KR101267580B1 - Transglutaminase2 as a marker for diagnosis of renal cell carcinoma and use thereof for diagnosis of renal cell carcinoma - Google Patents

Transglutaminase2 as a marker for diagnosis of renal cell carcinoma and use thereof for diagnosis of renal cell carcinoma Download PDF

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Abstract

본 발명은 신장암의 바이오 마커로서 TGase2(Transglutaminase 2) 및 VHL(Von Hippel-Lindau)에 관한 것으로, 보다 구체적으로 TGase2 및 VHL 중 하나 이상의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 신장암 진단용 조성물 및 상기 조성물을 포함하는 신장암 진단용 키트에 관한 것이다. 또힌 본 발명은 신장암 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 신장암이 의심되는 환자의 시료로부터 TGase2 및 VHL 중 하나 이상의 발현 수준을 측정하는 단계; 및 상기 TGase2 및 VHL 중 하나 이상의 발현 수준을 정상 대조구 시료의 TGase2 및 VHL 중 하나 이상의 발현 수준과 비교하는 단계를 포함하는 신장암 마커 TGase2 및 VHL 중 하나 이상을 검출하는 방법에 관한 것이다.The present invention relates to TGase2 (Transglutaminase 2) and VHL (Von Hippel-Lindau) as a biomarker of renal cancer, and more particularly to a composition for diagnosing renal cancer comprising an agent measuring the expression level of one or more of TGase2 and VHL. It relates to a kit for diagnosing kidney cancer comprising the composition. In another aspect, the present invention comprises the steps of measuring the expression level of one or more of TGase2 and VHL from a sample of a patient suspected of renal cancer to provide information necessary for diagnosing kidney cancer; And comparing the expression level of one or more of TGase2 and VHL with the expression level of one or more of TGase2 and VHL of a normal control sample.

Description

신장암 진단 마커로서의 트란스글루타미나제2 및 이를 이용한 신장암 진단 용도 {Transglutaminase2 as a marker for diagnosis of renal cell carcinoma and use thereof for diagnosis of renal cell carcinoma}Transglutaminase2 as a marker for diagnosis of renal cell carcinoma and use about for diagnosis of renal cell carcinoma}

본 발명은 신장암의 바이오 마커로서 TGase2(Transglutaminase 2) 및 VHL(Von Hippel-Lindau)에 관한 것으로, 보다 구체적으로 TGase2 및 VHL 중 하나 이상의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 신장암 진단용 조성물 및 상기 조성물을 포함하는 신장암 진단용 키트에 관한 것이다. 또힌 본 발명은 신장암 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 신장암이 의심되는 환자의 시료로부터 TGase2 및 VHL 중 하나 이상의 발현 수준을 측정하는 단계; 및 상기 TGase2 및 VHL 중 하나 이상의 발현 수준을 정상 대조구 시료의 TGase2 및 VHL 중 하나 이상의 발현 수준과 비교하는 단계를 포함하는 신장암 마커 TGase2 및 VHL 중 하나 이상을 검출하는 방법에 관한 것이다.
The present invention relates to TGase2 (Transglutaminase 2) and VHL (Von Hippel-Lindau) as a biomarker of renal cancer, and more particularly to a composition for diagnosing renal cancer comprising an agent measuring the expression level of one or more of TGase2 and VHL. It relates to a kit for diagnosing kidney cancer comprising the composition. In another aspect, the present invention comprises the steps of measuring the expression level of one or more of TGase2 and VHL from a sample of a patient suspected of renal cancer to provide information necessary for diagnosing kidney cancer; And comparing the expression level of one or more of TGase2 and VHL with the expression level of one or more of TGase2 and VHL of a normal control sample.

신장암은 대부분 신장의 실질(신장에서 소변을 만드는 세포들이 모여 있는 부분으로 수질과 피질로 구성됨)에서 발생하는 신장세포 암을 말한다. Kidney cancer is a renal cell carcinoma that occurs mostly in the parenchyma of the kidneys (the part of the kidney where the cells that make urine are composed of the medulla and the cortex).

신장암은 종양의 크기가 작을 때는 증상이 거의 없으며, 종양이 어느 정도 커져서 장기를 밀어낼 정도가 되어야 비로소 증상이 나타난다. 따라서 진단이 늦어지는 경우가 많아 처음 진단될 때 환자의 30% 정도는 이미 전이된 상태로 나타나게 된다. 가장 흔한 증상은 혈뇨(hematuria)이지만 이것도 환자의 60%에서만 나타난다. 오히려 전이된 부위에 따라 호흡곤란, 기침, 두통 등의 증상이 나타나 이러한 전이 증상 때문에 신장암을 진단하게 되는 경우도 전체 환자의 30%에 이른다. 신장암은 특별히 암세포가 생산하는 특정 호르몬 때문에 고혈압, 고칼슘혈증, 간기능 이상 등을 일으킬 수 있기 때문에 이런 다른 증상을 검사하던 중 종양이 발견되는 경우도 있다. 그러나 최근에는 아무 증상 없이 건강진단을 받던 중 우연히 영상검사상에서 발견되는 경우가 많은데, 이런 경우는 주로 초기에 발견되기 때문에 치료 결과가 비교적 좋다. Kidney cancer has little symptoms when the size of the tumor is small, and it only occurs when the tumor grows to some extent and pushes out the organ. Therefore, the diagnosis is often delayed, so when the first diagnosis, about 30% of the patients are already metastasized. The most common symptom is hematuria, but this only occurs in 60% of patients. Rather, depending on the site of the transition, symptoms such as dyspnea, cough, headache, and so on, the diagnosis of kidney cancer due to such metastases in 30% of the total patients. Kidney cancers can cause high blood pressure, hypercalcemia, and liver dysfunction, especially due to certain hormones produced by cancer cells. In recent years, however, many patients have been diagnosed without any symptoms and accidentally found on imaging tests. These cases are mainly found early, so the treatment results are relatively good.

신장암은 미국에서는 성인암의 약 3%를 차지하여, 연간 약 32,000명 정도의 새로운 환자가 발생하고 있다. 또한 약 12,000명 정도가 신장암으로 인해 사망하는 것으로 추정되고 있으며 전 세계적으로 매년 그 발생빈도가 증가하고 있다. Kidney cancer accounts for about 3% of adult cancers in the United States, with approximately 32,000 new cases per year. It is estimated that about 12,000 people die from kidney cancer, and the frequency is increasing every year worldwide.

우리나라에서는 이보다는 발생 빈도가 낮아 2002년 중앙암등록 자료에 따르면 1,578명의 환자가 새로 등록되어 전체 암 발생의 1.6%를 차지하고 있다. 특히 남성이 여성에 비해 2배 정도 많이 발생하는데, 2002년의 경우 남성에게서 1,104명의 환자가 발생하여 남성암의 장기별 등록분율 2.0%를 나타내며, 발생빈도에 있어서 열번째로 많이 발생하는 암으로 기록되어 있다.In Korea, the incidence of incidence is lower. According to the 2002 Central Cancer Registry, 1,578 patients were newly registered, accounting for 1.6% of all cancers. In particular, men are twice as likely as women, and in 2002, 1,104 patients occurred in men, representing 2.0% of men's cancers by organ, and recorded as the 10th most common cancer. It is.

신장암은 40대~60대에서 흔히 발생하여, 연령별 발생현황(2002년 중앙암등록자료)을 보면 60대가 가장 흔하며(479명, 30.2%), 50대(412명, 26.0%), 40대(268명, 16.9%)의 순으로 많이 발생한다.Kidney cancer is common in people in their 40's and 60's, and according to the age-specific incidence (2002 Central Cancer Registration Data), 60's are the most common (479, 30.2%), 50's (412, 26.0%), 40's. (268 people, 16.9%).

따라서 신장암의 조기 진단을 위한 마커의 개발은 중요한 과제라고 할 수 있다.Therefore, the development of a marker for early diagnosis of kidney cancer can be said to be an important task.

이러한 배경하에서 본 발명자들은 신장암에서 TGase2 가 과발현되며, 과발현된 TGase2가 VHL의 중합체 형성을 매개함으로써 VHL을 하향조절한다는 것을 발견하였다. 이로써 신장암 세포 및 조직에서 TGase2와 VHL의 발현 수준을 확인하여 신장암 진단에 유용하게 적용할 수 있음을 알아내어 본 발명을 완성하였다.
Against this background, the inventors found that TGase2 is overexpressed in kidney cancer and that overexpressed TGase2 downregulates VHL by mediating the polymer formation of VHL. As a result, the expression level of TGase2 and VHL was confirmed in renal cancer cells and tissues, and thus, the present invention was found to be useful for diagnosing renal cancer.

본 발명의 하나의 목적은 TGase2 및 VHL 중 하나 이상의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 신장암 진단용 조성물을 제공하는 것이다.One object of the present invention is to provide a composition for diagnosing kidney cancer comprising an agent for measuring the expression level of one or more of TGase2 and VHL.

본 발명의 다른 하나의 목적은 상기 조성물을 포함하는 신장암 진단용 키트를 제공하는 것이다.Another object of the present invention to provide a kit for diagnosing kidney cancer comprising the composition.

본 발명의 또 다른 하나의 목적은 신장암 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 신장암이 의심되는 환자의 시료로부터 TGase2 및 VHL 중 하나 이상의 발현 수준을 측정하는 단계; 및 상기 TGase2 및 VHL 중 하나 이상의 발현 수준을 정상 대조구 시료의 TGase2 및 VHL 중 하나 이상의 발현 수준과 비교하는 단계를 포함하는 신장암 마커 TGase2 및 VHL 중 하나 이상을 검출하는 방법을 제공하는 것이다.
Another object of the present invention is to measure the expression level of one or more of TGase2 and VHL from a sample of a suspected kidney cancer to provide information necessary for diagnosing kidney cancer; And comparing the expression level of one or more of TGase2 and VHL with the expression level of one or more of TGase2 and VHL of a normal control sample.

상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 TGase2 및 VHL 중 하나 이상의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 신장암 진단용 조성물에 관한 것이다.
As one embodiment for achieving the above object, the present invention relates to a composition for diagnosing kidney cancer comprising an agent for measuring the expression level of one or more of TGase2 and VHL.

본 발명에서 용어, "TGase2"는 트란스글루타미나제 2 (E.C. 2.3.2.13, protein-glutamine γrglutamyltransferase; Transglutaminase 2; TGase2)로 라이신과 글루타민 사이에서 Nε-(γ-L-glutamyl)-L-lysine 아이소펩타이드 결합 형성을 촉진하는 Ca2 + 의존성 효소를 말한다. Nε-(γ-L-glutamyl)-L-lysine 교차결합은 상피세포에서의 방어벽 기능, 세포 소멸, 세포외기질을 형성하며 세포 내 및 세포 외에 존재하는 단백질을 안정화시키는 것으로 알려져 있다. TGase2는 다양한 조직에서 정상적으로 낮은 수치로 발현되며 여러 가지 병리적인 상태에서 비정상적으로 활성화된다. 특히, TGase2 발현 수준은 염증질환에서 증가하는 것으로 알려졌다.
As used herein, the term "TGase2" refers to transglutaminase 2 (EC 2.3.2.13, protein-glutamine γrglutamyltransferase; Transglutaminase 2; TGase2), and the Nε- (γ-L-glutamyl) -L-lysine between lysine and glutamine. iso refers to Ca + 2 dependent enzymes to promote peptide bond formation. Nε- (γ-L-glutamyl) -L-lysine crosslinks are known to form protective barrier function, cell death, extracellular matrix in stabilizing epithelial cells and to stabilize proteins present in and outside of cells. TGase2 is normally expressed at low levels in various tissues and is abnormally activated in various pathological conditions. In particular, TGase2 expression levels are known to increase in inflammatory diseases.

본 발명에서 용어, "VHL(von Hippel-Lindau)"는 암 억제 단백질로 유비퀴틴-리가제 복합체의 일부이며, 폴리-유비퀴틴화 및 단백질 분해(proteosomal degradation)를 통해 HIF-1α를 하향조절한다. 또한 VHL은 p53의 전사활성을 통하여 세포사멸을 증대하고, 세포 주기를 억제함으로써, 암억제자로서의 기능을 수행한다. 또한, 신장암 세포에서 VHL은 c-FLIP, 서바빈, c-IAP-1, c-IAP-2와 같은 nf-κB 타겟 항-세포사멸 유전자를 억제함으로써 NF-κB를 하향조절한다. 또한, 본 발명에서는 TGase2가 VHL을 하향조절한다는 것을 최초로 규명하였다.
As used herein, the term "von Hippel-Lindau" (VHL) is a cancer suppressor protein that is part of the ubiquitin-ligase complex and downregulates HIF-1α through poly-ubiquitination and proteosomal degradation. In addition, VHL enhances apoptosis through the transcriptional activity of p53 and inhibits the cell cycle, thus functioning as a cancer suppressor. In renal cancer cells, VHL also downregulates NF-κB by inhibiting nf-κB targeted anti-apoptotic genes such as c-FLIP, subvavin, c-IAP-1, c-IAP-2. In the present invention, it was first identified that TGase2 downregulates VHL.

본 발명의 용어, "TGase2의 발현 수준을 측정하는 제제"는 신장암을 진단하기 위하여 생물학적 시료에서의 TGase2 유전자의 발현을 직접 또는 간접적으로 측정하여 발현 정도를 확인하는 제제로, TGase2 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 프라이머, 프로브 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 포함하는 조성물일 수 있다. 또한, 상기 제제는 TGase2 단백질에 특이적으로 결합하는 항체일 수 있다.
As used herein, the term "agent for measuring the expression level of TGase2" refers to an agent that directly or indirectly measures the expression of the TGase2 gene in a biological sample to diagnose kidney cancer. It may be a composition comprising a primer, a probe or an antisense oligonucleotide capable of binding to. In addition, the agent may be an antibody that specifically binds to TGase2 protein.

본 발명의 용어, "VHL의 발현 수준을 측정하는 제제"는 신장암을 진단하기 위하여 생물학적 시료에서의 VHL 단백질의 발현을 직접 또는 간접적으로 측정하여 발현 정도를 확인하는 제제로, 바람직하게는 VHL에 특이적으로 결합하는 항체이다. 상기 항체는 VHL 단백질의 발현 정도 또는 VHL 단백질 중합체의 발현 정도를 검출 할 수 있다.
As used herein, the term "agent for measuring the expression level of VHL" is an agent for determining the expression level by directly or indirectly measuring the expression of VHL protein in a biological sample in order to diagnose kidney cancer. It is an antibody that binds specifically. The antibody can detect the expression level of the VHL protein or the expression level of the VHL protein polymer.

본 발명의 용어, "프라이머"는 일반적으로 15개에서 30개의 염기로 구성된 단일 사슬의 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)이다. 프라이머는 보통 합성하지만 자연적으로 생성된 폴리뉴클레오티드(polynucletide)에서 이용할 수도 있다. 프라이머의 서열은 반드시 주형의 서열과 정확히 같을 필요는 없으며, 충분히 상보적이어서 주형과 혼성화될 수 있으면 된다. 프라이머의 위치 혹은 프라이머 결합부위는 프라이머가 혼성화하는 표적 DNA 절편을 말한다. 바람직하게 본 발명의 증폭단계에서 사용되는 프라이머는 TGase2 유전자에 대한 프라이머로서, 공지된 방법에 의해 당업자가 용이하게 디자인할 수 있다.
As used herein, the term "primer" is a single chain oligonucleotide, generally consisting of 15 to 30 bases. Primers are commonly synthesized but can also be used on naturally occurring polynucletide. The sequence of the primer does not necessarily have to be exactly the same as the sequence of the template, but only if it is sufficiently complementary to hybridize with the template. The position or primer binding site of the primer refers to the target DNA fragment to which the primer hybridizes. Preferably the primer used in the amplification step of the present invention is a primer for the TGase2 gene, can be easily designed by those skilled in the art by a known method.

본 발명에서 용어, "프로브"란 mRNA와 특이적 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하며 표지(Labelling)되어 있어서 특정 mRNA의 존재 유무를 확인 할 수 있다. 프로브는 올리고 뉴클레오티드 프로브, 단쇄 DNA(single stranded DNA) 프로브, 이중쇄 DNA(double stranded DNA) 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다. 본 발명에서는 본 발명의 마커 폴리뉴클레오티드와 상보적인 프로브를 이용하여 혼성화를 실시하여, 혼성화 여부를 통해 신장암을 진단할 수 있다. 적당한 프로브의 선택 및 혼성화 조건은 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다.
As used herein, the term "probe" refers to a nucleic acid fragment such as RNA or DNA, which is short to several bases to hundreds of bases, which is capable of specific binding with mRNA. You can check the presence. Probes may be made in the form of oligonucleotide probes, single stranded DNA probes, double stranded DNA probes, RNA probes, and the like. In the present invention, hybridization may be performed using a probe complementary to the marker polynucleotide of the present invention to diagnose kidney cancer through hybridization. Selection of suitable probes and hybridization conditions can be modified based on what is known in the art.

본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드, 프라이머 또는 프로브는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 비-제한적인 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오티드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오티드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다.
Antisense oligonucleotides, primers or probes of the invention can be chemically synthesized using phosphoramidite solid support methods, or other well known methods. Such nucleic acid sequences may also be modified using many means known in the art. Non-limiting examples of such modifications include methylation, capping, substitution with one or more homologs of natural nucleotides, and modifications between nucleotides, eg, uncharged linkages such as methyl phosphonate, phosphoester, phosphoro Amidate, carbamate, and the like) or charged linkers (eg, phosphorothioate, phosphorodithioate, etc.).

본 발명에서 용어, "항체"란 당해 분야에서 공지된 용어로서 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 발명의 목적상, 항체는 본 발명의 마커에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 본 발명의 항체의 형태는 특별히 제한되지 않으며 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체 또는 항원 결합성을 갖는 것이면 그것의 일부도 본 발명의 항체에 포함되고 모든 면역 글로불린 항체가 포함된다. 나아가, 본 발명의 항체에는 인간화 항체 등의 특수항체도 포함된다. 본 발명에 사용되는 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태 뿐만 아니라 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며 Fab, F(ab'), F(ab') 2 및 Fv 등이 있다.As used herein, the term "antibody" refers to a specific protein molecule directed to an antigenic site as it is known in the art. For the purposes of the present invention, an antibody means an antibody that specifically binds to a marker of the present invention, and the form of the antibody of the present invention is not particularly limited and has a polyclonal antibody, a monoclonal antibody or an antigen binding property. If part of it is included in the antibody of the present invention and all immunoglobulin antibodies are included. Furthermore, the antibodies of the present invention include special antibodies such as humanized antibodies. Antibodies used in the present invention include functional fragments of antibody molecules as well as complete forms with two full-length light chains and two full-length heavy chains. The functional fragment of an antibody molecule means the fragment which has at least antigen binding function, and includes Fab, F (ab '), F (ab') 2, and Fv.

이를 위한 분석 방법으로는 웨스턴블랏(western blotting), ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석법(Radioimmunoassay), 방사면역 확산법(Radioimmunodiffusion), 오우크레로니(Ouchterlony) 면역 확산법, 로케트(Rocket) 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역 침전분석법(immunoprecipitation assay), 보체 고정 분석법(complete fixation assay), FACS, 단백질 칩(protein chip) 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
Western blotting, ELISA (enzyme linked immunosorbent assay), radioimmunoassay, radioimmunodiffusion, Ouchterlony immunodiffusion, and Rocket immunoelectrolysis Yeongdong, tissue immunostaining, immunoprecipitation assay (immunoprecipitation assay), complement fixation assay (complete fixation assay), FACS, protein chip (protein chip) and the like, but are not limited thereto.

본 발명의 구체적인 실시예에서는 면역조직화학 염색법에 의하여 정상 신장 조직과 신장암 조직에서 TGase2 및VHL의 발현을 확인해 본 결과 신장암 조직에서 TGase2의 발현이 증가되어 있으며 역으로 VHL의 발현이 감소되어 있음을 확인하였으며(도 5), 정상 신장 세포 및 다양한 신장암 세포주에서 웨스턴 블랏을 실시한 결과 정상 신장 세포와는 달리 신장암 세포에서는 모두 TGase2 가 증가하고 VHL 이 감소한 것을 확인하였다 (도 12). 또한 TGase2가 VHL간의 교차 결합을 매개하여, VHL 단백질의 단량체를 감소시키고 VHL 단백질의 중합체를 형성시킴을 확인하였다(도 2). 따라서 TGase2의 발현정도 또는 VHL 단백질의 발현 정도를 측정함으로써 신장암 진단에 활용할 수 있음을 알 수 있다.
In a specific embodiment of the present invention, as a result of confirming the expression of TGase2 and VHL in normal kidney tissue and kidney cancer tissue by immunohistochemical staining, the expression of TGase2 is increased in the kidney cancer tissue and vice versa. As shown in FIG. 5, Western blot was performed in normal kidney cells and various kidney cancer cell lines, and unlike normal kidney cells, TGase2 was increased and VHL was decreased in all kidney cancer cells (FIG. 12). It was also confirmed that TGase2 mediates cross-linking between VHL, reducing monomer of VHL protein and forming polymer of VHL protein (FIG. 2). Therefore, it can be seen that by measuring the expression level of TGase2 or the expression level of the VHL protein can be utilized in the diagnosis of renal cancer.

또 하나의 양태로서 본 발명은 TGase2 및 VHL 중 하나 이상의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 신장암 진단용 키트에 관한 것이다.As another aspect, the present invention relates to a kit for diagnosing kidney cancer comprising an agent for measuring the expression level of at least one of TGase2 and VHL.

본 발명의 키트는 TGase2 유전자의 mRNA 발현 수준 또는 단백질의 발현 수준을 확인하거나, VHL 단백질의 발현 수준을 확인하여 신장암을 진단할 수 있다. 본 발명의 신장암 진단용 키트는 신장암 진단에 특이적으로 발현되는 TGase2의 발현수준을 측정하기 위한 프라이머, 프로브, 또는 선택적으로 마커를 인지하는 항체뿐만 아니라 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성성분 조성물, 용액 또는 장치가 포함될 수 있다. 또한 VHL 단백질의 발현 수준을 측정하기 위한 항체, 조성물, 용액 또는 장치가 추가적으로 포함된 키트일 수 있다. The kit of the present invention can confirm the expression level of the mRNA expression level or protein of the TGase2 gene, or diagnose the kidney cancer by confirming the expression level of the VHL protein. The kit for diagnosing kidney cancer of the present invention is a primer, a probe, or an antibody that selectively recognizes a marker for measuring the expression level of TGase2 specifically expressed in renal cancer diagnosis, as well as one or more other components suitable for analytical methods. Component compositions, solutions or devices may be included. In addition, the kit may further include an antibody, composition, solution or device for measuring the expression level of the VHL protein.

구체적인 일례로서, 본 발명에서 상기 TGase2 유전자의 mRNA 발현 수준을 측정하기 위한 키트는 RT-PCR을 수행하기 위해 필수한 요소를 포함하는 키트일 수 있다. RT-PCR 키트는 상기 유전자에 대한 특이적인 각각의 프라이머 쌍 외에도 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액, 데옥시뉴클레오디트(dNTPs), Taq-중합효소 및 역전사효소와 같은 효소, DNase, RNase 억제제, DEPC-물(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다. As a specific example, the kit for measuring the mRNA expression level of the TGase2 gene in the present invention may be a kit containing the essential elements for performing RT-PCR. RT-PCR kits include test tubes or other appropriate containers, reaction buffers, enzymes such as deoxynucleotides (dNTPs), Taq-polymerases and reverse transcriptases, DNase, RNase inhibitors, in addition to each primer pair specific for the gene. , DEPC-water, sterile water, and the like.

또한, 본 발명의 키트는 마이크로어레이 칩을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 신장암 특이적 유전자 진단 검출용 키트일 수 있다. 마이크로어레이 칩 키트는, 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA가 프로브로 부착되어 있는 기판을 포함하고 기판은 정량 대조구 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA를 포함할 수 있다. 보다 구체적으로, 본 발명의 마이크로어레이 칩은 에서 선택된 10개 이상의 유전자 또는 그 단편에 해당하는 올리고뉴클레오티드 또는 그의 상보가닥 분자가 집적된, 신장암 진단용 DNA 마이크로어레이 칩을 포함하는 신장암 진단용 키트일 수 있다. 상기 올리고 뉴클레오티드 또는 이의 상보가닥 분자는 상기 유전자의 18 내지 30개의 핵산을 포함하고, 바람직하게는 20 내지 25개의 핵산을 포함할 수 있다. 본 발명의 마이크로어레이 칩은 본 발명의 신장암 특이적 발현 유전자를 이용하여 당업계에서 통상적으로 사용되는 제조 방법에 의하여 용이하게 제조될 수 있다. 마이크로어레이 칩을 제작하기 위해서, 상기 탐색된 표지 유전자를 탐침 DNA 분자로 이용하여 DNA 칩의 기판상에 고정화시키기 위해 파이조일렉트릭(piezoelectric) 방식을 이용한 마이크로피펫팅(micropipetting)법 또는 핀(pin) 형태의 스폿터(spotter)를 이용한 방법 등을 사용하는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 마이크로어레이 칩의 기판은 아미노-실란(amino-silane), 폴리-L-라이신(poly-Llysine) 및 알데히드(aldehyde)로 이루어진 군에서 선택되는 활성기가 코팅된 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 상기 기판은 슬라이드 글래스, 플라스틱, 금속, 실리콘, 나일론 막 및 니트로셀룰로스막(nitrocellulose membrane)으로 이루어진 군에서 선택되는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다. In addition, the kit of the present invention may be a kit for detecting a kidney cancer specific gene diagnosis including essential elements necessary for performing a microarray chip. The microarray chip kit may include a substrate to which a cDNA corresponding to a gene or a fragment thereof is attached with a probe, and the substrate may include a cDNA corresponding to a quantitative control gene or a fragment thereof. More specifically, the microarray chip of the present invention may be a kit for diagnosing kidney cancer comprising a DNA microarray chip for diagnosing kidney cancer, in which an oligonucleotide or a complementary strand molecule corresponding to 10 or more genes or fragments thereof selected from is integrated. have. The oligonucleotide or complementary strand molecule thereof may comprise 18 to 30 nucleic acids of the gene, preferably 20 to 25 nucleic acids. The microarray chip of the present invention can be easily produced by a manufacturing method commonly used in the art using the kidney cancer specific expression gene of the present invention. In order to fabricate a microarray chip, a micropipetting method or a pin using a piezoelectric method is used to immobilize the detected marker gene as a probe DNA molecule on a substrate of a DNA chip. It is preferable to use a method using a spotter of the form, but is not limited thereto. The substrate of the microarray chip is preferably coated with an active group selected from the group consisting of amino-silane, poly-L-lysine, and aldehyde, but is not limited thereto. . In addition, the substrate is preferably selected from the group consisting of slide glass, plastic, metal, silicon, nylon film, and nitrocellulose membrane, but is not limited thereto.

또한, 본 발명에서 단백질 발현 수준을 측정하기 위한 키트는 항체의 면역학적 검출을 위하여 기질, 적당한 완충용액, 발색 효소 또는 형광물질로 표지된 2차 항체, 및 발색 기질 등을 포함할 수 있다. 상기에서 기질은 니트로셀룰로오스 막, 폴리비닐 수지로 합성된 96 웰 플레이트, 폴리스틸렌 수지로 합성된 96 웰 플레이트 및 유리로 된 슬라이드 글라스 등이 이용될 수 있고, 발색효소는 퍼옥시다아제(peroxidase), 알칼라인 포스파타아제(alkaline phosphatase) 등이 사용될 수 있고, 형광물질은 FITC, RITC 등이 사용될 수 있고, 발색기질액은 ABTS(2,2'-아지노-비스-(3-에틸벤조티아졸린-6-설폰산)) 또는 OPD(o-페닐렌디아민), TMB(테트라메틸 벤지딘)가 사용될 수 있다.
In addition, the kit for measuring the protein expression level in the present invention may include a substrate, a suitable buffer, a secondary antibody labeled with a coloring enzyme or a fluorescent substance, and a coloring substrate for immunological detection of the antibody. The substrate may be a nitrocellulose membrane, a 96 well plate synthesized with a polyvinyl resin, a 96 well plate synthesized with a polystyrene resin, a slide glass made of glass, and the like. The chromophore may be a peroxidase or an alkaline force. Alkaline phosphatase may be used, and the fluorescent material may be FITC, RITC, or the like, and the colorant substrate is ABTS (2,2'-azino-bis- (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfur). Phonic acid)) or OPD (o-phenylenediamine), TMB (tetramethyl benzidine) can be used.

또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 (a)신장암이 의심되는 환자의 시료로부터 TGase2 및 VHL 중 하나 이상의 발현 수준을 측정하는 단계; 및 (b)상기 TGase2 및 VHL 중 하나 이상의 발현 수준을 정상 대조구 시료의 TGase2 및 VHL 중 하나 이상의 발현 수준과 비교하는 단계를 포함하는 신장암 마커 TGase2 및 VHL 중 하나 이상을 검출하는 방법에 관한 것이다.
In another aspect, the present invention provides a method of treating cancer in a subject, comprising: (a) measuring the expression level of one or more of TGase2 and VHL from a sample of a patient suspected of having kidney cancer; And (b) comparing the expression level of one or more of TGase2 and VHL to the expression level of one or more of TGase2 and VHL of a normal control sample.

상기 단계 (a)에서 VHL의 발현 수준의 측정은 VHL 단백질의 단량체 또는 VHL 단백질의 중합체의 발현 수준을 측정하는 것을 포함한다.Determination of the expression level of VHL in step (a) comprises measuring the expression level of monomer of VHL protein or polymer of VHL protein.

바람직하게 본 발명은 TGase2 및 VHL 항체를 시료에 처리하여, 그 반응 정도를 비교 분석함으로써 대상 시료를 가진 개체의 신장암 발병 여부를 진단할 수 있다. Preferably, the present invention can treat TGase2 and VHL antibodies in a sample and compare the degree of response to diagnose whether the individual with the target sample develops kidney cancer.

본 발명에서 용어 "시료'란 개체의 암 조직에서 TGase2 및 VHL의 발현수준이 차이가 나는 전혈, 혈장, 혈액, 타액, 뇨 객담, 림프액, 뇌척수액 및 세포간액과 같은 시료등을 포함하며, 세포 분열 여부를 검출할 수 있는 세포를 포함하는 시료이면 제한되지 않는다. As used herein, the term "sample" includes samples such as whole blood, plasma, blood, saliva, urine sputum, lymphatic fluid, cerebrospinal fluid, and intercellular fluid with different expression levels of TGase2 and VHL in cancer tissues of an individual, and cell division. It will not restrict | limit if it is a sample containing the cell which can detect whether or not.

본 발명의 암의 진단을 위한 정보제공 방법은 상기와 같은 대조군 및 실험군에 항 TGase2 및 VHL 항체를 처리한 후 항원-항체 반응의 반응 수준을 비교할 수 있는데 본 발명에서 항원-항체 반응 수준이란 시료 중의 상기 단백질 항원과 이를 인지하는 본 발명의 항체 또는 이의 항원결합부위와 결합된 양을 의미하며, 항원-항체 복합체의 양이다. 이러한 항원-항체의 반응수준은 당업계에서 통상적으로 사용되는 측정방법을 제한 없이 사용하여 비교할 수 있다. 이러한 항원-항체의 반응수준은 당업계에서 통상적으로 사용되는 측정방법을 제한 없이 사용하여 비교할 수 있다. 항원-항체 반응수준 측정방법의 예로는 웨스턴 블럿(Western blot), ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA: Radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역 확산법, 로케트(rocket) 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법(Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), FACS, 응집법 및 단백질 칩(protein chip) 등이 있으나 이로 제한되는 것은 아니다.The information providing method for diagnosing cancer of the present invention can compare the reaction level of the antigen-antibody reaction after the anti-TGase2 and VHL antibodies to the control group and the experimental group as described above. The amount is associated with the protein antigen and the antibody or antigen-binding portion thereof of the present invention that recognizes the antigen, and the amount of the antigen-antibody complex. The response levels of these antigen-antibodies can be compared using, without limitation, measurement methods commonly used in the art. The response levels of these antigen-antibodies can be compared using, without limitation, measurement methods commonly used in the art. Examples of methods for measuring the level of antigen-antibody reaction include Western blot, enzyme linked immunosorbent assay (ELISA), radioimmunoassay (RIA), radioimmunodiffusion, Ouchterlony immunodiffusion But are not limited to, immunoassays, rocket immunoelectrophoresis, tissue immunostaining, immunoprecipitation assays, complement fixation assays, FACS, agglutination, and protein chips.

본 발명에서 용어, "항원-항체 복합체"란 마커 단백질과 이에 특이적인 항체의 결합물을 의미하고, 항원-항체 복합체의 형성량은 검출 라벨(detection label)의 시그널의 크기를 통해서 정량적으로 측정 가능하다. As used herein, the term “antigen-antibody complex” means a combination of a marker protein and an antibody specific thereto, and the amount of antigen-antibody complex formed can be measured quantitatively through the size of a signal of a detection label. Do.

단백질 발현수준 측정은 ELISA법을 이용할 수 있다. ELISA는 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 표지된 항체를 이용하는 직접적 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 항체의 복합체에서 포획 항체를 인지하는 표지된 항체를 이용하는 간접적 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 표지된 또 다른 항체를 이용하는 직접적 샌드위치 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 또 다른 항체와 반응시킨 후 이 항체를 인지하는 표지된 2차 항체를 이용하는 간접적 샌드위치 ELISA 등 다양한 ELISA 방법을 포함한다. 예를 들어, 고체 지지체에 항체를 부착시키고 시료를 반응시킨 후 항원-항체 복합체의 항원을 인지하는 표지된 항체를 부착시켜 효소적으로 발색시키거나 항원-항체 복합체의 항원을 인지하는 항체에 대해 표지된 2차 항체를 부착시켜 효소적으로 발색시키는 샌드위치 ELISA 방법에 의해서 검출할 수 있다. 마커 단백질과 항체의 복합체 형성 정도를 확인하여, 신장암의 발병 유무를 진단할 수 있다. The protein expression level can be measured by ELISA. ELISA is a direct ELISA using a labeled antibody that recognizes an antigen attached to a solid support, an indirect ELISA using a labeled antibody that recognizes a capture antibody in a complex of antibodies that recognize an antigen attached to a solid support, attached to a solid support Direct sandwich ELISA using another labeled antibody that recognizes the antigen in the antibody-antigen complex, a labeled antibody that recognizes the antibody after reacting with another antibody that recognizes the antigen in the complex of the antigen with the antibody attached to the solid support Various ELISA methods include indirect sandwich ELISA using secondary antibodies. For example, by attaching an antibody to a solid support and reacting a sample, a labeled antibody that recognizes an antigen of the antigen-antibody complex is enzymatically developed or labeled for an antibody that recognizes an antigen of the antigen-antibody complex. It can be detected by the sandwich ELISA method which attaches the secondary antibody thus enzymatically and colors it. By confirming the degree of complexation of the marker protein with the antibody, it is possible to diagnose the presence of renal cancer.

또한, 상기 마커에 대한 하나 이상의 항체를 이용한 웨스턴 블랏을 이용할 수 있다. 시료에서 전체 단백질을 분리하고, 이를 전기영동하여 단백질을 크기에 따라 분리한 다음, 니트로셀루로즈 막으로 이동시켜 항체와 반응시킨다. 생성된 항원-항체 복합체의 양을 표지된 항체를 이용하여 확인하는 방법으로 유전자의 발현에 의해 생성된 단백질의 양을 확인하여, 신장암 발병 유무를 확인할 수 있다. 상기 검출 방법은 신장암 발병 환자에서 TGase2 및 VHL 단백질의 발현량과 정상 대조군에서의 상기 단백질의 발현량을 비교하는 방법으로 이루어진다. 단백질 수준은 상기한 마커 단백질의 절대적(예: ㎍/㎖) 또는 상대적(예: 시그널의 상대강도)차이로 나타낼 수 있다. 또한, 상기 마커에 대한 하나 이상의 항체를 이용한 면역조직 염색을 실시할 수 있다. 신장암 발병 의심 개체의 조직을 채취 및 고정한 후, 당업계에서 널리 공지된 방법으로 파라핀 포매 블록을 제조한다. 이들을 수 μm 두께의 절편으로 만들어 유리 슬라이드에 붙인 후, 이와 상기의 항체 중 선택된 1개와 공지의 방법에 의하여 반응시킨다. 이후, 반응하지 못한 항체는 세척하고, 상기에 언급한 검출라벨 중의 하나로 표지하여 현미경 상에서 항체의 표지 여부를 판독한다.In addition, Western blot using one or more antibodies to the marker can be used. The whole protein is separated from the sample, and the protein is separated according to size by electrophoresis, and then transferred to the nitrocellulose membrane to react with the antibody. The amount of the generated antigen-antibody complex can be confirmed by using a labeled antibody to confirm the amount of the protein produced by the expression of the gene, thereby confirming the presence of kidney cancer. The detection method consists of comparing the expression levels of the TGase2 and VHL proteins in the kidney cancer patients with the expression levels of the protein in the normal control group. Protein levels can be expressed as absolute (eg μg / ml) or relative (eg relative intensity of signals) differences of the marker proteins described above. In addition, immunohistostaining with one or more antibodies to the marker can be performed. After collecting and immobilizing the tissues of a suspicious kidney cancer subject, paraffin embedding blocks are prepared by methods well known in the art. These are cut into slices of several μm thickness, adhered to glass slides, and reacted with one of the above antibodies by a known method. The unreacted antibody is then washed and labeled with one of the above-mentioned detection labels to read whether or not the antibody is labeled on a microscope.

또한, 상기 마커에 대한 하나 이상의 항체가 기판 위의 정해진 위치에 배열되어 고밀도로 고정화되어 있는 단백질 칩을 이용할 수 있다. 단백질 칩을 이용하여 시료를 분석하는 방법은, 시료에서 단백질을 분리하고, 분리한 단백질을 단백질 칩과 혼성화시켜서 항원-항체 복합체를 형성시키고, 이를 판독하여, 단백질의 존재 또는 발현 정도를 확인하여, 신장암의 발병 유무를 진단할 수 있다.
In addition, a protein chip in which one or more antibodies against the marker are arranged at predetermined positions on a substrate and immobilized at high density can be used. In the method of analyzing a sample using a protein chip, the protein is separated from the sample, and the separated protein is hybridized with the protein chip to form an antigen-antibody complex, which is read to confirm the presence or expression level of the protein, Diagnose the development of kidney cancer.

본 발명은 신장암의 진단마커를 발굴하고 제공함으로써, 신장암의 치료 및 예후관리에 유용한 지표로서 사용될 수 있는 효과를 기대한다. 나아가 신장암의 종양형성 연구에 활용될 수 있고, 신장암의 조기진단에 큰 기여를 할 수 있을 것으로 기대된다.
The present invention is expected to find an effect that can be used as an indicator useful in the treatment and prognosis of kidney cancer by discovering and providing a diagnostic marker for kidney cancer. Furthermore, it can be used to study tumorigenesis of renal cancer, and it is expected to contribute to the early diagnosis of renal cancer.

도 1은 정상 및 암세포주에서 HIF-1α 발현이 TGase2 녹다운에 의해 감소하며, VHL의 발현이 TGase2 발현과 역관계에 있음을 나타내는 도이다. (a) HIF-1α 발현은 암세포에서 TGase2 녹다운에 의해 억제되었다. TGase2는 TGase2 특이적 siRNA를 처리하여 억제하였고, HIF-1α의 수준을 면역블롯에 분석하였다. 암세포에서 VEGF 발현을 TGase2-특이적 siRNA를 이용한 TGase2 녹다운에 의해 억제하였다. VEGF 수준을 RT-PCR로 분석하였다. GAPDH mRNA 수준을 대조군으로 측정하였다. (b) 내생적 VHL의 발현은 TGase2가 과발현된 난소 암종 및 유방암세포에서 감소하였다. HEK293, MCF7, NCI/ADR-RES, 및 MDA-MB-231 세포의 세포질 분획을 항-TGase2 및 항-VHL 항체를 사용하여 면역블롯으로 분석하였다. β-액틴을 로딩 대조군으로 분석하였다. (c) 내생적 VHL 단백질 수준은 TGase2의 과발현에 의해 하향 조절되었고, TGase2 억제제 처리 또는 TGase2 돌연변이체(C277S)의 발현에 의해 회복되었다. HEK293 및 MCF7 세포를 TGase2의 발현 벡터 또는 TGase2 C277S 돌연변이체로 24시간 동안 단계적으로 형질감염 시켰고, 시스타민을 24시간 동안 처리하거나 처리하지 않았다(CTM; 0.5mM). 세포의 세포질 분획을 회수하고 항-TGase2 및 항-VHL 항체를 이용하여 면역블롯으로 분석하였다. (d) HEK-293 및 MCF7 세포에서 이소성 VHL 및 TGase2의 발현을 나타낸다. 세포를 24시간 동안 제시한 발현 플라스미드로 동시 감염시키고, 시스타민을 24시간 동안 처리하거나 처리하지 않았다(CTM; 0.5mM). TGase2 및 VHL수준을 항-TGase2 및 항-VHL 항체를 사용한 면역블롯을 통해 분석하였다. (e) 이소성으로 발현된 VHL은 이소성 TGase2의 용량 의존적 과발현에 의해 하향 조절되었다. 세포를 VHL발현 벡터로 동시 감염시켰고, TGase2 발현 벡터의 양은 48시간 동안 증가하였다. 세포 추출물을 준비하였고, 항-TGase2 및 VHL 항체를 이용한 면역블롯으로 분석하였다.
도 2는 TGase2 및 VHL의 직접적인 물리적 상호작용이 TGase2-VHL 중합체 형성 및 프로테아좀-의존적 분해를 일으킴을 나타내는 도이다. (a)TGase2는 프로테아좀 내에서 분해된 VHL 단량체의 집적을 유도한다. 세포를 24시간 동안 제시한 플라스미드로 형질감염 시키고, 회수하기 전에 12시간 동안 다양한 억제제(칼펩틴, 칼페인 억제제, 50μM; 류펩틴, 리소좀 억제제, 50μM; MG 132, 프로테아좀 억제제, 5μM)를 처리한 것과 처리하지 않은 것으로 구분하였다. TGase2 및 VHL수준을 항-TGase2 및 항-HA 항체를 이용한 면역블롯으로 분석하였다. (b) VHL은 TGase2와 상호작용하고, 이러한 상호작용은 프로테아좀 억제제의 존재시 더욱 증가하였다. 세포를 지시한 발현 플라스미드로 24시간 동시 감염시켰고, 그 후 12시간 동안 MG132(5mM)를 처리하거나 처리하지 않았다. 전체 세포 추출물을 항-HA 항체를 이용하여 면역 침전으로 분석하였고, 그 후 항-TGase2 및 항-VHL 항체를 이용하여 면역블롯으로 분석하였다. 항-TGase2 및 항-HA 항체를 이용한 전체 세포 추출물의 동시적 면역 블롯 분석은 TGase2 및 VHL이 프로테오좀 의존적인 방법으로 안정적으로 발현되는 것을 나타내었다. (c) TGase2-VHL 복합체는 프로테오좀-의존적인 분해가 일어난다. 세포를 지시한 발현벡터로 24시간 동시 감염시키고, MG132(5mM)를 12시간 동안 처리하거나 처리하지 않았다. 전체 세포추출물로부터 VHL을 항-HA 항체(b보다 5배 더 많은 세포 용해물) 이용하여 면역 침전하였고, 면역 복합체를 항-TGase2 및 항-VHL 항체를 이용한 면역블롯으로 분석하였다.
도 3은 TGase2의 억제와 함께 이소성 VHL의 발현이 NF-κB 활성을 억제시키고 IGF1R-β 수준을 감소시킨다는 것을 나타내는 도이다. (a)NF-κB 활성은 VHL의 이소성 발현 및 TGase2의 억제에 의해 감소하였다. 세포를 지시된 발현벡터로 24시간 형질 감염시킨 후 24시간 동안 시스타민(CTM; 0.5mM)을(오른쪽 패널) 또는 TGase2-특이적 siRNA를(왼쪽 패널)처리하거나 처리하지 않았다. 배양 배지를 회수하고, NF-κB 전사활성을 SEAP 리포터 분석을 이용하여 측정하였다. 결과는 평균 ± 3 세트 실험 평균의 기본 오차(SEM)로 나타내었다(p<0.05). (b) (a)에서 설명한 세포의 핵 추출물을 32P-표지된 NF-kB 프로브를 이용한 EMSA방법으로 분석하였다. (c) annexin V/프로피디움 아이오다이드 염색(PI) 및 절단된 카스파아제 3 및 PARP의 면역 블롯에 의해 세포 사멸을 분석하였다. 세포를 VHL 발현 플라스미드 및 TGase2-특이적-siRNA로 형질감염시켰다. Annexin Ⅴ/PI 염색을 유세포 분석으로 측정하였다. 초기 및 후기 세포사멸과 대응하여 사분면 내의 회수된 세포의 백분율을 나타내었다(위쪽 패널). 전체 세포 추출물을 항-절단 카스파아제-3, 항-PARP 및 항-β-액틴 항체를 이용한 면역블롯으로 분석하였다. (d) TGase2의 억제는 VHL 단백질 수준을 회복시켰고, 내생적 IGF1R-β 단백질 수준을 하향조절하였다. 세포를 지시한 플라스미드로 24시간 형질감염 하였고, 그 후 회수하기 전에 24시간 동안 시스타민(CTM; 0.5 mM)을 처리하거나 처리하지 않았다(왼쪽 패널). 대안적으로, 세포를 가역적 감염을 이용하여 TGase2-특이적 siRNA로 24시간 형질감염시켰고, 그 후 지시한 발현 플라스미드로 24시간 형질감염시켰다(오른쪽 패널). 전체 세포 추출물을 항-TGase2, 항-IGF1R-β 및 항-VHL 항체를 이용한 면역블롯으로 분석하였다.
도 4는 TGase2의 과발현이 체내 VHL의 억제 및 IFG1R-β 및 NF-κB의 활성을 유도하는 것을 나타내는 도이다. (a)TGase2 형질전환 마우스종을 생성하는데 사용한 TGase2-pCAGGS rpsha 구조체의 모식도를 나타낸다. (b) PCR에 의하여 TGase2 이식 유전자가 도입된 잠재적인 파운더 마우스를 확인하였다. (c) 관류 후에, 야생형 및 TGase2 형질전환 마우마우스로부터 유래한 동결 조직을 균질화하였고, 그 후 TGase2, VHL 및 IGF1R-β 수준을 항-TGase2, 항-VHL 및 항-IGF1R-β 항체를 이용한 면역블롯으로 상대적으로 검출하였다. (d) 조직은 (a)에서 설명한 바와 같이 준비하였고, 핵 추출물을 32P-표지된 NF-κB 프로브를 이용한 EMSA로 분석하였다. NF-κB DNA결합 활성을 밀도계측기를 이용하여 정량화하였다. 결과는 평균 ± 세 세트 샘플의 SEM으로 나타내었다(p<0.05).
도 5는 TGase2 및 VHL발현이 인간 RCC암종 시료에서 가역적인 관계에 있음을 나타내는 도이다. 11개의 RCC 세포 암종 샘플 중 9개에서 TGase2 및 VHL 발현이 역관계에 있었다. TGase2의 발현이 높은 샘플의 경우, VHL 발현은 낮거나 없었다(a 및 b). TGase2의 발현이 낮은 샘플의 경우, VHL의 발현은 상대적으로 높았다(c 및 d). 침습성 전반 세포(e, 화살표)에서 TGase2의 발현은 높은 반면, VHL의 발현은 상대적으로 낮거나 없었으며(f, 화살표), 이는 TGase2 및 VHL발현의 역관계를 나타내는 추가적인 증거로 제공된다. 모든 이미지 증폭 비율은 100X이다.
도 6은 NF-κB 활성에서 VHL 및 TGase2의 역할을 위해 제시된 모델을 나타낸다. TGase2는 중합 및 단백질 분해에 의한 I-κBα(Kim, D.S., Park, S.S., Nam, B.H., Kim, I.H. & Kim, S.Y. Reversal of drug resistance in breast cancer cells by transglutaminase 2 inhibition and nuclear factor-kappaB inactivation. Cancer Res 66, 10936-43 (2006)) 및 VHL의 감소를 통해 NF-κB의 활성을 유도되거나 확장한다. NF-κB의 잘 알려진 주요 억제제이며, VHL은 HIF-1α 및 IGF-1R을 조절하는 종양 억제제이다. I-κBα 및 VHL의 감소는 암세포에서 생존, 성장, 이동, 약물 내성 및 세포사멸의 저항을 증가시킨다.
도 7은 TGase2 과발현 NCI/ADR-RES 및 MDA-MB-231에서 VHL의 발현은 시스타민 또는 TGase2-특이적 siRNA의 억제에 의해 회복된 이소성 VHL의 TGase2 발현 억제에 의한 것임을 나타내는 도이다. 세포를 TGase-2 특이적 siRNA 및 상기에서 제시된 플라스미드로 48시간 형질감염 하거나(a. 오른쪽 패널), 시스타민을 처리하거나 처리하지 않은 상기에서 제시된 플라스미드로 형질감염하였다(b. 왼쪽 패널). VHL의 과발현을 항-VHL 항체를 이용한 면역 블롯 분석에 의해 확인하였다.
도 8은 이소성 VHL의 국소화는 NCI/ADR-RES 및 MDA-MB-231 암세포에서 TGase2 유전자에 의해 조절됨을 나타낸다. 세포를 24시간 동안 역 형질전환 및 상기 개시된 플라스미드를 이용한 역전사 TGase2-특이적 siRNA로 형질감염 시켰다. 세포를 회수 후 2개의 챔버 슬라이드에 16시간 재접종 하였다. 세포를 항-HA 일차항체를 이용하여 면역화학 분석 후 VHL의 검출을 위해 형광이 결합된 항-마우스 면역글로불린 이차 항체를 이용하여 분석하였다.
도 9는 TGase2가 시험관 내에서 용량 의존적으로 VHL의 중합에 의해 유도되는 것을 나타낸 것이다. 정제된 재조합 VHL을 시험관내에서 기니아 피그 간 TGase2에 의해 중합되었다. VHL 중합체는 SDS-PAGE에 의해 분리되었고, 쿠마시 블루 염색에 의해 가시화되었으며(왼쪽 패널), 항-VHL 항체를 이용한 면역블롯에 의해 분석되었다(오른쪽 패널).
도 10은 펩타이드의 질량 분석은 VHL의 단량체, 이량체 및 중합체로 추정되는 단백질 가수분해에 의한 것임을 나타낸 것이다. 정제된 재조합 VHL을 시험관 내에서 TGase2에 의해 중합되었다. 다중결합의 VHL 복합체는 SDS-PAGE에 의해 분리되었고, 쿠마시 블루 염색에 의해 가시화되었다. 수치화된 밴드는 수집되고, 환원되고, 트립신 처리에 의해 분해되었다. 펩타이드의 질량은 MALDI-TOF MS를 사용하여 결정하였다.
도 11은 VHL에서 교차결합 부위를 규명하기 위해, MS에 의해 정제된 VHL 단량체 및 중합체를 분석한 것을 나타낸 것이다. 도 4F는 VHL 단량체 및 중합체의 아미노산 서열을 나타낸 것으로, 붉은색 문자는 MS에 의해 규명된 잔기를 나타내며, 파란색 문자(VHL 중합체에서)는 중합 후 차단된 잔기를 나타낸다. 이 결과는 글루타민 164 및 203이 TGase2-유도 VHL 중합체에 포함되는 것을 말한다.
도 12는 TGase2 및 VHL발현이 인간 RCC 암종 시료에서 역관계에 있음을 나타내는 웨스턴 블랏 결과이다.
1 is a diagram showing that HIF-1α expression is reduced by TGase2 knockdown in normal and cancer cell lines, and that the expression of VHL is inversely related to TGase2 expression. (a) HIF-1α expression was inhibited by TGase2 knockdown in cancer cells. TGase2 was inhibited by treatment with TGase2 specific siRNA, and levels of HIF-1α were analyzed in immunoblot. VEGF expression in cancer cells was inhibited by TGase2 knockdown using TGase2-specific siRNA. VEGF levels were analyzed by RT-PCR. GAPDH mRNA levels were measured as controls. (b) The expression of endogenous VHL was decreased in ovarian carcinoma and breast cancer cells overexpressing TGase2. Cytoplasmic fractions of HEK293, MCF7, NCI / ADR-RES, and MDA-MB-231 cells were analyzed by immunoblot using anti-TGase2 and anti-VHL antibodies. β-actin was analyzed as a loading control. (c) Endogenous VHL protein levels were down regulated by overexpression of TGase2 and recovered by TGase2 inhibitor treatment or expression of TGase2 mutants (C277S). HEK293 and MCF7 cells were transfected stepwise for 24 hours with an expression vector of TGase2 or TGase2 C277S mutant and with or without cystamine for 24 hours (CTM; 0.5 mM). Cytoplasmic fractions of cells were recovered and analyzed by immunoblot using anti-TGase2 and anti-VHL antibodies. (d) Expression of ectopic VHL and TGase2 in HEK-293 and MCF7 cells. Cells were concurrently infected with the expression plasmids presented for 24 hours, and with or without cystamine for 24 hours (CTM; 0.5 mM). TGase2 and VHL levels were analyzed via immunoblot using anti-TGase2 and anti-VHL antibodies. (e) Ectopically expressed VHL was down regulated by dose dependent overexpression of ectopic TGase2. The cells were simultaneously infected with the VHL expression vector and the amount of TGase2 expression vector increased for 48 hours. Cell extracts were prepared and analyzed by immunoblot using anti-TGase2 and VHL antibodies.
FIG. 2 shows that direct physical interaction of TGase2 and VHL results in TGase2-VHL polymer formation and proteasome-dependent degradation. (a) TGase2 induces the accumulation of degraded VHL monomers in the proteasome. Cells were transfected with the plasmids presented for 24 hours, and various inhibitors (calpeptin, calpein inhibitor, 50 μM; leupeptin, lysosomal inhibitor, 50 μM; MG 132, proteasome inhibitor, 5 μM) for 12 hours prior to recovery. Treated and untreated. TGase2 and VHL levels were analyzed by immunoblot using anti-TGase2 and anti-HA antibodies. (b) VHL interacts with TGase2, and this interaction is further increased in the presence of proteasome inhibitors. Cells were simultaneously infected with the indicated expression plasmids for 24 hours, followed by or without MG132 (5 mM) for 12 hours. Whole cell extracts were analyzed by immunoprecipitation using anti-HA antibodies and then immunoblot using anti-TGase2 and anti-VHL antibodies. Simultaneous immunoblot analysis of whole cell extracts with anti-TGase2 and anti-HA antibodies showed that TGase2 and VHL were stably expressed in a proteosome dependent method. (c) TGase2-VHL complexes undergo proteosome-dependent degradation. Cells were simultaneously infected with the indicated expression vectors for 24 hours and MG132 (5 mM) was treated with or without 12 hours. VHL was immunoprecipitated from whole cell extracts with anti-HA antibody (5 times more cell lysate than b) and immune complexes were analyzed by immunoblot with anti-TGase2 and anti-VHL antibodies.
3 is a diagram showing that expression of ectopic VHL with inhibition of TGase2 inhibits NF-κB activity and reduces IGF1R-β levels. (a) NF-κB activity was reduced by ectopic expression of VHL and inhibition of TGase2. Cells were transfected with the indicated expression vectors for 24 hours and either with or without cystamine (CTM; 0.5 mM) (right panel) or TGase2-specific siRNA (left panel). The culture medium was recovered and NF-κB transcriptional activity was measured using SEAP reporter assay. Results are expressed as base error (SEM) of the mean ± 3 sets of experimental means (p <0.05). (b) Nuclear extracts of the cells described in (a) were analyzed by EMSA using a 32 P-labeled NF-kB probe. (c) Cell death was analyzed by annexin V / propidium iodide staining (PI) and immunoblot of cleaved caspase 3 and PARP. Cells were transfected with VHL expressing plasmids and TGase2-specific-siRNA. Annexin V / PI staining was determined by flow cytometry. The percentage of cells recovered in the quadrant corresponding to early and late cell death was shown (top panel). Whole cell extracts were analyzed by immunoblot using anti-cleaved caspase-3, anti-PARP and anti-β-actin antibodies. (d) Inhibition of TGase2 restored VHL protein levels and downregulated endogenous IGF1R-β protein levels. Cells were transfected with the indicated plasmids for 24 hours, and then treated or untreated with cystamine (CTM; 0.5 mM) for 24 hours before recovery (left panel). Alternatively, cells were transfected 24 hours with TGase2-specific siRNA using reversible infection, followed by 24 hours transfection with the indicated expression plasmids (right panel). Whole cell extracts were analyzed by immunoblot with anti-TGase2, anti-IGF1R-β and anti-VHL antibodies.
Figure 4 shows that overexpression of TGase2 induces inhibition of VHL and activity of IFG1R-β and NF-κB in the body. (a) The schematic of the TGase2-pCAGGS rpsha construct used to generate TGase2 transgenic mouse species is shown. (b) The potential founder mice to which the TGase2 transplant gene was introduced by PCR were identified. (c) After perfusion, frozen tissues derived from wild-type and TGase2 transgenic mice were homogenized and then TGase2, VHL and IGF1R-β levels were immunized with anti-TGase2, anti-VHL and anti-IGF1R-β antibodies. Relative to blot. (d) Tissues were prepared as described in (a) and nuclear extracts were analyzed by EMSA using 32 P-labeled NF-κB probes. NF-κB DNA binding activity was quantified using a density analyzer. Results are shown as SEM of mean ± three set samples (p <0.05).
Figure 5 shows that TGase2 and VHL expression is in a reversible relationship in human RCC carcinoma samples. In 9 of 11 RCC cell carcinoma samples, TGase2 and VHL expression were inversely related. For samples with high expression of TGase2, VHL expression was low or absent (a and b). For samples with low expression of TGase2, the expression of VHL was relatively high (c and d). The expression of TGase2 was high in invasive progenitor cells (e, arrow), while the expression of VHL was relatively low or absent (f, arrow), providing additional evidence indicating the inverse of TGase2 and VHL expression. All image amplification rates are 100X.
6 shows a model presented for the role of VHL and TGase2 in NF-κB activity. TGase2 is an I-κBα (Kim, DS, Park, SS, Nam, BH, Kim, IH & Kim, SY Reversal of drug resistance in breast cancer cells by transglutaminase 2 inhibition and nuclear factor-kappaB inactivation. Cancer Res 66 , 10936-43 (2006)) and reduction of VHL induces or expands NF-κB activity. It is a well known major inhibitor of NF-κB, and VHL is a tumor inhibitor that modulates HIF-1α and IGF-1R. Reduction of I-κBα and VHL increases resistance to survival, growth, migration, drug resistance and apoptosis in cancer cells.
Figure 7 shows that expression of VHL in TGase2 overexpressing NCI / ADR-RES and MDA-MB-231 is due to inhibition of TGase2 expression of ectopic VHL restored by inhibition of cystamine or TGase2-specific siRNA. Cells were transfected with TGase-2 specific siRNA and the plasmids presented above (a. Right panel) or transfected with the plasmids presented above with or without cystamine (b. Left panel). Overexpression of VHL was confirmed by immunoblot analysis using anti-VHL antibodies.
8 shows that localization of ectopic VHL is regulated by TGase2 gene in NCI / ADR-RES and MDA-MB-231 cancer cells. Cells were transfected for 24 hours with reverse transformation and reverse transcription TGase2-specific siRNA using the plasmids disclosed above. The cells were recovered and reinoculated on two chamber slides for 16 hours. Cells were analyzed using immuno-chemical analysis using anti-HA primary antibodies followed by fluorescently bound anti-mouse immunoglobulin secondary antibodies for detection of VHL.
9 shows that TGase2 is induced by polymerization of VHL in a dose dependent manner in vitro. Purified recombinant VHL was polymerized by guinea pig liver TGase2 in vitro. VHL polymers were separated by SDS-PAGE, visualized by Coomassie blue staining (left panel) and analyzed by immunoblot with anti-VHL antibodies (right panel).
FIG. 10 shows that mass spectrometry of peptides is due to proteolytic hydrolysis assumed to be monomers, dimers and polymers of VHL. Purified recombinant VHL was polymerized by TGase2 in vitro. Multiple binding VHL complexes were separated by SDS-PAGE and visualized by Coomassie Blue staining. The quantified bands were collected, reduced and resolved by trypsin treatment. The mass of peptides was determined using MALDI-TOF MS.
FIG. 11 shows analysis of VHL monomers and polymers purified by MS to identify crosslinking sites in VHL. 4F shows amino acid sequences of VHL monomers and polymers, in which the red letters represent residues identified by MS and the blue letters (in VHL polymer) represent residues blocked after polymerization. This result indicates that glutamine 164 and 203 are included in the TGase2-induced VHL polymer.
FIG. 12 is a Western blot showing that TGase2 and VHL expression are inverse in human RCC carcinoma samples.

이하 본 발명을 하기 실시예에 의해 더욱 구체적으로 설명한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명의 예시일 뿐 본 발명이 이에 한정되지 않는다.
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to the following examples. However, the following examples are only examples of the present invention and the present invention is not limited thereto.

실시예Example 1: 항체 및 시약 1: Antibodies and Reagents

항-VHL 항체는 BD Pharmingen(미국, CA, 산디에고)에서, 항-TGase2 항체는 NeoMarkers(미국, CA, 프레몬트, 클론 CUB 7402)에서, 항-β-액틴은 Abcam(영국, 캠브리지, 헤드쿼터)에서, 항-IGF1R-β 및 항-HA-프로브(F7) 항체는 Santa cruz Biotechnology(미국, CA, 산타크루즈)에서, 항-PARP 및 항-절단 카스파아제-3(Asp175) 항체는 Cell Signaling Technologies(미국, MA, Beverly)에서 각각 구입하였다. 리포펙타민 2000, 리포펙타민 RNAiMAX 트랜스펙션 시약 및 Stealth Negative 대조군을 포함한 리포펙타민 RNAiMAX를 Invitrogen에서 구입하였고, 칼펩틴(칼바이오켐), 류펩틴(미국, MO, 성 루이스, Sigma-Aldrich Co), MG132(칼바이오켐) 및 FITC-혼성 항-마우스 면역글로불린(미국, 펜실베니아, 웨스트 그로브, 잭슨 면역 연구실)을 상업적으로 구입하였다.
Anti-VHL antibodies from BD Pharmingen (USA, CA, San Diego), anti-TGase2 antibodies from NeoMarkers (USA, CA, Fremont, clone CUB 7402), anti-β-actin was Abcam (UK, Cambridge, Head) Quarter, anti-IGF1R-β and anti-HA-probe (F7) antibodies from Santa cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA), anti-PARP and anti-cutting caspase-3 (Asp175) antibodies from Cell It was purchased from Signaling Technologies (Beverly, MA, USA). Lipofectamine RNAiMAX, including Lipofectamine 2000, Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent, and Stealth Negative Control, was purchased from Invitrogen, Calpeptin (Calbiochem), Leupeptin (USA, MO, St. Louis, Sigma-Aldrich). Co), MG132 (Calbiochem) and FITC-hybrid anti-mouse immunoglobulin (US, Pennsylvania, West Grove, Jackson Immunology Laboratory) were purchased commercially.

실시예Example 2:  2: siRNAsiRNA (( smallsmall interferinginterfering RNARNA ) 처리에 의한 ) Treatment TGase2TGase2 의 억제(Suppression of silencingsilencing ))

인간 TGase2를 타겟팅하는 siRNA 이중가닥(5'-AAGAGCGAGAUGAUCUGGAACTT-3':서열번호 1)을 리포펙타민 RNAiMAX(인비트로젠)을 이용하여 제조사의 지시에 따라 세포에 도입하였다. 세포를 감염 후 48시간 째 회수하고, 세포질 분획 또는 전체 세포 추출물을 면역블롯 분석을 위해 준비하였다. 음성 대조군으로, 세포를 리포펙타민 RNAiMAX 단독 및 일반적(universal)인 음성 siRNA(인비트로젠)와 함께 배양하였다.SiRNA double strands targeting human TGase2 (5′-AAGAGCGAGAUGAUCUGGAACTT-3 ′: SEQ ID NO: 1) were introduced into cells using lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen) according to the manufacturer's instructions. Cells were harvested 48 hours post infection and cytoplasmic fractions or whole cell extracts were prepared for immunoblot analysis. As a negative control, cells were incubated with lipofectamine RNAiMAX alone and with a universal negative siRNA (Invitrogen).

실시예Example 3:  3: 면역블롯팅Immunoblotting (( ImmunoblottingImmunoblotting ) )

표준적으로 정립된 방법(Kim, D.S., Park, S.S., Nam, B.H., Kim, I.H. & Kim, S.Y. Cancer Res 66, 10936-43 (2006))에 따라 면역블롯 분석을 수행하였다.
Standardized methods (Kim, DS, Park, SS, Nam, BH, Kim, IH & Kim, SY Cancer Res 66 , 10936-43 (2006)) to perform immunoblot analysis.

실시예Example 4:  4: 전기영동상Electrophoresis 변화 분석법( Change analysis method ElectrophoreticElectrophoretic mobilitymobility shiftshift assayassay , , EMSAEMSA ))

NF-kB DNA 결합 사이트를 포함하는 이중 가닥 올리고뉴클레오디드 프로브(5'-AGT TGA GGG GAC TTT CCC AGG C-3':서열번호 2)를 Santa Cruz 생명공학사로부터 구입하였다. 제조사의 프로토콜에 따라 EMSA 분석을 수행하였다.
A double stranded oligonucleotide probe (5'-AGT TGA GGG GAC TTT CCC AGG C-3 ': SEQ ID NO: 2) containing an NF-kB DNA binding site was purchased from Santa Cruz Biotech. EMSA analysis was performed according to the manufacturer's protocol.

실시예Example 5: 세포사멸 분석 5: Apoptosis Assay

Annexin V결합에 의한 세포사멸 분석을 Annexin V-FITC 세포사멸 검출 키트(미국, CA, Mountain View, BD Biosciences)를 이용하여 제조사의 지시에 따라 수행하였다.
Apoptosis analysis by Annexin V binding was performed using the Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit (CA, Mountain View, BD Biosciences) according to the manufacturer's instructions.

실시예Example 6:  6: TGase2TGase2 ++ 형질전환 마우스의 제조 Preparation of Transgenic Mice

인간 CMV 인핸서, 닭 β-액틴 프로모터-인트론 및 토끼 β-글로빈 폴리아데닐화 서열을 포함하는 pCAGGS의 고유의 EcoRI-BglII 부위에 마우스 트랜스글루타미나아제 2 유전자를 삽입하였다. 5.8 kb의 DNA 단편 산물을 절단하고, 전핵(pronuclei) DNA 주입을 위한 기본적인 방법을 따라 준비하였다. 1 ㎝ 테일 클립(tail clip)으로부터 추출한 게놈 DNA의 PCR 분석을 통해 TGase2 이식 유전자(transgene)를 선별하였다. PCR은 하기의 프라이머를 이용하여 수행하였다.The mouse transglutaminase 2 gene was inserted into the native EcoRI-BglII site of pCAGGS comprising human CMV enhancer, chicken β-actin promoter-intron and rabbit β-globin polyadenylation sequence. The 5.8 kb DNA fragment product was cut and prepared following the basic method for pronuclei DNA injection. TGase2 transgene was selected by PCR analysis of genomic DNA extracted from a 1 cm tail clip. PCR was performed using the following primers.

5'-CAC CCT TCG TGT TTG CCG AGG TCA-3'(서열번호 3) 5'-CAC CCT TCG TGT TTG CCG AGG TCA-3 '(SEQ ID NO: 3)

5'-TCT CCG AGG TGT CGT TGC CGA TGT-3'(서열번호 4)5'-TCT CCG AGG TGT CGT TGC CGA TGT-3 '(SEQ ID NO: 4)

트란스글루타미나아제 2 이식유전자 및 야생형 대립유전자를 각각 334 염기쌍(basepair, pb) 및 3,056bp로 얻었다. 이러한 방식으로, 본 발명자는 TGase2 이식유전자의 유전자 카피를 가지는 네 가지 파운더 마우스를 확인하였다.
Transglutaminase 2 transgene and wild type allele were obtained with 334 basepairs (pb) and 3,056 bp, respectively. In this way, we identified four founder mice with gene copies of the TGase2 transgene.

실시예Example 7: 인간  7: Human RCCRCC 시료에서  In the sample TGase2TGase2  And VHLVHL 의 면역화학염색Immunochemical staining

일산 백병원(대한민국, 고양)에서 외과적 수술에 의해 얻은 11개의 신장 암 시료를 병리학과 기록으로부터 선별하였다. 기록된 조직의 이용은 윤리협회 및 임상시험심사위원회의 승인받았다(IRB number: 1B-2-1003-010). 면역화학염색을 Ultravision LP 검출 키트 및 DAB를 이용하여 수행하였다(미국, CA, Lab Vision Corporation Fremont). 파라핀화된 인간 RCC 조직을 염색하였다. 조직 섹션을 자일렌에 디파라핀화하였고, 항원회복을 1mM EDTA가 포함된 pH 9.0의 10mM 트리스 버퍼에서 샘플을 121℃에서 15분간 열처리하였다. 섹션을 95% 에탄올에서 고정하였고, 0.3% 과산화수소를 처리하고 울트라 V를 15분간 조사하여 고정하였다. 섹션을 20% FBS 가 포함된 0.05% TBS-T에서 항-TGase2 및 항-VHL 일차 항체를 처리하여 실온에서 1시간 반응하였다. TBS-T를 세척 후, 섹션을 일차항체 증폭자로 순차적으로 반응 후, 호스래디쉬 퍼옥시다아제(horseradish peroxidase;HRP) 고분자로 각각 30분 반응하였다. TBS-T 세척 후, 슬라이드를 DAB 및 Mayer's 헤마톡실린를 이용하여 대조염색하였다(덴마크, DakoCytomation).
Eleven kidney cancer samples obtained by surgical operation at Ilsan Paik Hospital (Korea, Goyang) were selected from pathology records. Use of the recorded organization was approved by the Ethics Association and the Institutional Review Board (IRB number: 1B-2-1003-010). Immunohistochemical staining was performed using the Ultravision LP detection kit and DAB (Lab Vision Corporation Fremont, CA, USA). Paraffinized human RCC tissue was stained. Tissue sections were deparaffinized in xylene and antigen recovery was heat treated at 121 ° C. for 15 minutes in 10 mM Tris buffer at pH 9.0 with 1 mM EDTA. Sections were fixed in 95% ethanol, treated with 0.3% hydrogen peroxide and fixed by irradiating Ultra V for 15 minutes. Sections were reacted for 1 hour at room temperature with anti-TGase2 and anti-VHL primary antibodies in 0.05% TBS-T with 20% FBS. After washing TBS-T, the sections were sequentially reacted with a primary antibody amplifier and then reacted with horseradish peroxidase (HRP) polymers for 30 minutes each. After TBS-T washing, slides were counterstained using DAB and Mayer's hematoxylin (DakoCytomation).

실시예Example 8. 정상 신장세포 및 신장암 세포에서의  8. In normal kidney cells and kidney cancer cells 웨스턴Western 블랏Blat

정상 신장세포인 HEK293 세포주, 그리고 신장암 세포인 786-O, A498, ACHN, CAKI-1, SN12C, TK10 및 U031 세포주에서 VHL 및 TGase2 단백질의 발현 여부를 웨스턴 블랏을 통해 측정하였다. 상기 정상 신장세포주 및 다양한 신장암 세포주에 항-TGase2 및 항-VHL 일차 항체를 처리하여 실온에서 반응시킨 후 2차 표지된 항체를 상온에 반응시켜 TGase2 및 VHL 단백질의 검출 여부를 확인하였다.
The expression of VHL and TGase2 proteins in HEK293 cell line, which is a normal kidney cell, and 786-O, A498, ACHN, CAKI-1, SN12C, TK10, and U031 cell lines, which were normal kidney cells, was measured by Western blot. The normal kidney cell line and various kidney cancer cell lines were treated with anti-TGase2 and anti-VHL primary antibodies and reacted at room temperature, and then the secondary labeled antibodies were reacted at room temperature to determine whether TGase2 and VHL proteins were detected.

실시예 9: 면역화학Example 9: immunochemistry

HA-VHL은 면역화학 및 위상차 현미경에 의해 가시화하였다. 세포를 TGase2 특이적 siRNA의 존재하에, 또는 대조군으로서 형질감염 하루 전날 일반적인(universal) 음성 siRNA 존재하에 2-웰 슬라이드 챔버에 접종하였다. 세포를 대조군 빈 벡터(mock) 또는 HA-VHL 발현 벡터로 24시간 동안 형질감염 시킨 후 PBS(Phosphate buffered saline)로 세척하였다. 면역화학을 표준 프로토콜에 따라 수행하였다.
HA-VHL was visualized by immunochemistry and phase contrast microscopy. Cells were seeded in a 2-well slide chamber in the presence of TGase2 specific siRNA, or in the presence of universal negative siRNA the day before transfection as a control. Cells were transfected with a control empty vector (mock) or HA-VHL expression vector for 24 hours and then washed with PBS (Phosphate buffered saline). Immunchemistry was performed according to standard protocols.

실시예Example 10: 인간  10: Human VHLVHL 의 발현 및 정제&Lt; / RTI &gt;

인간 VHL cDNA를 BamHⅠ/XhoⅠ제한효소를 이용하여 변형된 pET32(Novagen)내로 서브클로닝하고, VHL의 아미노 말단에 23-잔기 폴리히스티딘 태그(MHHHHHHGSLVPRSENLYFQGS, 6xHis)를, 카복시말단에 10-잔기 폴리히스티딘 태그(LEHHHHHHHH, 8xHis)를 첨가하였다. 재조합 VHL을 대장균 균주 Rosetta 2 (DE3)(Novagen)에서 과발현 후 확립된 프로토콜에 의해 정제하였다.
Human VHL cDNA was subcloned into modified pET32 (Novagen) using BamHI / XhoI restriction enzymes, a 23-residue polyhistidine tag (MHHHHHHGSLVPRSENLYFQGS, 6xHis) at the amino terminus of VHL, and a 10-residue polyhistidine tag at the carboxy terminus (LEHHHHHHHH, 8 × His) was added. Recombinant VHL was purified by established protocol after overexpression in E. coli strain Rosetta 2 (DE3) (Novagen).

실시예Example 11:  11: 기니아Guinea 피그Pig  liver TGase2TGase2 에 의한 On by VHLVHL 의 중합Polymerization

기니아 피그 간 TGase2(5㎕, U/㎖)를 정제된 인간 VHL(5 ㎍)이 포함된 반응 버퍼(50 mM Tris-HCL, pH 7.5, 150 mM NaCl, 15 mM CaCl2) 30㎕에 넣고 37℃에서 2시간 반응하였다. 단백질을 SDS-PAGE에 의해 분리하였고, 쿠마시 블루 염색에 의해 가시화하거나 면역블롯으로 분석하였다.
Add guinea pig liver TGase2 (5 μl, U / mL) to 30 μl of reaction buffer (50 mM Tris-HCL, pH 7.5, 150 mM NaCl, 15 mM CaCl 2 ) containing purified human VHL (5 μg). It reacted at 2 degreeC. Proteins were separated by SDS-PAGE and visualized by Coomassie Blue staining or analyzed by immunoblot.

실험결과Experiment result

실험예Experimental Example 1:  One: VHLVHL  And TGase2TGase2 of 역상관계Inverse relationship

본 발명자는 이전의 연구에서, TGase2 발현의 증가가 암세포의 약물 내성 획득에 핵심적인 역할을 한다는 것을 보여주었다. 특히 HIF-1α는 정상 산소조건에서 약물 내성 암 세포에서 증가하였다(도 1a). TGase2 유전자의 녹다운은 NCI/ADR-RES 및 MDA-MB-231 세포에서 용량 의존적으로 내생적 HIF-1α 단백질의 발현 수준을 감소시켰다(도 1A). NCI/ADR-RES 및 MDA-MB-231 유방암 세포에서 VHL의 발현수준은 HEK-293 및 MCF7 세포에서보다 낮았고(도 1b), 암세포주에서 내생적 VHL 수준은 TGase2와 역관계에 있었다(도 1b). 내생적 VHL은 HEK293 및 MCF7 유방암세포에서 이소성(ectopic) TGase2 발현에 의해 억제되었으며, 이러한 감소는 시스타민을 이용한 TGase2의 억제에 의해, 또는 촉매적으로 불활성화된 TGase2 변이체(C277S)의 발현을 이용한 TGAse2의 억제에 의해 역전되었다(도 1c). 이소성 VHL의 수준은 TGase2의 동시발현에 의하여 감소하였으며, 이러한 효과는 시스타민 또는 촉매적으로 불활성화된 TGase2 C277S의 발현을 이용한 TGase2의 억제에 의해 사라졌다(도 1d). 이러한 결과는 TGase2의 교차 연결 촉매 활성이 VHL 감소의 주요한 원인이 됨을 나타낸다.
In previous studies we have shown that increased TGase2 expression plays a key role in obtaining drug resistance of cancer cells. In particular, HIF-1α was increased in drug resistant cancer cells under normal oxygen conditions (FIG. 1A). Knockdown of the TGase2 gene reduced the expression level of endogenous HIF-1α protein in NCI / ADR-RES and MDA-MB-231 cells (FIG. 1A). The expression levels of VHL in NCI / ADR-RES and MDA-MB-231 breast cancer cells were lower than in HEK-293 and MCF7 cells (FIG. 1B), and endogenous VHL levels in cancer cell lines were inversely related to TGase2 (FIG. 1B). . Endogenous VHL was inhibited by ectopic TGase2 expression in HEK293 and MCF7 breast cancer cells, and this reduction was either by inhibition of TGase2 with cystamine or by expression of catalytically inactivated TGase2 variant (C277S). It was reversed by inhibition of TGAse2 (FIG. 1C). Levels of ectopic VHL were reduced by co-expression of TGase2, and this effect was lost by inhibition of TGase2 using expression of cystamine or catalytically inactivated TGase2 C277S (FIG. 1D). These results indicate that cross-linking catalytic activity of TGase2 is a major cause of VHL reduction.

실험예Experimental Example 2:  2: TGaseTGase 억제는 암세포에서  Suppression in cancer cells VHLVHL 의 안정성을 증가시킴Increases stability

TGase2 억제제가 VHL 안정성 조절에 의해 VHL의 수준을 증가시키는지 알아보기 위해, 본 발명에서는 VHL 단백질 수준에서 내생적 TGase2 활성의 억제 효과를 확인하였다. TGase2가 높은 수준으로 발현된 NCI/ADR-RES 및 MDA-MB-231 세포에 TGase2-특이적인 siRNA 또는 시스타민과 함께 HA-VHL 발현 벡터를 일과적으로(transiently) 형질 감염시켰다. 이소성 HA-VHL 의 수준은 TGase2 특이적 siRNA 또는 시스타민으로 처리되지 않고 HA-VHL 만 발현된 대조군 세포와 비교하여, 시스타민 또는 유전자 녹다운에 의한 TGase2 억제에 반응하여 증가하였다(도 7), 이는 도 2a의 결과와 일치한다. 항-HA 단클론 항체를 이용하여 HA-VHL-형질감염 NCI/ADR-RES 및 MDA-MB-231 세포의 면역세포화학 염색을 수행한 결과, VHL이 핵에 편재되어 있는 것으로 나타났다. 이와 비교하여, TGase2-특이적 siRNA 로 동시-형질감염된 세포는 HA-VHL의 세포질 및 핵 부위에 나타났다(도 8). 따라서, TGase2는 TGase2가 가장 많은 세포질 내에서 VHL를 타겟으로 하는 것으로 보인다.
To determine whether the TGase2 inhibitor increases the level of VHL by regulating VHL stability, the present invention confirmed the inhibitory effect of endogenous TGase2 activity on VHL protein levels. NCI / ADR-RES and MDA-MB-231 cells expressing high levels of TGase2 were transiently transfected with HA-VHL expression vectors with TGase2-specific siRNA or cystamine. Levels of ectopic HA-VHL increased in response to TGase2 inhibition by cystamine or gene knockdown, compared to control cells expressing only HA-VHL without treatment with TGase2-specific siRNA or cystamine (FIG. 7). It is consistent with the result of FIG. 2A. Immunohistochemical staining of HA-VHL-transfected NCI / ADR-RES and MDA-MB-231 cells with an anti-HA monoclonal antibody showed that VHL was localized in the nucleus. In comparison, cells co-transfected with TGase2-specific siRNA appeared in the cytoplasmic and nuclear regions of HA-VHL (FIG. 8). Thus, TGase2 appears to target VHL in the cytoplasm where TGase2 is most abundant.

실험예Experimental Example 3:  3: VHLVHL 중합체의  Polymer 프로테아좀Proteasome 의존적 분해( Dependent decomposition ( proteasomeproteasome -- dependentdependent degradationdegradation ))

TGase2-촉매화된 교차 연결을 통해 생성된 VHL 중합체가 대사적으로 분해되는 지를 확인하기 위하여, 본 발명자들은 VHL 분해를 억제하는 능력을 위한 세 가지 서로 다른 단백질 가수분해 억제제(프로테아좀 억제제, 리소좀 억제제, 칼페인 억제제)를 실험하였다. TGase2에 의한 VHL단량체의 감소는 프로테아좀 억제제 MG132 처리에 의해 억제되었으나, 칼페인(calpain) 또는 리소좀(lysosomal) 억제제에 의해서는 억제되지 않았다(도 2a). TGase2 와 VHL이 직접적으로 상호작용하는지 여부를 확인하기 위하여, 세포를 MG132와 함께 또는 MG132없이, HA-VHL 및 TGase2 의 발현 벡터와 공동 형질감염시켰으며, 면역블롯 분석을 위한 항-HA 항체를 이용하여 면역침전하였다(도 2b). TGase2를 VHL 침전물내에서 검출하였고, 침전된 VHL의 양은 MG132 처리에 의해 증가하였다(도 2b). 이러한 결과는 VHL이 TGase2와 상호작용하며 VHL 복합체가 프로테아좀-의존적 기전을 통해 분해된다는 것을 나타낸다(도 2a).In order to identify whether the VHL polymer produced via TGase2-catalyzed cross linking is metabolically degraded, we have identified three different proteolytic inhibitors (proteasome inhibitors, lysosomes) for their ability to inhibit VHL degradation. Inhibitors, calpine inhibitors). Reduction of VHL monomers by TGase2 was inhibited by proteasome inhibitor MG132 treatment, but not by calpain or lysosomal inhibitors (FIG. 2A). To determine whether TGase2 and VHL interact directly, cells were co-transfected with expression vectors of HA-VHL and TGase2, with or without MG132 and using anti-HA antibodies for immunoblot analysis. By immunoprecipitation (Fig. 2b). TGase2 was detected in the VHL precipitate, and the amount of precipitated VHL was increased by MG132 treatment (FIG. 2B). These results indicate that VHL interacts with TGase2 and that the VHL complex is degraded via proteasome-dependent mechanisms (FIG. 2A).

VHL 중합체는 쉽게 검출되었으며, MG132 를 처리한 세포에서 중합체의 발현 수준이 증가하였다. 또한, 중합된 TGase2 역시 항-HA 침전내에서 검출하였으며, 이는 TGase2가 중합화를 촉매하는 기능과 더불어 중합화의 기질로서 작용함을 나타낸다(도 2c). VHL이 TGase2의 기질임을 확인하기 위하여, 정제된 재조합 인간 VHL을 정제된 기니아 피그 간 TGase와 함께 체외에서(in vitro) 배양하였다. TGase2는 용량 의존적으로 VHL의 중합을 유도하였다(도 9). 고 분자량 겔 분획(도 9의 화살표 머리)회수 및 MS/MS에 의한 분석으로 VHL이 중합된 단백질 복합체의 주요 구성요소임을 확인하였다(도 10). VHL의 교차연결 부위를 규명하기 위해, 분석된 겔을 MS에 의해 VHL 단량체 및 중합체로 정제하였다. 도 4F는 VHL 단량체 및 중합체의 아미노산 서열을 나타내며, 붉은색 문자는 MS에 의해 확인된 잔기를 나타내고, 파란색 문자는(VHL 중합체 내) 중합 후 차단되는 잔기를 나타낸다. 이러한 결과는 글루타민 164 및 203이 TGase2-유도 VHL 중합화와 관련있다는 것을 나타낸다(도 11).
VHL polymer was easily detected and the expression level of the polymer was increased in the cells treated with MG132. In addition, polymerized TGase2 was also detected in anti-HA precipitation, indicating that TGase2 acts as a substrate for polymerization with the ability to catalyze polymerization (FIG. 2C). To confirm that VHL is a substrate of TGase2, purified recombinant human VHL was incubated in vitro with purified guinea pig liver TGase. TGase2 induced the polymerization of VHL in a dose dependent manner (FIG. 9). Recovery by high molecular weight gel fraction (arrow head in FIG. 9) and analysis by MS / MS confirmed that VHL was a major component of the polymerized protein complex (FIG. 10). To identify the crosslinking site of VHL, the analyzed gels were purified by MS into VHL monomers and polymers. 4F shows amino acid sequences of VHL monomers and polymers, red letters represent residues identified by MS, and blue letters (in VHL polymer) represent residues blocked after polymerization. These results indicate that glutamine 164 and 203 are associated with TGase2-induced VHL polymerization (FIG. 11).

실험예Experimental Example 4:  4: TGaseTGase 억제에 의한  By inhibition VHLVHL 발현 회복이  Manifestation recovery NFNF -κB 활성 억제를 초래함results in inhibition of -κB activity

NF-κB의 활성은 VHL에 의해 하향조절되는 것으로 보고되었다. NF-κB 활성은 VHL이 발현된 세포내에서 Tgase2 억제에 의해 감소하였다. 도 3에서 보는 바와 같이, TGase2-특이적 siRNA 또는 Tgase2 억제자 시스타민을 처리한 HA-VHL 발현 세포에서 NF-κB 활성은 HA-VHL 만 발현된 비처치 세포에서보다 낮았다(각각, 2배 및 2.5배)(도 3a). SEAP 리포터 분석과 동시에, 본 발명자들은 NF-κB DNA 결합 활성을 평가하기 위하여 전기 동력 이동 측정(electrophoretic mobility shift assay ,EMSA)을 수행하였다. 이소성 VHL 단독 발현 또는 TGase2 억제와 함께 발현된 NF-κB DNA 결합 활성을 감소시켰다(도 3b). 세포사멸은 siRNA 단독으로 처리한 세포와 비교하여 TGase2-특이적 siRNA와 함께 처리된 HA-VHL 발현 세포에서 보다 효율적으로 유도되었으며, annexin-Ⅴ 양성 염색 및 절단된 PARP의 상대적 수준으로 측정하였다(도 3c). The activity of NF-κB has been reported to be downregulated by VHL. NF-κB activity was reduced by Tgase2 inhibition in VHL expressed cells. As shown in FIG. 3, NF-κB activity in HA-VHL expressing cells treated with TGase2-specific siRNA or Tgase2 inhibitor cystamine was lower than in HA-VHL-only untreated cells (two-fold and 2.5 times) (FIG. 3A). Simultaneously with the SEAP reporter assay, we performed an electrophoretic mobility shift assay (EMSA) to assess NF-κB DNA binding activity. Reduced NF-κB DNA binding activity expressed with ectopic VHL expression alone or with TGase2 inhibition (FIG. 3B). Apoptosis was induced more efficiently in HA-VHL expressing cells treated with TGase2-specific siRNA compared to cells treated with siRNA alone, measured by relative levels of annexin-V positive staining and cleaved PARP (FIG. 3c).

기존 보고에서 VHL은 IGF-1R의 발현을 억제하는 것으로 나타났다. 시스타민 또는 유전자 녹다운에 의한 TGase2 억제는 이소성 VHL의 안정성을 가져오고, 이는 약물 내성 암 세포주에서 감소된 IGF-1R 수준과 관련되어 있다(도 3d).이러한 결과는 TGase2에 의한 VHL의 하향 조절이 IGF-1R단백질 발현의 필수적임을 나타낸다.
Previous reports have shown that VHL inhibits the expression of IGF-1R. TGase2 inhibition by cystamine or gene knockdown results in the stability of ectopic VHL, which is associated with reduced IGF-1R levels in drug resistant cancer cell lines (FIG. 3D). These results indicate that downregulation of VHL by TGase2 is associated with Indicates that IGF-1R protein expression is essential.

실험예Experimental Example 5:  5: TGase2TGase2 + 형질전환 마우스에서 + In transgenic mice VHLVHL 의 하향조절Down-regulation of

생체 내에서 VHL 및 TGase2 와의 관계를 확인하기 위하여, 본 발명자들은 마우스 TGase2+ 이식 유전자가 도입된 TGase2+ 형질전환 마우스를 제조하였다(도 4a 및 4b). TGase2+ 형질전환 마우스의 신장은 어떠한 조직학적 이상도 보이지 않았으며, 외형도 정상이었다. 면역블롯을 통하여 서로 다른 세가지 야생형 및 TGase2+ 형질전환 마우스의 신장에서 VHL 단백질 수준을 분석한 결과 야생형 마우스보다 TGase2+ 형질전환 마우스에서 VHL 발현 수준이 더 낮은 것으로 나타났다(도 4c). TGase2+ 과발현에 의한 VHL감소가 IGF-1R 단백질 수준에 영향을 주는지 확인하기 위하여, 본 발명자들은 항-IGF-1R 항체를 이용한 면역블롯을 통하여 야생형 및 TGase2+ 형질전환 마우스의 신장 샘플을 분석하였다. IGF-1R 단백질 수준은 예상대로 야생형 마우스보다 TGase2+ 형질전환 마우스에서 더 높게 발현되었다(도 4c). EMSA에 의한 NF-κB DNA 결합 활성의 분석결과, NF-κB 활성이 야생형 마우스와 비교하여 TGase2+ 형질전환 마우스에서 거의 3배 증가하였다(도 4d). 그러므로, VHL 수준은 야생형 마우스와 비교하여 TGase2+ 형질전환 마우스의 신장에서 감소하였으며, 이것은 IGF-1R의 높은 발현수준과 관련이 있다. 이러한 결과는 TGase2+는 VHL을 억제하며, 이로써 생체내에서 NF-κB 활성 및 IGF-1R의 발현이 유도됨을 나타낸다.
In order to confirm the relationship with VHL and TGase2 in vivo, we prepared TGase2 + transgenic mice into which the mouse TGase2 + transplant gene was introduced (FIGS. 4A and 4B). The kidneys of TGase2 + transgenic mice showed no histological abnormalities and the appearance was normal. Analysis of VHL protein levels in kidneys of three different wild-type and TGase2 + transgenic mice via immunoblot showed lower VHL expression levels in TGase2 + transgenic mice than in wild type mice (FIG. 4C). To determine whether VHL reduction by TGase2 + overexpression affected IGF-1R protein levels, we analyzed kidney samples from wild-type and TGase2 + transgenic mice via immunoblot with anti-IGF-1R antibodies. IGF-1R protein levels were expressed higher in TGase2 + transgenic mice than wild type mice as expected (FIG. 4C). As a result of analysis of NF-κB DNA binding activity by EMSA, NF-κB activity was increased almost three-fold in TGase2 + transgenic mice compared to wild type mice (FIG. 4D). Therefore, VHL levels were decreased in the kidneys of TGase2 + transgenic mice compared to wild type mice, which is associated with high expression levels of IGF-1R. These results indicate that TGase2 + inhibits VHL, thereby inducing NF-κB activity and expression of IGF-1R in vivo.

실험예Experimental Example 6: 인간 신장 세포  6: human kidney cells 암종carcinoma 시료에서  In the sample TGase2TGase2 + 및 + And VHLVHL 단백질 수준의  Protein level 역상관Decorrelating 관계 relation

암세포주와 형질전환 TGase2+ 마우스모델에서의 실험결과의 유효성을 확인하기 위해, 즉 TGase2+ 및 VHL 발현의 역관계를 확인하기 위해, 본 발명자들은 면역화학분석으로 인간신장세포 암종(Renal clear cell carcinoma) 조직 시료에서 VHL 및 TGase2의 발현 수준을 확인하였다(도 5). 정상 신장 조직에서는, TGase2가 사구체 세포에 존재하였고, 세뇨관 세포에 상대적으로 낮게 존재한 반면 VHL은 신세뇨관 세포에서 발현이 제한되었다. RCC 암종 조직에서, TGase2의 발현 수준은 일반적으로 증가하였고, VHL 의 발현은 감소하였다. 11개의 인간 RCC 암종 중 9개에서 TGase2 및 VHL 수준간에 역관계를 나타내었다. 도 5 a-d에서 보는 바와 같이, 6번 암에서 거의 완전한 역관계를 나타내었고, 3번 암에서는 TGase2 및 VHL의 양성 발현 영역에서 군데군데 나타났다. 일반적으로, TGase2의 발현이 높은 샘플의 경우, VHL의 발현은 낮거나 없었다(도 5a, b). TGase2의 발현이 낮은 샘플의 경우, VHL의 발현수준은 높았다(도 5c, d). 침습성 전반 세포(invasive front cell)에서, TGase2 발현은 암의 잔여 부분보다 높았으며(도 5e), VHL의 발현은 낮거나 없었다(도 5f). In order to confirm the validity of the experimental results in the cancer cell line and the transformed TGase2 + mouse model, that is, to confirm the inverse relationship between TGase2 + and VHL expression, the present inventors have immunohistochemically analyzed a sample of renal clear cell carcinoma tissue. Expression levels of VHL and TGase2 were confirmed in (FIG. 5). In normal kidney tissues, TGase2 was present in glomerular cells and relatively low in tubular cells, whereas VHL was restricted in renal tubular cells. In RCC carcinoma tissues, expression levels of TGase2 generally increased and expression of VHL decreased. Nine out of eleven human RCC carcinomas showed an inverse relationship between TGase2 and VHL levels. As shown in FIGS. 5A-D, almost complete inversion was seen in cancer 6, and in cancer 3, it was shown in positive regions of TGase2 and VHL. In general, for samples with high expression of TGase2, the expression of VHL was low or absent (Figures 5a, b). In the samples with low expression of TGase2, the expression level of VHL was high (Fig. 5C, d). In invasive front cells, TGase2 expression was higher than the rest of the cancer (FIG. 5E) and the expression of VHL was low or absent (FIG. 5F).

또한, 정상 신장세포인 HEK293 세포주, 그리고 신장암 세포인 786-O, A498, ACHN, CAKI-1, SN12C, TK10 및 U031 세포주에서 VHL 및 TGase2 단백질의 발현 여부를 웨스턴 블랏을 통해 측정한 결과, 정상 신장 세포와는 달리 신장암 세포에서는 모두 TGase2 가 증가하고 VHL 이 감소한 것을 확인하였다 (도 12).In addition, the expression of VHL and TGase2 protein in HEK293 cell line, which is normal kidney cell, and 786-O, A498, ACHN, CAKI-1, SN12C, TK10, and U031 cell lines, which were normal kidney cells, was measured by Western blot. Unlike kidney cells, it was confirmed that TGase2 was increased and VHL was decreased in all kidney cancer cells (FIG. 12).

이러한 결과는 TGase2 및 VHL 발현 간의 역관계를 추가적으로 증명하는 것이다.These results further demonstrate the inverse relationship between TGase2 and VHL expression.

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Claims (11)

TGase2(Transglutaminase 2)의 발현 수준 및 VHL(Von Hippel-Lindau)의 단백질양을 측정하는 제제를 포함하는 신장암 진단용 조성물.
A composition for diagnosing kidney cancer comprising an agent for measuring the expression level of TGase2 (Transglutaminase 2) and the amount of protein in VHL (Von Hippel-Lindau).
제1항에 있어서, 상기 TGase2의 발현 수준을 측정하는 제제는 TGase2 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머, 프로브 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 포함하는 것인 조성물.
The composition of claim 1, wherein the agent for measuring the expression level of TGase2 comprises a primer, probe or antisense oligonucleotide that specifically binds to the TGase2 gene.
제1항에 있어서, 상기 TGase2의 발현 수준을 측정하는 제제는 TGase2 단백질에 특이적인 항체를 포함하는 것인 조성물.
The composition of claim 1, wherein the agent for measuring the expression level of TGase2 comprises an antibody specific for TGase2 protein.
제1항에 있어서, 상기 VHL의 단백질양을 측정하는 제제는 VHL 단백질에 특이적인 항체를 포함하는 것인 조성물.
The composition of claim 1, wherein the agent for measuring the protein amount of VHL comprises an antibody specific for the VHL protein.
제1항에 있어서, VHL의 단백질양은 VHL 단백질의 단량체 또는 VHL 단백질의 중합체의 단백질양인 조성물.

The composition of claim 1, wherein the protein amount of the VHL is the protein amount of a monomer of the VHL protein or a polymer of the VHL protein.

제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 포함하는 신장암 진단용 키트.
Kit for diagnosing kidney cancer comprising a composition according to any one of claims 1 to 5.
제6항에 있어서, 상기 키트는 단백질 칩 키트인 것을 특징으로 하는 키트.
The kit of claim 6, wherein the kit is a protein chip kit.
신장암 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여, (a)신장암이 의심되는 환자의 분리된 시료로부터 TGase2의 발현 수준 및 VHL의 단백질양을 측정하는 단계; 및 (b)상기 TGase2의 발현 수준 및 VHL의 단백질양을 정상 대조구 시료의 TGase2의 발현 수준 및 VHL의 단백질양과 비교하는 단계를 포함하는 신장암 마커 TGase2 및 VHL을 검출하는 방법.
In order to provide information necessary for diagnosing renal cancer, (a) measuring the expression level of TGase2 and the amount of VHL protein from isolated samples of patients suspected of renal cancer; And (b) comparing the expression level of TGase2 and the protein amount of VHL with the expression level of TGase2 and the protein amount of VHL in a normal control sample.
제8항에 있어서, 상기 단계 (a)에서 VHL의 단백질양의 측정은 VHL 단백질의 단량체 또는 VHL 단백질의 중합체의 단백질양을 측정하는 것인 방법.

The method of claim 8, wherein the measuring of the protein amount of the VHL in step (a) is measuring the protein amount of the monomer of the VHL protein or the polymer of the VHL protein.

제8항에 있어서, 상기 TGase2의 발현 수준 및 VHL의 단백질양을 측정하는 것은 해당 단백질에 특이적인 항체를 이용하는 것인 방법.
The method of claim 8, wherein measuring the expression level of TGase2 and the protein amount of VHL is performed using an antibody specific for the protein.
제8항에 있어서, 상기 TGase2의 발현 수준 및 VHL의 단백질양을 측정하기 위한 방법은 웨스턴 블랏, ELISA, 방사선면역분석, 방사 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법, 보체 고정 분석법, FACS 또는 단백질 칩 방법 중 어느 하나를 이용하는 것인 방법.According to claim 8, The method for measuring the expression level of TGase2 and protein amount of VHL is Western blot, ELISA, radioimmunoassay, radioimmunoassay, Oukteroni immunodiffusion, rocket immunoelectrophoresis, tissue immunity staining , Immunoprecipitation assay, complement fixation assay, FACS or protein chip method.
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