KR101270255B1 - 아나카딕산을 유효성분으로 하는 유해조류 방제용 조성물 및 이를 이용한 유해조류 방제방법 - Google Patents

아나카딕산을 유효성분으로 하는 유해조류 방제용 조성물 및 이를 이용한 유해조류 방제방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 아나카딕산을 유효성분으로 하는 유해조류 방제용 조성물 및 이를 이용한 유해조류 방제방법에 관한 것으로, 상기 본 발명에 따른 유해 조류 방제용 조성물은 유익한 조류에는 독성이 적으면서 남조류 등의 유해조류를 상대적으로 잘 방제하며 각각의 단독처리보다는 혼합처리 시 활성이 상승됨으로써 적은 량의 투입이 가능하여 환경에 미치는 부작용이 보다 경감될 수 있으며, 조류(algae) 생장에 있어서 서로 다른 반응성을 보여 방제하고자 목표하는 유해조류를 선택적으로 제어할 수 있는 장점이 있어 식생을 크게 파괴하지 않는 범위에서 수생태계의 합리적 관리에 유용하게 사용될 수 있는 장점이 있을 뿐 아니라 유용한 특정조류를 실내외 재배시 유해조류 오염에 의한 피해를 방지하고자 하는 곳에 사용될 수 있어 고품질의 조류 바이오매스 생산에도 적용될 수 있는 장점이 있다.

Description

아나카딕산을 유효성분으로 하는 유해조류 방제용 조성물 및 이를 이용한 유해조류 방제방법{Composition comprising anacardic acids for enhansing control of harmful algae, and method for controlling harmful algae using the same}
본 발명은 아나카딕산을 유효성분으로 하는 유해조류 방제용 조성물 및 이를 이용한 유해조류 방제방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 아나카딕산(anacardic acids), 아나카딕산을 50% 이상 포함하는 천연물 및 아나카딕산 염화물로부터 선택되는 한 종 이상을 함유하는 유해 조류 방제용 조성물 및 이를 이용한 유해조류 방제방법에 관한 것이다.
유해 조류의 대발생(HAB, Harmful Algal Blooming)은 이들의 생육 서식지에 따라 산업적으로 다양한 문제를 일으키고 있다. 호수, 하천, 저수지, 양어장 등지에서의 유해조류의 대발생은, 1) 수생생물의 폐사를 일으키고(Duke 등, Weed Sci . 50: 138-151, 2002); 2) 이취미(off-flavor) 물질을 발생시켜 음용수 및 양식어류의 육질을 떨어뜨리는데, 예를 들면, 유해 조류인 오실라토리아 페로나타(Oscillatoria perornata)의 서식지에서는 물고기에 흙냄새(off-flavor)가 나게 되며(Duke 등, Weed Sci . 50: 138-151, 2002); 3) 사람 및 동물에 유해한 독소가 생성되는데, 예를 들어, 마이크로시스티스(Microcystis) 속, 노듈라리아(Nodularia) 속, 아나베나(Anabaena) 속, 아파니조메논(Aphanizomenon)속 등의 일부 조류는 각각 사람 및 동물에 유해한 독소인 마이크로시스틴(microcystins), 노듈라린(nodularin), 아나톡신(anatoxin) 및 삭시톡신(saxitoxin)을 생산한다고 알려져 있고(Haider 등, Chemosphere 52:1-21, 2003); 4) 물의 착색 및 이상발포(scum) 형성 등으로 불쾌감을 유발하고 여가 및 산업 활동을 저해하며; 5) 상수처리과정 중의 여과지 폐쇄 및 응집 침전 저해 등으로 인해 염소의 과다처리가 필요하므로 경제적 손실을 야기한다.
상기의 물 환경 분야에서 경제적, 사회적으로 많은 문제를 야기시켜 왔던 유해조류 대발생(Haider 등, Chemosphere 52:1-21, 2003; Duke 등, Weed Sci. 50: 138-151, 2002)을 억제하기 위한 기술개발도 새로운 전략이 요구되고 있다.
즉 과거에는 모든 조류의 발생을 무조건 차단하거나 비선택적으로 제거, 사멸시키는 개념의 기술이 시도되었지만 앞으로는 유해조류를 선택적으로 제거하거나 기타 조류의 생장정도를 보다 정밀하게 제어할 수 있는 기술의 적용이 필요하며, 이를 위해서는 무엇보다 유해조류에 선택적으로 반응하는 물질의 탐색과 합리적 처리기술 등에 대한 연구가 진행되어야 한다. 그리고 이에 해당되는 물질은 독성이 낮거나 환경 내 분해가 용이하여 유해물질의 환경 내 장기간 축적 문제를 일으키지 않는 것이 바람직하다.
상기 목적을 달성하기 위한 좋은 방안으로는 1) 합성화합물보다 상대적으로 분해가 용이할 것으로 여겨지는 천연물로부터 가능한 한 유해조류를 선택적으로 제어하는 물질을 발굴하고, 2) 효능에 있어서 상승작용을 가지는 화합물 조합을 탐색하여 혼합처리 함으로써 환경에 투입되는 화합물 절대량을 감소시키고, 3) 유해조류가 대발생하기 이전에 처리하여 조류발생을 초기부터 효율적으로 억제시킬 뿐만 아니라 유해조류 사체로 인한 이차오염을 줄일 수 있는 합리적 처리기술이 개발되는 것이 필요하다.
최근 천연물 또는 저독성 생화학제를 이용하여 미세조류를 제어하는 연구가 활발히 연구되고 있다(Schrader K.K., ACS Symposium Series 848: 195-208, 2003).
그러나 천연 살조제(natural algicide)는 탐색된 종류가 제한적이며 일부 천연물은 활성이 약하거나 작용스펙트럼이 좁고 생산가격이 비싸다는 문제점이 있어 이를 해결하기 위한 지속적인 연구가 필요한 상황이다.
한편, 아나카딕산을 많이 함유하고 있는 식물은 캐슈넛 종피(cashew nut shell), 은행 열매, Ozoroa insignis 수피 등으로 보고되고 있다(Shobha and Ravindranath. 1991. J. Agric. Food Chem. 39:2214-2217; Murata 등. 1997. Lebensm.-Wiss. u.-Technol., 30:458463; Rea 등 2003, Fitoterapia 74:732735). 그리고 지금까지 아나카딕산의 생리활성을 조사한 연구보고로서는 세포독성(Rea 등 2003, Fitoterapia 74:732735), 항산화활성(Kubo 등 2006. Food Chemistry 99:555562), 항종양활성(Kubo 등 1994. Journal of Agricultural and Food Chemistry 41:10121015), 박테리아활성 억제(Himejima and Kubo. 1991. J. Agric. Food Chem. 39:418-421; Muroi and Kubo. 1993. J. Agric. Food Chem. 41:1780-1783; Murata 등 1997. Lebensm.-Wiss. u.-Technol., 30:458463), 아파노미케스 코클리오이데스(Aphanomyces cochlioides) 균의 유주자 용해(Begum 등. 2002. Z. Naturforsch. 57c:874-882), 방오활성(Choi 등 2008. Journal of Industrial and Engineering Chemistry 14:292296; Chelikani 등, 2009, Applied Biochemistry and Biotechnology 157(2):263-277), 항균 활성(Prithiviraj 등, 1997. Canadian Journal of Botany 75(1):207-211), 모기 유충 및 사상충, 기타 해충 방제효과(Raj, 2007. 인도특허 2002MA00700; Schultz 등, 2006, J. Agric. Food Chem. 54(20):7522-7529), 달팽이와 같은 연체동물을 죽이는 활성(Sullivan 등, 1982. Planta Medica 44:175-177) 등이 보고되었으나 아나카딕산를 이용한 유해조류의 선택적 방제에 적용한 연구사례는 보고된 바가 없다.
이에 본 발명자들은 천연물 살조제(natural algicide)를 탐색하던 중, 아나카딕산(anacardic acids)을 함유하는 천연물이 우리나라에서 매년 심각한 문제를 야기시키고 있는 마이크로시스티스 아에루기노사(Microcystis aeruginosa)를 포함한 유해조류에 대한 우수한 방제활성 효과를 발견하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 안전성에 있어서 문제가 되는 합성 유기화합물 또는 무기물 대신에 인축독성이 낮고 자연친화적인 물질인 아나카딕산 또는 아나카딕산 함유 천연물을 이용한 유해조류를 선택적으로 제어할 수 있는 새로운 유해 조류 방제용 조성물 및 이를 이용한 유해 조류 방제 방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 상기의 목적을 달성하기 위하여, 인축독성이 낮고 자연친화적인 물질인 아나카딕산 또는 아나카딕산 함유 천연물을 이용한 유해조류를 선택적으로 제어할 수 있는 새로운 유해 조류 방제용 조성물 및 이를 이용한 유해 조류 방제 방법을 제공한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
아나카딕산(anacardic acids)은 캐슈너트 외피유(Cashew nut shell oil)에 함유되어진 물질로 nonisoprenoid alk(en)yl 측쇄를 가진 살리신산 유도체라고 일컫고 있다(Machlin & Bendich, 1987, The FASBE Journal, 1: 441445).
본 발명은 유효성분으로 아나카딕산(anacardic acids), 아나카딕산을 50% 이상 포함하는 천연물 및 아나카딕산 염화물로부터 선택되는 한 종 이상을 함유하는, 유해 조류 방제용 조성물 및 이를 이용한 유해 조류 방제 방법을 제공한다.
본 발명은 상기 조성물에 메나디온(menadione), 메나디온 소디움 바이설파이트(menadione sodium bisulphite), 나노실버, 크리소파놀(chrysophanol)로부터 선택된 첨가물을 더 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 있어서, 상기 조성물은 아나카딕산(anacardic acids), 아나카딕산을 50% 이상 포함하는 천연물 및 아나카딕산 염화물로부터 선택된 화합물(A군); 및
메나디온(menadione), 메나디온 소디움 바이설파이트(menadione sodium bisulphite), 나노실버, 크리소파놀(chrysophanol)로부터 선택된 첨가물(B군)의 혼합비율은 A군: B군 무게비율이 0.5 내지 99.5% : 99.5 내지 0.5%인 것을 특징으로 한다.
만약 상기 혼합 중량비 중 어느 한쪽 물질이 0.5% 미만이거나 99.5%를 초과하는 경우에는 혼합에 따른 상승효과가 미미할 수 있으므로 상기 범위에서 혼합하는 것이 바람직하다.
본 발명에 있어서, 상기 아나카딕산 염화물은 아나카딕산과 저급 알코올의 혼합물에 염기성 수용액을 첨가하여 제조될 수 있으며, 보다 상세하게는 아나카딕산을 메탄올(또는 에탄올)에 첨가하여 용해시킨 후, NaOH 또는 KOH 수용액을 첨가 하고 무수 황산암모늄을 첨가하여 비이커 내부의 수분을 제거한 후 여과시킨 다음, 여과물을 감압건조시켜 제조한다.
본 발명에 있어서, 상기 유해 조류는 마이크로시스티스(Microcystis), 아나베나(Anabaena), 오실라토리아(Oscillatoria), 스피룰리나( Spirulina ), 아파니조메논(Aphanizomenon), 노듈라리아(Nodularia), 코클로디늄(Cochlodinium), 스테파노디스커스(Stephanodiscus), 클로렐라(Chlorella), 클라미도모나스(Chlamydomonas), 세네데스무스(Scenedesmus) 및 보트리오코쿠스(Botryococcus) 속의 조류로 이루어진 군으로부터 선택되는 조류를 포함할 수 있다. 특히 마이크로시스티스(Microcystis), 오실라토리아(Oscillatoria), 아나베나(Anabaena) 등과 같은 남조류에 대하여 매우 높은 방제효과를 나타낸다.
본 발명의 유해조류 방제용 혼합조성물은 혼합물의 효과를 저해하지 않는 범위 내에서 효과의 안정적 발현, 적용 대상 생물로의 부착 증진, 운반 및 처리의 간편화를 위해 제제학적으로 허용 가능한 고체 담체, 액체 담체, 액체 희석제, 액화된 기체 희석제, 고체 희석제, 또는 기타 적당한 보조제, 예를 들면 유화제, 분산제 또는 기포제 등의 계면활성제를 더욱 포함할 수 있다.
본 발명의 방제용 조성물은 바람직하게는 유제, 수화제, 입제, 분제, 캅셀형 및 젤상의 제형으로 제제화될 수 있고, 제제의 부력을 위해 도넛형과 같은 제형을 통한 접촉제로서 제공되는 것이 바람직하다.
본 발명은 상기 본 발명에 따른 유해 조류 방제용 조성물을 상기에 예시된 바와 같은 유해조류가 발생한 수중 또는 토양에 처리하여 유해조류를 방제하는 유해조류 방제방법을 제공한다. 이때, 상기 조성물을 유해조류가 발생되는 초기에 처리함으로써 대량증식을 사전에 차단하는 것이 바람직하다.
본 발명은 상기 유해조류 방제용 조성물을 마이크로시스티스(Microcystis), 아나베나(Anabaena), 오실라토리아(Oscillatoria), 스피룰리나( Spirulina ), 아파니조메논(Aphanizomenon), 노듈라리아(Nodularia), 코클로디늄(Cochlodinium), 스테파노디스커스(Stephanodiscus), 클로렐라(Chlorella), 클라미도모나스(Chlamydomonas), 세네데스무스(Scenedesmus) 및 보트리오코쿠스(Botryococcus) 속의 조류가 서식하는 수중 또는 토양에 처리하는 것을 특징으로 하는, 유해 조류의 방제방법을 제공한다.
본 발명에 따른 유해 조류 방제방법은, 유해 조류가 발생한 수중 또는 토양에 처리 시 유효 성분의 농도가 너무 낮은 경우에는 유해 조류 방제 효과가 미미할 수 있고, 유효 성분의 농도가 너무 높은 경우에는 비경제적이거나 환경생태에 대한 부정적 영향이 나타날 수 있기 때문에 상기 유해 조류 방제용 조성물을 유효 성분 기준으로 0.01 ㎍/㎖ 내지 200 ㎍/㎖의 농도가 되도록 처리하는 것이 바람직하며, 이는 유해조류의 종류, 발생밀도, 생육 정도, 수질 환경 등을 고려하여 적절하게 조절할 수 있다.
보다 상세하게는, 처리 최종농도를 기준으로 아나카딕산 화합물은 0.1 ㎍/㎖ 내지 80 ㎍/㎖의 농도, 아나카딕산 함유 천연물은 1 ㎍/㎖ 내지 200 ㎍/㎖의 농도, 아나카딕산과 상승작용을 가지는 화합물은 0.01 ㎍/㎖ 내지 10 ㎍/㎖의 농도가 되도록 조류가 발생한 수중 또는 토양에 처리하는 것이 바람직하며, 이는 미세조류의 종류, 발생밀도, 생육 정도, 수질 환경 등을 고려하여 적절하게 조절할 수 있다.
본 발명에 따른 유해 조류 방제용 조성물은 유익한 조류에는 독성이 적으면서 남조류 등의 유해조류를 상대적으로 잘 방제하며 각각의 단독처리보다는 혼합처리 시 활성이 상승됨에 따라 적은 량의 투입이 가능하여 환경에 미치는 부작용이 보다 경감될 수 있는 장점이 있으며, 우수한 살조활성의 유지로 경제적이 장점이 있다.
본 발명에 따른 유해 조류 방제용 조성물은 조류(algae) 생장에 있어서 서로 다른 반응성을 보여 방제하고자 목표하는 유해조류를 선택적으로 제어할 수 있어 식생을 크게 파괴하지 않는 범위에서 수생태계의 합리적 관리에 유용하게 사용될 수 있는 장점이 있다.
본 발명에 따른 유해 조류 방제용 조성물은 생태환경 친화적이면서 효능이 우수한 유해조류 방제제로서 유용한 특정조류를 실내외에서 재배할 때, 유해조류 오염에 의한 피해를 방지하고자 하는 곳에 사용될 수 있어 고품질의 조류 바이오매스 생산에도 적용될 수 있는 장점이 있다.
도 1은 본 발명에 따른 아나카딕산의 마이크로시스티스 아에루기노사(Microcystis aeruginosa UTEX2388)에 대한 방제효과를 확인한 그래프이고,
도 2는 본 발명에 따른 아나카딕산 염화물들이 마이크로시스티스 아에루기노사(Microcystis aeruginosa UTEX2388)의 생육억제에 미치는 효과를 나타낸 그래프이며,
도 3은 본 발명에 따른 아나카딕산의 녹조류 및 남조류에 대한 생육억제활성 효과를 조사한 그래프이고 (Bb 2: 보트리오코쿠스 부라우니 UTEX 572, Bb 3: 보트리오코쿠스 부라우니 UTEX 2441, Cs: 클라미도모나스, Cv:클로렐라 불가리스 UTEX 265, Ss: 세네데스무스, Af: 아나베나 아피니스, Ma: 마이크로시스티스 아에루기노사 UTEX 2388, Ot: 오실라토리아 테누이스 UTEX1566, Sp: 스피룰리나 플라텐시스),
도 4는 본 발명에 따른 아나카딕산 및 메나디온 소디움 바이설파이트(menadione sodium bisulphite) 혼합물의 마이크로시스티스 아에루기노사(Microcystis aeruginosa UTEX2388)에 대한 방제 상승효과를 확인한 그래프이며,
도 5는 본 발명에 따른 아나카딕산 및 메나디온(menadione) 혼합물의 마이크로시스티스 아에루기노사(Microcystis aeruginosa UTEX2388)에 대한 방제 상승효과를 확인한 그래프이고,
도 6은 본 발명에 따른 아나카딕산 및 나노실버 혼합물의 마이크로시스티스 아에루기노사(Microcystis aeruginosa UTEX2388)에 대한 방제 상승효과를 확인한 그래프이며,
도 7은 본 발명에 따른 아나카딕산과 크리소파놀(Chrysophanol) 혼합물의 마이크로시스티스 아에루기노사(Microcystis aeruginosa UTEX2388)에 대한 방제 상승효과를 확인한 그래프이다.
본 발명은 하기 실시예에 의하여 더욱 구체적으로 설명한다. 그러나, 하기 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 어떤 의미로든 본 발명의 범위가 이러한 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.
이때, 사용되는 기술 용어 및 과학 용어에 있어서 다른 정의가 없다면, 이 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 통상적으로 이해하고 있는 의미를 가지며, 하기의 설명 및 첨부 도면에서 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있는 공지 기능 및 구성에 대한 설명은 생략한다.
[실시예 1] 아나카딕산(anacardic acids) 함유 천연물의 남조류에 대한 방제효과
아나카딕산(anacardic acids) 성분의 상대적 함량에 따른 살조활성 비교를 위해 유해 남조류인 마이크로시스티스 아에루기노사(Microcystis aeruginosa UTEX2388)의 생장억제에 미치는 혼합물의 효과를 조사하였다.
상기 남조류는 한국생명공학연구원 환경생물공학연구실에서 분양받은 마이크로시스티스 아에루기노사(Microcystis aeruginosa UTEX2388)를 Allen's medium(Allen, 1968, Journal of Phycology 4: 1-4), 온도 25℃, 광주기 14시간, 광도 50 μmolm-2s-1 조건에서 100 rpm으로 흔들면서 계대배양한 것을 사용하였다
(1) 화합물 확보
캐슈 넛트 쉘(Cashew nut shell)에서 추출하여 부분 정제된 혼합물을 시중에서 구입하여 사용하였다. 본 실험에 사용된 혼합물은 Ana-acid A(Anacardic acid가 87.1% 함유된 혼합물), Ana-acid B(Anacardic acid가 66.6%. Cardol이 19.9% 함유된 혼합물), Cardol(Cardol이 82.5%, Cardanol이 9.8% 함유된 혼합물), Polycardol (Cardol이 중합되어있는 혼합물)을 사용하였으며, 성분함량은 HPLC분석을 통해서 확인하였고, 상기 polycardol은 효소중합에 의해 제조된 것(Kim 등 2007. J. Mol. Catal. B: Enzym. 45:3944)을 사용하였다.
(2) 남조류에 대한 방제효과 확인
용액 3 mL에 각각의 조류 건물중이 0.25 mg되도록 농도를 조정한 후, 시험 약제를 투입하였다(microplate reader 이용하여 A670nm = 0.08내외).
상기 시험약제는 농도를 0.1 내지 100 ppm 수준에서 시험하였다. 시험기간 동안 시험용액을 교체해주지 않는 지수식(static)으로 시험하였다. 상기 시험 약제를 아세톤(Tween 20 0.02% 함유)에 녹여 알렌배지에 100배 희석하여 각 농도의 시험용액을 만들었다(Acetone 및 Tween 20 최종농도는 각각 1%, 2ppm). 이를 24 well plate에 1.5 mL씩 분주하여 4회 반복으로 실시하였다.
시험기간 동안 온도는 25℃, 광주기 14시간, 광도 40μmolm-2s-1에서 배양하였다. 시험 용액 처리 후 6일째에 흡광도를 측정하여 각 조류의 생장정도를 사전에 설정해 둔 흡광도-건물중 상관식(Kim 등, Aquatic Botany 85: 1-6, 2006)(수학식 1)을 통해 조사한 후, 상기 방제용 조성물의 조류 방제 효과를 대조군에 대한 건물중 억제정도(%)로 산출하였다.
Figure 112010061871019-pat00001
Figure 112010061871019-pat00002
그 결과, 도 1에서도 확인할 수 있듯이, 마이크로시스티스 아에루기노사(Microcystis aeruginosa UTEX2388)에 대한 활성의 경우, Ana-acid A > Ana-acid B > Cardol > Polycadol 순으로 나타나 아나카딕산(anacardic acids) 성분의 함량이 높은 수록 높은 살조활성을 나타내는 것을 확인할 수 있었다.
한편 polycardol은 cardol보다 효과가 떨어지는 것을 확인할 수 있었으며, 이는 중합처리에 인한 살조효과의 경감을 가져오는 것을 확인한 결과이기도 하다. 연구보고에 의하면(Choi 등 2008. Journal of Industrial and Engineering Chemistry 14:292296; Chelikani 등, 2009, Applied Biochemistry and Biotechnology 157(2):263-277) anacardic acid, carnadol, cardol 등을 중합하여 선박구조물이나 trap net 등의 표면에 피복하여 방오제로서 사용할 수 있다는 보고가 있으나, 이러한 처리는 결국 사용방법상에 있어서 제한때문이기는 하나 원래의 화합물 활성을 충분히 발현시키지 못하는 결과를 가져오는 것으로 생각된다.
[ 실시예 2] 아나카딕산 염화물의 살조활성 조사
아나카딕산(anacardic acids)은 지용성 물질로서 물에 대한 용해도가 상대적으로 낮아 유제 등으로 제형화 하려면 용매 또는 계면활성제가 혼입되게 된다. 이 경우 제조물을 물에 투여하면 기능발현 이후에 유기물로서 작용하여 수질을 악화시킬 여지가 있다. 따라서 가능한 한 수용성 성질을 부여하여 단일 물질이 처리되도록 하는 것이 바람직하다. 이에, 아나카딕산의 수용해도를 증진시키는 방법을 확립하고 제조된 물질의 살조활성 차이를 조사하였다.
(1) Ana - Na 와 Ana -K salt 조제
Ana-acid(Anacardic acid 66% 함유) 20 g을 칭량하여 메탄올(또는 에탄올) 200 mL에 첨가하여 용해시켰다.
다른 용기에 NaOH 또는 KOH 5 g을 증류수 10 mL에 용해시키고 이를 Ana-acid 용해액에 가하여 1시간 동안 교반을 한 후, 무수 황산암모늄을 과량 넣어주어 비이커 내부의 수분을 제거한 후 여과시킨 다음, 여과물을 감압건조시켜 용매를 제거하였다. 제조된 시료 모두는 물에 잘 용해되었다.
(2) 살조활성 검정
Ana-acid는 아세톤(Tween 20 0.02% 함유)에 녹이고, Ana-Na와 Ana-K시료는 멸균수에 녹인 다음, 이를 알렌배지에 100배 희석하여 최종적으로 0.015 내지 1.0 ug/mL 농도의 시험용액을 만들었다(Acetone 및 Tween 20 최종농도는 각각 1%, 2 ppm). 이어서 적정농도가 되도록 마이크로시스티스 아에루기노사(Microcystis aeruginosa UTEX2388)를 접종한 후 배양실에 옮겨 전 상기 실시예 1과 동일한 조건으로 생육억제활성을 조사하였다.
그 결과 도 2에서도 확인할 수 있듯이, 마이크로시스티스 아에루기노사(Microcystis aeruginosa UTEX2388)에 대한 생육억제활성의 정도는, Ana-acid > Ana-Na > Ana-K 순으로 효능이 나타나 염화물로 됨으로써 다소 약효가 감소되는 경향을 확인할 수 있었으며, Ana 염화물 시료간에는 상대적으로 sodium salt 형태가 potassium salt 형태보다 높은 활성을 보였다.
상기의 결과로부터 염화물 제조로(Ana-Na) 인한 활성은 다소 감소하긴 하나 현저한 정도는 아니며 제제를 위한 유기용매를 사용하지 않게 되고 또한 처리방법이 매우 간편해지기 때문에 Ana-acid 보다는 Ana-Na의 형태가 보다 실용적임을 확인하였다.
[ 실시예 3] 아나카딕산의 여러 담수조류에 대한 살조활성 스펙트럼 조사
아나카딕산(anacardic acids)의 여러 가지 담수조류에 대한 살조활성 스펙트럼을 알아보기 위하여 실험하였다.
(1) 시험생물
한국생명공학연구원 생물자원센터에서 분양받아 Allen's medium 또는 SOT medium, 온도 25℃, 광주기 14시간, 광도 50 μmolm-2s-1 조건에서 계대배양한 하기 표 1의 담수조류(녹조류 5종, 남조류 4종)를 사용하였다.
Figure 112010061871019-pat00003
(2) 살조활성 검정
상기 담수조류에 처리할 시험 용액은 Ana-acid를 100 ㎍/mL의 Tween 20™이 포함된 아세톤에 용해시킨 후 동일 용매를 이용하여 여러 농도로 조제하였다. 결국, 배양액내의 아세톤과 Tween 20의 최종 농도는 각각 1% 및 2 ㎍/mL이었다. 시험약제 처리시 조류 초기농도는 microplate reader를 이용하여 A670nm = 0.05 내지 0.08 내외로 조정하였으며, 각각의 배지로 조제한 시험용액 10 mL를 100 mL 유리 배양병에 분주한 후 아래와 같이 조제된 시험 용액 및 대조군 용액 100 ㎕를 각각 조류 배양액에 투여하였다. 모든 처리는 3회 반복으로 실시하였다. 온도는 25℃, 광주기 14시간, 광도 40μmolm-2s-1에서 6일 배양한 후 약제의 효과를 검정하였다.
Chlorella vulgaris(Cv), Scenedesmus spp(Ss), Microcystis aeruginosa(Ma)에 대한 약제처리 효과는 사전에 설정해 둔 흡광도-건물중 상관식(Kim et al. 2006. Aquatic Botany 85:1-6)을 통해 무처리에 대한 건물중 억제정도(%)로 나타내었지만 Botryococcus braunii(Bb), Chlamydomonas spp(Cs), Spirulina pratensis(Sp), Anabaena affinis(Af)에 대한 약제처리 효과는 흡광도의 무처리 대비 억제정도(%)로서 나타내었다.
그러나 Oscillatoria tenuis(Ot)의 경우에는 세포가 뭉쳐 자라기 때문에 배양액의 흡광도 측정이 곤란하여 흡광도 대신에 배양조류로부터 엽록소를 추출하여 그 함량을 통해 생육정도를 분석하였다. 즉, 조류 배양액을 여과지(GF/F filter, 직경 47 mm)에 거른 다음 이를 에탄올 용매에 넣어 엽록소를 추출하고 분광광도계로 648.5, 664.6, 750 nm 파장에서 흡광도를 측정한 후 정량식을 통해 엽록소 a 함량을 구한 다음(Nusch, 1980, Arch. Hydrobiol. Beih. (Ergebn. Limnol.), 14:14-36; Shin & Im, 2000, J. Kor. Water Resources Association 33(2):145-157), 대조군에 대한 엽록소 함량 감소정도를 구하여 약제처리 효과를 나타내었다.
Figure 112010061871019-pat00004
그 결과, 상기 표 2 및 도 3에서 확인할 수 있듯이 아나카딕산(anacardic acids)에 대해 남조류는 녹조류보다 상대적으로 민감한 반응을 나타내었고, 아나카딕산(anacardic acids)의 남조류에 대한 50% 생육억제농도는 1.0 ug/mL 이하였고, 녹조류에 대한 50% 생육억제농도는 4.5 내지 9.8 ug/mL로서, 두 그룹간의 선택성이 비교적 뚜렷한 특징을 나타내었다. 따라서 유해조류가 많이 포함된 남조류를 선택적으로 방제에 특히 유용하게 활용될 수 있음을 확인할 수 있었다.
특히 남조류 종간의 활성 비교에 있어서는 Oscillatoria tenuis(Ot)가 가장 민감하였고(IC50=0.19 ug/mL) 다음은 Microcystis aeruginosa(Ma)였으며(IC50=0.38 ug/mL), Spirulina pratensis(Sp)가 가장 둔감(IC50=1.0 ug/mL)하였다. 한편 녹조류 종간의 활성비교의 경우 종간의 큰 차이가 없었지만 상대적으로 Chlorella vulgaris(Cv)가 민감한 경향(IC50=4.54 ug/mL)이었다.
상기의 결과로부터 우리나라에서 가장 문제시 되는 대표적인 유해조류인 Oscillatoria tenuis(Ot)와 Microcystis aeruginosa(Ma)의 두 남조류에 대한 우수한 방제효과를 확인할 수 있었고 이는 본원발명의 아나타딕산이 유해조류가 많이 포함된 남조류를 선택적으로 제어할 수 있음을 확인한 결과이기도 하다.
[ 실시예 4] 아나카딕산과의 혼합처리를 통해 효능이 상승되는 화합물 탐색
살조제는 수생태계에 처리되는 것이기 때문에 물 환경에 크게 영향을 미치지 않는 범위에서 목적하는 유해조류를 방제하여야 한다. 이를 위해서는 가능한한 살조제 투입량 자체가 낮을수록 바람직한데 화합물의 경우, 상호작용에 의해 상대적으로 생물방제에 있어서 상승작용을 가지는 조합들이 있을 수 있다. 이를 탐색하여 살조 후보물을 제조하는 것은 살조제의 경제적 생산, 환경보호 등의 측면에서 매우 의미가 있다.
따라서 본 발명의 아나카딕산(anacardic acids)과의 혼합처리를 통해 효능이 증진되는 화합물 조합을 탐색하고자 실험하였다. 지금까지 아나카딕산(anacardic acids)과 상승작용을 가진다는 화합물은 메티실린(methicillin)으로서 이들의 혼합처리는 메티실린-저항성 황색포도상구균(Staphylococcus aureus)의 방제에 효과가 있었다고 하였으며(Muroi 등. 2004. Bioorganic & Medicinal Chemistry 12:583-587) 미세조류에 대한 연구결과는 아직 전혀 보고되지 않았다.
(1) 공시화합물
Ana-acid(Anacardic acid 87% 함유)와 본 실험실에서 제조한 nanosilver(박 등. 2009. 한국육수학회지 42(1):75-84), 메나디온 소디움 바이설파이트(MSB: menadione sodium bisulphite, Aldrich, 95% 순도), 메나디온(menadione, Aldrich, 97% 순도), 크리소파놀(chrysophanol, Sigma, 99% 순도)를 구입하여 혼합처리 실험을 위해 사용하였다.
(2) 혼합처리 활성검정
상기 화합물들을 적정 농도 범위 내에서 단독 또는 여러 가지 농도비율의 혼합물로 조제한 후, 남조류 마이크로시스티스 아에루기노사(Microcystis aeruginosa UTEX2388)에 대한 생육억제활성을 조사하였다.
먼저, 배양액(Allen's medium)에 계대배양중인 남조류(한국생명공학연구원 생물자원센터에서 분양받은 Microcystis aeruginosa UTEX 2388)를 접종하였으며 이 때의 조류 초기농도는 microplate reader를 이용하여 670 nm에서 약 0.06의 흡광도가 되도록 하였다. 이를 100 ㎖의 배양병에 10 ㎖씩 분주한 후 아래와 같이 조제된 시험 용액 100 ㎕를 투여하였다. 시험 용액 조제의 경우, Tween 20™이 포함된 DMSO 또는 아세톤에 화합물을 용해시킨 후 동일 용매를 이용하여 여러 농도로 조제한 다음, 단독 또는 여러 가지 농도비율로 혼합처리 하였다. 이때, 배양액내의 DMSO, 아세톤 및 Tween 20의 최종 농도는 각각 1%, 0.5%, 0.5-2 ㎍/㎖이었다. 그 후 이들 시험 약제가 투여된 조류 배양액은 25℃, 14시간 광주기, 광도 40-60 μmolm-2s-1 조건에서 배양하였다. 시험 용액 처리 후 6일째에 microplate reader를 이용하여 670 nm에서의 흡광도를 측정한 후 사전에 설정해 둔 흡광도-건물중 상관식(Kim 등, Aquatic Botany 85: 1-6, 2006)을 통해 조류의 생장정도(건물중)를 조사하였으며 약제처리 효과는 대조군에 대한 건물중 억제정도(%)로 환산하여 나타내었다. 두 혼합물간의 상호작용은 콜비 방법(Colby S.R.. Weeds 15: 20-22, 1967)으로 평가하였다. 만일 혼합제 처리에 의해 나타난 실제의 방제가(실측치, observed value)가 기대치(expected value) 보다 클 경우는 상승작용, 같을 경우는 상가작용, 작을 경우는 길항작용을 나타내는 것이다.
Ana-acid(0.125 ~ 0.5 ㎍/㎖)＋MSB(0.1 ~ 0.4 ㎍/㎖) 혼합처리의 경우, 각 농도조합별로 얻어진 살조활성(실측치)은 하기 표 3에서와 같았다. 이를 콜비방법으로 계산하여 상호작용성을 나타낸 결과 도 4에서 보는 바와 같이 강한 상승작용이 관찰되었다. 특히 혼합처리의 각 농도 조합 중 마이크로시스티스 아에루기노사(Microcystis aeruginosa UTEX2388)에 대한 우수한 방제 상승작용을 나타내는 조합은 Ana-acid 0.125 ~ 0.2 ㎍/㎖＋MSB 0.1 ~ 0.2 ㎍/㎖, Ana-acid 0.25 ㎍/㎖＋MSB 0.15~0.3 ㎍/㎖ 인 것을 확인할 수 있었다.
한편 혼합물 약제처리농도를 고정시키고 두 약제의 혼합비율을 달리한 다른 실험에서는 혼합비율이(무게/무게) Ana 40%＋MSB 50%로부터 Ana 90%＋MSB 10% 범위일 때 보다 뚜렷한 상승작용을 나타내는 것 역시 확인할 수 있었다(데이타 미제시).
Figure 112010061871019-pat00005
Ana-acid(0.125 ~ 0.5 ㎍/㎖)＋Menadione(0.05 ~ 0.2 ㎍/㎖) 혼합처리의 경우, 각 농도조합별로 얻어진 살조활성(실측치)은 하기 표 4에서와 같았다. 이를 콜비방법으로 계산하여 상호작용성을 나타낸 결과 도 5에서 보는 바와 같이 강한 상승작용이 관찰되었다. 혼합처리의 각 농도 조합 중 마이크로시스티스 아에루기노사(Microcystis aeruginosa UTEX2388)에 대한 우수한 방제 상승작용을 나타내는 조합은 Ana-acid 0.125 ~ 0.25 ㎍/㎖＋Menadione 0.05 ~ 0.1 ㎍/㎖인 것을 확인할 수 있었다.
Figure 112010061871019-pat00006
Ana-acid(0.125 ~ 1.0 ㎍/㎖)＋nanosilver(0.015 ~ 0.06㎍/㎖) 혼합처리의 경우, 각 농도조합별로 얻어진 살조활성(실측치)은 하기 표 5에서와 같았다. 이를 콜비방법으로 계산하여 상호작용성을 나타낸 결과 도 6에서도 확인할 수 있듯이 농도조합에 따라 상가 또는 상승작용성을 확인할 수 있었다. 혼합처리의 각 농도 조합 중 마이크로시스티스 아에루기노사(Microcystis aeruginosa UTEX2388)에 대한 방제 상승작용을 나타내는 조합은 Ana-acid 0.25 ㎍/㎖＋nanosilver 0.015 ㎍/㎖, Ana-acid 0.5 ㎍/㎖＋nanosilver 0.015 ~ 0.03 ㎍/㎖인 것을 확인할 수 있었다.
Figure 112010061871019-pat00007
Ana-acid(0.125 ~ 0.5 ㎍/㎖) + Chrysophanol(0.05 ~ 0.6 ㎍/㎖) 혼합처리의 경우, 각 농도조합별로 얻어진 살조활성(실측치)은 하기 표 6에서와 같았다. 이를 콜비방법으로 계산하여 상호작용성을 나타낸 결과 도 7에서도 확인할 수 있듯이, 농도조합에 따라 길항 또는 상승작용이 보이지만 전체적으로 볼 때 상가적 작용을 나타내는 확인할 수 있었다. 혼합처리의 각 농도 조합 중 마이크로시스티스 아에루기노사(Microcystis aeruginosa UTEX2388)에 대한 방제 상승작용을 나타내는 조합은 Ana-acid 0.125 ㎍/㎖＋chrysophanol 0.2 ~ 0.3 ㎍/㎖, Ana 0.375 ㎍/㎖＋chrysophanol 0.2 ㎍/㎖인 것을 확인할 수 있었다.
Figure 112010061871019-pat00008
[ 실시예 5] 온실조건의 퇴적물 존재하에서의 화합물의 선택적 살조활성 조사
자연상태를 모사한 조건(온실조건의 퇴적물 존재)에서 Ana-acid, Ana-Na 또는 이들과의 혼합조성물의 활성이 얼마나 나타나며 선택적 살조활성이 과연 관찰되는지를 알아보기 위하여 간이실험을 수행하였다.
(1) 공시 화합물
- 실험 1: 시험약제와 처리농도는 Ana-Na 10, 20, 40 ㎍/㎖와 Ana-Na 10 ㎍/㎖＋MSB 5 ㎍/㎖ 이었다. Ana-Na는 상기 실시예 2에서 제조된 것을 사용하였다.
- 실험 2: 시험약제와 처리농도는 Ana-acid(87% 순도) 5 ㎍/㎖와 Ana-acid 5 ㎍/㎖＋nanosilver 0.1 ㎍/㎖ 이었다.
- 실험 3: 시험약제와 처리농도는 Ana-Na 10 ㎍/㎖와 Ana-Na 5, 10 ㎍/㎖＋nanosilver 0.1 ㎍/㎖ 이었다. Ana-Na는 상기 실시예 2에서 제조된 것을 사용하였다.
(2) 혼합처리 활성검정
유리재질의 5 L 수조에 대청호 상류 지역(충북 옥천군 추소리)에서 수집된 퇴적물 0.2 L(약 350g)를 넣고 사전에 2일 이상 탈기시킨 수돗물을 채워 최종 4 L가 되도록 하였다. 부유된 흙탕물이 어느 정도 가라앉을 때까지 실내 약광조건에 두었다가 온실의 가열베드 위로 옮겼다. 수조의 수온은 밤 20℃/낮 30℃ 내외였다. 온실로 옮긴 후 3일째 수조 한개 당 Allen's medium 40 mL, 영양염 stock 4 mL, 대청댐 상류에서 채취한 조류 농축액 0.5 mL(Microcystis aeruginosa가 우점하여 존재)를 첨가한 후 시험약제를 처리하였다.
시험약제는 모두 수용성이었기 때문에 1,000배액으로 조제한 다음 수조 당 4 mL 처리하였다. 약제처리 후 3일째에 다시 영양염 stock 4 mL를 추가하였다. 영양염 stock 조제는 0.5 L 증류수에 NaNO3 75 g과 K2HPO4 1.95 g을 넣어서 제조하였다.
시험약제처리 후 일정기간마다 20 mL 배양용액을 취하여 GF/F에 여과한 다음, 여과지에 남은 조류세포를 대상으로 엽록소 함량 분석을 통해 조류발생 및 생장정도를 조사하였다. 즉, 여과를 통해 모아진 조류를 5 mL 에탄올에 넣고 60℃에 20분 동안 두어 엽록소를 추출, 실온/암조건에 하룻밤동안 둔 다음, 분광광도계(Beckman Coulter DU 800 spectrophotometer)로 648.5, 664.6, 750 nm 파장에서 흡광도를 측정한 후, 정량식을 통해 엽록소 a 함량을 구한 다음(Nusch, 1980, Arch. Hydrobiol. Beih. (Ergebn. Limnol.), 14:14-36; Shin & Im, 2000, J. Kor. Water Resources Association 33(2):145-157), 대조군에 대한 엽록소 함량 감소정도를 구하여 약제처리 효과를 나타내었다. 필요한 경우 배양액의 육안조사 또는 현미경 관찰을 통해 발생 조류의 종류를 분석하였다.
실험 1에 대한 결과로, 하기 표 7 및 표 8에서도 확인할 수 있듯이 Ana-Na 단독처리는 처리 초기(처리 후 6일)까지는 높은 억제활성이 나타났지만 그 이후는 살조효과가 신속히 경감되는 것으로 보아 분해가 빠르게 진행되는 것을 확인할 수 있었다. 그러나 약제효과는 처리 후 12일째까지도 약 50% 내외는 유지하였다. 이 때 유해 남조류 마이크로시스티스 아에루기노사(Microcystis aeruginosa) 발생의 경우 10 ㎍/㎖ 처리구에서는 73.3% 억제되었지만 20㎍/㎖ 이상 처리의 경우에는 96% 이상 억제되어 실내실험에서와 같이 선택적 방제효과가 있음을 확인할 수 있었다.
한편, Ana-Na+MSB(10+5 ㎍/㎖) 처리구에서는 Ana-Na 단독으로 40 u㎍/㎖ 처리했을 때보다 전반적으로 높은 살조활성을 나타내었으며, 처리 후 6일까지 전체 엽록소 함량이 낮아 양호한 방제활성을 보이는 것을 확인할 수 있었으며, 유해 남조류 마이크로시스티스 아에루기노사(Microcystis aeruginosa) 발생의 경우도 처리 후 12일째에서 96.3%의 억제효과를 유지하는 것을 확인할 수 있었다.
Figure 112010061871019-pat00009
Figure 112010061871019-pat00010
실험 2에 대한 결과로, 하기 표 9 및 표 10에서도 확인할 수 있듯이 Ana-acid 단독처리는 처리 초기(처리 후 6일)까지는 높은 억제활성이 나타났지만 그 이후는 살조효과가 신속히 경감되어 처리 후 12일째에서는 무처리구와 비슷한 엽록소 함량을 나타내는 것을 확인할 수 있었다. 이 때 유해 남조류 마이크로시스티스 아에루기노사(Microcystis aeruginosa)는 처리 후 14일까지 전혀 발생되지 않아 실내실험에서와 같이 선택적 방제효과를 확인할 수 있었다.
한편, Ana-acid＋nanosilver(5＋0.1 ㎍/㎖) 처리구에서는 Ana-acid 단독으로 처리했을 때보다 살조활성이 오래 지속되어 처리 후 6일째에 67.6%의 억제활성을 보이는 것을 확인할 수 있었고, 유해 남조류 마이크로시스티스 아에루기노사(Microcystis aeruginosa) 발생의 경우 처리 후 14일째에서 100%의 억제효과를 유지하는 것을 확인할 수 있었다.
Figure 112010061871019-pat00011
Figure 112010061871019-pat00012
실험 3에 대한 결과로, 하기 표 11에서도 확인할 수 있듯이 Ana-Na 10 ㎍/㎖ 단독처리는 처리 초기에는 높은 억제활성이 나타났지만 그 이후는 살조효과가 신속히 경감되어 처리 후 12일째에서는 11.8%의 생육억제효과를 나타내는 것을 확인할 수 있었다.
한편, Ana-Na＋nanosilver 혼합처리구에서는 Ana-Na 단독으로 처리했을 때 보다 살조활성이 높고 오랫동안 지속되는 것을 확인할 수 있었으며, Ana-Na 5 ㎍/㎖＋nanosilver 0.1 ㎍/㎖ 혼합처리와 Ana-Na 10 ㎍/㎖＋nanosilver 0.1 ㎍/㎖ 혼합처리는 처리 후 12일째에 각각 77.2, 88.5%의 생육억제활성을 유지하는 것을 확인할 수 있었다.
Figure 112010061871019-pat00013
본 혼합물을 대상으로 생태환경 안전성을 추측하기 위하여 송사리에 대한 간이독성실험을 실시한 결과, 나노실버 물질 0.1 ㎍/㎖에 Ana-Na 2.5, 5, 10 ㎍/㎖를 각각 조합하여 처리했을 때 모든 처리구에서 3일 후까지 100%의 생존율을 나타냈으며, 4일째에서는 Nanosilver＋Ana-Na가 0.1＋10 ㎍/㎖으로 처리된 경우만 75% 생존율을 보였고 기타 처리구는 100%의 생존율을 나타내었다(데이타 미제시).
상기의 결과로부터 본 발명의 아나카딕산(anacardic acids)을 포함하는 혼합물은 유해조류 특히 마이크로시스티스(Microcystis)속 및 오실라토리아(Oscillatoria)속 남조류가 발생하는 현장의 환경친화적인 살조용 신물질로서 아주 효과적임을 확인할 수 있었다.

Claims (7)

  1. 유효성분으로 아나카딕산(anacardic acids), 아나카딕산을 50% 이상 포함하는 천연물 및 아나카딕산 염화물로부터 선택되는 한 종 이상을 함유하는, 유해 조류 방제용 조성물.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 조성물은 메나디온(menadione), 메나디온 소디움 바이설파이트(menadione sodium bisulphite), 나노실버, 크리소파놀(chrysophanol)로부터 선택된 첨가물을 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 유해 조류 방제용 조성물.
  3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서,
    상기 조성물은 아나카딕산(anacardic acids), 아나카딕산을 50% 이상 포함하는 천연물 및 아나카딕산 염화물로부터 선택된 화합물(A군); 및
    메나디온(menadione), 메나디온 소디움 바이설파이트(menadione sodium bisulphite), 나노실버, 크리소파놀(chrysophanol)로부터 선택된 첨가물(B군)의 혼합비율은 A군: B군 무게비율이 0.5 내지 99.5% : 99.5 내지 0.5%인 것을 특징으로 하는, 유해 조류 방제용 조성물.
  4. 제 1항 또는 제 2항에 있어서,
    상기 아나카딕산 염화물은 아나카딕산과 메탄올 또는 에탄올의 저급 알코올의 혼합물에 염기성 수용액을 첨가하여 제조되는 것을 특징으로 하는, 유해 조류 방제용 조성물.
  5. 제 1항 또는 제 2항에 있어서,
    상기 유해 조류는 마이크로시스티스(Microcystis), 아나베나(Anabaena), 오실라토리아(Oscillatoria), 스피룰리나( Spirulina ), 아파니조메논(Aphanizomenon), 노듈라리아(Nodularia), 코클로디늄(Cochlodinium), 스테파노디스커스(Stephanodiscus), 클로렐라(Chlorella), 클라미도모나스(Chlamydomonas), 세네데스무스(Scenedesmus) 및 보트리오코쿠스(Botryococcus) 속의 조류로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 유해 조류 방제용 조성물.
  6. 제 1항 또는 제 2항의 유해조류 방제용 조성물을 마이크로시스티스(Microcystis), 아나베나(Anabaena), 오실라토리아(Oscillatoria), 스피룰리나(Spirulina), 아파니조메논(Aphanizomenon), 노듈라리아(Nodularia), 코클로디늄(Cochlodinium), 스테파노디스커스(Stephanodiscus), 클로렐라(Chlorella), 클라미도모나스(Chlamydomonas), 세네데스무스(Scenedesmus) 및 보트리오코쿠스(Botryococcus) 속의 조류가 서식하는 수중 또는 토양에 처리하는 것을 특징으로 하는, 유해 조류의 방제방법.
  7. 제 6항에 있어서,
    상기 유해조류 방제용 조성물을 유효성분 기준으로 수중 또는 토양 내에 0.01 ㎍/㎖ 내지 200 ㎍/㎖가 되도록 처리하는 것을 특징으로 하는, 유해 조류 방제 방법.
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