이루어진 프라이머 세트를 이용하여 식물체 검체로부터 추출한 DNA를 PCR 증폭하여 증폭산물의 존재여부를 확인하는 단계를 포함하는 클라비박터 미시가넨시 아종 스페도니쿠스의 검출 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 프라이머 세트를 이용하여 식물체 검체로부터 추출한 DNA를 PCR 증폭시킨 결과 클라비박터 미시가넨시 아종 스페도니쿠스에 특이적인 핵산 증폭산물이 존재하면, 해당 식물체 검체는 감자 둘레썩음병에 감염된 것으로 진단할 수 있다.
본 발명에 있어서 "식물체 검체"란 클라비박터 미시가넨시 아종 스페도니쿠스의 감염 여부를 확인하고자 하는 대상 식물체를 의미하며, 예를 들어 감자일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
식물체 검체로부터 DNA를 추출하는 방법은 당업계에 공지된 통상적인 방법에 의해 수행될 수 있으며, 이는 당업자가 적절히 선택 가능하다.
본 발명의 한 구체예에서, 상기 PCR 증폭은 통상적인 PCR 증폭 반응을 이용할 수 있으며, 바람직하게는 컨벤셔널 PCR 증폭 반응(conventional PCR) 또는 리얼타임 PCR 증폭 반응(real-time PCR)을 이용할 수 있고, 리얼타임 PCR 증폭 반응을 이용하는 경우 실시간으로 정량적인 분석이 가능하다. 컨벤셔널 PCR 증폭 반응은 특정 DNA를 증폭한 후에 특정 DNA의 증폭여부를 확인하는 단계를 추가로 수행하여야 하는 통상의 PCR 증폭 반응을 의미하며, 상기 특정 DNA의 증폭여부를 확인하는 단계는 전기영동 등을 통하여 증폭된 DNA 산시물의 크기를 확인하는 방법으로 수행할 수 있다.구체적인 PCR 증폭 방법은 당업자에 의해 적절히 선택되어 수행될 수 있다.
또한 본 발명은 서열번호 1의 핵산서열 및 서열번호 2의 핵산서열을 갖는 프라이머로 이루어진 프라이머 세트를 포함하는 클라비박터 미시가넨시 아종 스페도니쿠스 검출용 키트를 제공한다.
본 발명에 따른 검출용 키트는 상기 프라이머 세트 외에도 시료 내에서 클라비박터 미시가넨시 아종 스페도니쿠스를 검출하기 위해 필요한 반응완충용액, 중합효소, dNTP, 안정화제 및 모든 생물학적 또는 화학적 시약, 사용설명서 등을 포함할 수 있다. 이러한 키트의 다른 구성은 당업자에 의하여 적절히 선택될 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
실시예 1: 실험균주
본 발명에서 사용된 클라비박터 미시가넨시 아종 스페도니쿠스(Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus)를 포함한 기타 미생물은 벨기에의 the Belgian Co-ordinated Collections of Micro-organisms (BCCMTM)와 한국 농업생명공학연구원 유전자원과의 Korean Agricultural Culture Collection (KACC) 그리고 영국의 National Collection of Plant Pathogenic Bacteria (NCPPB)에서 분양받았으며, 이들의 출처는 표 1에 정리하였다.
클라비박터 균주들은 YPG배지(글루코스 0.2%, 펩톤 (Difco) 0.1%, 이스트 추출물 (Difco) 0.05%, 아가 0.15% : 1L)에서 배양하였다.
번호 균주명 기탁번호 출처
1 Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus T NCPPB 2137 Canada
2 Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus LMG 2897 United States
3 Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus LMG 5861 Sweden
4 Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus NCPPB 3384 Norway
5 Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus NCPPB 3896 United Kingdom
6 Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus NCPPB 3916 Argentina
7 Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus NCPPB 4218 Czech Republic
8 Clavibacter michiganensis subsp. michiganansis T LMG 7333 Hungary
9 Clavibacter michiganensis subsp. insidiosus T LMG 3663 United States
10 Clavibacter michiganensis subsp. nebraskensis T LMG 3700 United States
11 Clavibacter michiganensis subsp. tesselarius T NCPPB 3664 United States
12 Clavibacter rathayi T LMG 7288 New Zealand
13 Ralstonia solanasearum T (Race 1 / Biovar 1) LMG 2299 United States
14 Ralstonia solanasearum (Race 1 / Biovar 3) LMG 2305 Egypt
15 Ralstonia solanasearum (Race 1 / Biovar 4) KACC 10704 Republic of Korea
16 Ralstonia solanasearum (Race 1 / Biovar -) KACC 11179 Republic of Korea
17 Ralstonia solanasearum (Race 3 / Biovar 2) KACC 10716 Republic of Korea
18 Ralstonia mannitolilytica T LMG 6866 United Kingdom
19 Ralstonia pickettii T LMG 5942 United States
20 Pseudmonas syringae pv. antirrhini T NCPPB 1817 United Kingdom
21 Pseudmonas syringae pv. berberidis T NCPPB 2724 New Zealand
22 Pseudmonas syringae pv. persicae T NCPPB 2761 France
23 Pseudmonas syringae pv. lachrymans T NCPPB 2916 Zimbabwe
24 Pseudmonas syringae pv. maculicola T LMG 5071 New Zealand
25 Pseudmonas syringae pv. tomato T LMG 5093 United Kingdom
26 Burckholderia gladioli pv. gladioli T LMG 2216 United States
27 Xanthomonas campestris pv. campestris T LMG 568 United Kingdom
28 Xanthomonas axonopodis pv. citri KACC 10443 Republic of Korea
29 Xanthomonas axonopodis pv. vesicatoria LMG 905 -
30 Xanthomonas vesicatoria LMG 921 United States
31 Erwinia persicina T LMG 11254 Japan
32 Pectobacterium carotovorum subsp. atrosepticum T LMG 2386 United Kingdom
33 Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum T LMG 2404 Denmark
34 Escherichia coli T LMG 2092 Denmark
실시예 2: 프라이머 세트 제작
실시예 2-1: DNA 추출
실시예 1에서 배양된 균주들의 총 DNA는 CTAB 방법으로 추출하였으며, 다른 미생물의 총 DNA는 Qiagen(Hilden, Germany)사의 genomic DNA 추출 키트(Genomic-tips)를 이용하여 추출하였다.
실시예 2-2: 특이 염기서열 정보 탐색
클라비박터 미시가넨시 아종 스페도니쿠스를 특이적으로 검출하기 위한 프라이머 세트의 제작을 위해 National Center for Biotechnology Information (NCBI)의 GenBank (www.ncbi.nlm.nih.gov/)에 등록된 클라비박터 미시가넨시 아종 스페도니쿠스의 유전체 정보를 blastn 프로그램을 이용하여 분석한 결과 putative phage-related protein 의 서열(서열번호 3)이 클라비박터 미시가넨시 아종 스페도니쿠스에 특이적임을 확인하였다.
실시예 2-3: 프라이머 세트 제작
클라비박터 미시가넨시 아종 스페도니쿠스의 putative phage-related protein 에서 89bp 크기의 단편(서열번호 4)을 증폭하는 CmsF 프라이머와 CmsR 프라이머 세트를 제작하였다. 프라이머의 서열은 하기 표 2와 같다.
서열번호 명칭 서열
1 CmsF 5'-CCACGGACACGTCTGATGCT-3'
2 CmsR 5'-CCTTGGCGACGGTTCAGAGA-3'
상기 프라이머는 GenBank등록된 각각의 putative phage-related protein 의 서열정보를 blastn 프로그램을 통해 특이성을 확인 후 제작하였다.
실시예 3: 프라이머 세트의 특이성 확인
실시예 3-1: 일반 PCR 증폭 반응
CmsF 및 CmsR로 구성된 프라이머 세트를 사용하여 표 1에 기재된 균주들을 대상으로 PCR 증폭 반응을 실시하였다.
PCR 증폭 반응은 PTC-200TM thermocycler(MJ research, Watertown, mass)를 사용하여 실시하였으며, 각 반응은 Tris-HCl 10mM, KCl 50mM, MgCl2 1.5mM, 젤라틴 0.01%, dNTP 각각 0.2mM, 프라이머 각각 10pM, 2 unit의 텍 중합효소(Taq polymerase,(Promega, Madison, Wis.))를 함유하는 PCR 혼합액으로 총50㎕의 양으로 수행하였다. PCR 혼합액에 첨가한 균주들의 게놈 DNA 양은 약 50ng이었다.
클라비박터 미시가넨시 아종 스페도니쿠스의 반응은 94℃에서 5분간 변성하고 94℃에서 60초, 59℃에서 30초, 72℃에서 60초로 25회 반복시킨 후 72℃에서 10분간 반응시켰다. 증폭반응 후 10㎕의 PCR 증폭산물을 1.5%농도의 아가로스젤에 전기영동한 후 에티디움 브로마이드에 착색시켜 자외선 조사기(UV transilluminator)에서 확인하고, 그 결과를 도 1에 나타내었다.
도 1에서 M은 DNA 크기측정 마커(1kb ladder, Gibco BRLTM)이고, 1 내지 34까지의 번호는 상기 표 1에 표시된 번호의 균주를 의미하며, 35번은 증류수를 이용한 대조군이다. 도 1을 통해 알 수 있듯이, PCR 증폭 산물을 나타내는 밴드가 클라비박터 미시가넨시 아종 스페도니쿠스 균주인 1 내지 7번에서만 확인되었는바, 본 발명에 따른 프라이머 세트가 클라비박터 미시가넨시 아종 스페도니쿠스 균주를 특이적으로 검출할 수 있음을 알 수 있다.
실시예 3-2: Real - time PCR 증폭 반응
Real-time PCR 증폭 반응은 CFX96 real-time PCR system (Bio-Rad laboratories, Inc., USA)을 사용하여 실시하였으며, 각 반응은 iQTM SYBR® Green Supermix (Bio-Rad laboratories, Inc., USA) 10㎕, 프라이머 각각 20pM을 함유하는 PCR 혼합액으로 총 20㎕의 양으로 수행하였다. Real-time PCR 혼합액에 첨가한 클라비박터 미시가넨시 아종 스페도니쿠스의 genomic DNA 양은 약 5ng이었고, 감자 둘레썩음병균에 감염된 감자 종자에서 직접 추출하여 각각 1㎕ 씩 첨가하여 Real-time Bio-PCR을 하였다.
클라비박터 미시가넨시 아종 스페도니쿠스의 반응은 95℃에서 2분 30초간 변성하고 95℃에서 10초, 59℃에서 20초로 45회 반복시킨 후 95℃에서 10초간 변성하고 65℃에서 95℃까지 0.5℃씩 올리면서 melt curve와 melt peak를 확인하였다. 그 결과를 도 2에 나타내었다.
도 2에서 1은 클라비박터 미시가넨시 아종 스페도니쿠스 NCPPB 2137의 genomic DNA; 2는 미처리 대조군; 3 내지 7은 클라비박터 미시가넨시 아종 스페도니쿠스 감염된 감자; 8은 no template 대조군(NTC)을 나타낸다. 도 2(A)에서 앞쪽에 나오는 curve 부분은 클라비박터 미시가넨시 아종 스페도니쿠스 NCPPB 2137의 genomic DNA(1)와 감자 둘레썩음병균(클라비박터 미시가넨시 아종 스페도니쿠스)에 감염된 감자 종자(3 내지 7)에 공통적으로 존재하는 특이 PCR 단편을 나타낸다. 클라비박터 미시가넨시 아종 스페도니쿠스 NCPPB 2137의 genomic DNA와 감자 둘레썩음병균(클라비박터 미시가넨시 아종 스페도니쿠스)에 감염된 감자 종자에서만 핵산 단편이 특이적으로 증폭된 것을 확인할 수 있다.
따라서, CmsF 및 CmsR 프라이머는 감자 둘레썩음병균의 특이 핵산 단편만을 증폭시킬 수 있으므로 감자 둘레썩음병균의 감염여부 진단을 위한 PCR 프라이머로 이용 가능하다는 것을 알 수 있으며, 감자 둘레썩음병균에 감염된 종자 하나까지도 특이적으로 검출할 수 있음을 확인하였다.
서열목록 전자파일 첨부

Claims (3)

  1. 삭제
  2. 서열번호 1의 핵산서열 및 서열번호 2의 핵산서열로 이루어진 프라이머 세트를 이용하여 서열번호 4의 핵산서열 89 bp를 증폭시킴으로써 감자 둘레썩음병원균인 클라비박터 미시가넨시 아종 스페도니쿠스(Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus)의 검출 방법으로,
    상기 방법은 감자 추출물을 PCR 증폭시키는 것을 포함하고, 상기 PCR은 상기 감자 추출물을 포함하는 PCR 반응액을 94에서 5분간 변성하고 94에서 60초, 59에서 30초, 72에서 60초로 25회 반복시킨 후 72에서 10분간 증폭시켜 증폭산물의 존재 여부를 확인하는 단계를 포함하는, 클라비박터 미시가넨시 아종 스페도니쿠스의 검출 방법.
  3. 삭제
KR1020100133347A 2010-12-23 2010-12-23 클라비박터 미시가넨시 아종 스페도니쿠스 검출용 프라이머 세트 및 이를 이용한 검출 방법 KR101303746B1 (ko)

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* Cited by examiner, † Cited by third party
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Journal of Applied Microbiology, Vol. 93, pp. 840-849 (2002.12.31.) *
NCBI, GenBank, Accession No. AM849034 (2008.02.26.) *

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