KR101293740B1 - The subculture method of in vitro Gastrodia elata protocorms - Google Patents
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Abstract
본 발명은 애주름버섯(Mycena spp.)을 발아균주로 사용하여 천마종자로부터 원구경을 발아시키는 단계; 및 뽕나무버섯(Armillaria mellea)을 생장균주로 사용하여 상기 발아된 원구경을 비대 또는 생장키는 단계; 를 포함하는 천마종자로부터 종마 또는 자마를 기내배양시키는 것을 목적으로 하는 천마 원구경 계대배양방법에 관한 것이다.
바람직하게는 상기 계대배양배지의 조성은 무기질소원으로 Hyponex powder(2g/l), 유기질소원으로 Peptone(1g/l) 및 당원으로서 Sucrose(20g/l)를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 발아된 원구경의 길이는 0.8cm인 것을 특징으로 할 수 있으며, 상기 계대배양의 배양기간은 21일인 것을 특징으로 할 수 있다.The present invention comprises the steps of germinating the circumferential diameter from the spermatozoa seed by using the mushrooms ( Mycena spp. ) As a germination strain; Mulberry and mushroom (Armillaria enlarge or grow the germinated caliber using mellea ) as a growth strain; It relates to a circumferential circumferential passage method for the purpose of culturing a stallion or a stallion from the celestial seed comprising a.
Preferably the composition of the passage medium may be characterized in that it comprises Hyponex powder (2g / l) as an inorganic nitrogen source, Peptone (1g / l) as an organic nitrogen source and Sucrose (20g / l) as a sugar source, The germinated diameter of the diameter can be characterized in that the 0.8cm, the culture period of the subculture can be characterized in that 21 days.
Description
본 발명은 천마 원구경 계대배양방법에 관한 기술이다. 보다 상세하게는 애주름버섯(Mycena spp.)을 발아균주로 사용하여 천마종자로부터 원구경을 발아시키는 단계; 및 뽕나무버섯(Armillaria mellea)을 생장균주로 사용하여 상기 발아된 원구경을 비대 또는 생장키는 단계; 를 포함하는 천마종자로 부터 종마 또는 자마를 기내배양시키는 것을 목적으로 하는 천마 원구경 계대배양방법에 관한 것이다.The present invention relates to a circumferential diameter passage method. More specifically, germinating the circumferential diameter from the spermatozoa seed by using a mushroom ( Mycena spp. ) As a germination strain; Mulberry and mushroom (Armillaria enlarge or grow the germinated caliber using mellea ) as a growth strain; It relates to a circumferential circumferential culture method for the purpose of cultivating a stallion or a stallion from the celestial horse seed comprising a.
천마는 난과(Orchidaceae)에 속하는 다년생 고등식물이지만 광합성 능력이 퇴화된 식물이다. 한국, 중국, 일본 등의 고산지대에 자생하는 것으로 알려진 천마는 예부터 귀중한 상등품 약재로 이용되어 왔으며, 덩이줄기(塊莖)는 중풍, 고혈압, 현기증, 신경성 질환 등에 효능이 좋아 두부질환의 예방과 치료제로 이용되어 왔다. 1911년 천마는 독립적 생육이 불가능하고, 뽕나무 버섯(Armillaria mellea)과 공생을 통해 공생한다는 것이 최초로 밝혀졌다. 1980년 이후 천마종자는 또 다른 버섯인 애주름버섯(Mycena spp.)에 의해 발아가 되며 뽕나무버섯과 애주름버섯을 동시에 접종하였을 때는 천마종자가 발아되지 않는다는 연구가 발표되기도 하였다. 우리나라에서는 1995년 뽕나무 버섯균주인 천마균1호가 개발 보급되면서 대량재배가 가능하게 되었으나, 자마(子麻)에 의한 계속된 무성번식으로 품질과 수량이 저하되는 천마퇴화현상, 천마균주의 오용과 배양기술의 부족, 연작피해, 건조 등 환경 스트레스에 대한 천마자체의 생리적 취약성 등으로 인해 급격한 생산성 변동 및 재배농가의 경제적 손실로 이어지고 있다. 또한 무분별한 야생천마의 수집으로 인한 천마유전자원이 소멸되어가고 있는 상태이며, 국제자연보호연맹(International Union for Conservation of Nature)에서는 멸종위기 2급 식물로 지정 보호되고 있는 식물이기도 하다.
Chunma is a perennial higher plant belonging to Orchidaceae , but is a plant with reduced photosynthetic capacity. Cheonma, known to grow native to Korea, China, and Japan, has been used as a valuable premium medicine since ancient times. Tuberculosis is effective in treating stroke, hypertension, dizziness, and neurological diseases. It has been used as. 1911 Pegasus is impossible to independently Growth, mulberry mushroom (Armillaria It was first revealed that symbiosis is through symbiosis with mellea ). Since 1980, Chunma seeds have been germinated by another mushroom, Mycena spp. , And some studies have shown that Chunma seeds don't germinate when inoculated with mulberry mushrooms and acne mushrooms. In 1995, the mulberry mushroom strain Chunma Bacteria No. 1 was developed and distributed, which allowed mass cultivation.However, the cultivation of Chunma, which causes deterioration in quality and yield due to continued asexual breeding by follicles, misuse and culture The physiological weakness of Cheonma itself to environmental stresses such as lack of technology, serial damage, and drying has led to rapid productivity fluctuations and economic losses for farmers. In addition, the cheonma gene source is disappearing due to the indiscriminate collection of wild horses, and it is also a plant that is designated and protected as an endangered second class plant by the International Union for Conservation of Nature.
주름버섯(Mycena)은 담자균류 주름버섯목 주름버섯과의 버섯으로, 분포지역은 한국(변산반도 국립공원, 가야산, 발왕산), 일본, 중국, 시베리아, 유럽, 북아메리카, 호주, 아프리카이다. 주름버섯은 여름부터 가을까지 풀밭이나 밭에 무리를 지어 자라며 가끔 균륜(菌輪)을 만든다. 버섯갓은 지름 5～10cm로 공 모양에서 빵 모양을 거쳐 편평해진다. 갓 표면은 흰색이지만 노란색 또는 붉은색을 띠고 비단실 같은 광택이 있으며 가장자리는 어릴 때 안쪽으로 감긴다. 살은 두껍고 흰색인데 흠집이 생기면 약간 붉은색을 띤다. 주름살은 끝붙은 주름살로 촘촘하며 처음에 보라색이다가 자갈색 또는 흑갈색으로 변한다. 버섯대는 크기가 5~10cm×7~20mm로 기부가 가늘다. 버섯대 표면은 흰색이며 손으로 만지면 갈색으로 변한다. 고리는 자루 상부 또는 중간에 붙어 있고 얇은 흰색 막질인데 쉽게 떨어진다. 홀씨는 6~9.5×4.5~7μm의 타원형 또는 달걀 모양이고 자갈색이고, 식용으로도 이용되고 있다.
Mycena is a fungus that is a fungus of the basidiomycetes, fungi, and fungi, and is distributed in Korea (Byunsan Peninsula National Park, Gayasan, Balwangsan), Japan, China, Siberia, Europe, North America, Australia, and Africa. Pleated mushrooms grow in groups in the meadow or field from summer to autumn, sometimes making fungal rings. Mushroom shade is 5 ~ 10cm in diameter, flattened from ball to bread. The shade of the lampshade is white but yellow or red in color, with a silky luster and the edges are wound inward when young. The flesh is thick and white, but if it is scratched, it is slightly reddish. Wrinkles are dense with end wrinkles, purple at first, then turn brown or blackish brown. The mushroom stand is 5 ~ 10cm × 7 ~ 20mm in size and has a thin base. The surface of the mushroom stand is white and turns brown when touched by hand. The rings are attached to the top or middle of the bag and are thin white membranes that fall off easily. Hall seeds are 6-9.5 × 4.5-7 μm oval or oval, purple-brown, and are also used for food.
뽕나무버섯은 주름버섯목 송이과 뽕나무버섯속에 속하는 버섯으로, 활엽수의 그루터기나 죽은 나무에서 자란다. 갓은 3~1cm로 연갈색이고 갓표면에 암갈색의 인편이 있으며 특히 중앙부에 밀집해 있다. 주름살은 다소 빽빽하며 처음에는 흰색이나 후에 담갈색이 된다. 대의 표면은 섬유상이고 상부에 백황색의 말질 턱받이가 있다. 턱받이의 상부는 대개 흰색이고 아래는 암갈색이다. 포자는 타원형이며, 포자문은 크림색이다. 외국에서는 침엽수 등의 수목에 치명적인 병원균으로 알려져 있고 우리나라에서도 일부 잣나무 등에 병원균으로서 피해를 주고 있다. 우리나라와 일본에서는 식용하나 유렵과 북아메리카에서는 독버섯으로 취급하여 먹지 않는다. 주로 한국, 동아시아, 북미, 아프리카, 호주 등에 분포한다.
Mulberry is a fungus belonging to the genus Pleurotus eryngii and Mulberry, which grows on stumps and dead trees of hardwoods. Gad is 3 ~ 1cm, light brown, dark brown scale on the surface of gat, especially concentrated in the center. Wrinkles are rather dense, initially white or light brown. The surface of the stand is fibrous and has a yellowish white bib at the top. The upper part of the bib is usually white and the lower part is dark brown. Spores are oval, and spores are cream. It is known as a deadly pathogen in trees such as conifers in foreign countries, and in Korea, it is damaging some pine trees as a pathogen. It is edible in Korea and Japan, but it is not treated as poisonous mushroom in Europe and North America. It is mainly distributed in Korea, East Asia, North America, Africa and Australia.
천마 종자로부터 자마를 번식하는 기내배양방법에 대한 체계적인 연구는 전 세계적으로 자세히 보고된 바 없다. 또한 기내배양생산에 의해 공생균주를 제외한 다른 잡균이 오염되지 않은 무병 종마를 생산한 경우도 없다. 따라서 유성번식방법에 의해 생산된 천마종자를 이용하여 실제 천마재배 시 종마로서 사용될 수 있는 무병한 자마를 기내배양방법을 통해 연중 대량생산할 수 있는 방법의 개발이 절실하다. Systematic research on in-flight cultivation methods for breeding follicles from Chunma seeds has not been reported worldwide. In addition, in-flight culture produced no disease-free stallions other than symbiotic strains. Therefore, the development of a method to mass-produce the disease-free horses that can be used as a stallion during actual cultivation of horses by using the chick horses produced by the sexual breeding method through the in-flight culture method throughout the year is urgently needed.
본 발명자들은 일차적으로 애주름버섯 균주를 이용하여 천마종자를 발아시키고, 이로부터 발달된 원구경을 이차적으로 뽕나무버섯균주와 접종시키는 단계에서 뽕나무버섯으로부터 발달된 균사속이 원구경에 연결될 때까지 원구경의 상태를 유지하고 균사속을 유도하는 효과를 지닌 계대배양방법을 개발하고 본 발명을 완성하게 되었다.
The present inventors first germinate cheonma seed by using the strain of apricot mushroom, and in the step of inoculating the circumference of the developed circle diameter with the mulberry mushroom strain, until the mycelia developed from the mulberry mushroom are connected to the circle diameter. Development of a subculture and the effect of maintaining the state of the induction of mycelium has been completed the present invention.
따라서, 본 발명의 목적은 계대배양배지의 조성, 적정 원구경의 크기 및 배양기간 등의 원구경 배양방법, 액체배양된 생장균주를 이용하여 기내에서 참나무로부터 균사속을 유도하는 방법, 상기 방법을 통해 기내에서 무병한 자마를 생산할 수 있는 방법을 제공하는 것을 포함한다.
Therefore, an object of the present invention is a method for cultivating a myriad of oak in oak using a culture medium of a circumferential diameter, such as the composition of the passage medium, the appropriate size of the diameter and the incubation period, liquid cultured strains, the method It provides a way to produce disease-free foals on board.
본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제들은 이상에서 언급한 기술적 과제들로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 기술적 과제들은 본 발명의 기재로부터 당해 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.The technical objects to be achieved by the present invention are not limited to the above-mentioned technical problems, and other technical subjects which are not mentioned can be clearly understood by those skilled in the art from the description of the present invention .
상기 종래기술의 문제점을 해결하기 위해 본 발명에서는 애주름버섯(Mycena spp.)을 발아균주로 사용하여 천마종자로부터 원구경을 발아시키는 단계; 및 뽕나무버섯(Armillaria mellea)을 생장균주로 사용하여 상기 발아된 원구경을 비대 또는 생장시키는 단계; 를 포함하는 천마종자로 부터 종마 또는 자마를 기내배양시키는 것을 목적으로 하는 천마 원구경 계대배양방법을 제공한다.In order to solve the problems of the prior art, the present invention comprises the steps of germinating the circumferential diameter from the sperm seed using a seed mushroom ( Mycena spp. ) As a germination strain; And enlarging or growing the germinated caliber using a mulberry mushroom ( Armillaria mellea ) as a growth strain; Provides a circumferential circumferential culture method for the purpose of cultivating a stallion or a stallion from the celestial horse seed comprising a.
바람직하게는 상기 계대배양배지의 조성은 무기질소원으로 Hyponex powder(2g/l), 유기질소원으로 Peptone(1g/l) 및 당원으로서 Sucrose(20g/l)를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.Preferably, the composition of the passage medium may be characterized in that it comprises Hyponex powder (2g / l) as an inorganic nitrogen source, Peptone (1g / l) as an organic nitrogen source and Sucrose (20g / l) as a sugar source.
바람직하게는 상기 발아된 원구경의 길이는 0.8cm인 것을 특징으로 할 수 있다.Preferably the length of the germinated circle diameter may be characterized in that 0.8cm.
바람직하게는 상기 계대배양의 배양기간은 21일인 것을 특징으로 할 수 있다.Preferably, the culture period of the subculture may be 21 days.
또한 본 발명에서는 (1) 애주름버섯균주(Mycena spp.) 또는 뽕나무버섯균주(Armillaria mellea)의 균사체를 무균적으로 자른 후, 잔나비배지 100ml를 첨가하여, 100rpm으로 27±1℃에서 3주 동안 진탕 배양하는 제1단계; (2) 상기 배양된 애주름버섯균주(Mycena spp.) 또는 뽕나무버섯균주(Armillaria mellea)의 균사체를 호모게나이져로 간 후 5ml을 낙엽미강 배지(미강:물=1:4) 15ml에 접종하여 24±1℃에서 2주 동안 배양하는 제2단계; (3)천마종자를 포함하고 있는 꼬투리를 화염소독한 후 한천배지(Agar 8 g/l)가 함유된 페트리디쉬에 종자를 살포하는 제3단계; (4) 상기 제2단계의 배양이후 애주름버섯균주의 균사가 충분히 형성되면 낙엽미강 배지를 2 x 2 cm로 자른 후, 천마종자가 살포된 상기 한천배지의 중앙에 올려놓은 후 종자가 발아되어 원구경이 생산될 때까지 1.5~2.0개월 동안 배양하는 제4단계; (5) 상기 제4단계로부터 생산된 원구경을 원구경계대배양배지(Hyponex powder 2 g/l, peptone 1 g/l, sucrose 20 g/l)에서 3주간 배양하는 제 5단계; (6) 상기 제2단계의 배양이후 뽕나무버섯균주의 균사가 충분히 형성되면 450분간 121℃에서 멸균된 참나무(지름 1.0~1.5cm, 길이 5~9cm) 5~7개를 뽕나무버섯균주에 올려놓고 0.9~1.1개월 동안 참나무로부터 균사속이 형성될 때까지 유지시키는 제6단계; (7) 상기 제6단계로 균사속이 참나무로부터 형성된 후, 제5단계의 원구경 계대배양배지에서 3주간 배양된 원구경을 1.5x1.5cm 크기의 계대배양배지와 함께 균사속이 형성된 부위에 치상하는 단계; 를 포함하는 천마종자로부터 발아된 원구경을 비대 및 생장시켜 자마를 생산하는 방법을 제공한다.
In addition, in the present invention (1) after aseptically cutting the mycelium strain of Mycena spp. Or Mulberry mushroom strain ( Armillaria mellea ), 100 ml of residual butterfly medium is added, 100 rpm for 3 weeks at 27 ± 1 ℃ A first step of shaking culture; (2) After inoculating the mycelium of the cultured mycena spp. ( Mycena spp. ) Or the mulberry mushroom strain ( Armillaria mellea ) with a homogenizer, 5 ml was inoculated in 15 ml of deciduous rice bran medium (rice bran: water = 1: 4) Incubating for 2 weeks at 24 ± 1 ° C .; (3) a third step of spraying the seeds on a petri dish containing agar medium (Agar 8 g / l) after flame sterilizing the pod containing the sperm seeds; (4) After the culture of the second stage, the mycelia of the strains of the fungus mushrooms are sufficiently formed, after cutting the deciduous rice bran medium to 2 x 2 cm, put the seeds on the center of the agar medium sprayed with cheonma seed seed germinated A fourth step of incubating for 1.5-2.0 months until the circumferential diameter is produced; (5) a fifth step of culturing the circumferential diameter produced from the fourth step in a circumferential boundary culture medium (Hyponex powder 2 g / l, peptone 1 g / l, sucrose 20 g / l) for 3 weeks; (6) If the mycelia of the mulberry mushroom strain after the culture of the second step is sufficiently formed, put 5-7 pieces of oak sterilized oak (diameter 1.0-1.5cm, length 5-9cm) at 121 ℃ for 450 minutes on the mulberry mushroom strain A sixth step of maintaining the mycelia from the oak for 0.9-1.1 months; (7) After the mycelia were formed from the oak tree in the sixth step, the circumferential diameter cultured for three weeks in the circumferential passage culture medium of the fifth stage was toothed on the site where the mycelia were formed together with the passage culture medium of 1.5x1.5 cm size. step; It provides a method for producing a follicle by enlarging and growing the circumferential diameter germinated from the cheon horse seed comprising a.
본 발명은 원구경 계대배양을 통해 천마종자로부터 어린 천마(종마 또는 자마)를 기내배양 생산시키는 것에 관련된 것으로서, 일차적으로 발아균주(애주름버섯)에 의해 종자로부터 발아된 원구경이 이차적으로 생장균주(뽕나무버섯)와 접종될 때까지 원구경의 생장을 유지하고 생장균주의 균사속과의 연결을 용이하게 해주는 천마 원구경 계대배양방법에 관한 것이다. 본 발명을 통해 천마종자로부터 발아된 원구경을 어린 천마, 즉 자마로 기내배양 및 생산하는 것이 가능하게 되었다. 따라서 본 발명은 기존 무성번식재배방법에 의한 천마퇴화현상의 극복 및 무분별한 야생천마 수집에 의한 국내 천마 유전자원의 감소를 극복할 수 있는 방법의 제공과 더불어 기내배양생산에 의해 공생균주를 제외한 다른 잡균이 오염되지 않은 무병 종마를 일반 천마재배자 에게 보급할 수 있다는 장점을 가지고 있다.The present invention relates to the in-flight culture of young horses (horse stallions or horses) from cheonma seed through circumferential passage, in which the bore diameters germinated from seeds by germinating strains (prime mushrooms) are secondarily grown. (Culture Mushroom) relates to a circumferential circumferential culture method that maintains the circumferential diameter until inoculation with the mulberry mushroom and facilitates the connection with the mycelial growth of the strain. Through the present invention, it is possible to incubate and produce the circumferential diameter germinated from the cheon-ma seed as a young cheon-ma, ie, follicle. Therefore, the present invention provides a method for overcoming the phenomena degeneration phenomenon by the existing asexual breeding method and the reduction of the domestic cheonma genetic resources by the indiscriminate collection of wild horses, and in addition to the other bacteria except symbiotic strains by in-flight culture production. This unpolluted disease-free stallion has the advantage of being available to general cultivators.
본 발명에 의해 개발된 원구경 계대배양방법을 이용하여 생장균주와의 감염이 용이하게 되었으며, 종자를 이용한 천마의 기내배양생산에 가능하게 되었다. 따라서 본 발명은 기존 무성번식재배방법에 의한 천마퇴화현상의 극복, 무분별한 야생천마 수집에 의한 국내 천마 유전자원의 감소를 극복할 수 있는 방법의 제공과 더불어 기내배양생산에 의해 공생균주를 제외한 다른 잡균이 오염되지 않은 무병 종마를 일반 천마재배자 에게 보급할 수 있다는 장점을 가지고 있다.Infection with growth strains was facilitated using the circumferential passage method developed by the present invention, and it was possible to produce in-flight cultures of the chick horses using seeds. Therefore, the present invention provides a method for overcoming the phenomena deterioration phenomenon by the existing asexual breeding method and the reduction of the domestic cheonma genetic resources by the indiscriminate collection of wild horses, and other various bacteria except symbiotic strains by in-flight culture production. This unpolluted disease-free stallion has the advantage of being available to general cultivators.
도1은 발아균주(Mycena spp.)에 의해 발아된 천마종자유래의 원구경의 노화와 원구경 단독 또는 발아배지(WA medium)에 있는 원구경을 생장균주(Armillaria mellea)와 접종했을 때 균사속 감염이 되지 않는 양상에 관련된 사진으로 본 발명의 근본이유에 관련된 사진이다. A. 발아균주에 의해 발아된 원구경(배양 8주 후), B. 노화된 원구경의 모습, C. 생장균주 균사속이 유도된 참나무에 접종된 원구경의 고사되고 있는 형태, D. 발아배지와 함께 원구경이 생장균주 균사속이 유도된 참나무에 접종되었을 때 고사되고 있는 형태.
도2는 본 발명에 의해 개발된 계대배양배지의 주요 성분들의 5주간 단독처리 또는 조합처리에 의한 원구경 생장 및 발아균주(Mycena spp.)의 생장을 나타낸 그림이다. A. Hyponex powder (2 g/l), B. Peptone (1 g/l), C. Sucrose (20 g/l), D. 조합처리(Hyponex powder 2 g/l, Peptone 1 g/l, Sucrose 20 g/l).
도3은 발아된 원구경의 크기 별로 계대배양배지에서 5주간 배양한 후 초기 원구경 길이에 따른 원구경의 생장(측지수 또는 원구경 길이)의 차이에 대한 그래프이다. A. 측지수, B. 원구경 길이. 초기 원구경의 길이에 따른 그룹 (I. 0.3cm, II. 0.5cm, III. 0.8cm, IV. 1.0 cm, V. 1.2 cm).
도4는 발아된 원구경의 크기 별로 계대배양배지(Hyponex powder 2 g/l, Peptone 1 g/l, Sucrose 20 g/l)에서 3주간 배양한 후 원구경의 생장을 비교한 그림이다(온도조건 24℃). A. 0.3cm, B. 0.5cm, C. 0.8cm, D. 1.0cm.
도5는 발아된0.8cm크기의 원구경을 계대배양배지에 접종한 후 배양기간에 따른 생장(측지수 및 원구경 길이)을 나타낸 그래프이다. A. 측지수, B. 원구경 길이.
도6은 계대배양배지에서 3주간 배양된 원구경을 생장균주의 균사속이 유도된 참나무에 접종했을 때 배양기간에 따라 생장하는 모습을 나타낸 그림이다. 배양기간(A. 8주, B. 12주, C. 16주).Figure 1 shows the aging of the caliber seed germinated by the germinating strain (Mycena spp.) And the mycelial growth when inoculated with the growth caliber (Armillaria mellea) in the caliber alone or in the germ medium (WA medium). It is a photograph related to an aspect that does not become an infection and is a photograph related to the fundamental reason of the present invention. A. Germ diameter germinated by germinated strain (after 8 weeks of culture), B. Aged germ diameter, C. Killed form of germ seeded in oak-derived oak induced growth mycelium, D. Germination medium In addition, the circumference of the circumference when the inoculation of oak-derived growth strain mycelium induced form.
Figure 2 is a diagram showing the circumferential growth and the growth of the germ strain (Mycena spp.) By five weeks alone or combined treatment of the main components of the passage medium developed by the present invention. A. Hyponex powder (2 g / l), B. Peptone (1 g / l), C. Sucrose (20 g / l), D. Combination treatment (Hyponex powder 2 g / l, Peptone 1 g / l, Sucrose 20 g / l).
Figure 3 is a graph of the difference in the growth of the diameter (geometry index or diameter of the diameter) according to the initial diameter of the diameter after incubation for 5 weeks in the passage medium for the size of the germinated diameter. A. Geodetic index, B. Diameter diameter. Group according to the length of the initial diameter (I. 0.3 cm, II. 0.5 cm, III. 0.8 cm, IV. 1.0 cm, V. 1.2 cm).
Figure 4 is a diagram comparing the growth of circumferential diameters after incubation for 3 weeks in subculture (Hyponex powder 2 g / l, Peptone 1 g / l, Sucrose 20 g / l) by the size of germinated caliber (temperature Conditions 24 ° C.). A. 0.3 cm, B. 0.5 cm, C. 0.8 cm, D. 1.0 cm.
Figure 5 is a graph showing the growth (surface index and diameter diameter) according to the culture period after inoculating germinated 0.8 cm sized diameter in the passage medium. A. Geodetic index, B. Diameter diameter.
Figure 6 is a diagram showing the growth in accordance with the culture period when inoculated on the mycelium induced mycelia of the growth culture of the circumferential diameter cultured for three weeks in passage culture medium. Incubation period (A. 8 weeks, B. 12 weeks, C. 16 weeks).
본 발명은 애주름버섯(Mycena spp.)을 발아균주로 사용하여 천마종자로부터 원구경을 발아시키는 단계; 및 뽕나무버섯(Armillaria mellea)을 생장균주로 사용하여 상기 발아된 원구경을 비대 또는 생장시키는 단계; 를 포함하는 천마종자로부터 종마 또는 자마를 기내배양시키는 것을 목적으로 하는 천마 원구경 계대배양방법에 관한 것이다.The present invention comprises the steps of germinating the circumferential diameter from the spermatozoa seed by using the mushrooms ( Mycena spp. ) As a germination strain; And enlarging or growing the germinated caliber using a mulberry mushroom ( Armillaria mellea ) as a growth strain; It relates to a circumferential circumferential passage method for the purpose of culturing a stallion or a stallion from the celestial seed comprising a.
바람직하게는 상기 계대배양배지의 조성은 무기질소원으로 Hyponex powder(2g/l), 유기질소원으로 Peptone(1g/l) 및 당원으로서 Sucrose(20g/l)를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.Preferably, the composition of the passage medium may be characterized in that it comprises Hyponex powder (2g / l) as an inorganic nitrogen source, Peptone (1g / l) as an organic nitrogen source and Sucrose (20g / l) as a sugar source.
바람직하게는 상기 발아된 원구경의 길이는 0.8cm인 것을 특징으로 할 수 있다.Preferably the length of the germinated circle diameter may be characterized in that 0.8cm.
바람직하게는 상기 계대배양의 배양기간은 21일인 것을 특징으로 할 수 있다.Preferably, the culture period of the subculture may be 21 days.
또한 본 발명은 (1) 애주름버섯균주(Mycena spp.) 또는 뽕나무버섯균주(Armillaria mellea)의 균사체를 무균적으로 자른 후, 잔나비배지 100ml를 첨가하여, 100rpm으로 27±1℃에서 3주 동안 진탕 배양하는 제1단계; (2) 상기 배양된 애주름버섯균주(Mycena spp.) 또는 뽕나무버섯균주(Armillaria mellea)의 균사체를 호모게나이져로 간 후 5ml을 낙엽미강 배지(미강:물=1:4) 15ml에 접종하여 24±1℃에서 2주 동안 배양하는 제2단계; (3)천마종자를 포함하고 있는 꼬투리를 화염소독한 후 한천배지(Agar 8 g/l)가 함유된 페트리디쉬에 종자를 살포하는 제3단계; (4) 상기 제2단계의 배양이후 애주름버섯균주의 균사가 충분히 형성되면 낙엽미강 배지를 2 x 2 cm로 자른 후, 천마종자가 살포된 상기 한천배지의 중앙에 올려놓은 후 종자가 발아되어 원구경이 생산될 때까지 1.5~2.0개월 동안 배양하는 제4단계; (5) 상기 제4단계로부터 생산된 원구경을 원구경계대배양배지(Hyponex powder 2 g/l, peptone 1 g/l, sucrose 20 g/l)에서 3주간 배양하는 제 5단계; (6) 상기 제2단계의 배양이후 뽕나무버섯균주의 균사가 충분히 형성되면 450분간 121℃에서 멸균된 참나무(지름 1.0~1.5cm, 길이 5~9cm) 5~7개를 뽕나무버섯균주에 올려놓고 0.9~1.1개월 동안 참나무로부터 균사속이 형성될 때까지 유지시키는 제6단계; (7) 상기 제6단계로 균사속이 참나무로부터 형성된 후, 제5단계의 원구경 계대배양배지에서 3주간 배양된 원구경을 1.5x1.5cm 크기의 계대배양배지와 함께 균사속 부근에 치상하는 단계; 를 포함하는 천마종자로부터 발아된 원구경을 비대 및 생장시켜 자마를 생산하는 방법에 관한 것이다.
In addition, the present invention (1) aseptic mushroom strain ( Mycena spp. ) Or mulberry mushroom strain ( Armillaria mellea ) mycelium after aseptic cut, after the addition of 100 ml of residual butterfly medium, 100 rpm for 3 weeks at 27 ± 1 ℃ A first step of shaking culture; (2) After inoculating the mycelium of the cultured mycena spp. ( Mycena spp. ) Or the mulberry mushroom strain ( Armillaria mellea ) with a homogenizer, 5 ml was inoculated in 15 ml of deciduous rice bran medium (rice bran: water = 1: 4) Incubating for 2 weeks at 24 ± 1 ° C .; (3) a third step of spraying the seeds on a petri dish containing agar medium (Agar 8 g / l) after flame sterilizing the pod containing the sperm seeds; (4) After the culture of the second stage, the mycelia of the strains of the fungus mushrooms are sufficiently formed, after cutting the deciduous rice bran medium to 2 x 2 cm, put the seeds on the center of the agar medium sprayed with cheonma seed seed germinated A fourth step of incubating for 1.5-2.0 months until the circumferential diameter is produced; (5) a fifth step of culturing the circumferential diameter produced from the fourth step in a circumferential boundary culture medium (Hyponex powder 2 g / l, peptone 1 g / l, sucrose 20 g / l) for 3 weeks; (6) If the mycelia of the mulberry mushroom strain after the culture of the second step is sufficiently formed, put 5-7 pieces of oak sterilized oak (diameter 1.0-1.5cm, length 5-9cm) at 121 ℃ for 450 minutes on the mulberry mushroom strain A sixth step of maintaining the mycelia from the oak for 0.9-1.1 months; (7) After the mycelia were formed from oak trees in the sixth step, the circumferential diameter cultured for three weeks in the circumferential passage culture medium of the fifth stage was placed in the vicinity of the mycelia with a passage culture medium of 1.5x1.5 cm size. ; It relates to a method for producing a follicle by enlarging and growing the circumferential diameter germinated from the cheon horse seed comprising a.
이하에서 첨부된 도면을 참조한 실시예에 의거하여 구체적으로 설명한다.
Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to the accompanying drawings.
[실시예 1] 애주름버섯균주(Mycena spp.)를 이용한 천마종자의 발아 [Example 1] Germination of Chunma Seeds by using Pleurotus eryngii strain (Mycena spp.)
액체 배양용 재료로 사용하기 위해 Potato Dextrose Agar(PDA, Difco; 39 g/l) 배지에 배양중인 애주름버섯 균사체를 무균적으로 잘게 짤라 250ml의 삼각플라스크에 넣고, 잔나비배지(glucose 25 g/l, yeast extract 2 g/l, glutamic acid 1g/l, thiamine 0.1 g/l, KH2PO4 2 g/l, MgSO4 0.5 g/l, disodium dihydrate EDTA 0.2 g/l, MnSO4 0.1 g/l) 100ml을 첨가하여, 100rpm으로 27±1℃에서 약 3주간 진탕배양 하였다. 배양된 균사체를 호모게나이져로 간 후 5ml을 15ml의 낙엽미강 배지(미강:물=1:4)에 접종하여 3주간 27±1℃ 에서 배양하였다. Ascortic mushroom mycelium incubated in Potato Dextrose Agar (PDA, Difco; 39 g / l) medium aseptically finely chopped into a 250 ml Erlenmeyer flask and used as a medium for liquid culture. , yeast extract 2 g / l, glutamic acid 1g / l, thiamine 0.1 g / l, KH 2 PO 4 2 g / l, MgSO 4 0.5 g / l, disodium dihydrate EDTA 0.2 g / l, MnSO 4 0.1 g / l ) 100 ml were added and shaken for 3 weeks at 27 ± 1 ° C. at 100 rpm. After incubating the mycelium with a homogenizer, 5 ml was inoculated in 15 ml of deciduous rice bran medium (rice bran: water = 1: 4) and incubated at 27 ± 1 ° C. for 3 weeks.
천마종자를 포함하고 있는 꼬투리를 화염소독 한 후 발아배지(WA medium; Agar 8 g/l)가 함유된 페트리디쉬(지름 9cm)에 종자를 골고루 털었다. 이때 한 꼬투리당 약 10개의 페트리디쉬에 종자를 살포하고, 애주름버섯 균주가 감염된 낙엽미강 배지를 2 x 2 cm로 자른 후 종자가 살포되어 있는 한천배지 중앙에 올려놓았다. 천마종자는 이후 24±1℃에서 8주간 암실에서 공조배양 하였을 때 원구경이 노화 또는 갈변화되는 현상을 나타냈다(도 1A 및 1B 참조). 이는 발아 후 생장균주의 접종에 따른 2차적 비대생장이 요구되는 시기라는 것을 나타낸다. Flame sterilization of the pod containing the celestial seeds was followed by evenly shaking the seeds in a Petri dish (9 cm diameter) containing germinated medium (WA medium; Agar 8 g / l). At this time, seed was sprayed on about 10 petri dishes per pod, and the deciduous rice bran medium infected with the fungus mushroom strain was cut into 2 x 2 cm and placed in the center of the agar medium to which the seeds were sprayed. Chunma seeds exhibited a phenomenon of aging or browning when circumferentially cultured in a dark room at 24 ± 1 ° C. for 8 weeks (see FIGS. 1A and 1B). This indicates that it is the time when secondary germ growth is required following inoculation of the growth strain after germination.
약 6주간 배양된 원구경을 생장균주(Armillaria mellea)가 감염된 참나무에 원구경 자체 또는 발아배지와 함께 접종했을 때 생장균주의 균사속에 의해 감염되지 않았고, 결국 고사되는 현상이 나타났다(도 1C 및 1D 참조). 상기 기술된 문제들은 본 발명의 근본적인 이유가 된다.
When inoculated with an armillaria mellea-infected oak with the circumferential bore or germination medium, the cultured circumferentially grown circumference was not infected by the mycelia of the cultivars, and eventually died (Fig. 1C and 1D). Reference). The problems described above are the fundamental reason for the present invention.
[실시예 2] 천마원구경 계대배양배지의 조성에 따른 생장 비교 [Example 2] Growth comparison according to the composition of the circumferential culture medium
발아된 원구경(길이 1cm)을 대조구인 물과 비교구로서 무기질소원인 하이포넥스(Hyponex powder, 질소 6.5%, 인 6.0%, 칼륨 19.0%), 유기질소원(Peptone, Tryptone, Yeast extract), 당원(Sucrose, Glucose, Xylose, Starch)등 총 9종류의 영양성분이 단독처리된 배지에 4주간 배양한 후 원구경의 생장(측지수, 원구경 길이 및 원구경 두께)을 관찰하였으며, 하이포넥스는 2g/l에서는 측지생장이 가장 우수하였고, 유기질소원 중에서는 Peptone 1g/l에서 원구경의 길이생장이 가장 우수하였으며, 당원 중에서는 Sucrose 20g/l에서 원구경의 두께생장과 발아균주의 균사생장이 가장 우수하였다(표 1 및 도 2 참조). 따라서 원구경생장에 우수한 효과를 나타내었던 각 구성성분들의 조합처리(Hyponex powder 2g/l, Peptone 1g/l, Sucrose 20g/l) 결과, 조합처리에서 원구경 생장이 단독처리보다 월등히 우수한 것으로 나타났다(도 2D 참조). 하기 표 1은 영양원(무기염류, 유기질소 및 당)에 따른 원구경 생장효과에 관한 것이다.
The germinated diameter (1cm in length) was compared with water as a control, and the source of inorganic nitrogen was Hyponex powder (6.5% nitrogen, 6.0% phosphorus, 19.0% potassium), organic nitrogen sources (Peptone, Tryptone, Yeast extract), sugar source After culturing for 4 weeks in a medium treated with a total of 9 kinds of nutrients (Sucrose, Glucose, Xylose, Starch), the growth of circumferential diameter (surface index, circumferential length, and circumferential thickness) was observed. At 2 g / l, geodesic growth was the best, and among the organic nitrogen sources, Peptone 1g / l showed the best growth of the diameter of the circumference, and among the sugar sources, the thickness growth of the diameter and the mycelial growth of the germinating strain were Best of all (see Table 1 and FIG. 2). Therefore, as a result of the combination treatment (Hyponex powder 2g / l, Peptone 1g / l, Sucrose 20g / l), which showed excellent effect on the circumferential growth, the circumferential growth was superior to the single treatment in the combination treatment ( See FIG. 2D). Table 1 below relates to the circumferential growth effect according to nutrients (inorganic salts, organic nitrogen and sugars).
각 영양원이 첨가된 한천배지에서 5주간 배양한 후 원구경 생장(n=15/처리구)이 조사됨. After culturing for 5 weeks in agar medium supplemented with each nutrient source, circumferential growth (n = 15 / treatment) was investigated.
1 측지의 길이가 5mm 이상 되는 것만을 측지수에 포함시킴. 1 Include in geodetic only those geodesic lengths greater than 5 mm.
2 관찰을 용이하게 하기 위해 임의대로 얇은 그룹은 1, 중간그룹은 2, 가장 두꺼운 그룹은 3의 가치를 부여한 후 원구경 두께의 평균이 계산됨.
2 To facilitate observation, the average value of the diameter of the diameter is calculated after assigning the value of 1 for the thin group, 2 for the middle group, and 3 for the thickest group.
[실시예 3] 원구경 계대배양배지에 접종되는 원구경 길이 및 배양기간에 따른 원구경 생장 비교Example 3 Comparison of circumferential growth according to circumferential diameter and incubation period inoculated in circumferential passage medium
발아균주가 접종된 낙엽미강배지(2 x 2 cm)를 포함하고 있는 발아배지에서 6주간 배양한 후 천마종자로부터 발아된 원구경을 길이 별(0.3~1.2cm)로 원구경 계대배양배지에 4주간 배양하고 원구경의 생장발달(측지수 및 원구경 길이)을 관찰하였다. 원구경 길이가 1.2cm였을 때 가장 생장이 우수하였으나 실제 발아배지에서 1.2cm길이의 원구경을 얻는 것은 어려웠으므로 0.8cm길이의 원구경이 가장 적절한 크기의 원구경인 것으로 판단되었다(도 3 및 도 4 참조) After culturing for 6 weeks in the germination medium containing deciduous rice bran medium (2 x 2 cm) inoculated with germinated strains, the diameters germinated from Chunma seeds by length (0.3 ~ 1.2cm) were added to circumferential passage medium. The culture was performed weekly and the growth development of the circumference was observed (geodesic and caliber length). When the diameter was 1.2cm, the growth was the most excellent, but it was difficult to obtain the diameter of 1.2cm from the germination medium, so the diameter of 0.8cm was determined to be the most appropriate size. 4)
0.8 cm원구경을 계대배양배지에서 5주간 배양한 후 배양기간에 따른 원구경 발달을 측지수와 원구경길이로 측정하였다. 결과는 3주 배양 이후에는 더 이상 측지수나 원구경 길이가 증가하지 않는 것으로 관찰되어 약 3주간의 배양이 가장 적절한 배양기간인 것으로 나타났다(도 5 참조).
After 0.8 cm diameter was incubated for 5 weeks in subculture, the diameter development was measured by the geodetic index and the diameter. The results showed that after three weeks of incubation, the geodesic index or diameter of the circumference no longer increased, indicating that the incubation period of about three weeks was the most appropriate incubation period (see FIG. 5).
[실시예 4] 원구경 계대배양배지에서 3주간 배양된 원구경을 생장균주(뽕나무버섯) 접종한 후 배양기간에 따른 원구경 비대[Example 4] After culturing for three weeks in a circumferential passage culture medium, inoculated with the growth cultivation strain (Mulberry mushroom) and enlarged circumferential diameter according to the culture period
액체 배양용 재료로 사용하기 위해 PDA배지에 배양중인 생장균주의 균사체를 무균적으로 잘게 짤라 250ml의 삼각플라스크에 넣고, 잔나비배지 100ml을 첨가하여, 100rpm으로 27±1℃에서 약 3주간 진탕배양 하였다. 배양된 균사체를 호모게나이져로 간 후 5ml을 낙엽미강 배지(미강:물=1:4) 15ml에 접종하여 24±1℃에서 원형배양용기(지름 9 cm, 높이 5 cm)를 이용하여 배양하였다. 배양2주 후 낙엽미강배지에 균사체가 충분히 자라면 450분간 121℃에서 멸균된 참나무(지름 1.0 ~1.5cm, 길이 5~9cm) 5~7개를 낙엽미강배지위에 올려놓았다. 약 1개월 후 참나무로부터 균사속이 형성되면 원구경 계대배양배지에서 3주간 배양된 원구경을 일정크기(1.5 x 1.5 cm)의 배지와 함께 균사속 형성부위에 치상하였다. 배양기간에 따른 원구경 생장 변화를 관찰한 결과, 배양 2주 후부터 균사속이 원구경에 감염되었고, 원구경이 비대되는 것은 배양 8주 후부터 시작되는 것으로 관찰되었다.
To use as a liquid cultivation material, mycelia of the cultured growth strain in PDA medium were aseptically chopped into a 250 ml Erlenmeyer flask, and 100 ml of bow butterfly medium was added and shaken at 100 rpm for 3 weeks at 27 ± 1 ° C. . After incubating the mycelium with a homogenizer, 5ml was inoculated into 15ml of deciduous rice bran medium (rice bran: water = 1: 4) and cultured using a circular culture vessel (diameter 9 cm,
이상 본 발명의 구체적 실시형태와 관련하여 본 발명을 설명하였으나 이는 예시에 불과하며 본 발명은 이에 제한되지 않는다. 당업자는 본 발명의 범위를 벗어나지 않고 설명된 실시형태를 변경 또는 변형할 수 있으며, 이러한 변경 또는 변형도 본 발명의 범위에 속한다. 또한, 본 명세서에서 설명한 각 구성요소의 물질은 당업자가 공지된 다양한 물질로부터 용이하게 선택하여 대체할 수 있다. 또한 당업자는 본 명세서에서 설명된 구성요소 중 일부를 성능의 열화 없이 생략하거나 성능을 개선하기 위해 구성요소를 추가할 수 있다. 뿐만 아니라, 당업자는 공정 환경이나 장비에 따라 본 명세서에서 설명한 방법 단계의 순서를 변경할 수도 있다. 따라서 본 발명의 범위는 설명된 실시형태가 아니라 특허청구범위 및 그 균등물에 의해 결정되어야 한다.
Although the present invention has been described in connection with the specific embodiments of the present invention, it is to be understood that the present invention is not limited thereto. It will be understood by those skilled in the art that various changes in form and details may be made therein without departing from the spirit and scope of the invention as defined by the appended claims. In addition, the materials of each component described herein can be readily selected and substituted for various materials known to those skilled in the art. Those skilled in the art will also appreciate that some of the components described herein can be omitted without degrading performance or adding components to improve performance. In addition, those skilled in the art may change the order of the method steps described herein depending on the process environment or equipment. Therefore, the scope of the present invention should be determined by the appended claims and equivalents thereof, not by the embodiments described.
본 발명은 원구경 계대배양을 통해 천마종자로부터 어린 천마(종마 또는 자마)를 기내배양 생산시키는 것에 관련된 것으로서, 일차적으로 발아균주(애주름버섯)에 의해 종자로부터 발아된 원구경이 이차적으로 생장균주(뽕나무버섯)와 접종될 때까지 원구경의 생장을 유지하고 생장균주의 균사속과의 연결을 용이하게 해주는 천마 원구경 계대배양방법에 관한 것이다. The present invention relates to the in-flight culture of young horses (horse stallions or horses) from cheonma seeds through circumferential passage, in which the bore diameters germinated from seeds by germinating strains (prime mushrooms) are secondarily grown. (Culture Mushroom) relates to a circumferential circumferential culture method that maintains the circumferential diameter until inoculation with the mulberry mushroom and facilitates the connection with the mycelial growth of the strain.
본 발명을 통해 천마종자로부터 발아된 원구경을 어린 천마, 즉 자마로 기내배양 및 생산하는 것이 가능하게 되었다. 따라서 본 발명은 기존 무성번식재배방법에 의한 천마퇴화현상의 극복 및 무분별한 야생천마 수집에 의한 국내 천마 유전자원의 감소를 극복할 수 있는 방법의 제공과 더불어 기내배양생산에 의해 공생균주를 제외한 다른 잡균이 오염되지 않은 무병 종마를 일반 천마재배자 에게 보급할 수 있다는 장점을 가지고 있다. Through the present invention, it is possible to incubate and produce the circumferential diameter germinated from the cheon-ma seed as a young cheon-ma, ie, follicle. Therefore, the present invention provides a method for overcoming the phenomena degeneration phenomenon by the existing asexual breeding method and the reduction of the domestic cheonma genetic resources by the indiscriminate collection of wild horses, and in addition to the other bacteria except symbiotic strains by in-flight culture production. This unpolluted disease-free stallion has the advantage of being available to general cultivators.
Claims (5)
(2) 상기 배양된 애주름버섯균주(Mycena spp.) 또는 뽕나무버섯균주(Armillaria mellea)의 균사체를 호모게나이져로 간 후 5ml을 낙엽미강 배지(미강:물=1:4) 15ml에 접종하여 24±1℃에서 2주 동안 배양하는 제2단계;
(3) 천마종자를 포함하고 있는 꼬투리를 화염소독한 후 한천배지(Agar 8 g/l)가 함유된 페트리디쉬에 종자를 살포하는 제3단계;
(4) 상기 제2단계의 배양이후 애주름버섯균주의 균사가 충분히 형성되면 낙엽미강 배지를 2 x 2 cm로 자른 후, 천마종가가 살포된 상기 한천배지의 중앙에 올려놓은 후 종자가 발아되어 원구경이 생산될 때까지 1.5~2.0개월 동안 배양하는 제4단계;
(5) 상기 제4단계로부터 생산된 원구경을 원구경계대배양배지(Hyponex powder 2 g/l, peptone 1 g/l, sucrose 20 g/l)에서 3주간 배양하는 제5단계;
(6) 상기 제2단계의 배양이후 뽕나무버섯균주의 균사가 충분히 형성되면 450분간 121℃에서 멸균된 참나무(지름 1.0~1.5cm, 길이 5~9cm) 5~7개를 뽕나무버섯균주에 올려놓고 0.9~1.1개월 동안 참나무로부터 균사속이 형성될 때까지 유지시키는 제6단계;
(7) 상기 제6단계로 균사속이 참나무로부터 형성된 후, 제5단계의 원구경 계대배양배지에서 3주간 배양된 원구경을 1.5x1.5cm 크기의 계대배양배지와 함께 균사속 부근에 치상하는 단계;
를 포함하는 천마종자로부터 발아된 원구경을 비대 및 생장시켜 자마를 생산하는 방법. (1) Aseptic mycelium strain ( Mycena spp. ) Or mulberry mushroom strain ( Armillaria mellea ) aseptically cut mycelium, 100 ml of Jang butterfly medium added, shaking culture for 3 weeks at 27 ± 1 ℃ at 100rpm Stage 1;
(2) After inoculating the mycelium of the cultured mycena spp. ( Mycena spp. ) Or the mulberry mushroom strain ( Armillaria mellea ) with a homogenizer, 5 ml was inoculated in 15 ml of deciduous rice bran medium (rice bran: water = 1: 4) Incubating for 2 weeks at 24 ± 1 ° C .;
(3) a third step of spraying the seeds on a petri dish containing agar medium (Agar 8 g / l) after flame sterilizing the pod containing the cheonma seed;
(4) After the culture of the second step, if the mycelium of the strains of the fungus mushrooms are sufficiently formed, cut the deciduous rice bran medium to 2 x 2 cm, put the seed on the center of the agar medium sprayed with Cheonma Jongga and the seeds germinate A fourth step of incubating for 1.5-2.0 months until the circumferential diameter is produced;
(5) a fifth step of culturing the circumferential diameter produced from the fourth step in a circumferential boundary culture medium (Hyponex powder 2 g / l, peptone 1 g / l, sucrose 20 g / l) for 3 weeks;
(6) If the mycelia of the mulberry mushroom strain after the culture of the second step is sufficiently formed, put 5-7 pieces of oak sterilized oak (diameter 1.0-1.5cm, length 5-9cm) at 121 ℃ for 450 minutes on the mulberry mushroom strain A sixth step of maintaining the mycelia from the oak for 0.9-1.1 months;
(7) After the mycelia were formed from oak trees in the sixth step, the circumferential diameter cultured for three weeks in the circumferential passage culture medium of the fifth stage was placed in the vicinity of the mycelia with a passage culture medium of 1.5x1.5 cm size. ;
Method to produce a follicle by enlarging and growing the circumferential diameter germinated from the cheon horse seed comprising a.
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