KR101292163B1 - Ｋｒｔ１９ 항체를 포함하는 항암용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 항 KRT19(Cytokerain19) 항체의 항암적 용도에 관한 것으로, 보다 구체적으로 KRT19-HER2 간의 상호작용 및 이와 관련된 분자적 메커니즘과 관련하여 KRT19(Cytokerain19)의 특정 부위를 타겟으로 하는 KRT19 항체를 이용한, HER2을 발현하는 암 치료 방법 및 항암제에 관한 것이다.

Description

ＫＲＴ１９ 항체를 포함하는 항암용 조성물{An Anti―Cancer Composition Containing an Antibody of KRT19}

본 발명은 항 KRT19(Cytokerain19) 항체의 항암적 용도에 관한 것으로, 보다 구체적으로 KRT19-HER2 간의 상호작용 및 이와 관련된 분자적 메커니즘과 관련하여 KRT19(Cytokerain19)의 특정 부위를 타겟으로 하는 KRT19 항체를 이용한, HER2을 발현하는 암 치료 방법 및 항암제에 관한 것이다.

HER2는 유방암 세포의 증식과 생존에 관계하는 중요한 신호전달 체계 중의 하나인 상피세포 성장인자 수용체 (epidermal growth factor receptor; EGFR) 패밀리이다. EGFR 패밀리의 티로신 인산화효소 수용체(receptor tyrosine kinases) 는 erbB1, HER2/erbB2, erbB3, erbB4의 4개로 되어 있으며 세포 증식(proliferation)과 생존(survival) 외에도 세포의 부착(adhesion), 이동(migration) 및 분화(differentiation)를 조절하는데 관여하는 것으로 알려져 있다. 4개의 erb family 중 HER2/erbB2가 결합하는 리간드는 없지만 유방암에서 가장 강력한 암유전자(oncogene)로 알려져 있다.

HER2가 정상적인 수준인 경우에는 정상적인 유선조직의 성장과 발달에 관여하지만, 비정상적으로 HER2가 과발현하거나 증폭되면 정상세포 조절이 붕괴되어 유선조직에서는 공격적인 암세포가 형성되게 된다. 이 과정은 HER2가 다른 EGFR family member와 올리고머화(oligomerization)되어 활성화되면 많은 하부 분자(downstream molecules)를 인산화하여 차례로 여러 가지 신호전달계(signaling cascades)를 활성화시킨다. 이 중 세포 증식(cell proliferation)에 관여하는 SOS-Ras-Raf-MEK-MAPK 경로와 세포사멸(apoptosis)을 억제하는 PI3K-Akt 경로가 암 증식에 관여하는 대표적인 기전이다.

전임상과 임상실험 결과 HER2 과발현은 암발생 단계의 초기부터 나타나는 중요한 현상이며, 이는 암의 성장과 진행에 중요한 역할을 하고 있다. HER2 과발현은 침윤성 유방암의 약 20-30%에서 나타나고 있으며, 과발현은 악성도가 보다 높은 공격적인 암으로 유방암의 불량한 예후와도 관계가 있는 것으로 알려지고 있다.

유방암 연구에 있어서 HER2에 대한 관심이 큰 이유는 HER2 증폭 또는 과발현 여부가 유방암 환자에서 예후적 지표와 치료에 대한 반응의 예측 지표로서의 가치를 가지고 있기 때문이다. 예후인자로서의 가치는 논란이 있으나, HER2 유전자의 증폭 또는 그 결과로 나타나는 단백질의 과발현이 관찰되는 경우 예후가 나쁘고, 생존기간이 유의하게 짧아진다는 보고들이 여러 학회를 통해 발표되고 있다.

특히, 전이성 혹은 원발성 유방암 환자에서 HER2에 대한 단일클론항체(monoclonal antibody) 치료제인 허셉틴(Herceptin)을 사용하여 암환자를 치료하기 위해서는 HER2의 증폭 또는 과발현 여부가 결정적인 지표가 되므로, HER2에 대한 표준화된 평가 및 HER2 과발현과 관련된 분자적 메커니즘을 이용한 효과적인 암 치료가 요구되고 있는 실정이다.

이에, 본 발명자들은 HER2 과발현 세포에서의 KRT19 발현 관련성을 확인하고, 암 세포에서 KRT19 항체를 이용해 KRT19의 발현을 억제함으로써 HER2 안정성을 저해시킬 수 있는 항암효과를 밝힘으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 주된 목적은 KRT19의 항체를 유효성분으로 함유하는 항암용 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 KRT19의 항체를 이용하여 HER2의 안정성을 감소시키는 방법을 제공하는 데 있다.

상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 KRT19 단백질에 상보적으로 결합하는 KRT19 항체를 유효성분으로 포함하는, HER2를 발현하는 암에 대한 항암용 조성물을 제공한다.

특히, KRT19는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있는데, 상기 KRT19 항체는 서열번호 1의 아미노산 서열 중 78~330번째 서열을 타겟으로 하는 것을 바람직하다. 상기 KRT19 항체는 단일클론 또는 다클론 항체 등일 수 있고, 바람직하게는 단일클론 항체이다.

KRT19 항체는 KRT19와 HER2 사이의 물리적 결합을 저해하는 것을 특징으로 한다. 즉, KRT19와 상보적으로 결합함으로써, 상기 KRT19와 HER2 사이의 물리적 결합을 저해하는 것이다.

본 발명의 KRT19 항체는 HER2 자체의 항체가 아니므로, 본 발명의 항암용 조성물은 다른 HER2 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 조성물과 병용하여 투여함으로써, 더욱 효율적인 항암효과를 발휘할 수 있다.

한편, 본 발명의 효과를 나타내는 HER2를 발현하는 암은 난소암, 복막암, 난관암, 유방암, 비-소세포 폐암 (NSCLC), 편평 세포암, 전립선암 및 결장직장암 등이다.

이처럼, 본 발명은 HER2-KRT19의 상호작용 메커니즘을 기반으로 하여, KRT19 항체를 이용을 통해 상기 HER2의 안정성을 저해함으로써 HER2를 발현하는 암의 치료 또는 예방할 수 있는 조성물 및 방법에 관한 전반적인 사항을 제공할 수 있다.

본 발명은 HER2 발현을 저해시키는 KRT19 항체의 항암적 용도에 관한 것으로, KRT19 항체를 이용하여 KRT19-HER2 간 물리적 결합을 저해함으로써 HER2를 발현하는 암세포를 효과적으로 성장억제 및 세포사멸시킬 수 있으므로, 유방암 등 HER2와 관련된 질병의 예방, 경감 및 치료에 매우 유용하다.

도 1은 세포막 외부에서의 HER2 및 KRT19의 물리적 결합을 확인한 면역세포화학법 및 웨스턴 블럿의 실험 결과이다.
도 2는 KRT19 단일 클론 항체의 항암효과를 확인한 MTT assay 결과이다.
도 3은 KRT-19 서열 상 glycine-rich region profile이 존재하는 것을 나타내는 도식도이다.
도 4는 KRT19의 소수성 region porfile을 포함하는 항체 분석결과이다.
도 5는 KRT19 하이브리도마 18가지 클론의 웨스턴 블럿 검증 결과이다.
도 6은 KRT19 하이브리도마 클론의 선별하기 위한 세포 증식률 비교 그래프이다.
도 7은 선별된 KRT19 하이브리도마 5E4를 이용하여 항암효과를 재검증한 세포증식률 비교 그래프이다.

본 발명에서 사용되는 용어에 대한 정의는 이하와 같다.

"대상" 또는 "환자"는 인간, 소, 개, 기니아 피그, 토끼, 닭, 곤충 등을 포함하여 치료가 요구되는 임의의 단일 개체를 의미한다. 또한, 임의의 질병 임상 소견을 보이지 않는 임상 연구 시험에 참여한 임의의 대상 또는 역학 연구에 참여한 대상 또는 대조군으로 사용된 대상이 대상에 포함된다. 본 발명의 일 실시예에서는 인간을 대상으로 하였다.

"조직 또는 세포 샘플"은 대상 또는 환자의 조직으로부터 얻은 유사한 세포의 집합체를 의미한다. 조직 또는 세포 샘플의 공급원은 신선한, 동결된 및/또는 보존된 장기 또는 조직 샘플 또는 생검 또는 흡인물로부터의 고형 조직; 혈액 또는 임의의 혈액 구성분; 대상의 임신 또는 발생의 임의의 시점의 세포일 수 있다. 조직 샘플은 또한 1차 또는 배양 세포 또는 세포주일 수 있다.

임의로, 조직 또는 세포 샘플은 원발성 또는 전이성 종양으로부터 얻는다. 조직 샘플은 특성상 조직과 서로 혼합되지 않는 화합물, 예를 들어 보존제, 항응고제, 완충액, 고정액, 영양물질, 항생제 등을 포함할 수 있다. 본 발명의 목적을 위해, 조직 샘플의 "절편"은 조직 샘플의 하나의 일부 또는 조각, 예를 들어 조직 샘플로부터 절단한 조직 또는 세포의 얇은 슬라이스를 의미한다. 본 발명이 조직 샘플의 동일한 절편이 형태학적 및 분자적 수준 모두에 분석되거나 단백질 및 핵산 모두에 대해 분석되는 방법을 포함함을 이해한다면, 조직 샘플의 다수의 절편을 취하여 본 발명에 따른 분석에 적용할 수 있음이 이해된다.

"항체"는 가장 넓은 의미로 사용되고, 구체적으로 무손상 단일클론(모노클로날) 항체, 다클론(폴리클로날) 항체, 적어도 2개의 무손상 항체로부터 형성된 다중특이적 항체 (예를 들어 이중특이적 항체) 및 목적하는 생물학적 활성을 보이는 항체 단편을 포함한다.

세포의 "증식(proliferation)" 또는 "성장(growth)'이라는 용어는 세포가 분열되어 동질의 것이 불어나는 것으로서 보통 다세포생물의 체내에서 세포수가 증가되어 가는 것을 말한다. 세포수가 증식(증폭)되어 어느 시기에 이르면, 형질이 변화(분화)되어 가는 것과 동시에 제어되고 있는 것이 보통이다. 체내에서 세포가 증가되어 가는 것과, 또 세포 내에서 세포질이 신생(新生)되어 가는 경우에는 생장으로 구별하는 경우가 많다. 그러나 생물학적으로 세포수가 증가된다는 점에서 보면, 다세포생물의 발생기에서 분화가 일어나지 않는 시기는 증식 또는 성장으로 보는 것이 정당하다. 본 발명에서는 상기 두 용어가 혼용되어 쓰이고 있다.

"세포사멸"은 넓은 의미로 사용되고, 일반적으로 세포질 압축, 형질막 미세융모의 상실, 핵의 분할, 염색체 DNA의 분해 또는 미토콘드리아 기능의 상실을 포함하는 하나 이상의 특징적인 세포 변경이 수반되는 포유동물의 규칙에 따르거나 조절된 세포 치사를 의미한다.

"암", "종양" 또는 "악성"은 일반적으로 비조절된 세포 성장의 특징을 갖는 포유동물의 생리학적 상태를 나타내거나 설명한다. 암의 예는 암종, 림프종, 백혈병, 모세포종 및 육종을 포함하지만 이로 제한되지 않는다.

"억제제 또는 저해제(inhibitor)"는 KRT19의 발현 또는 활성을 억제, 차단 또는 감소시키는 물질을 의미한다. 억제제의 활성 메커니즘은 특별히 제한되지 않는다. 예로서는 유기 또는 무기 화합물, 단백질, 탄수화물, 지질과 같은 폴리머 화합물, 다양한 화합물의 컴포지트(composite)를 포함한다. 예를 들어, 'KRT19 억제제'는 종양발생(tumorigenesis)에서 KRT19 단백질의 활성을 억제, 차단 또는 감소시키는 물질을 포함할 수 있다.

"유효량"은, 이롭거나 바람직한 임상적 또는 생화학적 결과에 영향을 주는 적절한 양이다. 유효량은 한번 또는 그 이상 투여될 수 있다. 본 발명의 목적을 위하여, 저해제 화합물의 유효량은 질병 상태의 진행을 일시적으로 완화, 개선, 안정화, 되돌림, 속도를 늦춤 또는 지연시키는데 적절한 양이다. 만약, 수혜동물이 조성물의 투여에 견딜 수 있거나, 조성물의 그 동물에의 투여가 적합한 경우라면, 조성물은 "약학적으로 또는 생리학적으로 허용가능함"을 나타낸다. 투여된 양이 생리학적으로 중요한 경우에는 상기 제제는 "치료학적으로 유효량"으로 투여되었다고 말할 수 있다. 상기 제제의 존재가 수혜 환자의 생리학적으로 검출가능한 변화를 초래한 경우라면 상기 제제는 생리학적으로 의미가 있다.

"치료"는 이롭거나 바람직한 임상적 결과를 수득하기 위한 접근을 의미한다. 본 발명의 목적을 위해서, 이롭거나 바람직한 임상적 결과는 비제한적으로, 증상의 완화, 질병 범위의 감소, 질병 상태의 안정화 (즉, 악화되지 않음), 질병 진행의 지연 또는 속도의 감소, 질병 상태의 개선 또는 일시적 완화 및 경감 (부분적이거나 전체적으로), 검출가능하거나 또는 검출되지않거나의 여부를 포함한다. 또한, "치료"는 치료를 받지 않았을 때 예상되는 생존율과 비교하여 생존율을 늘이는 것을 의미할 수도 있다. "치료"는 치료학적 치료 및 예방적 또는 예방조치 방법 모두를 가리킨다. 상기 치료들은 예방되는 장애뿐만 아니라 이미 발생한 장애에 있어서 요구되는 치료를 포함한다. 질병을 "완화(Palliating)"하는 것은 치료를 하지 않은 경우와 비교하여, 질병상태의 범위 및/또는 바람직하지 않은 임상적 징후가 감소되거나 및/또는 진행의 시간적 추이(time course)가 늦춰지거나 길어지는 것을 의미한다.

"약"이라는 것은 참조 양, 수준, 값, 수, 빈도, 퍼센트, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이에 대해 30, 25, 20, 25, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1% 정도로 변하는 양, 수준, 값, 수, 빈도, 퍼센트, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이를 의미한다.

본 명세서를 통해, 문맥에서 달리 필요하지 않으면, "포함하다" 및 "포함하는"이란 말은 제시된 단계 또는 원소, 또는 단계 또는 원소들의 군을 포함하나, 임의의 다른 단계 또는 원소, 또는 단계 또는 원소들의 군이 배제되지는 않음을 내포하는 것으로 이해하여야 한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명자들은 HER2 발현 조직에서 KRT19의 발현수준을 분석하여, 주위 비-종양 간 조직보다 HER2 발현 조직에서 KRT19가 현저히 과발현됨을 확인하였다.

HER2 유전자는 상피 성장 인자 수용체들의 erbB 군(family)에 속하는 분자량 185,000 dalton 막간 당단백질(transmembrane glycoprotein)을 인코딩한다. 리간드 결합(binding)은 erbB 동질-(homo-) 및 이질이량체들(heterodimers)의 형성을 유도하여 세포질 키나아제(kinase) 영역이 활성화되도록 한다. HER2는 리간드가 없는 수용체이며 리간드 결합 EGFR 군 EGFR/erbB1, HER3/erbB3 및 HER4/erbB4 중에서 바람직한 이질이량체화 파트너이다. 공수용체(co-receptor)로서, HER2는 신호 전달을 매개하여 유사분열생식(mitogenesis), 세포자살(apoptosis), 혈관형성(angiogenesis) 및 세포분화(cell differentiation)를 일으킨다. 경로들을 신호화하는 엄격히 조절된 erbB 수용체에 임의의 변화가 가해지면 중요한 이상 및 종양형성이 나타난다. HER2 유전자는 약 20-30 %의 침습성 유방암종에서 증폭 및 과다발현되며 증가된 전이성 잠재성 및 빈약성 예후와 관련된다. 또한, 자궁, 전립선, 위, 허파, 방광 및 신장 암종들을 포함한 다양한 인간 암들에서 HER2수용체의 과발현이 발생한다.

KRT19은 모든 세포 내에 존재하는 비수용성의 세포 내 섬유성 단백질로서 분자량에 따라 약 20여 가지로 나뉜다. 이중 KRT19이 장 점막 세포에 특이적으로 존재하는데 장 상피 기원의 종양을 진단하는데 면역 조직화학 염색을 이용 하여 광범위하게 이용되고 있다.

예를 들어, 본 발명에서의 KRT19 단백질은 이하의 400개의 아미노산 서열(서열번호 1)로 이루어질 수 있다.

MTSYSYRQSSATSSFGGLGGGSVRFGPGVAFRAPSIHGGSGGRGVSVSSARFVSSSSSGAYGGGYGGVLTASDGLLAGNEKLTMQNLNDRLASYLDKVRALEAANGELEVKIRDWYQKQGPGPSRDYSHYYTTIQDLRDKILGATIENSRIVLQIDNARLAADDFRTKFETEQALRMSVEADINGLRRVLDELTLARTDLEMQIEGLKEELAYLKKNHEEEISTLRGQVGGQVSVEVDSAPGTDLAKILSDMRSQYEVMAEQNRKDAEAWFTSRTEELNREVAGHTEQLQMSRSEVTDLRRTLQGLEIELQSQLSMKAALEDTLAETEARFGAQLAHIQALISGIEAQLGDVRADSERQNQEYQRLMDIKSRLEQEIATYRSLLEGQEDHYNNLSASKVL(서열번호 1)

본 발명자들은 KRT19의 발현에 의존적으로 HER2의 안정성이 조절되는 메커니즘을 확인하였는데, 이와 관련하여 구체적으로 KRT19가 세포막으로 이동하여 HER2와 결합함으로써 HER2를 안정화시킴을 확인하였다.

이는 KRT19-HER2 간의 상호작용에 대한 분자 메커니즘에 대한 새로운 발견으로, 이를 이용하여 본 발명자는 항 KRT19 항체를 이용하여 상기 KRT19의 발현 또는 활성 억제를 통해 HER2 안정성을 감소시킬 수 있음을 알 수 있었다.

따라서, 본 발명은 일 관점에서, KRT19 단백질에 상보적으로 결합하는 KRT19 항체를 이용하여 HER2의 안정성을 감소시키는 방법에 관한 것이다.

또한, 본 발명자는 상기 발견에 근거하여, 항 KRT19 항체를 이용하여 상기 KRT19의 발현 또는 활성 억제를 통한 HER2 발현 암에 대한 항암적 용도를 착안하였다.

특히, 종래의 허셉틴은 HER2에 직접 결합하는 항체로서, 허셉틴이 직접적으로 HER2와 결합함으로써 HER2 발현을 억제하여 항암효과를 나타낸 것이라면, 본 발명의 항 KRT19 항체는 그 자체가 HER2 항체는 아니다. 특히, 본 발명의 항 KRT19 항체는 상기 KRT19의 서열번호 1의 아미노산 서열 중 78~330번째 서열을 타겟으로 하는 것을 특징으로 한다.

KRT19는 HER2 발현과 상보적으로 관련성을 가지는 단백질로서 본 발명의 특징은 상기 KRT19와 상보적으로 결합하는 항체를 이용하여, KRT19와 관련된 HER2의 발현을 저해하는 기작으로 항암효과를 나타낸다. 따라서, HER2 발현과 관련된 암 질환의 치료에 있어서, 본 발명은 종래 직접적인 HER2 억제제와 함께 사용함으로써 더욱 효과적인 항암기능을 발휘할 수도 있고, 특히, 종래 HER2 억제제(저해제)에 내성을 가지는 경우에도 KRT19 항체를 이용하여 HER2 발현을 저해시킬 수 있으므로 더욱 큰 유용성을 가진다고 하겠다.

즉, 본 발명은 항 KRT19 항체의 항암적 용도에 관한 것으로, 다른 관점에서, 항 KRT19 항체를 유효성분으로 함유하는 항암용 조성물에 관한 것이다.

본 발명에서 "항체"라는 용어는 가장 넓은 의미로 사용되고, 구체적으로는 단일 클론 항체, 다클론 항체, 적어도 2개의 무손상 항체로부터 형성된 다중특이적 항체 (예를 들어, 이중특이적 항체), 및 원하는 생물학적 활성을 나타내는 한, 항체 단편을 포함한다. 바람직하게는 단일 클론 항체를 예로 들 수 있다.

"단일 클론(모노클로날) 항체"라는 용어는 실질적으로 균질한 항체의 군집으로부터 수득한 항체를 나타내고, 즉, 군집을 구성하는 개별 항체들은 단일 클론 항체 생산시에 발생할 수 있는 가능한 변이체를 제외하고는 동일하고/거나 동일한 에피토프에 결합한다. 전형적으로 상이한 결정자 (에피토프)에 대해 유도되는 상이한 항체를 포함하는 다클론 항체 제제와는 대조적으로, 각각의 단일 클론 항체는 항원 상의 단일 결정자에 대해 유도된다. 그의 특이성에 이외에도 단일 클론 항체는 기타 다른 면역글로불린에 의해 오염되지 않는 점에서 유리하다. "단일 클론"이라는 수식어는 실질적으로 균질한 항체 군집으로부터 얻었다는 항체의 특징을 가리키는 것이며, 임의의 특정 방법에 의해 항체를 생산하여야 한다는 것으로 해석되어서는 안된다. 예를 들면, 단일 클론 항체는 문헌 [Kohler et al., Nature, 256:495 (1975)]에 최초로 기재된 하이브리도마 방법에 의해 제조될 수 있거나, 재조합 DNA 방법에 의해 제조될 수 있다. "단일 클론 항체"는 또한 예를 들면, 문헌 ([Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991)] 및 [Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597(1991)])에 기재된 기법을 사용하여 파지 항체 라이브러리로부터 단리될 수 있다.

본원에서 단일 클론 항체는 구체적으로 원하는 생물학적 활성을 보이는 한, 중쇄 및/또는 경쇄의 일부는 특정 종으로부터 유래되거나 특정 항체 부류 또는 하위부류에 속하는 항체의 상응하는 서열과 동일하거나 상동성이고, 쇄(들)의 나머지는 또다른 종으로부터 유래되거나 또다른 항체 부류 또는 하위부류에 속하는 항체의 상응하는 서열과 동일하거나 상동성인 것인 "키메라" 항체 및 상기 항체의 단편을 포함한다.

"키메라 항체"는, 비-인간 영장류 (예를 들어, 구세계 원숭이(Old World Monkey), 유인원 등)로부터 유래된 가변 도메인 항원-결합 서열 및 인간 불변 영역 서열을 포함하는, "영장류화된" 항체를 포함한다.

"항체 단편"은 바람직하게는 그의 항원-결합 영역 또는 가변 영역을 포함하는 무손상 항체의 일부를 포함한다. 항체 단편의 예로는 Fab, Fab', F(ab')2 및 Fv 단편; 디아바디; 선형 항체; 단일쇄 항체 분자; 및 항체단편(들)으로부터 형성된 다중특이적 항체를 포함한다.

"무손상 항체"는 항원-결합 가변 영역 뿐만 아니라, 경쇄 불변 도메인 (CL) 및 중쇄 불변 도메인, CH1, CH2 및 CH3을 포함하는 것이다. 불변 도메인은 천연 서열 불변 도메인 (예를 들어, 인간 천연 서열 불변 도메인) 또는 그의 아미노산 서열 변이체일 수 있다. 바람직하게, 무손상 항체는 하나 이상의 효과기 기능을 갖고, 그의 1 또는 2개의 중쇄에 부착된 올리고당 구조를 포함한다.

한편, "네이키드 항체"는 예를 들어, 세포독성 부분 또는 방사성 표지와 같은 이종성 분자에 접합되지 않은 항체이다. 단리된 항체는 그의 천연 환경의 성분으로부터 확인하고 분리 및/또는 회수된 것이다. 그의 천연 환경의 오염 성분은 항체에 대한 진단학적 또는 치료학적 사용을 방해하는 물질로서, 이는 효소, 호르몬 및 기타 다른 단백질성 또는 비단백질성 용질을 포함할 수 있다. 바람직한 실시태양에서, 항체는 (1) 로우리(Lowry) 방법에 의한 측정시, 항체의 95 중량％ 초과, 및 가장 바람직하게는 99 중량％ 초과 수준까지, (2) 회전식 컵 서열분석기를 사용하여 N-말단 또는 내부 아미노산 서열의 적어도 15개 잔기를 얻는데 충분한 정도까지, 또는 (3) 쿠마시(Coomassie) 블루 또는 바람직하게는, 은 염색을 사용하여 환원 또는 비-환원 조건하에 SDS-PAGE에 의해 균질할 때까지 정제된다. 단리된 항체는 항체의 천연 환경의 적어도 하나의 성분이 존재하지 않을 것이기 때문에 재조합 세포 내의 계내 항체를 포함한다. 그러나, 통상적으로, 단리된 항체는 적어도 하나의 정제 단계에 의해 제조될 것이다.

이러한 KRT19 항체의 아미노산 서열 변이체를 코딩하는 핵산 분자는 당업계에 공지된 다양한 방법에 의해 제조될 수 있다.

상기 방법은 천연 공급원으로부터의 단리 (천연적으로 발생된 아미노산 서열 변이체의 경우) 또는 KRT19 항체의 초기 제조된 변이체 또는 비-변이체 버전의 올리고뉴클레오티드-매개 (또는 부위 지정) 돌연변이 유발, PCR 돌연변이 유발, 및 카세트 돌연변이 유발에 의한 제조를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

"KRT19에 대한 특이적(specific) 결합"이라는 용어는 KRT19만이 결합되는 것을 의미한다. 즉, 본 발명에 따른 항-KRT19 항체의 결합은 KRT19에 대해 특이적이다. 특히, KRT-19의 서열번호 1의 아미노산 서열 중 78~330번째 서열 중 일부 또는 전부에 특이적으로 결합하는 것이 바람직하다. 당해 기술분야의 숙련된 당업자들에게 공지된 방법들을 이용하여 친화도 측정을 할 수 있다. 특이적 결합을 측정하는 다른 적절한 방법들은 당해 기술분야의 숙련된 당업자들에게 잘 알려져 있을 것이다

또한, KRT19항체는 안정성 및/또는 반감기를 증가시키기 위해 개질될 수 있다. 예를 들어, 항체의 반감기는 항체 또는 항체 단편의 페그화(pegylation)에 의해 증가될 수 있다(예를 들어, Chapman AP, Adv Drug Deliv Rev 2002, 54; 531-545 참조). 본 발명에 따른 항체는 또한 향상 조작 기법(enhancement manipulation technique)들을 채용한 무장 분자로서 생성될 수 있다. 또한, 인간 면역글로불린의 Fc 불변 부분의 첨가나 체인 셔플링(chain shuffling)과 같은 기법들을 이용한 돌연변이 항체들의 생성에 의해 전체 항체가 구성될 수도 있다 항체는 진단 또는 치료제와 연결된 항체 구성요소를 포함하는 면역 접합체(immunoconjugate)로 생성될 수 있다.상기 연결은 화학적 접합 또는 유전적 융합을 포함하는 해당 분야에서 숙련된 당업자가 인식하는 수단들에 의할 수 있다.

본 발명의 항암용 조성물은 상기 유효성분에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다.

본 발명의 항암용 조성물은, 상기 기재한 유효성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 제조할 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올, 리포좀 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있으며, 표적 기관에 특이적으로 작용할 수 있도록 표적 기관 특이적 항체 또는 기타 리간드를 상기 담체와 결합시켜 사용할 수 있다. 더 나아가 당해 기술분야의 적정한 방법으로 또는 레밍턴의 문헌(Remington's Pharmaceutical Science(최근판), Mack Publishing Company, Easton PA)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.

또한, 본 발명은 다른 관점에서, 약학적으로 유효한 양의 KRT19 항체를 포함하는 제제를 개체에 투여하는 단계를 포함하는, HER2를 발현하는 암 예방 또는 치료 방법에 관한 것이다.

상기 투여는 특별히 이에 제한되는 것은 아니나, 목적하는 방법에 따라 비경구 투여(예를 들어 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)하거나 경구 투여할 수 있으며, 비경구 투여가 바람직하며, 정맥내 주사에 의한 투여가 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다. 일일 투여량은 화합물의 경우 약 0.1 내지 100 ㎎/㎏ 이고, 바람직하게는 0.5 내지 10 ㎎/㎏ 이며, 하루 일회 내지 수회에 나누어 투여하는 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

본 발명에서, 치료 대상으로 하는 암은 HER2를 발현하는 암으로서, 예를 들어, 난소암, 복막암, 난관암, 유방암, 비-소세포 폐암 (NSCLC), 편평 세포암, 전립선암 및 결장직장암으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 것을 특징으로 한다. 바람직하게는 유방암이다.

실시예

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

준비 및 세포배양

인간 유방암 세포주 MCF-7 vec, MCF-7 HER2, MDA-MB-231, MDA-MB-468, T47D, BT-474, SKBR-3, Jimt-1을 American Type Culture Collection (ATCC; Manassas, VA)로부터 구입하여 37℃, 5% CO2 배양기 환경에서, 10% FBS (Sigma, St Louis, MO) 및 1 mg/mL 페니실린/스트렙토마이신 (Invitrogen, Grand Island, NY)이 첨가된 DMEM 배지에서 유지시켰다.

웨스턴 블랏

전 세포 추출물 (whole-cell lysate)을 세포 용해 버퍼 (50 mmol/L Tris-HCl pH 7.4, Sigma, 150 mmol/L NaCl, Sigma, 1% NP-40, Sigma, 0.25 % sodium deoxycholate, Sigma, 프로테아제 억제제 를 함유하는 1 mmol/L Phenylmetane-sulfonylfluoride, Roche, Mannheim, Germany)로 준비하였다.

단백질 농도는 BCA 단백질 분석 키트 (Pierce, Rockford, IL)를 이용하여 측정하고, 단백질 시료의 흡광도는 570 nm에서 VICTOR3TM Multilabel Plate Reader (PerkinElmer)를 이용하여 측정하였다.

단백질을 함유하는 세포 용해물을 SDS-PAGE (H2O, 30% acrlamide, Sigma, 1.5 mol/L Tris-HCl pH 8.8, 1 mol/L Tris-HCl pH 6.8, 10% sodium dodecyl sulfate, Sigma, 10% ammonium persulfate, Sigma, TEMED, Sigma 를 사용하여 제조하며 gel 퍼센트 농도에 따라 첨가되는 양에 차이가 있음) 에 의해 분리하고 polyvinylidene difluoride membrane (Amersham HybondTM-P, Little Chalfont, Buckinghamshire, UK) 상에 옮겨, 비특이적 결합에 대해 보호하기 위해 밤새 0.05% Tween-20 (Sigma)를 함유하는 TBS 용액에서 5% 스킴밀크 (BD Bioscience)에서 유지시켰다. Membrane을 각 일차 항체 및 HRP-결합된 2차 항체 (Pierce)로 인큐베이션 하였다.

이 때, ECL 플러스 웨스턴 블럿 검출 시스템 (Amersham)을 HRP (horseradish peroxidase) 표지된 항체와 결합되어 있는, 고정된 특정 항원을 검출하는데 사용하였다. 상기 membrane을 LAS 3000 (Fuji Photo Film Co. LTD, Japan)에 노출시켰다.

확인예 1: KRT19 와 HER2 의 물리적 결합

BT-474에서 KRT19와 HER2의 세포내 위치를 확인하기 위하여 면역세포화학법 (immunocytochemistry)을 이용하였다.

세포를 약 4% paraformaldehyde (Sigma)에 10분 배양하여 고정시킨 후, 0.1% Triton X-100 (Sigma)에 10분 배양하여 permeabilized 한다. 3% 스킴밀크로 blocking 한 후 나머지 실험 방법은 웨스턴 블럿과 동일하게 진행하였다. 2차 항체는 녹색 형광을 관찰 할 수 있는 IgG-Oregon Green (Invitrogen), 적색 형광을 관찰 할 수 있는 IgG-Cy3 (Invitrogen) 등을 사용하였다. Confocal 현미경을 사용하여 z축을 2μm 씩의 절편으로 사진 촬영을 하였다.

그 결과를 도 1에 나타내었다. Merge로 표기된 부분이 KRT19와 HER2가 세포내 같은 부위에서 발현되는 것을 보여준다 (도 1a).

KRT19가 세포질뿐만 아니라 HER2와 유사하게 세포막에서 발현되는 것을 확인하기 위하여 세포막 분획법 방법을 이용하였다. 세포를 100,000 g로 초고속 원심분리하여 부유물을 세포질 부분, 펠렛을 세포막 부분으로 분획하였고 나머지 진행 방법은 웨스턴 블럿과 동일하게 진행하였다. HER2를 발현하지 않는 MCF-7 vec 세포를 제외한 나머지 MCF-7 HER2, BT-474 세포에서 세포막에 KRT19의 발현을 관찰하였으며, AQP4는 세포막 특이적 마커로, Actin은 세포질 특이적 마커로 사용하였다 (도 1b).

KRT19와 HER2의 물리적 결합을 확인하기 위하여 공-면역침전법 (co-immunoprecipitation)을 이용하였다. 세포 용액 부유물에 타겟 항체를 넣고 밤새 유지시킨 후, Protein G sepharose (GE Healthcare, Sweden)를 추가로 넣어 3시간 유지시키고 원심분리기를 이용해 Protein G sepharose 펠렛만을 획득하여 SDS-PAGE로 단백질을 분리시키고 나머지 방법은 웨스턴 블럿과 동일하다. HER2 과발현 세포주인 MCF-7 HER2, BT-474에서 KRT19와 HER2의 물리적 결합이 확인되었다 (도 1c).

또한 KRT19가 HER2와 마찬가지로 세포막 외부로 노출되어있다는 것을 확인하기 위하여 permeabilized 과정을 배제한 면역세포화학법을 이용하였다. KRT19는 세포막 외부로 노출이 되어있음을 확인하였으며 음성대조군을 동시에 관찰한 결과 세포질과 핵에서만 발현되는 ERK에서는 적색 형광을 확인하지 못하였다 (도 1d).

도 1에 나타난 바와 같이, KRT19는 세포막에서도 발현되며 그 발현은 세포막 외부로 노출되어있고 또한 HER2와 물리적으로 결합할 수 있다는 사실을 확인할 수 있다. 따라서 HER2 결합 단백질로써의 새로운 항암제 타겟 단백질 후보로서의 KRT19 항체의 기능을 예측할 수 있었다.

실시예 1: KRT19 단일 클론 항체의 항암효과

KRT19 단일 클론 항체의 항암효과를 확인하기 위하여 MTT assay를 이용하였다. MTT assay는 탈수소 효소작용에 의하여 노란색의 수용성 기질인 MTT tetrazolium을 청자색을 띄는 비수용성의 MTT formazan (3-(4,5-dimethylthiozol-2-yl)-2,5-tetrazolium bromide)으로 환원시키는 미토콘드리아의 능력을 이용하는 검사이다.

배양 세포에 MTT solution (Sigma)을 첨가하여 약 2~3시간 배양 후 DMSO (dimethyl sulfoxide, Sigma)로 청자색 결정을 녹여 570 nm에서 흡광도를 측정하였다.

그 결과, KRT19 단일 클론 항체가 HER2 과발현 세포인 BT-474 및 SKBR-3의 생존을 억제시킴을 확인하였고, 허셉틴의 내성을 지니고 있는 Jimt-1 세포도 세포 생장 저해를 확인하였다 (도 2).

즉, HER2 과발현 암세포주뿐만 아니라 종래의 허셉틴에 대해 내성을 가지는 암세포주라 할지라도, 본 발명에 의해 HER2 발현 저해 효과를 발휘할 수 있으므로, HER2를 발현하는 암에 대하여, 허셉틴 등을 대신 할 수 있는 새로운 항암제로 사용될 수 있음을 시사한다.

실시예 2: KRT19 단일 클론 항체의 대량 생산을 위한 하이브리도마 제작

실시예 1에서 처리한 KRT19 단일 클론 항체는 CHEMICON 사에서 상업적으로 판매하고 있는 제품이다. KRT19 단일 클론 항체의 항암 효과를 관찰하는데 많은 양의 항체가 필요하므로 본 발명자들은 KRT19 단일 클론 항체를 생산할 수 있는 하이브리도마를 제작하였다.

KRT19의 펩타이드 서열은 다음과 같다 (총 400개의 아미노산 서열).

MTSYSYRQSSATSSFGGLGGGSVRFGPGVAFRAPSIHGGSGGRGVSVSSARFVSSSSSGAYGGGYGGVLTASDGLLAGNEKLTMQNLNDRLASYLDKVRALEAANGELEVKIRDWYQKQGPGPSRDYSHYYTTIQDLRDKILGATIENSRIVLQIDNARLAADDFRTKFETEQALRMSVEADINGLRRVLDELTLARTDLEMQIEGLKEELAYLKKNHEEEISTLRGQVGGQVSVEVDSAPGTDLAKILSDMRSQYEVMAEQNRKDAEAWFTSRTEELNREVAGHTEQLQMSRSEVTDLRRTLQGLEIELQSQLSMKAALEDTLAETEARFGAQLAHIQALISGIEAQLGDVRADSERQNQEYQRLMDIKSRLEQEIATYRSLLEGQEDHYNNLSASKVL

유사성 (homology)이 높은 특정 도메인 부위로 펩타이드 (peptide) 항체를 만들 경우 다른 단백질을 같이 인지할 확률이 있으므로 일반적으로 도메인 부위는 제외하였다.

Glycosylation site, myristoylation site를 포함하는 부분은 합성된 펩타이드와 발현된 단백질이 동일하지 않으므로 (번역-후 변성 (post-translational modification)에 의해 다른 구조를 형성할 가능성이 높음) 합성 펩타이드로 제작한 항체로 인지될 확률이 매우 낮아 제외하였다.

도 3은 16 번째 아미노산 서열부터 78 번째 아미노산 서열 사이에 glycine-rich region profile이 존재하는 것을 나타내며 따라서 이 부분을 선택할 경우 cross reactivity를 고려해야 하므로 타겟 서열에서 제외하였다.

소수성 (hydrophobicity)이 낮고 항원성 (antigenicity)이 높은 지역이 일반적으로 항체 제작의 가능성이 높으며 단백질 3차 구조에서 외부로 노출되어 있을 가능성이 높아 이 지역을 우선 고려하여 선정하였다 (도 4, 두꺼운 녹색 줄로 표기된 부분).

위의 모든 사항을 고려하여 이하와 같은 총 4가지의 타겟 후보 아미노산 서열을 확립하였다.

아미노산 서열 정보	아미노산 서열
167개 (7~173)	RQSSATSSFGGLGGGSVRFGPGVAFRAPSIHGGSGGRGVSVSSARFVSSSSSGAYGGGYGGVLTASDGLLAGNEKLTMQNLNDRLASYLDKVRALEAANGELEVKIRDWYQKQGPGPSRDYSHYYTTIQDLRDKILGATIENSRIVLQIDNARLAADDFRTKFETEQ
253개 (78~330)	GNEKLTMQNLNDRLASYLDKVRALEAANGELEVKIRDWYQKQGPGPSRDYSHYYTTIQDLRDKILGATIENSRIVLQIDNARLAADDFRTKFETEQALRMSVEADINGLRRVLDELTLARTDLEMQIEGLKEELAYLKKNHEEEISTLRGQVGGQVSVEVDSAPGTDLAKILSDMRSQYEVMAEQNRKDAEAWFTSRTEELNREVAGHTEQLQMSRSEVTDLRRTLQGLEIELQSQLSMKAALEDTLAETEAR
150개 (1~150)	MTSYSYRQSSATSSFGGLGGGSVRFGPGVAFRAPSIHGGSGGRGVSVSSARFVSSSSSGAYGGGYGGVLTASDGLLAGNEKLTMQNLNDRLASYLDKVRALEAANGELEVKIRDWYQKQGPGPSRDYSHYYTTIQDLRDKILGATIENSR
179개 (215~393)	KKNHEEEISTLRGQVGGQVSVEVDSAPGTDLAKILSDMRSQYEVMAEQNRKDAEAWFTSRTEELNREVAGHTEQLQMSRSEVTDLRRTLQGLEIELQSQLSMKAALEDTLAETEARFGAQLAHIQALISGIEAQLGDVRADSERQNQEYQRLMDIKSRLEQEIATYRSLLEGQEDHYNN

이 중 78번째 아미노산 서열부터 330번째 아미노산 서열의 총 253 아미노산 서열을 항체 제작 타겟으로 선정하였다.

항원으로 선정한 서열을 펩타이드 합성을 통해 제작하여 생후 6~8주 가량 된 암컷 BALB/C 생쥐의 복강에 주입하였다. 약 3~4 번의 주입으로 boost immunization이 확인되면 생쥐 꼬리에서 채혈하여 ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay)로 항체의 농도를 확인하였다.

항원을 주입하여 면역화가 일어난 생쥐에서 채취한 splenocyte와 골수종 세포 (myeloma)를 세포 융합 (cell fusion)하여 인공 배양 환경에서도 계속해서 계대배양과 항체 생산이 가능한 하이브리도마 세포주 클론을 18개 획득하였다.

실시예 3: 하이브리도마 클론에서 생성된 KRT19 단일 클론 항체의 웨스턴 블럿

실시예 2의 18가지 하이브리도마에서 항체를 얻어 정제한 후 KRT19과 특이적 결합을 하는지 검증하기 위하여 웨스턴 블럿 방법을 이용하였다.

그 결과, 도 5에 나타나 있는 바와 같이, 모든 클론에서 KRT19 항원 특이적 결합을 보였다. 첫 번째 lane은 KRT19 음성 대조군으로 293T 세포주의 단백질을, 두 번째 lane은 KRT19 양성 대조군으로 MCF-7 HER2 세포주를 사용한 것이다.

실시예 4: HER2 과발현 세포의 사멸을 유도하는 하이브리도마 클론 선별

실시예 2의 18가지 하이브리도마에서 항체를 얻어 정제한 후 HER2 과발현 세포에 처리하여 세포 생장을 저해시키는 하이브리도마 클론을 선별하였다. 실험방법은 실시예 1의 MTT assay와 동일하게 하였다.

HER2 과발현 세포주인 BT-474에서 18가지 클론을 처리한 후 세포 생장 억제의 효과가 있는 9가지 클론을 선별한 후, 마찬가지로 HER2 과발현 세포주인 SKBR-3에서 9가지 클론을 처리한 후 세포 생장 억제의 효과가 가장 큰 5E4 클론을 선별하였다 (도 6).

또한 상기 하이브리도마 클론들 중에서, 5E4 하이브리도마 클론(해당 서열은?)을 배양한 후 BALB/C 생쥐에 주입한 후 1~2주 뒤 복수 (ascites fluid)를 얻고 항체 정제 키트 (Millipore)로 정제한 후 별도로 항암효과를 검증하여보았다. 그 결과, 도 7에 도시하고 있는 바와 같이 HER2를 발현하는 세포의 생장이 억제되는 것을 확인할 수 있었다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims (5)

1. KRT19 단백질에 상보적으로 결합하는 KRT19 항체를 유효성분으로 포함하는, HER2를 발현하는 암에 대한 항암용 조성물.
   
2. 제1항에 있어서, 상기 KRT19는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어져 있는 것을 특징으로 하는 항암용 조성물.
   
3. 제1항에 있어서, 상기 KRT19 항체는 서열번호 1의 아미노산 서열 중 78~330번째 서열을 타겟으로 하는 것을 특징으로 하는 항암용 조성물.
   
4. 제1항에 있어서, 상기 KRT19 항체는 단일클론 항체인 것을 특징으로 하는 항암용 조성물.
   
5. 제1항에 있어서, 상기 KRT19 항체는 KRT19와 HER2 사이의 물리적 결합을 저해하는 것을 특징으로 하는 항암용 조성물.

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