KR101288420B1

KR101288420B1 - 우포늪 퇴적토 유래 신규 에스테라아제 ｌ28과 이의 용도

Info

Publication number: KR101288420B1
Application number: KR1020110115189A
Authority: KR
Inventors: 이창묵; 윤상홍; 김수진; 구본성; 강한철
Original assignee: 대한민국
Priority date: 2011-11-07
Filing date: 2011-11-07
Publication date: 2013-07-26
Also published as: KR20130050055A

Abstract

본 발명은 우포늪 퇴적토 유래의 신규한 에스테라아제 (esterase) L28 효소에 관한 것이다.
본 발명에 따른 신규 에스테라아제 L28 효소는 통상적인 방법으로는 배양이 불가능한 난배양 미생물로부터 유래된 효소로서 저온 및 알칼리 상태에서도 상당한 에스테라아제 활성을 유지할 수 있다. 따라서, 일차적으로는 지방 분해를 위한 가수분해 효소로 이용될 수 있으며, 효소의 특성에 따라 음식의 향을 조절하는 식품가공 및 광학 활성을 통한 신약제조 등의 상업분야에서도 유용하게 활용될 수 있다.

Description

우포늪 퇴적토 유래 신규 에스테라아제 Ｌ28과 이의 용도 {Novel esterase L28 from Upo swamp metagenome and its usage}

본 발명은 우포늪 퇴적토 유래의 신규한 에스테라아제 (esterase) 효소에 관한 것이다.

기름은 기본 구조인 글리세롤(glycerol)에 다양한 지방산(fatty acid)이 결합된 형태로 존재한다. 기름의 분해는 글리세롤과 지방산의 에스테르 결합을 가수분해 할 수 있는 에스테라아제에 의해 이루어진다. 화학적으로 기름은 융점보다 낮은 저온에서 고형화되어 환경에서 제거하기 어려워진다. 현재 화학적인 방법에 비하여 기름성분을 분해하는 생물학적인 방법은 경제적이며 친환경의 장점이 있지만, 아직 산업적으로 충분한 경제성을 가진 다양한 미생물 유래 고활성 에스테라아제 효소가 개발되지 못하고 있다. 또한 에스테라아제(esterase)는 에스터 화합물의 가수분해 및 합성을 촉진시키는 카복실 에스터 하이드록실라아제이다. 에스테라아제는 탄소수 10개 이하의 단쇄 지방산을 가수분해하는 효소로서, 현재 점점 많은 키랄 약물 및 유기인 화합물이 에스테라아제 촉매화된 반응을 통해 생산되고 있다. 에스테라아제 효소는 동물, 식물 및 미생물에 존재한다고 보고되었으며, 다양한 공급배지로부터 여러 가지 에스테라아제가 생산될 수 있다. 에스테라아제는 식품가공, 오일 제조 및 광학활성을 통한 신약제조 등 다양한 산업 분야에서 잠재적인 이용 가능성을 가지고 있으며, 따라서 신규 효소의 특이성 및 선택성을 활용한 상업적 이용이 기대된다.

본 발명에서는 알칼리성 저온에서도 활성이 오래 유지되는 에스테라아제를 분리하여 이를 유전공학적 기법으로 대량발현하는 신규 균주를 사용해 기름 오염 농업환경정화 과제를 경제적이며 환경친화적으로 해결하고자 한다.

환경 내 미생물 군집 중 대부분의 미생물이 인공적으로 배양하기 어렵기 때문에 전통적인 배양기술로서는 신종 식물세포벽 분해효소 및 지방가수분해효소 등의 생촉매를 선발하는데 한계에 도달하였다. 이러한 한계점을 극복하기 위하여 1998년 미국의 위스콘신대학에서 알려지지 않은 토양미생물을 이용한 신약탐색을 시작한 후로, 해양, 사막, 강 및 온천 등 특정 환경에 존재하는 인공배양이 불가능한 난배양 미생물로부터 신종 생촉매 선발이 활발히 진행되고 있는데, 이러한 기술을 메타게놈 (metagenome) 이라고 한다. 최근 여러 환경으로부터 구축된 메타게놈 라이브러리로부터 신종 촉매 효소들이 보고되고 있다(국내특허 제10-0817321호 등).

본 발명은 우포늪 퇴적토에 존재하는 난배양 미생물로부터 분리한 신규한 에스테라아제 (esterase) L28 효소 및 이의 제조방법을 제공하고자 한다.

본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 에스테라아제 효소 및 이를 코딩하는 유전자를 제공한다.

또한 본 발명은 상기 유전자를 보유하는 벡터를 제공한다.

또한 본 발명은 상기 벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공한다.

또한 본 발명은 (a) 상기 형질전환체를 배양하는 단계; (b) 상기 배양된 형질전환체로부터 에스테라아제를 생산하는 단계; 및 (c) 상기 생산된 에스테라아제를 회수하는 단계를 포함하는 에스테라아제 효소의 제조방법을 제공한다.

본 발명에 따른 신규 에스테라아제 효소는 통상적인 방법으로는 배양이 불가능한 난배양 미생물로부터 유래된 효소이다. 본 발명이 제공하고 있는 L28 에스테라아제는 대장균에서 발현하여 0~35℃의 폭넓은 온도와 pH 8~11의 알칼리 환경에서도 지방분해 능력을 발휘하므로, 이를 사용하여 에스테르 결합을 가진 기름, 유지를 효과적으로 제거 할 수 있다. 따라서, 일차적으로는 지방 분해를 위한 가수분해 효소로 이용될 수 있으며, 효소의 저온, 알칼리성 저항 특성에 따라 음식의 향을 조절하는 식품가공 및 광학 활성을 통한 신약제조의 과정에서 상기 공정이 필요한 상업분야에서 유용하게 활용될 수 있다.

도 1 은 우포늪 메타게놈 유전자은행에서 선발한 에스테라아제 활성을 갖는 메타게놈 클론 L28의 지방분해 활성 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 2 는 에스테라아제 활성을 갖는 메타게놈 클론 E28의 핵산서열 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 3 은 ClustalW 알고리즘으로 multiple alignment된 신규한 에스테라아제 L28의 단백질 도메인 분석 결과를 나타낸 것이다. 중요한 catalytic triad는 밑줄로 표현하였고, 비교군 에스테라아제에서 잘 보존된 아미노산은 별표로 표시하였다.
도 4 는 신규한 에스테라아제 L28의 계통분석도를 나타낸 것이다. 각 branch에 있는 숫자는 Bootstrap 분석치(1,000 resampling)이다. 분석에 사용된 각 에스테라아제/라이페에즈가 유래한 균과 GenBank ID를 보였다.
도 5 는 신규한 에스테라아제 L28을 대장균 BL21(DE3)에서 발현 및 정제하여 확인한 결과를 나타낸 것이다(1, Induction 전 대장균 조단백질; 2, L28 과다발현 대장균 조단백질; 3, 동일 미생물에서 정제한 Soluble 조단백질; 4, 6XHis Tag을 이용하여 순수 정제한 L28 단백질; M, Size marker).
도 6 은 신규한 에스테라아제 L28의 최적 활성 온도를 측정한 그래프를 나타낸 것이다.
도 7 은 신규한 에스테라아제 L28의 최적 활성 pH를 측정한 그래프를 나타낸 것이다.
도 8 은 신규한 에스테라아제 L28의 온도별 활성 안정도를 그래프로 나타낸 것이다.
도 9 는 신규한 에스테라아제 L28의 pH별 활성 안정도 그래프를 나타낸 것이다.

본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 에스테라아제 (esterase) 효소 및 상기 에스테라아제 효소를 코딩하는 유전자를 제공한다.

본 발명의 에스테라아제 효소는 통상적인 방법으로는 배양이 불가능한 난배양 미생물로부터 유래된 효소로서, 0~45℃의 폭넓은 온도와 pH 8~11의 알칼리 환경에서도 뛰어난 지방분해 능력을 발휘하므로, 이를 사용하여 에스테르 결합을 가진 기름, 유지를 효과적으로 제거 할 수 있다. 하기 실시예에 따르면 본 발명의 에스테라아제 효소는 0~45℃, 10~40℃, 20~40℃, 25~40℃ 또는 30~40℃의 온도 범위에서 우수한 지방분해 활성을 가지며, 또한 pH 8~11, pH 8~10 또는 pH 8.5~9.5의 알칼리성 pH 조건에서 우수한 지방분해 활성을 나타냄을 알 수 있다.

본 발명의 일실시예에서, 상기 에스테라아제 효소 및 유전자는 우포늪 퇴적토 유래의 메타게놈으로부터 유래한 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 유전자는 서열번호 2의 핵산서열로 이루어진 유전자일 수 있다.

서열번호 2의 핵산서열로 이루어진 에스테라아제 유전자 또는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 에스테라아제 효소 외에도 상기 서열들의 변이체가 본 발명의 범위 내에 포함되는 것으로 본다. 변이체는 핵산서열 또는 아미노산 서열은 변화되지만, 서열번호 2의 핵산서열 또는 서열번호 1의 아미노산 서열과 유사한 기능적 특성을 갖는 핵산서열로 이루어진 유전자 또는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드이다. 구체적으로, 본 발명에 따른 유전자는 서열번호 2의 핵산서열과 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 핵산서열을 포함할 수 있으며, 본 발명에 따른 에스테라아제 효소는 서열번호 1의 아미노산 서열과 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.

또한 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 에스테라아제 효소를 코딩하는 유전자를 보유하는 벡터를 제공한다.

본 발명의 한 구체예에서, 상기 유전자는 서열번호 2의 핵산으로 이루어진 유전자일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 따른 형질전환 벡터는 도 2에 기재된 개열 지도를 갖는 pUC118 벡터이나, 발명의 형질전환 벡터는 이에 한정되지 않으며, 바람직한 예는 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.

본 발명에 있어서 “벡터(vector)”는 적합한 숙주 내에서 DNA를 발현시킬 수 있는 적합한 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 DNA 서열을 보유하는 DNA 제조물을 의미한다. 벡터는 플라스미드, 파지 입자, 또는 간단하게 잠재적 게놈 삽입물일 수 있다. 적당한 숙주로 형질전환되면 벡터는 숙주 게놈과 무관하게 복제하고 기능할 수 있거나, 또는 일부 경우에 게놈 그 자체에 통합될 수 있다.

상기 벡터는 발현 벡터일 수 있으며, 본 발명에서 사용된 용어 “발현 벡터”는 목적한 코딩 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동 가능하게 연결된 코딩 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다. 진핵세포에서 이용 가능한 프로모터, 인핸서, 종결신호 및 폴리아데닐레이션 신호는 공지되어 있다.

발현 벡터는 하나 이상의 선택성 마커를 포함할 수 있다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 그 예로는 글리포세이트(glyphosate) 또는 포스피노트리신(phosphinothricin)과 같은 제초제 저항성 유전자, 카나마이신(kanamycin), G418, 블레오마이신(Bleomycin), 하이그로마이신(hygromycin), 클로람페니콜(chloramphenicol)과 같은 항생제 내성 유전자가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 당업자에 의해 적절히 선택 가능하다.

본 발명의 일 실시예에 따른 벡터에서, 프로모터는 CaMV 35S, 액틴, 유비퀴틴, pEMU, MAS 또는 히스톤 프로모터일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. "프로모터"란 용어는 구조 유전자로부터의 DNA 업스트림의 영역을 의미하며 전사를 개시하기 위하여 RNA 폴리머라아제가 결합하는 DNA 분자를 말한다.

또한, 본 발명은 상기 벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공한다.

본 발명의 일실시예에 따르면 상기 형질전환체는 국립농업과학원 농업유전자원센터에 2011년 09월 27일자로 기탁된 수탁 번호 KACC95111P인 균주일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에서 용어 "형질전환(transformation)"이란 DNA를 숙주로 도입하여 DNA가 염색체의 인자로서 또는 염색체 통합 완성에 의해 복제 가능하게 되는 것으로 외부의 DNA를 세포 내로 도입하여 인위적으로 유전적인 변화를 일으키는 현상을 의미한다.

본 발명의 벡터를 안정되면서 연속적으로 클로닝 및 발현시킬 수 있는 형질전환체는 당업계에 공지된 어떠한 형질전환체도 이용할 수 있으며, 예컨대, E. coli JM109, E. coli BL21, E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110와 같은 대장균; 바실러스 서브틸리스, 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주; 살모넬라 티피무리움, 세라티아 마르세슨스; 슈도모나스 속과 같은 균주 등이 있다.

또한, 본 발명의 벡터를 진핵 세포에 형질전환시키는 경우에는 형질전환체로서, 효모(Saccharomyce cerevisiae), 곤충세포, 사람세포 (예컨대, CHO 세포주 (Chinese hamster ovary), W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, 3T3, RIN 및 MDCK 세포주) 및 식물세포 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 벡터를 형질전환체 내로 운반하는 방법은, 형질전환체가 원핵 세포인 경우, CaCl2 방법 (Cohen, S.N. et al., Proc. Natl. Acac. Sci. USA, 9:2110-2114(1973)), 하나한 방법 (Hanahan, D., J. Mol. Biol., 166:557-580(1983)) 및 전기천공 방법 (Dower, W.J. et al., Nucleic. Acids Res., 16:6127-6145(1988)) 등에 의해 실시될 수 있다. 또한, 숙주세포가 진핵세포인 경우에는, 미세주입법(Capecchi, M.R., Cell, 22:479(1980)), 칼슘포스페이트 침전법 (Graham, F.L. et al., Virology, 52:456(1973)), 전기천공법(Neumann, E. et al., EMBO J., 1:841(1982)), 리포좀-매개 형질감염법(Wong, T.K. et al., Gene, 10:87(1980)), DEAE-덱스트란 처리법(Gopal, Mol. Cell Biol., 5:1188-1190(1985)), 및 유전자 밤바드먼트(Yang et al., Proc.Natl. Acad. Sci., 87:9568-9572(1990)) 등에 의해 벡터를 형질전환체 내로 주입할 수 있다.

또한 본 발명은 (a) 서열번호 1의 에스테라아제 효소를 코딩하는 유전자를 보유하는 벡터로 형질전환된 형질전환체를 배양하는 단계; (b) 상기 배양된 형질전환체로부터 에스테라아제를 생산하는 단계; 및 (c) 상기 생산된 에스테라아제를 회수하는 단계를 포함하는 에스테라아제 효소의 제조방법을 제공한다.

상기 단계 (a)에 있어서, 형질전환체의 배양은 다양한 배지에서 수행할 수 있으며, 예를 들어 페드-배치(fed-batch) 배양 또는 연속 배양 등을 수행할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 또한 구체적인 배지의 조성 및 배양 조건은 숙주세포 및 기질의 종류에 따라 당업자에 의해 적절히 선택될 수 있다.

상기 단계 (b)에 있어서, 적절한 숙주세포를 선택하여 배지 조건을 조성하면 형질전환체는 에스테라아제를 생산하게 되며, 벡터의 구성 및 숙주세포의 특징에 따라 숙주세포의 세포질 내, 페리플라즈믹 스페이스(periplasmic space) 또는 세포 외로 분비될 수 있다.

상기 단계 (c)에 있어서, 숙주 세포 내 또는 외에서 발현된 에스테라아제는 통상의 방식으로 회수될 수 있다. 예를 들어 염석(예를 들어 황산암모늄 침전, 인산 나트륨 침전 등), 용매 침전(예를 들어, 아세톤, 에탄올 등을 이용한 단백질 분획 침전 등), 투석, 겔 여과, 이온 교환, 역상 컬럼 크로마토그래피와 같은 크로마토그래피 및 한외여과 등의 기법을 단독 또는 조합으로 적용하여 회수할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니며, 당업계의 통상적인 방법에 의해 회수할 수 있다(Sambrook, J et al. Molecular Cloning 3rd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory, 2001).

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

< 실시예 1: 우포늪 메타게놈 유전자은행 구축>

우포늪 (35°33'∑, 128°25'E) 퇴적토에서 분리한 메타게놈 시료에서 유래한 것으로, 메타게놈을 분리하기 위하여 퇴적토를 -80℃에서 얼린 후, 막자사발에서 액체질소를 첨가하며 분쇄하였다. 분쇄된 퇴적토는 PowerMax soil DNA 분리 키트(MoBio Co. U.S.A)를 사용하여 crude 메타게놈은 DNA를 분리하였다. Humic compound와 ~30kb DNA를 분리하기 위하여 전기영동용 loading buffer(60% glycerol, 0.025% bromophenol blue, 0.025% xylene cyanol)을 넣어 혼합하고 0.8% low melting agarose gel(0.5×TBE: 45 mM Tris base, 45 mM boric acid, 1 mM EDTA)에 DNA시료를 넣은 후 PFGE(Pulsed Field Gel Electrophoresis)의 CHEF III system(BioRad, USA)을 이용하여 6 V/cm로 14시간 동안 전기영동 하였다. 사용한 agarose gel은 2% polyvinylpyrrolidine이 포함된 부위로 patch하여 사용하였다. 35kb이상의 DNA를 포함하는 agarose block만을 자른 다음 agarase효소를 넣어 1시간 동안 반응시킨 후 70℃에서 10분간 agarase를 비활성화 시켰으며, 이 반응액에 2.5배의 에탄올을 첨가하여 원심 분리한 후 침전된 DNA pellet을 적당한 농도로 TE buffer에 용해하여 metagenomic library를 만드는데 사용하였다.

Fosmid library 제작은 정제한 DNA 25μl (5 μg)에 5 unit의 T4 polymerase와 2 unit T4 polynucleotide kinase 그리고 6 unit의 Klenow fragment (Takara Co., Japan)를 가한 후 반응액량을 50 μl로 조절한 후 37℃에서 30분간 반응시켜 DNA의 말단을 평활화하여 제작하였다. 반응이 끝난 후 동량의 phenol/chloroform/isoamylalcohol (25:24:1,v/v/v)을 첨가하여 섞은 다음 10분간 원심분리하고 상등액을 모아서 동량의 chloroform/isoamylalchohol (24:1, v/v)을 첨가하여 혼합한 후에 12,000 rpm에서 10분간 원심분리하여 상등액 만을 취하고 2.5배의 100% ethanol을 넣어 1시간 동안 상온에서 방치한 다음 원심분리하여 상등액은 버리고 70% ethanol로 DNA를 세척하여 DNA를 준비하였다. pEpiFos5 fosmid vector (Epicentre, USA)에 end-repaired DNA를 첨가하여 16℃에서 16시간 ligation 반응시켰다. In vitro packaging을 위해 16℃에서 16시간 반응한 시료를 70℃에서 10분간 열처리하여 ligase 효소를 불활성화시켰다. Ligation한 반응액 10μl에 MAX lambda packaging extracts kit (Epicentre, USA)의 extracts 25μl를 공기방울이 생기지 않게 조심스레 섞어 준 다음 30℃에서 90분간 반응시켰다. 여기에 다시 phage extracts 25 μl를 더 넣어 pipette을 사용해 공기방울이 생기지 않게 조심스레 섞어 준 다음 30℃에서 90분간 반응시켜 in vitro packaging을 수행하였다. 파지 희석용 SM 완충용액을 1 ml 첨가하여 위아래로 잘 섞어 준 다음 여기에 25μl의 chloroform을 넣어 다시 packaging 되지 않은 물질들을 불활성화 시켰다. 원심분리를 조심스럽게 하여 정치한 다음 4℃에 보관하였고 상등액을 대장균 Epi100균에 감염시켜 총 113,000여 개별 형질 전환된 균주로 구성된 메타게놈 유전자은행을 완성하였다.

<실시예 2: 에스테라아제 유전자 스크리닝>

우포늪 퇴적토 메타게놈 유전자은행의 ~100,000여 개별 클론을 지질성분인 글리세릴 트리부티레이트 (glyceryl tributyrate) 0.5%, Chloramphenicol 20μg/ml이 포함된 LB평판 배지에 도말하여 28°C에서 7일간 배양하였다. 이후 기질로 제공한 글리세릴 트리부티레이트가 분해되어 투명한 환을 형성하는 클론을 에스테라아제 기능을 가진 양성으로 1차 판정하였다. 상기 스크리닝 과정을 반복하여 기질을 분해하는 활성을 가진 포스미드 E28 클론을 1차로 선발하였다. 균의 생리적인 효과에 의한 지질성분 분해 같은 위양성을 검출하고, 이 균에 존재하는 유전자에 의한 기질 분해 효과인지를 확인하기 위하여 E28 클론에서부터 포스미드(fosmid)를 FosmidMax DNA purification kit (Epicentre, U.S.A)을 사용하여 분리한 다음, 이를 다시 대장균 DH5α에 별도로 형질전환 시켜 동일한 트리부티레이트 기질을 가진 LB 평판배지에서 투명환이 재현되는 경우에 양성으로 최종 판정하였다. (도 1).

<실시예 3: 신규 에스테라아제 유전자의 핵산서열 분석>

트리부티린 (Tributyrine) 분해활성을 보인 포스미드 E28의 shot-gun 클론 SE28으로부터 전체 도입 크기 (insert size) 2,303 bp의 핵산서열을 확보하였다. 결정된 전체 핵산서열을 대상으로 ORF 분석을 한 결과, 1,031 bp의 ORF가 GenBank상에서 Streptococcus sanguinis에서 유래한 hydrolase/acyltransferase와 유의성을 가진 것으로 나타났다 (Maximum identity 30%, Positive homology 45%, E-value 8e-30). 기존의 특허 유전자 데이터베이스와 환경베타게놈 유전체 정보 데이터베이스에서는 유의성을 가진 유사한 효소가 검출되지 않았다. 이 ORF를 L28로 명명하였다. L28에서 유래한 단백질의 크기는 31.3 kDa이며 pI는 5.2로 추정되었다 (도 2).

<실시예 4: 신규 에스테라아제 유전자의 구성과 도메인 특성>

L28 핵산서열을 사용하여 domain 분석을 한 결과, L28 단백질 아미노산에는 잘 알려진 oxyanion hole (RG: 64~65아미노산) 모티프, pentapeptide 모티프 (GHSLG: 101~105아미노산)와 에스테라아제/라이페에즈의 전형적인 catalytic triad인 Aspartic acid/Glutamic acid (D: 202 아미노산), Histidine (H: 263 아미노산)가 잘 보존된 α-/β-hydrolase 6 domain(32~281 아미노산 부분)이 매우 높은 확실성을 가지고 (E=8.42e-31) 존재하는 것을 확인하였다(도 3). 반면, L28은 에스테라아제/라이페에즈 효소군 에서 흔히 보이는 leader sequence가 존재하지 않았다. 이는 이 단백질 효소가 대장균 세포 내에서 특정부위로 이송되어 활성을 나타내지 않고 세포의 파쇄와 같은 비특이적 외부 유출을 통하여 활성을 가질수 있다는 것을 암시하였다. L28의 도메인 multiple alignment 분석에 사용된 에스테라아제/라이페에즈가 유래한 비교 미생물 효소군과 GenBank accession 번호는 다음과 같다. EGC22818 (Streptococcus sanguinis SK353), ZP_08722529(Streptococcus macacae NCTC 11558), EGC78296 (Treponema denticola F0402), ZP_02093405 (Parvimonas micra ATCC33270), ZP_0160229 (Slackia exigua ATCC 700122), ZP_04608920 (Micromonospora sp. ATCC39149) (도 3).

L28 유전자를 형질 전환시킨 대장균 DH5α를 국립농업과학원 농업유전자원센터에 2011년 09월 27일자로 기탁하였으며, 2011년 10월 10일자로 수탁번호 KACC95111P를 부여 받았다.

<실시예 5: 신규 에스테라아제 유전자의 계통분석>

상기 실시예 3과 4에서 확인된 L28 ORF 단백질 아미노산을 사용하여 알려진 에스테라아제와의 종간 유사성을 계통분석으로 조사하였다. Mega4 program (www.megasoftware.net)을 사용하여, BlastP 검색으로 가장 Homology가 높은 17개 에스테라아제/라이페에즈를 선택하여 L28 ORF와 multiple-amino acid-alignment를 수행하고 그 결과를 바탕으로 계통분석을 수행하였다. ClustalW로 multiple-alignment 한 뒤, Neighbor-Joining 알고리즘을 사용하였고 Bootstrap parameter는 1,000 replication, Random seed 44087을 사용하였다. 그 결과, L28 ORF는 아스테레즈 (또는 라이페에즈) 도메인을 가진 알려진 균들과 달리 계통상 완전히 새로운 것을 확인하였다. 따라서 L28 ORF가 coding 하는 단백질은 에스테라아제 결합 분해 능력을 가진 미지의 난배양 미생물에서 유래한 새로운 에스테라아제를 만드는 유전자로 판단하였다 (도 4).

<실시예 6: 신규 에스테라아제 단백질의 발현 및 정제>

실시예 3에서 발명한 신규 L28 유전자의 대장균 발현 균주를 이용하여 단백질 발현을 실시하였다. L28의 ORF를 5'-CCG GAATTC A TGGGAGCACG AAAATCTATGA-3' (EcoRI site밑줄침) 와 5'-CCG CTCGAG A CCGACGGCTT TCAGCATT-3' (XhoI site 밑줄침) 프라이머를 사용하여 PCR 증폭하였다. 증폭된 PCR 산물을 제한효소 EcoRI과 XhoI으로 double-digestion하여 pET21a발현벡터(Novagen, U.S.A)을 EcoRI와 XhoI으로 double-digestion한 벡터에 클로닝하여 대장균 BL21(DE3)에 형질 전환시켜 도입하였다. 형질 전환된 대장균을 OD₆₀₀~0.6정도까지 진탕 배양 후, IPTG 0.5mM로 25℃에서 18시간 배양시켜 L28 단백질을 과다발현 시켰다. 그 결과, 36 kDa의 L28 단백질이 과다 발현된 것을 확인하였다 (도 5).

이 단백질을 순수 분리정제 하기 위하여 L28 ORF로 형질 전환된 BL21(DE3) 대장균의 50mL 배양액을 원심분리를 통해 세포만을 수득해 10ml lysis buffer (50mM NaH₂PO₄ (pH 8.0), 300mM NaCl, 10mM Imidazole)에 재현탁한 후 초음파 파쇄기를 이용하여 세포를 파쇄 하였다. 파쇄한 세포를 15,000rpm에서 15분간 원심 분리한 뒤 상층액을 수득하여, 에스테라제 분리에 필요한 조효소액으로 이용하였다. 상기의 방법으로 확보한 조효소액에서 L28 단백질은 아미노산 C-terminal에 임의로 붙여준 6XHis-Tag을 사용하여 Ni-NTA resin (Qiagen U.S.A) 과 섞어 주어 column에 packing 하였다. 조효소의 resin에 결합 후, 10 volume의 washing buffer (50mM NaH₂PO₄ (pH 8.0), 300mM NaCl, 20mM Imidazole)로 씻어 준 다음 L28 단백질을 5 volume의 elutioin buffer (50mM NaH₂PO₄ (pH 8.0), 300mM NaCl, 250mM Imidazole)로 통상의 알려진 방법으로 순수 분리하였다 (Qiagen U.S.A). 단백질의 농축과 imidazole dialysis는 분자량 10kDa 이상을 농축할 수 있는 YM10 membrane(Amicon Ultra, Millipore Co.)을 이용한 한회여과를 통하여 농축하였다. 최종 정제된 단백질은 SDS-PAGE 전기영동으로 단백질의 상태를 점검하였다. 그 결과, 발현된 단백질의 크기가 C-terminal 6XHis-Tag을 포함한 예상한 35kDa 인 것을 확인할 수 있었다(도 5).

<실시예 7: 신규 에스테라아제 단백질의 활성분석>

정제된 L28 단백질에 대한 생화학적 특성을 확인하고자 순수도가 높게 나타난 분획을 이용하였다. 최적 활성을 나타내는 온도를 측정하기 위해 Tris·Cl 완충액(50mM, pH 8.0, 400μl)하에서 0.08μg 정제된 L28 단백질을 사용하여 최종농도 0.1mM pNP-butyrate (pNPC₄, solvent acetonitrile)과 혼합하여 35°C에서 5분이 지난 뒤 분해된 pNP 산물을 405nm의 흡광도 분석으로 측정하였다. 반응의 종결을 위해 acetone (2M)을 100μl 첨가하였다. 그 결과 L28은 매우 광범위한 저온에서 안정된 활성이 유지되는 것을 알 수 있었다. 최고의 활성은 35℃에서 나타내었으며, 30℃에서는 약 95%의 활성을 보였고 0℃의 저온에서도 약 40%의 활성이 잔존하였다. 이는 얼음에서도 L28의 활성을 산업적으로 이용할 수 있다는 점을 보여준다 (도 6).

L28 단백질의 최적 활성 pH를 확인하기 위해 각각 50mM Na-acetate (pH 4.0~6.0), 50mM Na-phosphate (pH 6.0~7.5), 50mM Tris·Cl 완충액 (pH 7.5~10.5), 50mM Tris·Phosphate (pH 11)을 이용하여 pH 4.0와 pH 11 사이에서 각 0.4μg L28 단백질과 0.1mM pNP-decanoate (pNPC₁₀, solvent acetonitrile)를 10분간 반응시켜 기질의 분해 활성을 상기한 방법으로 측정하였다. 그 결과, L28 단백질은 pH 8.5~9.5의 알칼리 환경에서 최적의 분해 활성을 나타내었다 (도 7).

L28 단백질의 저온에서의 안정성을 테스트하기 위하여 50mM Tris·Cl (pH 8.0), 400μl 용액에 각 0.16 μg L28 단백질을 첨가 후, 0~55℃ 범위에서 시료를 10분 단위로 1시간씩 처리하였다. 이 후 0.1mM pNPC₄ 기질을 넣고 준 다음 5분간 잔여 활성을 검출하였다. L28 단백질은 최적온도 35°C를 넘으면 쉽게 활성을 잃어 버렸다. 기질 분해 활성은 40℃ 에서부터 감소하기 시작해 50℃ 에서는 10분 만에 활성이 완전히 소실되었다. 반면 0~35℃ 까지는 L28의 활성이 거의 완전하게 보존되었다 (도 8).

L28 단백질의 pH 안정성을 측정하기 위해 상기 각각 다른 pH 하에서 L28 단백질을 4℃에서 15시간 동안 방치한 뒤, 0.1mM pNPC₁₀ 기질을 넣어 준 다음 기질 분해 능력을 확인하였다. 그 결과 L28 단백질은 산성 (pH 6.0 이하)에서는 매우 활성이 감소하는 반면(~10%), 알칼리 환경인 pH 9.0~10.0에서는 최소 30% 이상의 활성이 유지되었다. pH 9에서는 4℃에서 장기간 보존하여도 기능의 소실이 전혀 없었으며, 심지어 pH 11 에서도 효소 활성이 20%나 남아 있으므로 알칼리환경에서 전반적으로 매우 안정된 특성을 보여주었다 (도 9).

L28 단백질의 기질에 따른 활성을 확인해보면 pNPC4와 pNPC6에 대하여 매우 높은 분해능력을 가진 전형적인 에스테라아제 특징을 가지고 있으나, 지방산의 길이가 길어지는 경우 에스테라아제의 기능이 감소하는 것을 보여주었다. 따라서 L28은 저분자 수용성 물질의 에스테르 결합을 우선적으로 분해하는 카르복실 에스테라아제 (Carboxylesterase, EC 3.1.1.1)라고 할 수 있다 (표 1: L28의 에스테라아제의 기질특이성 분석 결과).

Substrate	Specific activity (U/mg)
p-Nitrophenyl acetate (C2)	13.73±4.37
p-Nitrophenyl butyrate (C4)	127.03±17.42
p-Nitrophenyl hexanoate (C6)	56.42±3.64
p-Nitrophenyl octanoate (C8)	12.72±1.70
p-Nitrophenyl decanoate (C10)	5.03±0.73
p-Nitrophenyl laurate (C12)	ND^a
p-Nitrophenyl myristate (C14)	ND
p-Nitrophenyl palmitate (C16)	ND
p-Nitrophenyl stearate (C18)	ND

ND^a , not detectable

농업생명공학연구원

KACC95111

20110927

서열목록 전자파일 첨부

Claims

서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 에스테라아제 효소.
제1항의 에스테라아제 효소를 코딩하는 유전자.
제2항에 있어서,
상기 유전자는 서열번호 2의 핵산서열로 이루어진 유전자.
제2항 또는 제3항에 따른 유전자를 보유하는 벡터.
제4항에 있어서,
상기 벡터는 도 2에 기재된 개열 지도를 갖는 pUC118 벡터.
제4항의 벡터로 형질전환된 형질전환체.
제6항에 있어서,
상기 형질전환체는 대장균인 것을 특징으로 하는 형질전환체.
제7항에 있어서,
상기 형질전환체는 KACC95111P 균주인 것을 특징으로 하는 형질전환체.
(a) 제6항의 형질전환체를 배양하는 단계;
(b) 상기 배양된 형질전환체로부터 에스테라아제를 생산하는 단계; 및
(c) 상기 생산된 에스테라아제를 회수하는 단계를 포함하는
에스테라아제 효소의 제조방법.