KR101272521B1 - 전자현미경 분석을 위한 고분자 시료 전처리 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 전자현미경 분석을 위한 나일론계 고분자 복합소재의 시료 전처리 방법에 관한 것으로 고분자 복합소재에서 나일론 성분을 선택 염색하기 위해서, 상온에서 -65℃까지 커팅 온도범위를 적용하는 저온 습식 초박절편법을 포함하는 샘플 커팅단계, 텅스텐인산수화물(PTA) 용액을 적용한 샘플 염색 단계, 증류수를 적하시켜 세척하는 단계를 포함하는 최적화된 전처리 분석기술에 관한 것이다. 이러한 최적의 전처리과정으로 전자현미경 분석이 정확하고 용이한 적용이 가능하다. 이를 통해 고분자 복합재, 특히 나일론계 고분자 복합소재 적용 자동차 부품의 조성분포 및 구조 분석을 위한 표면분석이 가능하여, 플라스틱 부품의 물성 및 공정적합성 예측을 통한 예방품질, 품질문제 대응 및 신제품 개발 등에 활용하여, 제품 불량을 미연에 방지하고 품질 향상에 기여할 수 있다.
Description
본 발명은 전자현미경 분석을 위한 고분자 시료 전처리 방법에 관한 것이다.
본 발명은 주사전자현미경(SEM) 및 투과전자현미경(TEM)의 분석 대상인 시편의 제작방법에 관한 것으로, 특히, 나일론계 고분자 복합소재 등의 고분자 시료의 선택적 염색을 통해, 조성분포 및 구조 분석을 위한 것이다.
자동차에 적용되는 고분자 소재의 경우, 폴리카보네이트/폴리부틸텔레프탈레이트(PC/PBT), 스타이렌·아크릴로나이트릴· 뷰타다이엔(ABS)의 삼원계 공중합체 등 다양한 블랜드 복합수지가 적용되고 있다. 이러한 복합고분자 수지의 상분포 및 구조분석을 통해 물성특성 및 공정적합성 예측이 가능하다. 전자현미경으로 이러한 분석을 위해서는 복합고분자 구성 성분을 선택 염색 전처리하고, 위해서 초박절편기(Ultramicrotome)을 사용해 50~100 nm 두께로 샘플을 절개하여 전자현미경용 관찰용 그리드(Grid)에 올려 투과전자현미경이나 주사전자현미경의 투과모드로 분석한다.
종래의 시편 전처리법은 사산화오스뮴(OSO4)나 사산화루테늄(RuO4)를 사용하여 다음과 같은 방법으로 복합고분자를 선택 염색 처리하는 방법을 적용하고 있다.
일반적인 플라스틱 고분자의 경우, 상온 습식 절편법(Room Temperature Wet Sectioning)을 적용하여 상온에서 커팅하는 방법을 사용하나, 혼합된 고분자 수지의 물성 차이로 인해 다양한 온도에서 커팅하는 방법이 필요하다. 이러한 방법은 구체화 되어 있지 않고, 사용자의 경험에 의지하여 시행된다.
종래의 사산화오스뮴(OSO4)나 사산화루테늄(RuO4)를 사용한 염색과정은 다음과 같다. 메이다병에 사산화오스뮴(OSO4) 등의 염색 용액과 스터러를 투입하고, 병입구에 가는 섬유망을 씌우고, 샘플이 올려진 그리드를 망 위에 올려 놓고 유리 커버를 씌운다. 8시간 이상 스터러를 핫 플레이트에서 작동시키고 방치하면 사산화오스뮴(OSO4) 등의 중금속 용매가 휘발되어, 고분자 소재를 천천히 염색 시키게 된다.
이렇게 염색되는 원리는 고분자 화합물의 이중결합이 시약으로 적용된 중금속 이온과 특정 결합을 하여 발색하는 원리로 중금속으로 치환된 분자는 투과전자현미경에서 어둡게 보이고, 염색되지 않는 부분은 밝게 보인다.
종래에 적용되었던 시약들의 경우 눈과 접촉 시 시신경 마비을 마비시킬 수 있는 독극물로 사용 시약의 유해성으로 인해, 작업상의 제한이 많고, 환기가 완벽한 후드 시설 및 시약을 염색할 수 있는 특수 장치 사용 및 보호안경을 착용하는 등의 안전상의 이유로 실험실 및 분석기관에서 그 적용을 꺼리고 있다. 또 이와 같은 방법으로는 나일론계 고분자는 아마이드 작용기를 가지고 있어 이중결합이 치환되는 종래의 염색법으로는 염색되지 않아 분석이 불가능하다.
따라서, 자동차 소재처럼 다양한 고분자 시료의 분석에 적합하고, 종래의 분석법보다 안전하고 최적화된 분석 전처리법이 요구되고 있다. 이러한 유해한 시약을 대체할 수 있는 염색시약으로 텅스텐인산수화합물(PTA) 용매가 있는데, 주로 바이오/생체 재료에 적용되어 왔고, 나일론 고분자 폴리머 소재 등에 적용된 사례는 거의 없고, 주로 사용자의 경험에 의거해 실용적으로 적용할 수 있는 최적화된 분석 방법은 없었다.
본 발명은 종래의 분석법보다 유해한 중금속 용매를 적용하지 않고, 염색이 용이하지 않은 나일론계 고분자 복합소재를 안전하고 최적화된 분석 전처리법을 제공하는데 그 목적이 있다.
각 단계별 전처리 분석방법에 상세화를 통해, 본 발명자 이외의 3자가 본 기술을 손쉽게 재현할 수 있게 함 있다.
본 발명은 본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 i) 저온 습식 초박절편법을 포함하는 샘플 커팅 단계;
(ii) 샘플에 텅스텐인산수화물(PTA) 용액을 처리하는 것을 포함하는 샘플 염색 단계; 및
(iii) 염색된 샘플에 증류수를 적하시키는 것을 포함하는 세척 단계;
를 포함하는 고분자 복합소재에서 나일론 또는 폴리에스테르계 고분자를 선택 염색하는 전처리 분석방법을 제공한다.
본원 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다.
(i) 본 발명은 전자현미경 분석을 위한 나일론계 고분자 복합소재의 시료 전처리 방법에 관한 것으로 나일론 또는 폴리에스테르계 고분자 성분을 선택 염색하는데 저온 습식 초박절편법을 포함하는 전처리 방법에 관한 것이다.
(ii) 종래의 상온 습식 초박절편법과 달리, 본 발명의 저온 습식 초박절편법을 이용하면 고분자 복합재, 특히 나일론계 고분자 복합소재 적용 자동차 부품의 조성분포 및 구조 분석 등을 보다 구체적으로 수행 가능하며, 나일론 성분을 선택 염색하는데 매우 우수하다.
(iii) 이에 본 발명의 전처리 방법을 이용하면 플라스틱 부품의 물성 및 공정적합성 예측을 통한 예방품질, 품질문제 대응 및 신제품 개발 등에 활용하여, 제품 불량을 미연에 방지하고 품질 향상에 기여할 수 있는 장점이 있다.
도 1은 본 발명의 전처리 분석 과정의 전체 과정을 보여주는 모식도이다.
도 2는 본 발명의 샘플 커팅 단계에서 초박절편 과정을 보여주는 모식도이다.
도 3은 본 발명의 염색 단계에서 텅스텐인산수화물을 적하하여 염색 처리하는 과정을 보여주는 사진이다.
도 4는 염색 전(좌측 패널) 및 염색 후(우측 패널)의 2만 배의 현미경 사진을 통해 나일론 6가 염색된 정도의 차이를 비교하는 사진이다. 우측 패널의 본 발명의 전 처리 과정을 거친 후 나일론 6의 염색이 보다 선택적으로 잘 되었음을 보여주었다.
도 2는 본 발명의 샘플 커팅 단계에서 초박절편 과정을 보여주는 모식도이다.
도 3은 본 발명의 염색 단계에서 텅스텐인산수화물을 적하하여 염색 처리하는 과정을 보여주는 사진이다.
도 4는 염색 전(좌측 패널) 및 염색 후(우측 패널)의 2만 배의 현미경 사진을 통해 나일론 6가 염색된 정도의 차이를 비교하는 사진이다. 우측 패널의 본 발명의 전 처리 과정을 거친 후 나일론 6의 염색이 보다 선택적으로 잘 되었음을 보여주었다.
이하 본 발명을 더욱 자세하게 설명하겠다.
본 발명의 일 양태를 따르면, 본 발명은
(i) 저온 습식 초박절편법을 포함하는 샘플 커팅 단계;
(ii) 샘플에 텅스텐인산수화물(PTA) 용액을 처리하는 것을 포함하는 샘플 염색 단계; 및
(iii) 염색된 샘플에 증류수를 적하시키는 것을 포함하는 세척 단계;
를 포함하는 고분자 복합소재에서 나일론을 선택 염색하는 전처리 분석방법을 제공한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 저온 습식 초박절편법은 -65℃ ~ 상온의 온도에서 시행한다. 보다 바람직하게는 -65 ~ -40℃에서 초박절편한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 샘플을 커팅하는 단계에서 상기 절편을 디메틸설폭사이드 및 증류수를 50~70:50~30 비율로 희석한 용액에 띠우고, 이 후 토치로 가열한 그리드에 올려놓고 건조시키는 과정을 포함한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 샘플 염색 단계에서 준비과정으로 PARA 필름에 증류수를 적하시키고, 1~10% 텅스텐인산수화물 용액을 적하시켜 염색하는 과정을 포함한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 샘플 세척 단계에서 PARA 필름에 증류수 또는 물을 드롭릿 형태로 적하시키고, 염색 처리된 그리드 위 샘플을 적하된 물 또는 증류수 위에 올려 세척하는 포함한다.
본 발명은 샘플 준비 단계 및 염색 단계, 세척 단계로 크게 구분되어, 각 단계는 다음과 같이 구성된다.
< 1단계 : 샘플 커팅 단계 >
초박절편기로 관찰 및 분석 목적에 따라 시료를 채취한다.
1) 트리밍: 초박절편기 홀더에 맞게 약 5 mm 길이로 시편을 면도칼로 절단한다.
2) 샘플 고정: 샘플을 홀더에 고정하고, 커팅 다이아몬드 나이프를 장착한다.
일반적인 플라스틱 고분자 복합재료의 경우, 상온 습식 절편법(Room Temperature Wet Sectioning)보다 적용하나, 본 발명에서는 혼합된 고분자의 종류에 따라 넓은 온도 범위에서 시편을 절단할 수 있는 저온 습식 절편법(Cryo Wet Sectioning) 조건을 최적화 하였다. 절단된 샘플은 샘플이 띄워지는 홀더(보트)에 액체용매를 채우게 되는데, 본 연구에서는 디메틸설폭사이드 (DMSO,Dimethyl Surfoxide 99.0%)와 증류수를 50~70 :50~30 비율로 희석하여 적용하였다.
3) 전처리용 용액 제조 : 디메틸설폭사이드 (DMSO,Dimethyl Surfoxide 99.0%)와 증류수를 50~70 :50~30 비율로 희석한다.
4) 전처리용 용액를 보트에 채운다.
5) 저온 습식 초박절편 : 상온에서 -65℃ 온도 범위에서 소재에 적당한 온도를 선택하여 100 nm 이하로 절편한다. 이 작업은 전처리 용액이 얼지 않기 때문에 소재에 따라 상온에서 -65℃까지 커팅 온도를 선택하여 작업할 수 있다.
초박절편기의 커팅조건 즉, 커팅 온도와 커팅 속도를 셋팅한다. 본 연구에서는 0.5~2 ㎜/sec 속도로 커팅을 하였다.
6) 그리드 전처리 : 샘플을 채취하는 그리드를 토치로 2~3초 가열하여 표면에서 유기물질을 제거한다. 샘플을 올려 놓는 그리드는 구리소재의 가는 망처럼 생긴 원판의 메시 형태(200메시)인데, 보관 및 제조상의 이유로 표면이 소수성이 될 수 있다. 토치로 불로 유기물질 등을 제거하여 표면을 친수성으로 만들어 픽업시 샘플이 정전기로 반발력으로 그리드에 잘 붙지 않는 현상을 제거하였다.
7) 그리드를 핀셋으로 잡고, 보트에 떠 있는 샘플을 픽업한다.
8) 그리드를 용액을 흡수할 수 있는 종이소재에 올려놓고, DMSO 혼합액을 건조시킨다.
< 2단계 : 염색 단계 >
1) 준비단계 : PARA Film에 물을 묻혀 후드 바닥에 놓는다. 이후 PTA 용액을 떨어 뜨릴 때 표면 극성을 맞추어 염색 시약이 튀지 않게 하는 준비단계이다.
2) PTA 적하 : PTA (텅스텐인산수화물) 용매를 스포이드를 이용하여 드롭릿(droplet) 형태로 떨어뜨려 놓는다. 본 발명에서 PTA 농도는 증류수에 혼합하여 1~10% 농도의 혼합액을 제조하여 사용한다.
PTA 용매는 바이오/생체 시료등의 단백질 시료를 염색할 때 적용되어 왔다. 본 발명에 적용된 나일론 계 고분자 시료의 경우에는 다음과 같은 메커니즘으로 아마이드(-CONH-) 작용기가 텅스텐으로 치환되어 염색된다
이렇게 치환된 작용기는 전자현미경으로 투과모드 분석시 원자번호가 무거운 분자화합물이 되므로 검게 나타난다.
3) 샘플/시약 접촉작업 : 그리드 위에 올려진 시편이 시편이 PTA 용매와 직접 닿도록 드롭릿(droplet) 위에 올려 놓는다.
4) 염색 처리 : 10분이상 3일정도 상온에서 방치한다.
< 3단계 : 세척 단계>
1) 증류수 적하 : 정해진 염색 처리 시간이 경과하면, 파라필름 위에 증류수를 스포이드를 이용하여 드롭릿(droplet) 형태로 떨어뜨려 놓는다.
2) 린싱(Rinsing) : 그리드를 증류수 위에 올려 린싱 한다.
1)과 2)이 세척과정을 5회이상 반복하여 염색시약을 완전히 제거한다.
< 4단계 : 기기분석 단계>
1) 투과전자현미경 또는 주사전자현미경을 적용하여 분석한다. 주사전자현미경의 경우는 투과모드를 적용하여 분석한다.
실시예
:
◈ 샘플 커팅 단계
적용 초박절편기는 RMC 社의 PT-XL모델을 적용하였다.
1) 시편 준비 : 시편을 5 X 5 X 10 ㎜ 로 면도칼로 홀더에 맞게 절단하였다.
2) 샘플을 홀더에 고정하고, Cryo Wet Section용 다이아몬드 나이프를 장착하였다.
3) 디메틸설폭사이드 (DMSO,Dimethyl Surfoxide 99.0%)와 증류수를 60 : 40 비율로 희석하여 보트에 채울 용매를 제조하였다.
4) 보트에 혼합용매를 채웠다.
5) 커팅 조건을 설정하였다. (온도: -50℃, 커팅속도: 0.8㎜/s, 커팅두께 : 80㎚ )
6) 샘플은 80 nm 두께로 커팅하였다.
7) 그리드를 토치로 2~3초 가열하였다.
8) 그리드를 핀셋으로 잡고, 보트에 떠 있는 샘플을 픽업하였다.
9) 그리드를 거름종이에 올려 놓고, DMSO 혼합액을 건조시켰다.
◈ 염색 단계
1) PARA Film에 물을 묻혀 후드 바닥에 놓았다.
2) 텅스텐인산수화물 용매(PTA) 는 증류수에 혼합하여 2% 농도의 혼합액을 제조하였다.
3) 텅스텐인산수화물 용매를 스포이드를 이용하여 드롭릿(droplet) 형태로 떨어뜨려 놓았다.
4) 시편이 PTA 용매와 직접 닿도록 드롭릿(droplet) 위에 올려 놓고, 3일 방치 하였다.
◈ 세척 단계
1) 그리드를 증류수 위에 올려 린싱(Rinsing) 하였다.
2) 이와 같은 과정을 5회 반복하였다.
◈ 기기분석 단계
1) 주사전자현미경의 투과모드를 적용하여 시편을 관찰하였다.
실험 결과 도 4에서 보여주듯이, 실시 예에서 염색 전에서는 흐리게 나타났던 나이론 6의 상(좌측 패널)이 염색 후에 어두운 상으로 염색된 나일론 6 소재(우측 패널)가 구분되어 관찰된다. 폴리케톤 성분은 염색되지 않고 밝게 보인다.
또한, 본 발명의 전처리 방법은 나일론계 고분자 복합재료 외에 폴리에스테르 계 고분자 등의 소재에 확대 응용할 수 있다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일뿐, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
Claims (5)
- (i) 저온 습식 초박절편법을 포함하는 샘플 커팅 단계;
(ii) 샘플에 텅스텐인산수화물(PTA) 용액을 처리하는 것을 포함하는 샘플 염색 단계; 및
(iii) 염색된 샘플에 증류수를 적하시키는 것을 포함하는 샘플 세척 단계;
를 포함하는 고분자 복합소재에서 나일론계 고분자를 선택 염색하는 전처리 분석방법에 있어서, 상기 샘플 커팅 단계는 절편을 디메틸설폭사이드 및 증류수를 50~70:50~30 비율로 희석한 용액에 띄우는 과정을 포함하는 것인 분석방법.
- 청구항 1에 있어서, 상기 저온 습식 초박절편법은 -65℃ ~ 상온의 온도에서 시행하는 것을 특징으로 하는 분석방법.
- 청구항 1에 있어서, 상기 절편을 디메틸설폭사이드 및 증류수를 50~70:50~30 비율로 희석한 용액에 띄운 이 후 토치로 가열한 그리드에 올려놓고 건조시키는 과정을 포함하는 것을 특징으로 하는 분석방법.
- 청구항 1에 있어서, 상기 샘플 염색 단계에서 준비과정으로 PARA 필름에 증류수를 적하시키고, 1~10% 텅스텐인산수화물 용액을 적하시켜 염색하는 과정을 포함하는 것을 특징으로 하는 분석방법.
- 청구항 1에 있어서, 상기 샘플 세척 단계에서 PARA 필름에 증류수 또는 물을 드롭릿 형태로 적하시키고, 염색 처리된 그리드 위 샘플을 적하된 물 또는 증류수 위에 올려 세척하는 포함하는 분석 방법.
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