KR101273569B1

KR101273569B1 - 전립선암 특이적 유전자의 메틸화 검출 방법 및 이의 용도

Info

Publication number: KR101273569B1
Application number: KR1020110105874A
Authority: KR
Inventors: 김용준; 김원재; 윤형윤
Original assignee: 충북대학교 산학협력단
Priority date: 2011-10-17
Filing date: 2011-10-17
Publication date: 2013-06-11
Also published as: KR20130041549A

Abstract

본 발명은 전립선암 진단에 필요한 정보를 제공하기 위해 APC(Adenomatous polyposis coli) 유전자의 특정 DNA 부위의 메틸화 상태를 측정하는 방법, 전립선암의 진단방법 및 전립선암 진단용 키트에 관한 것이다. 본 발명에 의하면 생물학적 시료로부터 전립선암을 저비용으로 간편하고 정확하게 진단할 수 있다.

Description

전립선암 특이적 유전자의 메틸화 검출 방법 및 이의 용도{Methods for Detecting Methylation of Prostate Cancer Specific Gene and Use Thereof}

본 발명은 전립선암 특이적 유전자의 메틸화 검출 방법 및 이의 용도에 관한 것이다.

전립선암은 남성에게 자주 발생하는 질환 중 하나로써 주요한 건강 문제로 인식되고 있다. 말기 진단 환자와 비교하였을 때, 환자의 증상을 완화시키기 위해서 암의 조기 발견 및 신속한 치료가 중요하다. 일반적으로 혈청 전립선특이항원(PSA, prostate-specific antigen) 수준의 측정 및/또는 직장 수지검사(DRE, digital rectal examination)등의 생체검사 결과가 근간이 되어 전립선암을 판단한다. 그러나 이러한 검사의 낮은 민감도 및 특이성으로 인한 음성판단이 생체검사의 주요 문제점으로 화두가 되고 있다.(1-2) 더욱이 전립선 생체 검사는 통증, 불편함, 불안감, 합병증 및 의료비의 인상을 유발한다.(3) 따라서, 높은 PSA 수준으로 인한 남성의 원치 않는 긴장 및 사망을 예방하기 위해서 특이적이며 민감도 높은 스크리닝 검사가 요구되는 실정이다.

암에서 흔히 나타나는 DNA 과메틸화(hypermethylation)는 암억제자(suppressor) 및 DNA 수복(repair) 유전자의 침묵(silencing)을 유도하는 현상으로 과메틸화 마커는 조직 및 체액에서 암세포를 검출하기 위한 유용한 도구이다.(4-6) 이러한 비정상적인 DNA 메틸화를 검출하기 위한 방법이 최근 몇 년 동안 꾸준히 개발되고 있으나, 임상적 이용에 가장 적합한 분석방법은 아직까지 확립되어 있지 않은 실정이다.(5-9) 이와 관련된 주요 선행연구로는 메틸화 정도를 평가하는 메틸화-특이적 중합효소 연쇄반응(MSP, methylation specific polymerase chain reaction) 또는 정량적 메틸화-특이적 중합효소 연쇄반응(QMSP, quantitative methylation-specific chain reaction)이 있으며, 데이터를 인위적으로 구분하여 단순히 과메틸화 또는 과메틸화 범주로 나타내는 방법이 있다. 이러한 방법들은 보편적으로 이용됨에도 불구하고, 절대적 정량 대신 상대적인 비교에 의존하며 위양성(false-positive) 및 위음성(false-negative)이 많다는 단점이 있다. 한편, 파이로시퀀싱(PSQ, pyrosequencing)은 정량적으로 DNA 메틸화를 평가하는 매우 정확한 방법 중 하나이다. 이것은 민감도가 높으며 아주 적은 양의 임상적 표본 DNA로도 분석이 가능하여 재현가능성이 매우 높은 방법이다. 전립선암에 관한 몇몇 메틸화의 연구에서는 파이로시퀀싱이 이용되고 있다.

APC(Adenomatous polyposis coli)는 유비퀴틴이 관여하는 베타-카테닌 저하를 통해 Wnt(Wingless-type) 신호경로를 조절하는 암 억제 유전자로 널리 알려져있다. 전립선암의 발달과정동안 APC가 지속적으로 과메틸화되며, APC의 과메틸화는 진단 및 예후에서 중요한 의미를 갖는다는 것은 잘 알려진 바이다.

본 발명자들은 전립선암을 저비용으로 간단하게 진단할 수 있는 분자생물학적 방법을 개발하기 위해 연구 노력하였다. 그 결과, 생물학적 시료로부터 APC(Adenomatous polyposis coli) 유전자의 특정 DNA 내의 CpG 디뉴클레오티드의 메틸화(methylation) 상태를 측정하면 전립선암을 정확하게 진단할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 전립선암 진단에 필요한 정보를 제공하기 위해 APC(Adenomatous polyposis coli) 유전자의 특정 DNA 부위의 CpG 디뉴클레오티드 메틸화 상태를 측정하는 방법을 제공하는 것에 있다.

본 발명의 다른 목적은 전립선암 진단용 키트를 제공하는 것에 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 전립선암 진단 방법을 제공하는 것에 있다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 전립선암 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여 대상자(subject)의 시료로부터 얻은 DNA 상의 메틸화 분석(methylation assay)을 행하는 방법으로서, 상기 메틸화 분석은 서열번호 1 서열내의 하나 이상의 CpG 디뉴클레오타이드(dinucleotides)의 메틸화 상태를 측정하는 방법을 제공한다.

본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 전립선암의 진단방법을 제공한다:

(a) 대상자(subject)의 시료로부터 지놈 DNA를 얻는 단계;

(b) 상기 지놈 DNA에 대해 메틸화 분석(methylation assay)을 행하는 단계로서, 상기 메틸화 분석은 서열번호 1 서열 내에 포함된 하나 이상의 CpG 디뉴클레오타이드(dinucleotides)의 메틸화 상태를 측정하는 것인 단계; 및

(c) 상기 측정된 메틸화 상태가 과메틸화(hypermethylation)된 경우 전립선암으로 판단하는 단계.

본 발명자들은 전립선암을 저비용으로 간편하게 진단할 수 있는 분자생물학적 방법을 개발하기 위해 연구 노력하였다. 그 결과, 생물학적 시료로부터 APC(Adenomatous polyposis coli) 유전자상의 특정 DNA 영역의 CpG 디뉴클레오티드의 메틸화(methylation) 상태를 측정하면 전립선암을 정확하게 진단할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 명세서에서 용어 “메틸화 분석”은 DNA 내의 특정 서열내에서 CpG 디뉴클레오타이드의 메틸화 상태(methylation status)를 측정하는 분석을 의미한다.

본 명세서에서 용어 “메틸화 상태”는 DNA내의 특정 서열내에서 하나 이상의 CpG 디뉴클레오타이드에서 5-메틸시토신(5-methylcytosine)의 존재 또는 부존재 상태를 의미한다.

본 명세서에서 용어 “과메틸화(hypermethylation)”은 테스트되는 DNA 시료의 DNA 서열내에서 하나 이상의 CpG 디뉴클레오타이드에서 5-메틸시토신의 양이, 정상 대조군 DNA 시료내에서의 대응하는 CpG 디뉴클레오티드에서 발견되는 5-메틸시토신의 양과 비교하여 증가되어 있는 메틸화 상태를 의미한다.

본 명세서에서 용어 “저메틸화(hypomethylation)”은 테스트되는 DNA 시료의 DNA 서열내에서 하나 이상의 CpG 디뉴클레오타이드에서 5-메틸시토신의 양이, 정상 대조군 DNA 시료내에서의 대응하는 CpG 디뉴클레오티드에서 발견되는 5-메틸시토신의 양과 비교하여 감소되어 있는 메틸화 상태를 의미한다.

본 명세서에서 용어 “대상자(subject)”는 전립선암을 가질 것으로 의심되는 포유동물이며, 바람직하게는 인간을 의미한다.

본 발명은 APC 유전자 중에서 발견된 특정 부위의 DNA 내의 CpG 디뉴클레오타이드의 과메틸화 상태가 전립선암과 매우 강하게 연관되어 있음을 발견한 것에 기초한다. 따라서, 본 발명에서의 메틸화 상태의 측정은 APC 유전자의 특정 부위의 DNA내의 하나 이상의 CpG 디뉴클레오타이드에 대해 행한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 의하면, 대상자(subject)로부터 얻은 DNA 시료중의 상기 서열번호 1 서열내의 CpG 디뉴클레오타이드의 메틸화 상태가 과메틸화된 경우 이는 전립선암인 가능성이 높은 것을 지시한다.

본 발명의 보다 바람직한 구현예에 의하면, 상기 서열번호 1 서열내의 CpG 디뉴클레오타이드는 서열번호 1의 219번째 뉴클레오타이드 내지 265번째 뉴클레오타이드 영역의 CpG 디뉴클레오타이드이다.

본 발명에서 상기 시료는 바람직하게는 생물학적 시료이며, 예컨대 조직, 전혈, 혈청, 혈장, 체액, 소변, 세포, 세포 파쇄물 또는 세포 배양의 상등액을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

DNA 상의 하나 이상의 CpG 디뉴클레오타이드의 메틸화상태의 측정은 공지된 다양한 DNA 메틸화분석방법을 사용하여 행할 수 있다. 예를 들어 메틸화 민감성 제한효소(methylation sensitive restriction enzyme)로 DNA를 절단한 후 서던 블롯(Southern blot) 검출이나 PCR 증폭을 행하는 방법이 있으며, 중아황산염 처리에 기반한 방법으로서, 메틸화 특이 PCR (MSP, methylation specific PCR)법과, 중아황산염(bisulfite)으로 처리된 DNA를 서열분석하는 방법이 있다. 예컨대, 중아황산염 처리를 사용하여 DNA 메틸화 패턴과 5-메틸시토신을 분석하기 위해 간편화된 지놈 서열분석방법이 개발되어 있다(Frommer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:1827-1831, 1992). 또한, 중아황산염 처리된 DNA로부터 증폭된 PCR 산물을 제한효소로 절단하여 검출하는 방법(Sadri & Hornsby, Nucl. Acids Res. 24:5058-5059, 1996), 또는 COBRA(Combined Bisulfite Restriction Analysis) (Xiong & Laird, Nucleic Acids Res. 25:2532-2534, 1997)이 공지되어 있다.

중아황산염 처리된 DNA의 서열분석을 이용한 메틸화분석법은 다음과 같은 원리에 기초한다. pG 디뉴클레오타이드 부위에서 메틸화가 발생되면 5-메틸시토신이 형성되는데, 이 변형된 염기는 중아황산염 처리시 우라실(uracil)로 변화된다. 시료로부터 추출된 DNA에 중아황산염을 처리할 때 CpG 디뉴클레오타이드가 메틸화되었다면 우라실로 변화하고, 메틸화되지 않았다면 시토신(cytosine)으로 보존된다. 중아황산염 처리된 DNA의 서열분석은 바람직하게는 파이로시퀀싱(pyrosequencing) 방법을 사용하여 행할 수 있다. 파이로시퀀싱에 대한 상세한 설명은 선행문헌에 공지되어 있다[Ronaghi et al, Science 1998 Jul 17, 281(5375), 363-365; Ronaghi et al, Analytical Biochemistry 1996 Nov 1, 242(1), 84-9; Ronaghi et al. Analytical Biochemistry 2000 Nov 15, 286 (2): 282-288; Nyr, P. Methods Mol Biology 2007, 373, 114].

또한, MSP(methylation-specific PCR)의 방법은 시료 DNA에 중아황산염을 처리한 후에 PCR을 수행할 프라이머를 CpG 디뉴클레오타이드의 메틸화 여부에 따라 다른 종류의 프라이머를 디자인하여 사용하는 방법이다. 프라이머 결합 부위가 메틸화되었으면 메틸화된 프라이머에 의해 PCR이 진행되고, 메틸화가 되지 않았으면 정상 프라이머에 의해 PCR이 진행된다. 즉, 시료 DNA에 중아황산염을 처리한 후 두 가지 종류의 프라이머를 동시에 사용하여 PCR을 행한 후, 결과를 비교하는 방법이다.

다른 방법으로는 메틸화 민감성 제한 효소를 사용하여 메틸화 여부를 측정하는 방법이 있다. 메틸화 민감성 제한 효소는 CpG 디뉴클레오타이드를 작용부위로 하며, 이 부위가 메틸화된 경우에는 효소로서 작용하지 못한다. 따라서, 시료 DNA를 메틸화 민감성 제한효소로 처리한 후 효소 타겟 부위를 포함하도록 PCR로 증폭하면, 메틸화된 경우에는 제한효소가 작용되지 않아 PCR 증폭되지만 메틸화되지 않은 정상 부위는 제한효소에 의해 절단되어 PCR 증폭되지 않으므로 특정 DNA 부위의 메틸화 여부를 측정할 수 있다.

메틸화 상태 측정은 바람직하게는,“MethyLight”(a fluorescence-based real-time PCR technique)(Eads et al., Cancer Res. 59:2302-2306, 1999), Ms-SNuPE (Methylation-sensitive Single Nucleotide Primer Extension) 반응 (Gonzalgo & Jones, Nucleic Acids Res. 25:2529-2531, 1997), MSP(methylation-specific PCR) (Herman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:9821-9826, 1996; U.S. Pat. No. 5,786,146), 및 메틸화된 CpG 섬(island) 증폭(“MCA”; Toyota et al., Cancer Res. 59:2307-12, 1999)의 방법들이 단독 또는 다른 방법과 조합하여 사용된다.

본 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 서열번호 1의 서열, 또는 서열번호 1 서열의 중아황산염(bisulfite) 변환된 서열(서열번호 6 서열) 또는 이들의 상보적인 서열에 혼성화되는 12개 이상의 연속적인 뉴클레오타이드를 갖는 프라이머(primer) 또는 프로브(probe)를 포함하는 전립선암 진단용 키트(kit)를 제공한다.

본 명세서에서 용어, "키트"는 증폭 또는 분석을 수행하기 위한 시약의 집합체를 의미한다.

본 명세서에서 용어, "진단" 은 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 본 발명의 목적상, 진단은 전립선암 발병 여부를 확인하는 것이다.

본 명세서에서 용어, "프라이머"는 짧은 자유 3′-말단 OH 기를 가지는 핵산 서열로 상보적인 주형(template)과 염기쌍을 형성할 수 있고 주형 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미하는 것으로, 서열번호 1 서열, 서열번호 1 서열의 중아황산염 변환된 서열, 또는 이들의 상보적인 서열에 혼성화되는 12개 이상의 연속적인 뉴클레오타이드를 갖는다. 본 발명의 프라이머는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 비제한적인 예로는 메틸화, "캡화", 천연 뉴클레오타이드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오타이드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다. 핵산은 하나 이상의 부가적인 공유 결합된 잔기, 예를 들면, 단백질(예: 뉴클레아제, 독소, 항체, 시그날 펩타이드, 폴리-L-리신 등), 삽입제(예: 아크리딘, 프소랄렌 등), 킬레이트화제(예: 금속, 방사성 금속, 철, 산화성 금속 등), 및 알킬화제를 함유할 수 있다. 본 발명의 핵산 서열은 또한 검출 가능한 시그날을 직접적으로 또는 간접적으로 제공할 수 있는 표지를 이용하여 변형시킬 수 있다. 표지의 예로는 방사성 동위원소, 형광성 분자, 바이오틴 등이 있다.

본 명세서에서 용어 "프로브"는 특이적으로 의도된 표적 바이오분자, 예컨대 핵산 전사체 또는 바이오마커에 의해 또는 해당되는 단백질에 선택적으로 결합할 수 있는 임의의 분자를 의미하는 것으로, 본 발명에서 이용되는 프로브는 서열번호 1의 서열, 서열번호 1 서열의 중아황산염 변환된 서열(서열번호 6), 또는 이들의 상보적인 서열에 혼성화되는 12개 이상의 연속적인 뉴클레오타이드를 갖는 것이다. 프로브는 당업자가 합성하거나 또는 적절한 생물학적 조제물로부터 유래될 수 있다. 프로브는 표지되도록 특이적으로 설계될 수 있다. 프로브로서 활용될 수 있는 분자의 예로는, RNA, DNA, 단백질, 항체 및 유기 분자가 있으나, 이로 한정되는 것은 아니다.

본 명세서에서 용어 "혼성화"는 왓슨 클릭 염기쌍에 의해서 복합체를 형성하도록 충분히 상보적인 뉴클레오티드 서열간의 복합체 형성을 지칭한다. 프라이머가 주형(template)과 "혼성화" 하는 경우에, 이러한 복합체(또는 혼성체)는 예를 들어, DNA 중합효소가 DNA 합성을 개시하는 것에 의해 요구되는 프라이밍 기능을 돕도록 충분히 안정적이다. 본 명세서에서 프라이머 및 프로브는 둘 모두 부분적으로 반응 혼합물 내의 목적하는 서열인 서열목록 1의 서열, 서열번호 1 서열의 중아황산염 변환된 서열(서열번호 6), 또는 이들의 상보적인 서열에 혼성화함으로써 기능한다.

본 발명의 키트는 상기 프라이머 또는 프로브 이외에 DNA 메틸화 분석을 수행할 수 있는 시약을 더 포함할 수 있으며, 예를 들어, 제한효소, DNA 중합효소, dNTPs, 루시퍼라아제(luciferase), 또는 아피라아제(apyrase)를 더욱 포함할 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 의하면, 상기 프라이머는 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 및 서열번호 5로 이루어지는 군에서 선택되는 염기서열을 갖는 프라이머 또는 이 프라이머들의 조합인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(ⅰ) 본 발명은 전립선암 진단에 필요한 정보를 제공하기 위해 APC(Adenomatous polyposis coli) 유전자상의 특정 DNA내의 메틸화 상태를 측정하는 방법, 전립선암의 진단방법, 및 전립선암 진단용 키트에 관한 것이다.

(ⅱ) 본 발명에 의하면 생물학적 시료로부터 전립선암을 저비용으로 간편하고 정확하게 진단할 수 있다.

도 1a는 전립선비대증 및 전립선암에서의 APC 메틸화 수준을 나타낸 그래프이다. 전립선비대증 및 전립선암 사이의 차이(p 값)는 두 샘플의 t 테스트를 통해 평가하였다. y축이 나타내는 바는 절대적 APC 메틸화 수준이다.
도 1b는 전립선암의 예측을 위한 APC 메틸화의 ROC 곡선분석을 나타낸 그래프이다. 파선은 기준선을 나타낸다.
도 2는 APC 메틸화 수준과 글리슨 점수 사이의 상관관계를 나타내는 그림이다. 두 그룹의 차이(p 값)는 ANOVA 추세 분석으로 평가하였다. y축이 나타내는 바는 절대적 APC 메틸화 수준이다.
도 3은 전립선암의 예측을 위한 메틸화 정도 측정방법에 사용되는 APC 유전자의 염기서열의 중아황산염 처리 전과 후의 염기서열 변화를 나타내는 모식도이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실험 방법

1. 인간세포 조직 샘플

본 발명에서 총 218의 인간 전립선 조직(106의 전립선비대증 조직 및 112의 전립선암 조직)을 얻었다(충북대학교 병원). 전립선암 환자는 근치적 전립선절제술(radical prostatectomy, RP) 및 고식적 경요도전립선 절제술(transurethral resection, TUR)을 받았고, 전립선 비대증환자는 고식적 경요도전립선 절제술을 받았다. 모든 조직은 절제술 15분 이내에 마크로-절개(macro-dissected)되었다. 각각의 전립선 표본의 냉동 단편을 병리학적 분석으로 확인한 후, 남은 조직은 액체질소로 냉동하여 사용 전까지 -80 ℃에 보관하였다. 샘플 수집 및 분석은 지방의 임상시험심사위원회의 승인을 받았으며 각 환자에게 동의를 얻었다.

2. DNA추출 및 파이로시퀀싱 분석

지놈 DNA(genomic DNA)를 정제 키트의 표준 방법에 따라 추출하였다(Wizard genomic DNA purification system; Promega, Madison, WI). 지놈 DNA(500 ng)의 중아황산염 변형(bisulfite modification)를 수행하기 위해서 DNA 메틸화 키트를 이용하였다(EZ DNA methylation kit; Zymo research, Orange, CA). 또한, APC 메틸화는 파이로시퀀싱으로 분석하였다. PCR 및 시퀀싱 프라이머는 소프트웨어를 사용하여 디자인하였으며(Pyromark assay design version 2.0.1.15; Qiagen, Valencia, CA), 파이로시퀀싱 분석은 서열번호 1 서열내의 메틸화부위인 4 군데의 CpG 사이트를 분석하도록 디자인하였다. 프라이머 서열 및 증폭 조건은 표 1에 기재된 바와 같다. 20 ng의 중아황산염-전환 지노믹 DNA를 사용하여 2단계 PCR 반응을 수행하였다. 바이오틴으로 레이블링된 프라이머(역방향 프라이머)는 스트렙트아비딘으로 코팅된 세파로즈 비드(streptavidin-coated sepharose beads; GE healthcare, Buckinghamshire, UK)를 이용하여 최종 PCR 산물을 정제하는 과정에 사용하였다. 세파로즈 비드에 결합된 PCR 산물은 정제 및 세척 후 0.2 mol/ℓ의 수산화나트륨으로 변성시킨 후 다시 세척하였다. 이어서 정제된 단일 가닥 PCR 산물에 0.3 μmol/ℓ의 파이로시퀀싱 프라이머를 어닐링(annealing)하여 파이로시퀀싱을 수행하였다(Pyromark Q96 ID; Qiagen, Valencia, CA). 전체의 중아황산염-변환에 대한 내부 대조군을 제공하기 위해서 파이로시퀀싱 타겟 부위에 non-CG 사이토신을 포함하였다. 타겟 CpG 사이트의 분석을 위해 각 염기의 메틸화 비율을 C/T율로 계산하고 피크 높이를 수치화하였다. 이후 장비 소프트웨어(PSQ96MA 2.1; Qiagen, Valencia, CA)를 사용하여 파이로그램으로 전환하였으며, 데이터 분석도 소프트웨어를 사용하여 수행하였다(Pyromark Q96 ID software v.1.0; Qiagen, Valencia, CA).

	전방향프라이머	역방향 프라이머	시퀀싱 프라이머
제1단계	5´-GGTAAGGGGTTAGGGTTAGGTAG-3´ (서열번호 2)	5´-ACAACACCTCCATTCTATCT-3´ (서열번호 3)
제2단계	5´-GGTAAGGGGTTAGGGTTAGGTAG-3´ (서열번호 2)	5´-Biotin-ACTACACCAATACAACCACATATC-3´ (서열번호 4)	AGGGTTAGGTAGGTT (서열번호 5)

상기 표 1에서 제1단계 PCR 반응은 각 0.01 μM의 프라이머, Taq 중합효소(Bioneer, Daejon, Korea) 및 20 ng의 아황산염 처리된 DNA가 포함된다. 써모싸이클링 파라미터(thermocycling parameters)는 다음과 같다: 5분 동안 94℃로 변성; 30초 동안 94℃, 30초 동안 59℃ 및 30초 동안 72℃로 30 싸이클; 5분 동안 72℃로 최종 증폭. 제2단계 PCR 반응은 각 0.01 μM의 프라이머, Taq 중합효소(Bioneer, Daejon, Korea) 및 1 μl의 1단계 PCR 산물. 써모싸이클링 파라미터는 다음과 같다: 5분 동안 94℃로 변성; 30초 동안 94℃, 30초 동안 56℃ 및 30초 동안 72℃로 40 싸이클; 5분 동안 72℃로 최종 증폭.

3. 통계 분석

정량적 APC 메틸화 수준은 임상병리학적 특징과 비교분석 하였다. 각 샘플의 메틸화 수준은 유의한 값으로 표현하였다.(각 CpG 사이트 메틸화 수준의 합(％)/ 전체 CpG 사이트의 수(n=4)) 2번의 샘플 시험으로 각 그룹 사이의 연속변량의 차이를 측정하고 카이제곱검정(chi-square test)으로 범주형 변수를 비교하였다. 전립선암과 전립선비대증 사이의 식별을 위해서 수신자 조작 특성(receiver operator characteristic, ROC)곡선 분석으로 APC DNA 메틸화의 최적의 민감도 및 특이성을 평가하였다.(Medcalc software, Mariakerke, Belgium) ROC 곡선의 아래 부분 및 전립선암의 예측을 위한 최적 민감도와 특이성을 산출하는 메틸화 한계점을 계산하였다. 계산된 한계점을 이용하여 민감도, 특이성, 양성 및 음성 예측값을 계산하였다. 또한, 피어슨 상관계수(pearson's correlation)를 이용하여 APC 메틸화 수준 및 임상병리학적 파라미터 사이의 관계를 분석하였으며, 다항식 대조를 사용한 ANOVA 추세 분석을 수행하여 검사의 추세를 파악하였다. 통계적 분석을 위해 다음의 임상병리학적 파라미터를 따라 전립선암을 소그룹으로 나누었다: ⅰ) 글리슨 점수(Gleason score)(≤6, 7, ≥8); ⅱ) 진단의 병기(T2, T3, T4); 및 ⅲ) 진단의 PSA 수준(<3, 3-10, ≥10 ng/㎖). 통계적 분석은 SPSS 12.0 소프트웨어를 사용하여 수행하였으며(SPSS Inc., Chicago, IL), P<0.05가 통계적으로 유의미하게 고려되었다.

실험 결과

1. 기준치 특성( baseline characteristics )

표 2에 나타난 바와 같이, 기준치 특성 중 전립선비대증과 전립선암환자 사이에 전체 전립선 부피 및 평균령에서는 어떠한 의미 있는 차이도 볼 수 없었다. 따라서, 본 발명자들은 전립선암 환자와 전립선비대증 환자의 PSA 수준을 비교분석 하였다.

	BPH (n=106)	PCa (n=112)	p Value
Age (range)	69.4 ± 7.9	68.9 ± 7.1	0.590
PSA (ng/㎖)	4.4 ± 5.7	135.4 ± 216.2	<0.001
Total prostate volume (㎖)	40.7 ± 23.7	41.9 ± 22.8	0.723
Source of tissue (%)
TUR	106 (100)	55 (49.1)
Prostatectomy		57 (50.9%)

데이터는 평균±표준편차로 나타내었다.

2. 전립선 조직의 메틸화 수준

전립선암 샘플에서의 APC 메틸화 수준이 전립선비대증에 비해 유의미하게 더 높았다(33.3±20.7% vs. 1.3±1.8%, P<0.001)(도 1a). 전립선암의 예측을 위해 수행한 ROC 분석결과, APC 메틸화 수준의 곡선 아래 부분은 0.960에 도달(95％ CI 0.934-0.987)하였다(도 1b). 민감도 및 특이성의 밸런스를 확인하기 위해서 6.07％의 APC 메틸화 한계점을 사용하였으며, 한계점은 8.93％의 민감도(95％ CI 82.0-94.3％), 98.1％ 특이성(95％ CI 93.4-99.8％), 98.0％ 양성 예측값(95％ CI 93.1-99.8％) 및 89.7％의 음성 예측값(95％ CI 92.6-94.6％)을 나타내었다. 표 3에서 나타낸 바와 같이, 전립선암과 전립선비대증 샘플의 APC는 각각 89.3％와 1.9％로 메틸화되었다. PSA 수준, 병기 및 글리슨 점수에 의한 계층화 분석에서도 이와 비슷한 결과를 얻을 수 있었다.

	BPH (n=106)	PCa (n=112)
Methylation rate*	1.9 (2/106)	89.3 (100/112)
PSA level (ng/mL)
< 3 ng/mL	0 (0/55)	100 (1/1)
310 ng/mL	4.8 (5/32)	88.5 (23/26)
≥ 10 ng/mL	0 (0/9)	88.5 (23/26)
T staging
T2	-	92.5 (49/53)
T3	-	86.1 (31/36)
T4	-	87.0 (20/23)
Gleason score
≤6	-	66.7 (4/6)
7	-	90.9 (40/44)
810	-	90.3 (56/62)

*메틸화 비율은 백분율로써 나타내었다(메틸화된 샘플의 수/ 전체 샘플의 수).

3. 전립선암의 임상병리학적 파라미터와 메틸화 수준 사이의 상관관계

APC 메틸화 수준과 임상병리학적 파라미터 사이의 상관관계를 분석하였다. APC 메틸화 수준과 환자의 연령(r=-0.103, p=0.281) 또는 혈청 PSA 수준(r=-0.085, p=0.372) 사이에는 어떠한 상관관계도 발견되지 않았다. 이와 대조적으로, 전립선암 환자의 APC 수준과 글리슨 점수 사이에는 양성 상관관계가 관찰되었다(r=0.190, p=0.045). 이후, APC 메틸화 수준을 진단 병기(T2, T3, T4), 글리슨 점수(≤6, 7, ≥8) 및 진단에서의 PSA 수준(<3, 3-10, ≥10 ng/㎖)을 포함한 임상병리학적 파라미터와 비교분석 하였다. 메틸화 수준은 글리슨 점수(p=0.016)와는 양성적 상관관계(도 2)가 있는 반면, APC 메틸화 수준과 PSA 수준 및 진단 병기와는 어떠한 성향도 나타나지 않았다(p>0.05).

고찰 ( Discussion )

본 발명의 결과를 통해, 전립선비대증 환자에 비해 전립선암 환자의 APC 메틸화 수준이 확연하게 높음을 알 수 있다. 더욱이 APC 과메틸화는 증가하는 전립선암의 발생과 관련이 있을 뿐 아니라, 증가한 글리슨 점수와는 양성적 상관관계가 있다. 이와 대조적으로 전립선암환자의 PSA 수준, 환자의 연령 및 병기와 APC 메틸화 사이에는 어떠한 의미 있는 관계도 나타나지 않았다. 비정상적 DNA 메틸화 패턴과 같은 후성적 변질은 다양한 인간의 암종과 관련이 있다. 여러 다른 종류의 암에 있어서, 메틸화 패턴의 차이는 암 위험성 판단, 암 진단 및 치료 모니터링을 위한 마커로써 부각되어왔다. RNA 또는 단백질에 비해서, DNA의 내재하는 안정성 때문에 DNA 메틸화는 암을 검출하는데 매우 유용하다. 질병마커로써 이용되는 메틸화는 암세포에 특이적일 뿐 아니라, 유전자 침묵의 경우에 그 기능을 하는지에 관한 분석에 용이하며, 또한 임상적으로 중요한 정보와 밀접한 관련이 있다. 이러한 관점에서, 본 발명의 결과는 전립선암에서 파이로시퀀싱을 통한 APC 메틸화의 검출이 높은 민감도(89.3%) 및 특이성(98.1%)을 갖는 유용한 진단값이라는 것을 규명하였다.

APC는 잘 알려진 암 억제자로써, 단백질분해효소복합체의 분해를 위한 전사적 공활성화 인자인 베타 카테닌을 타겟으로 하여 Wnt 시그널을 하향조절하고, 핵 전사인자인 TCF/LEF(lymphoidenhancer-binding factor/ T cellfactor)와의 작용을 저해한다. Wnt 경로는 암 발생에서 중심적인 역할을 하며 이 경로의 부적절한 활성은 많은 인간 암에서 공통된 특징으로 암의 증식과 분화의 비조절을 유도한다. 결장암에서 초기 발견된 APC는 전립선암을 포함한 다양한 악성종양에서 발생적 및 후생적 메커니즘에 의해 비활성화되었다. APC의 메틸화 정도는 전립선암으로부터 양성 조직을 구별하는데도 사용될 수 있다. 더욱이 APC의 메틸화 정도는 암의 병기, 등급 및 결핍된 예후를 포함하여 임상병리학적 변수와 상당한 상관관계가 있다. 본 발명자들은 APC 과메틸화가 전립선암과 이것의 확연한 특징의 합리적인 예측변수임을 규명하였다.

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Claims

전립선암 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여 대상자(subject)의 시료로부터 얻은 DNA상의 메틸화 분석(methylation assay)을 행하는 방법으로서, 상기 메틸화 분석은 서열번호 1 서열 내의 하나 이상의 CpG 디뉴클레오타이드(dinucleotides)의 메틸화 상태를 측정하는 것인 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 대상자의 서열번호 1 서열내의 CpG 디뉴클레오타이드의 메틸화 상태가 과메틸화(hypermethylation)된 경우 전립선암을 지시하는 것임을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 서열번호 1 서열의 CpG 디뉴클레오타이드는 서열번호 1 서열의 219번째 뉴클레오타이드 내지 265번째 뉴클레오타이드 영역의 CpG 디뉴클레오타이드인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 메틸화분석은 대상자(subject)의 시료로부터 얻은 DNA를 중아황산염(bisulfite)으로 처리한 후 변환된 DNA의 서열을 분석하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 시료는 전혈, 혈청, 혈장, 체액, 소변, 세포, 세포 파쇄물 또는 세포 배양의 상등액인 것을 특징으로 하는 방법.
서열번호 1 서열, 서열번호 1 서열의 중아황산염 변환된 서열, 또는 이들의 상보적인 서열에 혼성화되는 12개 이상의 연속적인 뉴클레오타이드를 갖는 프라이머(primer) 또는 프로브(probe)를 포함하는 전립선암 진단용 키트(kit).
제 6 항에 있어서, 상기 키트는 DNA 중합효소 및 dNTPs를 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
제 6 항에 있어서, 상기 프라이머는 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 및 서열번호 5로 이루어지는 군으로부터 선택되는 염기서열을 갖는 프라이머 또는 이 프라이머들의 조합인 것을 특징으로 하는 키트.