KR101281920B1 - 항균 효능을 나타내는 밀배아 추출물의 제조방법 - Google Patents

항균 효능을 나타내는 밀배아 추출물의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명의 항균 효능을 갖는 밀배아 추출물을 함유하는 밀배아 추출물 조성물은 식품, 화장품 또는 동물 사료 등에 첨가되는 방부제 또는 항생제를 대체할 수 있고, 밀배아는 밀가루 생산 공정시 부산물로 대량으로 값싸고 쉽게 구할 수 있어 이를 활용한 본 발명의 밀배아 추출물은 식품, 음료, 화장품 등에 폭 넓게 사용가능할 뿐만 아니라 현재 화두로 되고 있는 동물사료 항생제를 대체할 수 있는 항균물질로서 사용가능한 장점이 있다. 따라서, 본 발명의 밀배아 추출물은 식품 등을 매개로 하는 병원균성 질병을 예방 및 치료할 수 있고 항생제에 대한 내성 증가를 방지하기 위한 새로운 천연 항균물질로서 사용될 수 있으며, 동물사료 뿐만 아니라 음식, 음료, 화장품 및 식품 포장 등의 다양한 분야에 적용이 가능한 장점이 있다.

Description

항균 효능을 나타내는 밀배아 추출물의 제조방법{A method for preparing wheat germ extract showing the effect of antimicrobial activities}
본 발명은 항균 효능을 갖는 밀배아 추출물을 함유하는 밀배아 추출물 조성물 및 밀배아로부터 항균 성분을 추출하는 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 식품, 화장품 또는 동물 사료 등에 첨가되는 방부제 또는 항생제를 대체할 수 있는 천연 재료 성분인 밀배아 추출물을 유효성분으로 함유하는 밀배아 추출물 조성물 및 밀배아로부터 항균 성분을 추출하는 방법에 관한 것이다.
구체적으로, 본 발명은 식품 등을 매개로 하는 병원균성 질병을 예방 및 치료할 수 있고 항생제에 대한 내성 증가를 방지하기 위한 새로운 천연 항균물질로서, 음식, 음료, 화장품 및 식품 포장 등의 다양한 분야에 적용이 가능한 항균 효능을 갖는 밀배아 추출물을 함유하는 밀배아 추출물 조성물 및 밀배아로부터 항균 성분을 추출하는 방법에 관한 것이다.
식품 등의 대량 생산 및 유통에 따라 식품을 안전하게 장기간 보관할 수 있는 방부제가 식품이나 화장품에 첨가물로서 흔히 사용되고 있다. 방부제를 사용하지 않을 경우 식품 등을 매개로 하는 병원균이 식품이나 화장품에서 증식하여 이를 섭취하거나 피부 등에 도포하는 사람에게 치명적인 위해를 가할 수 있다. 따라서, 인간에 대한 안전성이 검증된 방부제가 식품이나 화장품에 널리 첨가되어 사용되고 있다. 그러나 이러한 안전성이 검증된 방부제 역시 최근의 연구결과에 의하면 인간 면역 기능을 교란시켜 알레르기 질환, 아토피성 피부염 등을 일으키거나 심지어는 암을 유발하는 인자로서 보고되고 있다.
또한, 축산업 및 양식업의 발달로 동물의 대량 사육이 가능해져 값싸게 대량으로 양질의 육류, 어류 및 이들의 가공품 등을 사람들에게 공급하게 되었으나, 동물의 대량 사육은 동물들에게는 열악한 환경을 제공하고 동물들의 저항력을 떨어뜨려 바이러스성 질병 또는 병원균성 질병이 한번 발생하게 되면 그 피해는 해당 축산농가나 양식장뿐만 아니라 해당 지역에 확산되는 문제가 발생한다. 이러한 문제로 인한 생산량 감소를 방지하기 위해 가축이나 어류에게 항생제를 예방차원에서 주사하거나 또는 동물사료에 섞어서 급이하는 방식이 널리 시행되고 있다. 그러나, 이러한 동물 사육 과정에서의 항생제 남용은 항생제 내성을 가져오게 되는 문제를 일으킬 뿐만 아니라 육류, 어류 및 축산가공품의 최종 소비자인 인간에게도 영향을 주게 되어 특정 항생제가 인간에게 내성을 발생시키는 문제가 발생하기에 이르렀다. 즉, 사람이 먹는 동물들의 사료에 항생제를 지속적으로 사용할 경우 병원균의 내성이 커져 국민 보건에 치명적 영향을 줄 수 있는 부작용이 생긴 것이다.
이러한 문제점을 감안하여 최근에는 정부주도로 안전축산물 생산을 위해 배합사료 내의 항생·항균제 혼합을 점진적으로 줄이는 한편, 사람과 동물에 모두 쓸 수 있는 인수공통 항생제를 가축과 양식 어류의 사료에 첨가하는 행위를 2012년 부터 금지하는 조치가 이루어졌다. 대표적인 인수공통 항생제는 페니실린, 테트라사이클린 계열 항생제, 다시트라신아연, 황산콜리스틴, 황산네오마이신, 염산네오마이신 등이며, 이러한 인수공통 항생제들은 향후 동물사료 제조 시 전면적으로 사용이 금지될 예정이다.
그런데, 이러한 국민 건강 보호라는 좋은 정책적 측면에도 불구하고 항생제 사용금지는 가축의 병원체 감염으로 인한 질병 확산 그리고 농가에는 가축 치료비 부담의 증가로 나타날 가능성이 높이며 향후 가축 생산량의 감소라는 문제점도 안고 있다. 따라서, 인간에 영향을 주는 인수 공통 항생제 사용 금지에 따른 가축 생산량 감소를 방지하기 위해 기존의 항생제를 대체하여 동물의 병원균 감염을 방지할 수 있는 새로운 축산 산업의 방향이 제시될 필요성이 본 발명이 속하는 기술분야에서는 요구되고 있다고 할 수 있다.
이에 대한 해결책의 하나로 파지를 이용한 동물사료 항균제 개발이 시도되고 있으나, 아직은 초기 단계이고 이 역시 인체에 대한 유해성 논란이 있다. 따라서, 식품을 매개로 하는 병원균성 질병을 예방 및 치료할 수 있고 항생제에 대한 내성 증가를 방지하기 위한 새로운 천연 항균물질의 개발이 최근에는 주목을 받고 있다. 즉, 본 발명이 속하는 기술분야에서는 식품을 매개로 하는 병원균성 질병을 예방 및 치료할 수 있고 항생제에 대한 내성 증가를 방지하기 위한 새로운 천연 항균물질로서, 음식, 음료, 화장품 및 식품 포장 등의 다양한 분야에 적용이 가능한 항균 효능을 갖는 새로운 천연 항균물질의 개발이 절실히 요구되고 있다.
한편, 밀배아는 통밀을 밀가루로 처리하는 공정에서 제거되어 나오는 말알(wheat kernel)의 영양분이 풍부한 배아로서, 전체 밀알의 약 2~3%를 차지한다. 밀의 씨눈인 밀배아는 현재까지 항산화 비타민으로 알려진 비타민 E(토코페롤)가 풍부한 것으로 알려져 있고, 최근 연구에 따르면 밀배아에서 추출한 천연물질이 인체의 손상된 면역기능을 복원하는 효과가 있는 것으로 알려져 있다.
특히, 밀배아를 30℃에서 18시간 동안 효모와 함께 발효시킨 수용성 추출물인 아베마르(Avemar)는 항암제품의 사용으로 생길 수 있는 발열이나 기타 합병증을 반감시키는 효과가 있는 것으로 보고되었고, 소아암환자의 경우 항암제 부작용이 50% 이상 줄어든 것이 보고된 바가 있다.
한편, 밀배아를 이용한 다른 연구 내용과 특허출원들을 살펴보면, 대한민국 등록특허 제10-0376538호에서는 밀배아 단백질을 일부 첨가물로서 함유하는 모발 내부 섬유질을 강화하는 모발샴푸 조성물을 개시하고 있으나 이는 샴푸 조성물의 일부로서 전술한 바와 같은 밀배아의 알려진 성분인 토코페놀의 효능을 이용하는 수준에 머문 것이라고 할 수 있다.
또한, 대한민국 등록특허 제10-0970544호는 미백효과 및 노화방지효과가 우수한 피부외용제로서, 주성분인 시스터스과 식물 추출물과 이에 첨가되는 여러 다양한 식물들의 추출물들을 개시하고 있는데 부수적인 첨가 추출물의 하나로서 밀배아 추출물을 언급하고 있다. 그러나, 대한민국 등록특허 제10-0970544호의 피부외용제의 효능은 주로 시스터스과 식물 추출물에 관한 것이고 밀배아 추출물은 단순히 부수적인 첨가 추출물로서 언급되고 있고 밀배아 추출물의 정확한 효능에 대해서는 전혀 개시하고 있는 바가 없다.
또한, 대한민국 공개특허 제10-2010-0038621호는 밀배아유와 나노리포좀 형태의 세라마이드를 함유한 아토피성 피부염 개선용 화장료 조성물을 개시하고 있는데, 밀배아유 사용에 의한 수분손실량의 감소에 의한 피부 보습력 강화로 아토피성 피부염을 개선하는 효능만을 개시하고 있을 뿐 구체적인 면역 개선 효능에 대해서는 개시나 암시하고 있지 않을 뿐만 아니라 항균 작용에 대해서는 전혀 시사하고 있는 바가 없다.
이와 같이 밀배아유나 밀배아 추출물에 함유된 토코페놀을 이용한 연구 및 항암 치료시 부작용 억제에 대해 현재까지 많은 연구들이 진행되고 있으나, 아직 그 효능이나 약리기전이 완전히 입증되어 있지 못한 실정이고 밀배아 추출물의 다른 효능에 대한 연구는 아직 미진한 실정이다. 다만, 전술한 연구 및 특허출원들에서 알 수 있듯이 밀배아에 함유된 토코페놀 효능을 이용한 상품 개발이나 밀배아유의 보습기능 그리고 밀배아 추출물의 한 종류인 아베마르가 항암 치료시 부작용을 감소시킨다는 것이 알려져 있는 정도이다.
삭제
이에 본 발명자들은 천연소재인 밀배아 추출물에 관심을 갖고 연구하던 중 본 발명자가 개발한 추출방법으로 추출된 밀배아 추출물이 식품을 매개로 하는 주요 병원체들에 대해 뛰어난 항균 효능이 있고 화장품에 대해서도 뛰어난 방부 효능이 있는 것을 확인하여 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
대한민국 등록특허 제10-0376538호 (2003.03.17) 대한민국 등록특허 제10-0970544호 (2010.07.16) 대한민국 공개특허 제10-2010-0038621호 (2010.04.15)
본 발명은 항균 효능을 갖는 밀배아 추출물을 함유하는 밀배아 추출물 조성물 및 밀배아로부터 항균 성분을 추출하는 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 식품, 화장품 또는 동물 사료 등에 첨가되는 방부제 또는 항생제를 대체할 수 있는 천연 재료 성분인 밀배아 추출물을 유효성분으로 함유하는 밀배아 추출물 조성물 및 밀배아로부터 항균 성분을 추출하는 방법에 관한 것이다.
구체적으로, 본 발명은 식품 등을 매개로 하는 병원균성 질병을 예방 및 치료할 수 있고 항생제에 대한 내성 증가를 방지하기 위한 새로운 천연 항균물질로서, 음식, 음료, 화장품 및 식품 포장 등의 다양한 분야에 적용이 가능한 항균 효능을 갖는 밀배아 추출물을 함유하는 밀배아 추출물 조성물 및 밀배아로부터 항균 성분을 추출하는 방법에 관한 것이다.
상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 밀배아 추출물을 유효성분으로 포함하는 항균 효능을 나타내는 조성물을 제공한다.
본 발명의 일실시예의 항균 효능을 나타내는 조성물에 있어서, 상기 밀배아 추출물은 클로로포름, 메틸렌클로라이드, 에틸아세테이트 및 디에틸렌 글라이콜 모노에틸에테르로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 하나의 용매로 추출한 것을 특징으로 한다. 바람직하게는, 상기 밀배아 추출물은 상기 용매로 추출한 후 추가로 여과처리하여 수득된 것이다.
본 발명의 또 다른 일실시예의 항균 효능을 나타내는 조성물에 있어서, 상기 밀배아 추출물은 초임계유체추출법에 의해 추출한 것을 특징으로 한다. 바람직하게는, 상기 초임계유체추출법에서 사용되는 초임계유체는 이산화탄소이고 보조용매는 에틸알콜일 수 있다. 더욱 바람직하게는 상기 밀배아 추출물은 상기 보조용매와 혼합한 후 추가로 여과처리하여 수득된 것이다.
본 발명의 항균 효능을 나타내는 조성물에 있어서, 상기 밀배아 추출물은 건조과정을 거쳐 건조분말형태로 제조되는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 항균 효능을 나타내는 조성물은, 전체 조성물 중량에 대해 상기 밀배아 추출물 0.01 중량% 내지 100 중량%를 포함할 수 있다.
본 발명의 항균 효능을 나타내는 조성물은, 식품, 음료 또는 화장품에 첨가되는 방부제를 대체하는 항균물질 또는 동물사료에 첨가되는 항생제를 대체하는 항균물질로 사용될 수 있다.
본 발명의 일실시예의 밀배아로부터 항균 성분을 추출하는 방법은,
(a) 준비된 밀배아를 분쇄하고 분쇄된 밀배아를 클로로포름, 메틸렌클로라이드, 에틸아세테이트 및 디에틸렌 글라이콜 모노에틸에테르로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 하나의 용매로 처리하여 밀배아 추출물을 얻는 단계와,
(b) 상기 (a) 단계에서 얻은 밀배아 추출물을 상기 용매에 재용해시킨 후 여과처리하는 단계를 포함한다.
본 발명의 일실시예의 밀배아로부터 항균 성분을 추출하는 방법은 상기 (a) 단계에 있어서 밀배아 추출물을 진공 증발기에서 대략 40℃의 최대 온도로 증발농축시키는 단계를 더 포함한다.
본 발명의 일실시예의 밀배아로부터 항균 성분을 추출하는 방법에 있어서, 상기 (b) 단계는 상기 (a) 단계에서 얻은 밀배아 추출물 또는 밀배아 추출물의 증발농축물을 상기 용매에 재용해시킨 후 PTFE(polytetrafluoroethylene) 필터를 통해 여과처리하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 일실시예의 밀배아로부터 항균 성분을 추출하는 방법은,
(a) 준비된 밀배아를 분쇄 및 건조하고 분쇄 및 건조된 밀배아에 대해, 초임계유체로서 이산화탄소를 이용하고 보조용매로서 에틸알콜을 이용한 초임계유체추출법을 수행하여 밀배아 추출물을 얻는 단계와,
(b) 상기 (a) 단계에서 얻은 밀배아 추출물을 상기 보조용매와 혼합한 후 여과처리하는 단계를 포함한다.
본 발명의 또 다른 일실시예의 밀배아로부터 항균 성분을 추출하는 방법에 있어서, 상기 (b) 단계는 상기 (a) 단계에서 얻은 밀배아 추출물을 상기 보조용매와 혼합한 후 PTFE(polytetrafluoroethylene) 필터를 통해 여과처리하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 항균 효능을 갖는 밀배아 추출물을 함유하는 밀배아 추출물 조성물은 식품, 화장품 또는 동물 사료 등에 첨가되는 방부제 또는 항생제를 대체할 수 있다. 특히, 밀배아는 밀가루 생산 공정시 부산물로 대량으로 값싸고 쉽게 구할 수 있어 이를 활용한 본 발명의 밀배아 추출물은 식품, 음료, 화장품 등에 폭 넓게 사용가능할 뿐만 아니라 현재 화두로 되고 있는 동물사료 항생제를 대체할 수 있는 항균물질로서 사용가능한 장점이 있다.
따라서, 본 발명의 밀배아 추출물은 식품 등을 매개로 하는 병원균성 질병을 예방 및 치료할 수 있고 항생제에 대한 내성 증가를 방지하기 위한 새로운 천연 항균물질로서 사용될 수 있으며, 동물사료 뿐만 아니라 음식, 음료, 화장품 및 식품 포장 등의 다양한 분야에 적용이 가능한 장점이 있다.
도 1은 본 발명의 밀배아 추출물이 식품을 매개로 하는 주요 병원체인 황색포도상구균에 대해 강력한 생장억제효능을 나타내는 그래프로서 식품의 일례인 두유(Soy milk)에서의 황색포도상구균에 대한 항균효능을 나타내는 그래프이다.
도 2는 본 발명의 밀배아 추출물이 식품을 매개로 하는 주요 병원체인 황색포도상구균에 대해 강력한 생장억제효능을 나타내는 그래프로서 식품의 일례인 우유(Milk)에서의 황색포도상구균에 대한 항균효능을 나타내는 그래프이다.
이하, 본 발명을 실시예에 기초하여 보다 상세히 기술한다. 본 발명의 하기 실시예는 본 발명을 구체화하기 위한 것일 뿐 본 발명의 권리범위를 제한하거나 한정하는 것이 아님은 물론이다. 본 발명의 상세한 설명 및 실시예로부터 본 발명이 속하는 기술분야의 전문가가 용이하게 유추할 수 있는 것은 본 발명의 권리범위에 속하는 것으로 해석된다. 본 발명에 인용된 참고문헌은 본 발명에 참고로서 통합된다.
실시예 1: 본 발명의 실시예들에서 사용되는 재료들
밀배아는 동아원 주식회사(대한민국 서울시 소재)에서 시판하고 있는 것을 구입하여 사용하였고, 본 발명의 밀배아 추출물의 항균 및 방부력 시험 대상이 되는 병원균(본 발명에서는 인간 또는 동물에 질병을 일으키는 바이러스, 세균, 균류 등 미생물을 포괄하는 용어로 사용됨)으로는 살모넬라균(Salmonella typhimurium), 대장균(Escherichia coli), 리스테리아 모노사이토제니스(Listeria monocytogenes), 황색포도상구균(Staphylococcus aureus), 바실러스세레우스균(Bacillus cereus), 녹농균(Pseudonomas aeruginosa), 칸디다 알비칸스(Candida albicans) 및 흑국균(Aspergillus niger)은 당업계에 알려진 미생물 분양기관, 예를 들어 한국생명공학연구원의 유전자은행(Korean Collection for Type Cultures, KCTC)(대한민국 대전광역시 소재)으로부터 구입하였다.
또한, 항균 활성 분석을 위한 영양 배지(0.03 % 쇠고기 추출물 및 0.05 % 펩톤 함유)는 BBL Microbiology System (Cockeysville, MD, USA.)으로부터 입수하였고, 쇠고기 추출물과 펩톤은 Difco Laboratories (Detroit, MI, USA)에서 구입하였다. 그리고 그 외의 재료들은 별도로 명시하지 않는 한 미국의 시그마(Sigma Co., U.S.A.)에서 구입했다.
실시예 2: 본 실시예에서 사용되는 항균 효능 측정방법
하기 실시예들에서 항균 활성은 변형된 디스크 확산법에 의해 검출되었는데(Bauer, A. W., W. M. Kirby, J. C. Sherris, and M. Turck. 1966. Antibiotic susceptibility testing by a standardized single disk method. Am. J. Clin. Pathol. 45: 493-496), 항균물질의 확산을 용이하게 하고 당업계에 널리 알려진 웰 확산법(agar well diffusion assay)을 이용하여 본 발명의 밀배아 추출물의 항균 활성을 분석하였다.
우선, 실시예 1에서 준비된 살모넬라균(Salmonella typhimurium), 대장균(Escherichia coli), 리스테리아 모노사이토제니스(Listeria monocytogenes), 황색포도상구균(Staphylococcus aureus) 및 바실러스세레우스균(Bacillus cereus)이 각각 배지에서 계대배양되었고, 37℃(단, 바실러스세레우스균은 30℃)에서 18시간 동안 인큐베이션되었다. 그런 다음, 맥팔랜드 프로토콜(McFarland protocol)에 따라 생리적 식염수에 상기 각각의 병원균 세포를 현탁하여 약 105 CFU/ml 정도의 현탁액을 만들었다.
상기 각각의 병원균 현탁액 0.5ml를 40℃에서 영양 한천 150ml와 혼합하고, 라미나 플로우 캐비닛(laminar flow cabinet)에서 한천 플레이트(23×23cm)로 부었다. 그리고 나서, 7mm 직경의 중공형 튜브를 이용하여 병원균이 뿌려진 한천 배지로부터 한천 웰들을 절단하고 약간의 음압을 가하여 한천의 플러그(plug)를 제거하여 웰 확산법을 수행할 한천 웰 플레이트를 준비하였다.
한편, 테스트 물질에 대한 상기 각각의 병원균의 민감도는 상기 한천 웰 플레이트를 37℃에서 18시간 동안 인큐베이션한 후 생장 저해 구역(inhibition zone) 형성에 의해 결정되었다. 실험들은 3배수로 시행되었고, 결과는 3개의 측정값들에 대한 평균값으로 표시되었다.
또한, 최소 저해 농도(minimum inhibitory concentration)는 Christoph et al.의 방법(Christoph, M.S., P. Klaus, W. Annette, S. Erwin, and J. C. Simon. 1999. Antibacterial activity of hyperforin from St. John's wort, against multiresistant Staphylococcus aureus and gram-positive bacteria. The Lancet. 353: 2129-2131)을 이용한 마크로다일루션(macrodilution) 테스트에 의해 평가되었다. 테스트 물질에 대한 연속적인 2배 희석액이 디메틸설폭사이드(dimethylsulfoxide)에서 준비되었고, 테스트 물질의 희석액 0.5ml이 9.0ml의 영양 배지에 첨가되었다. 이와 같이 하여 얻은 각각의 테스트 물질의 희석 용액에 하룻밤 동안 배양한 살모넬라균(Salmonella typhimurium), 대장균(Escherichia coli), 리스테리아 모노사이토제니스(Listeria monocytogenes), 황색포도상구균(Staphylococcus aureus), 또는 바실러스세레우스균(Bacillus cereus)의 배양액 0.5ml가 주입되었다. 37℃(단, 바실러스세레우스균은 30℃)에서 48시간 동안 인큐베이션한 후에, 병원균들의 가시적 생장을 보이지 않게 하는 테스트 물질의 최소 농도인 최소 저해 농도가 결정되었다.
전술한 바와 같이 준비된 각각의 병원균이 함유된 한천 웰 플레이트에, 테스트 물질을 용매에 용해시킨 용액 150㎕ 씩을 첨가하여 웰 확산법에 의한 항균 활성을 측정하였다. 이때, 클로람페니콜 100ppm, 500ppm 또는 1000ppm을 포함하는 한천 웰 플레이트는 양성 대조군으로 사용하였고(표 1 내지 표 4에서 "CMP"로 표시함), 클로로포름, 메틸렌클로라이드, 에틸아세테이트, 또는 디에틸렌 글라이콜 모노에틸에테르(카르비톨)을 포함하는 한천 웰 플레이트는 음성 대조군으로 사용하였다. 하기 실시예들의 표 1 내지 표 4에서 밀배아 추출물의 항균 활성은 양성 대조군 및 음성 대조군과 비교하여 생장 저해 구역 테스트(inhibition zone test)에 의해 측정되었고, 그 결과는 mm 단위로서 표시되었다. 표 1 내지 표 4에 표시된 결과들은 총 3회에 걸친 실험으로부터 얻어진 측정값들에 대한 평균값±표준편차를 나타내고, 표 1 내지 표 4의 모든 데이터들은 통계분석 프로그램[Statistical Package for Social Science (SPSS; SPSS Inc., Chicago, IL, USA)]을 이용하여 수행된 통계학적 분석 결과이다.
실시예 3: 밀배아 추출물 준비 및 디스크 확산법에 의한 항균 효능 시험
실시예 3-1: 클로로포름을 이용한 밀배아 추출물 준비 및 항균 효능 시험
준비된 밀배아를 분쇄하고 분쇄된 밀배아 100 g에 2차 증류수 2.5 L를 첨가하여 1시간 동안 교반한 후, 상기 용액에 다시 1 L의 클로로포름(CHCl3) 용액을 첨가하여 30분 동안 재교반하고 원심분리를 통해 용매층을 회수하였다. 이때 원심분리 후 클로로포름층을 제거하고 남은 여액층을 다시 동일한 방법으로 3회에 걸쳐 클로로포름 추출을 시행하였다. 클로로포름 층들을 모은 다음, 증류수로 세척하고 진공증발기를 사용하여 40℃의 최대 온도에서 농축시켰다. 농축된 물질(6.2 g)은 최종적으로 클로로포름에 재용해시킨 후 0.45-㎛ PTFE 필터를 통해 여과처리하였다.
상기 과정에 따라 여과처리되어 얻어진 밀배아 추출물을 시료로 사용하여 실시예 2에서 설명한 바와 같이 살모넬라균(Salmonella typhimurium), 대장균(Escherichia coli), 리스테리아 모노사이토제니스(Listeria monocytogenes), 황색포도상구균(Staphylococcus aureus), 또는 바실러스세레우스균(Bacillus cereus)이 배양된 한천 웰 플레이트에 각각 시료 150㎕ 씩 넣어 웰 확산법을 이용한 항균활성을 측정하였다(표 1 참조).
하기 표 1에 나타난 결과들을 살펴보면, 본 실시예 3-1의 밀배아 추출물(1.5g의 생중량(FW; fresh weight)/150㎕)은 예를 들어, 황색포도상구균(Staphylococcus aureus)(대략 27.22mm의 생장 저해 구역) 및 바실러스세레우스균(Bacillus cereus)(대략 12.99mm의 생장 저해 구역)에 대해 강력한 생장 억제 효능을 갖는 것을 확인할 수 있다. 이는 본 발명의 밀배아 추출물이 식중독 방지를 위한 유용한 항균물질로서 사용될 수 있음을 강력히 시사한다. 즉, 본 발명의 밀배아 추출물은 식품 또는 음료의 안전한 생산을 위한 방부제로서 적용가능하고 항균·항생제로서 사용가능한 물질임을 확인할 수 있다.
실시예 3-2: 메틸렌클로라이드를 이용한 밀배아 추출물 준비 및 항균 효능 시험
준비된 밀배아를 분쇄하고 분쇄된 밀배아 100 g에 2차 증류수 2.5 L를 첨가하여 1시간 동안 교반한 후, 상기 용액에 다시 1 L의 메틸렌클로라이드(CH2Cl2) 용액을 첨가하여 30분 동안 재교반하고 원심분리를 통해 용매층을 회수하였다. 이때 원심분리 후 메틸렌클로라이드 층을 제거하고 남은 여액층을 다시 동일한 방법으로 3회에 걸쳐 메틸렌클로라이드 추출을 시행하였다. 메틸렌클로라이드 층들을 모은 다음, 증류수로 세척하고 진공증발기를 사용하여 40℃의 최대 온도에서 농축시켰다. 농축된 물질(5.9 g)은 최종적으로 메틸렌클로라이드에 재용해시킨 후 0.45-㎛ PTFE 필터를 통해 여과처리하였다.
상기 과정에 따라 여과처리되어 얻어진 밀배아 추출물을 시료로 사용하여 실시예 2에서 설명한 바와 같이 살모넬라균(Salmonella typhimurium), 대장균(Escherichia coli), 리스테리아 모노사이토제니스(Listeria monocytogenes), 황색포도상구균(Staphylococcus aureus), 또는 바실러스세레우스균(Bacillus cereus)이 배양된 한천 웰 플레이트에 각각 시료 150㎕ 씩 넣어 웰 확산법을 이용한 항균활성을 측정하였다(표 1 참조).
하기 표 1에 나타난 결과들을 살펴보면, 본 실시예 3-2의 밀배아 추출물(1.5g의 생중량(FW; fresh weight)/150㎕)은 예를 들어, 황색포도상구균(Staphylococcus aureus)(대략 29.59mm의 생장 저해 구역) 및 바실러스세레우스균(Bacillus cereus)(대략 14.49mm의 생장 저해 구역)에 대해 강력한 생장 억제 효능을 갖는 것을 확인할 수 있다. 이는 본 발명의 밀배아 추출물이 식중독 방지를 위한 유용한 항균물질로서 사용될 수 있음을 강력히 시사한다. 즉, 본 발명의 밀배아 추출물은 식품 또는 음료의 안전한 생산을 위한 방부제로서 적용가능하고 항균·항생제로서 사용가능한 물질임을 확인할 수 있다.
표 1
Figure 112011057069878-pat00001
실시예 3-3: 에틸아세테이트를 이용한 밀배아 추출물 준비 및 항균 효능 시험
준비된 밀배아를 분쇄하고 분쇄된 밀배아 100 g에 2차 증류수 2.5 L를 첨가하여 1시간 동안 교반한 후, 상기 용액에 다시 1 L의 에틸아세테이트 (CH3COOC2H5) 용액을 첨가하여 30분 동안 재교반하고 원심분리를 통해 용매층을 회수하였다. 이때 원심분리 후 에틸아세테이트 층을 제거하고 남은 여액층을 다시 동일한 방법으로 3회에 걸쳐 에틸아세테이트 추출을 시행하였다. 에틸아세테이트 층들을 모은 다음, 증류수로 세척하고 진공증발기를 사용하여 40℃의 최대 온도에서 농축시켰다. 농축된 물질(5.5 g)은 최종적으로 에틸아세테이트에 재용해시킨 후 0.45-㎛ PTFE 필터를 통해 여과처리하였다.
상기 과정에 따라 여과처리되어 얻어진 밀배아 추출물을 시료로 사용하여 실시예 2에서 설명한 바와 같이 살모넬라균(Salmonella typhimurium), 대장균(Escherichia coli), 리스테리아 모노사이토제니스(Listeria monocytogenes), 황색포도상구균(Staphylococcus aureus), 또는 바실러스세레우스균(Bacillus cereus)이 배양된 한천 웰 플레이트에 각각 시료 150㎕ 씩 넣어 웰 확산법을 이용한 항균활성을 측정하였다(표 2 참조).
하기 표 2에 나타난 결과들을 살펴보면, 본 실시예 3-3의 밀배아 추출물(1.5g의 생중량(FW; fresh weight)/150㎕)은 예를 들어, 황색포도상구균(Staphylococcus aureus)(대략 22.75mm의 생장 저해 구역) 및 바실러스세레우스균(Bacillus cereus)(대략 16.47mm의 생장 저해 구역)에 대해 강력한 생장 억제 효능을 갖는 것을 확인할 수 있다. 이는 본 발명의 밀배아 추출물이 식중독 방지를 위한 유용한 항균물질로서 사용될 수 있음을 강력히 시사한다. 즉, 본 발명의 밀배아 추출물은 식품 또는 음료의 안전한 생산을 위한 방부제로서 적용가능하고 항균·항생제로서 사용가능한 물질임을 확인할 수 있다.
표 2
Figure 112011057069878-pat00002
실시예 3-4: 카르비톨을 이용한 밀배아 추출물 준비 및 항균 효능 시험
준비된 밀배아를 분쇄하고 분쇄된 밀배아 100 g에 1 L의 디에틸렌 글라이콜 모노에틸에테르(카르비톨) 용액을 첨가하여 30분 동안 교반하고 원심분리를 통해 용매층을 회수하였다. 이때 원심분리 후 디에틸렌 글라이콜 모노에틸에테르(카르비톨)층을 제거하고 남은 침전물을 다시 동일한 방법으로 3회에 걸쳐 디에틸렌 글라이콜 모노에틸에테르(카르비톨) 추출을 시행하였다. 디에틸렌 글라이콜 모노에틸에테르(카르비톨) 층들을 모은 다음, 40℃의 최대 온도에서 농축시켰다. 농축된 물질(4.9 g)은 최종적으로 0.45-㎛ PTFE 필터를 통해 여과처리하였다.
상기 과정에 따라 여과처리되어 얻어진 밀배아 추출물을 시료로 사용하여 실시예 2에서 설명한 바와 같이 살모넬라균(Salmonella typhimurium), 대장균(Escherichia coli), 리스테리아 모노사이토제니스(Listeria monocytogenes), 황색포도상구균(Staphylococcus aureus), 또는 바실러스세레우스균(Bacillus cereus)이 배양된 한천 웰 플레이트에 각각 시료 150㎕ 씩 넣어 웰 확산법을 이용한 항균활성을 측정하였다(표 3 참조).
하기 표 3에 나타난 결과들을 살펴보면, 본 실시예 3-4의 밀배아 추출물(1.5g의 생중량(FW; fresh weight)/150㎕)은 예를 들어, 황색포도상구균(Staphylococcus aureus)(대략 25.59mm의 생장 저해 구역) 및 바실러스세레우스균(Bacillus cereus)(대략 13.49mm의 생장 저해 구역)에 대해 강력한 생장 억제 효능을 갖는 것을 확인할 수 있다. 이는 본 발명의 밀배아 추출물이 식중독 방지를 위한 유용한 항균물질로서 사용될 수 있음을 강력히 시사한다. 즉, 본 발명의 밀배아 추출물은 식품 또는 음료의 안전한 생산을 위한 방부제로서 적용가능하고 항균·항생제로서 사용가능한 물질임을 확인할 수 있다.
표 3
Figure 112011057069878-pat00003
실시예 3-5: 초임계유체추출법을 이용한 밀배아 추출물 준비 및 항균 효능 시험
본 실시예에서 사용한 초임계유체추출법은 임계온도 및 경계압력을 초과하는 상태의 유체인 초임계유체를 이용한 추출법이다. 초임계유체추출법은 액체추출법에 비해 효율이 높은데, 용해력은 밀도에 강하게 의존하기 때문에 조작온도나 압력을 변화시킴으로써 목적물질에 적합한 추출조건을 얻을 수 있다. 일반적으로 불활성, 무미, 무취, 무해인 이산화탄소를 사용하여 실온 부근에서 조작하기 때문에 식품이나 의약품에는 안전하게 사용할 수 있고, 상압에서는 유체가 기화하기 때문에 추출성분만이 용이하게 얻어진다.
본 실시예에서는 이러한 초임계유체추출법을 이용하여 추출한 밀배아 추출물을 디스크 확산 법에 의해 항균성을 평가하였다(표 4 참조).
우선, 밀배아 분말을 건조한 후 초임계유체 추출시 추출기(extractor)의 온도를 50 ~ 80℃로 조절하고, 분리기(separator)의 온도를 30 ~ 60℃로 유지시키며, 냉각기의 온도를 -1 ~ -5℃로 유지시켰다. 밀배아 분말 원료 100g을 초임계유체추출기에 주입하고 추출기(extractor)의 압력을 60 ~ 300 bar가 되게 조절하며, CO2의 유속을 10 ~ 80%로 조절한 후, 보조용매인 에틸알콜(주정)을 0.5 ~ 2.0 ml/min 유속으로 주입하여 압력이 200 ~ 300 bar에 이르렀을 때 20 ~ 300 분간 30분 간격으로 원료를 추출하였다. 추출이 끝난 시료는 다시 주정과 혼합하여 0.45-㎛ PTFE 필터를 통해 여과처리하였다.
상기 과정에 따라 여과처리되어 얻어진 밀배아 추출물을 시료로 사용하여 실시예 2에서 설명한 바와 같이 살모넬라균(Salmonella typhimurium), 대장균(Escherichia coli), 리스테리아 모노사이토제니스(Listeria monocytogenes), 황색포도상구균(Staphylococcus aureus), 또는 바실러스세레우스균(Bacillus cereus)이 배양된 한천 웰 플레이트에 각각 시료 150㎕ 씩 넣어 웰 확산법을 이용한 항균활성을 측정하였다(표 4 참조).
하기 표 4에 나타난 결과들을 살펴보면, 본 실시예 3-5의 밀배아 추출물(1.5g의 생중량(FW; fresh weight)/150㎕)은 예를 들어, 황색포도상구균(Staphylococcus aureus)(대략 26.77mm의 생장 저해 구역) 및 바실러스세레우스균(Bacillus cereus)(대략 13.01mm의 생장 저해 구역)에 대해 강력한 생장 억제 효능을 갖는 것을 확인할 수 있다. 이는 본 발명의 밀배아 추출물이 식중독 방지를 위한 유용한 항균물질로서 사용될 수 있음을 강력히 시사한다. 즉, 본 발명의 밀배아 추출물은 식품 또는 음료의 안전한 생산을 위한 방부제로서 적용가능하고 항균·항생제로서 사용가능한 물질임을 확인할 수 있다.
표 4
Figure 112011057069878-pat00004
실시예 4: 우유와 두유를 이용한 식품보존능 확인 시험
하기 표 5에 도시된 바와 같이, 황색포도상구균(Staphylococcus aureus)을 인위적으로 두유 또는 우유 ml당 105 CFU 농도로 접종한 후, 전술한 바와 같은 본 발명의 밀배아 추출물을 처리하여 우유 또는 두유 중의 황색포도상구균(Staphylococcus aureus)에 대한 생육저해능을 측정하였다.
표 5
Figure 112011057069878-pat00005
도 1 및 도 2에 나타난 결과들을 살펴보면, 본 발명의 밀배아 추출물은 농도 의존적으로 황색포도상구균(Staphylococcus aureus)에 대해 강력한 생장 억제 효능을 갖는 것을 확인할 수 있었다. 이로부터 본 발명의 밀배아 추출물이 식품 또는 음료의 안전한 생산을 위한 방부제로서 적용가능하고 항균·항생제로서 사용가능한 물질임을 다시 한번 확인할 수 있었다.
실시예 5: 화장품베이스를 이용한 방부력 테스트
황색포도상구균(Staphylococcus aureus), 대장균(Escherichia coli), 녹농균 (Pseudonomas aeruginosa), 칸디다 알비칸스(Candida albicans), 흑국균(Aspergillus niger)을 18시간 동안 37℃와 25℃에서 배양한 후 10-3으로 희석하고 화장품 베이스(하기 표 6) 샘플 9g에 각각의 배양균 1 ml을 첨가하여 교반한 후, 다시 각 시료에 본 발명의 밀배아 추출물을 0.5 ~ 2.0% 농도로 첨가하여 25℃에서 보관하고, 보관된 샘플의 방부력 시험을 위하여 0, 7, 14일째(day)에 각 시료의 균수를 측정하였다.
표 6: 화장품 베이스/포뮬라: MM 6420
Figure 112011057069878-pat00006
실험 결과, 하기 표 7에서 확인되는 것과 같이 본 발명의 밀배아 추출물의 처리군의 경우, 7일째부터 현저하게 균수가 줄어드는 것을 알 수 있었다.
표 7
Figure 112011057069878-pat00007
따라서, 본 발명의 밀배아 추출물은 음식을 매개로 한 병원체들에 대한 안전하고 저렴한 천연 항균물질로서 음식과 화장품 등에 사용될 수 있음이 확인되었다. 특히, 밀배아는 밀가루 생산 공정시 부산물로 대량으로 값싸고 쉽게 구할 수 있어 이를 활용한 밀배아 추출물은 식품, 음료, 화장품 등에 폭 넓게 사용가능할 뿐만 아니라 현재 화두로 되고 있는 동물사료 항생제를 대체할 수 있는 항균물질로서 사용가능한 장점이 있다.
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이상 본 발명을 상기 실시예를 들어 설명하였으나, 본 발명은 이에 제한되는 것이 아니다. 당업자라면 본 발명의 취지 및 범위를 벗어나지 않고 수정, 변경을 할 수 있으며 이러한 수정과 변경 또한 본 발명에 속하는 것임을 알 수 있을 것이다.

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  10. (a) 준비된 밀배아를 분쇄하고 분쇄된 밀배아를 에틸아세테이트 용매로 처리하여 밀배아 추출물을 얻는 단계와,
    (b) 상기 (a) 단계에서 얻은 밀배아 추출물을 에틸아세테이트 용매에 재용해시킨 후 여과처리하는 단계를 포함하는 항균 효능을 나타내는 밀배아 추출물의 제조방법.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 (a) 단계에 있어서 밀배아 추출물을 진공 증발기에서 40℃의 최대 온도로 증발농축시키는 단계를 더 포함하는 항균 효능을 나타내는 밀배아 추출물의 제조방법.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 (b) 단계는 상기 (a) 단계에서 얻은 밀배아 추출물 또는 밀배아 추출물의 증발농축물을 에틸아세테이트 용매에 재용해시킨 후 PTFE(polytetrafluoroethylene) 필터를 통해 여과처리하는 것을 특징으로 하는 항균 효능을 나타내는 밀배아 추출물의 제조방법.
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