KR101258614B1 - PNA microarray chip for a differential diagnosis of the genotype of canine parvovirus and the method for diagnosing using the same - Google Patents
PNA microarray chip for a differential diagnosis of the genotype of canine parvovirus and the method for diagnosing using the same Download PDFInfo
- Publication number
- KR101258614B1 KR101258614B1 KR1020090128806A KR20090128806A KR101258614B1 KR 101258614 B1 KR101258614 B1 KR 101258614B1 KR 1020090128806 A KR1020090128806 A KR 1020090128806A KR 20090128806 A KR20090128806 A KR 20090128806A KR 101258614 B1 KR101258614 B1 KR 101258614B1
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- cpv
- pna
- genotype
- canine parvovirus
- differential diagnosis
- Prior art date
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase
- C12Q1/6837—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase using probe arrays or probe chips
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
- C12Q1/701—Specific hybridization probes
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2525/00—Reactions involving modified oligonucleotides, nucleic acids, or nucleotides
- C12Q2525/10—Modifications characterised by
- C12Q2525/107—Modifications characterised by incorporating a peptide nucleic acid
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Immunology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Virology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
본 발명은 개 파보바이러스 유전자형 감별진단을 위한 PNA 마이크로어레이 칩 및 이를 이용한 감별진단법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 특정 PNA(Peptide nucleic acid) 프로브 및 프라이머를 이용한 하이브리드화(hybridization)를 통해 정확하게 개 파보바이러스 타입 2의 4종류 유전형, 즉 CPV-2, -2a, -2b 및 -2c를 신속하고 정확하게 감별진단할 수 있는 개 파보바이러스 유전자형 감별진단용 PNA 마이크로어레이 칩 및 이를 이용한 감별진단법에 관한 것이다.The present invention relates to a PNA microarray chip for differential diagnosis of canine parvovirus genotype and to a differential diagnosis method using the same, and more specifically, to accurately dig a dog through hybridization using a specific PNA (Peptide nucleic acid) probe and primer. The present invention relates to a PNA microarray chip for differential diagnosis of canine parvovirus genotype capable of rapidly and accurately discriminating four genotypes of virus type 2, namely CPV-2, -2a, -2b and -2c.
PNA 마이크로어레이, 어레이 칩, 개 파보바이러스, 유전형 감별진단법 PNA microarray, array chip, canine parvovirus, genotyping
Description
본 발명은 개 파보바이러스 유전자형 감별진단을 위한 PNA 마이크로어레이 칩 및 이를 이용한 감별진단법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 특정 PNA(Peptide nucleic acid) 프로브 및 프라이머를 이용한 하이브리드화(hybridization)를 통해 정확하게 개 파보바이러스 타입 2의 4종류 유전형, 즉 CPV-2, -2a, -2b 및 -2c를 신속하고 정확하게 감별진단할 수 있는 개 파보바이러스 유전자형 감별진단용 PNA 마이크로어레이 칩 및 이를 이용한 감별진단법에 관한 것이다.The present invention relates to a PNA microarray chip for differential diagnosis of canine parvovirus genotype and to a differential diagnosis method using the same, and more specifically, to accurately dig a dog through hybridization using a specific PNA (Peptide nucleic acid) probe and primer. The present invention relates to a PNA microarray chip for differential diagnosis of canine parvovirus genotype capable of rapidly and accurately discriminating four genotypes of
개 파보바이러스(CPV: Canine parvovirus)는 고양이 파보바이러스에서 유래되었고, 1978년 이전까지는 CPV-2가 유행하였으나 이후 CPV-2a가 출현하였으며, 개에 병원성이 강해 장염으로 피해가 크고 특히 어린강아지에서는 폐사율이 매우 높았다. 1984년부터는 CPV-2b가 유행하였으며, 오늘날에는 CPV-2c가 출현하여 항원들 의 변형으로 인한 병원성의 차이들을 보이고 있다. Canine parvovirus (CPV) was derived from feline parvovirus, and CPV-2 prevailed until 1978, but CPV-2a appeared afterwards. This was very high. Since 1984, CPV-2b has been in vogue. Today, CPV-2c has emerged, showing differences in pathogenicity due to alteration of antigens.
기존에 개 파보바이러스로 인해 국내 반려견 등에서 개 파보바이러스로 인한 피해가 많이 보고되고 있으나 기존백신과의 유전적 타입이 맞지 않고 또한 1980년대 이후 개 파보바이러스에 대한 항원적변이가 캡시드유전자에서 발생하여 병원성이 더욱 강해지고 있다. 현재 국내는 타입 2a, 변형된 2a 및 2b가 최근에 조사되었는데 이탈리아 등에서는 병원성이 강한 타입 2c가 출현한 상태이고, 이 항원은 계속 변이가 진행되고 있는 상황이라 새로운 타입의 바이러스가 출현할 가능성도 매우 높다. The dog parvovirus has been reported to cause damage caused by dog parvovirus in domestic dogs, but the genetic type of the existing vaccine does not match, and since the 1980s, the antigenic mutation of dog parvovirus has occurred in the capsid gene. This is getting stronger. In Korea,
국내에서는 CPV-2 백신 9품목이 허가되어 시판되고 있으나, 야외항원검사에서는 CPV-2a가 주를 이루고 있고 간혹 CPV-2b가 출현하고 있어 제품화된 백신주들이 실질적인 야외 활동 주들과는 차이가 있어 백신의 교체뿐만 아니라 보다 정밀한 SNP를 이용한 PNA 마이크로어레이 칩 개발의 필요성이 대두되고 있다.Nine CPV-2 vaccines have been approved and marketed in Korea. However, CPV-2a is mainly used in the field antigen test, and sometimes CPV-2b is emerging. In addition, there is a need to develop PNA microarray chips using more precise SNPs.
이에 본 발명자들은 기존에 PCR법에서 다루지 못한 개 파보바이러스의 유전형별 감별시스템 개발을 통하여 지속적인 야외주들의 항원변이 양상을 측정하고자 노력한 결과, 개 파보바이러스 타입 2의 4종류의 유전형(CPV-2, -2a, -2b 및 -2c) 감별을 위한 6개의 PNA 프로브 및 프라이머 등을 이용한 하이브리드화를 통해 신속하고 정확하게 개 파보바이러스 유전형을 감별진단할 수 있음을 발견하고 본 발명을 완성하게 되었다.Therefore, the present inventors have tried to measure the antigenic variation of continuous outdoor strains by developing a system for distinguishing canine parvovirus, which is not covered by the PCR method. As a result, four genotypes of canine parvovirus type 2 (CPV-2, -2a, -2b and -2c) The hybridization using six PNA probes and primers for differentiation allows the rapid and accurate differential diagnosis of canine parvovirus genotypes.
따라서, 본 발명의 목적은 신속하고 정확하게 개 파보바이러스 유전형을 감별진단할 수 있는 PNA 마이크로어레이 칩 및 이를 이용한 개 파보바이러스 유전형 감별진단법을 제공하는 것이다.Accordingly, an object of the present invention is to provide a PNA microarray chip capable of rapidly and accurately discriminating canine parvovirus genotypes and a canine parvovirus genotyping method using the same.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에서는 서열번호 1 내지 6의 펩타이드 핵산을 포함하는 개 파보바이러스 유전형 감별진단용 PNA 마이크로어레이 칩을 제공한다.In order to achieve the above object, the present invention provides a PNA microarray chip for dog parvovirus genotype differential diagnosis comprising the peptide nucleic acids of SEQ ID NO: 1 to 6.
또한 본 발명에서는 상기 PNA 마이크로어레이 칩을 이용하여 개 파보바이러스 유전형을 감별진단하는 방법을 제공한다.The present invention also provides a method for differentially diagnosing canine parvovirus genotype using the PNA microarray chip.
본 발명에 의한 PNA 마이크로어레이 칩은 기존에 DNA 마이크로어레이 칩보다 훨씬 감도가 높고 SNP(single nucleotide polymorphim)를 이용한 진단이 가능하여 염기서열 1개 또는 2개의 차이만 갖고도 유전형을 구별할 수 있는 고감도 진단법을 제공할 수 있었다.The PNA microarray chip according to the present invention is much more sensitive than the conventional DNA microarray chip and can be diagnosed using SNP (single nucleotide polymorphim), so it is possible to distinguish genotype with only one or two nucleotide sequences. Could provide diagnostics.
이하 본 발명을 보다 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail.
본 발명은 하기 표 1에 기재된 서열번호 1 내지 6의 펩타이드 핵산(PNA)을 포함하는 개 파보바이러스 유전형 감별진단용 PNA 마이크로어레이 칩에 관한 것이다:The present invention relates to a canine parvovirus genotype differential diagnosis PNA microarray chip comprising peptide nucleic acids (PNAs) of SEQ ID NOs: 1 to 6 as described in Table 1 below:
번호order
number
상기 PNA 서열 중 굵게 표시된 서열은 잠재적 불일치(potential mismatch) 서열이고, 박스 안의 서열들은 305 또는 426 위치의 아미노산 서열이다.The bolded sequence in the PNA sequence is a potential mismatch sequence, and the sequences in the box are amino acid sequences at positions 305 or 426.
본 발명에 의한 펩타이드 핵산(PNA)법은 일반 DNA 마이크로어레이법과 유사하게 하이브리드화 과정을 거쳐 수행되는 방법으로서, 기존의 DNA 프로브 대신 PNA 프로브를 사용함으로써 1∼2개의 염기 서열 차이만으로도 유전형을 감별할 수 있는 고감도 진단법이다. Peptide nucleic acid (PNA) method according to the present invention is a method carried out through a hybridization process similar to the general DNA microarray method, by using a PNA probe instead of a conventional DNA probe to distinguish genotypes by only one or two base sequence differences It is a highly sensitive diagnostic method.
또한 본 발명은 상기 PNA 마이크로어레이 칩을 이용하여 개 파보바이러스 유전형을 감별진단하는 방법에 관한 것으로, 하기 단계들을 포함한다:The present invention also relates to a method for differential diagnosis of canine parvovirus genotype using the PNA microarray chip, comprising the following steps:
1) 샘플에서 DNA를 추출하는 단계;1) extracting DNA from the sample;
2) 표적 DNA를 PCR로 증폭시키는 단계;2) amplifying the target DNA by PCR;
3) 서열번호 1 내지 6의 PNA 프로브와 상기 2)에서 증폭시킨 표적 DNA를 하이브리드화시키는 단계;3) hybridizing the PNA probe of SEQ ID NO: 1 to 6 and the target DNA amplified in 2);
4) 상기 3)의 결과물을 스캐닝하는 단계; 및4) scanning the output of 3); And
5) 상기 4)의 스캐닝 결과를 판독하여 유전형을 결정하는 단계.5) determining the genotype by reading the scanning result of 4).
도 1에서는 개 파보바이러스 유전자타입 감별진단을 위한 PNA 마이크로어레이 칩과 표적 DNA가 하이브리드화되는 반응 과정을 보여준다. 즉, 기판 위에 PNA 프로브를 개 파보바이러스 유전자형별로 6-아미노헥실 링커(6-aminohexyl linker)를 달아 유리기판 위에 심어 놓고 PCR로 증폭시킨 바이오틴 라벨-PCR 산물을 첨가하면 PNA와 바이오틴 라벨-PCR 산물이 하이브리드를 형성하게 된다.1 shows a reaction process in which a target DNA is hybridized with a PNA microarray chip for differential diagnosis of canine parvovirus genotype. In other words, a PNA probe was placed on a substrate by attaching a 6-aminohexyl linker for each of the dog parvovirus genotypes, and adding a PCR product, which was amplified by PCR, to produce PNA and biotin label-PCR products. It will form a hybrid.
도 2는 PNA 어레이 화학반응 모식도이다. PNA 프로브와 표적 DNA가 하이브리드에 의해 결합하는 모양과 바이오틴, 스트렙타비딘(streptavidin) 및 알칼라인포스파타제에 의해 발색되는 과정을 보여준다.2 is a schematic diagram of PNA array chemistry. PNA probe and target DNA are shown to be hybridized and developed by biotin, streptavidin and alkaline phosphatase.
도 3은 본 발명에 의한 PNA 마이크로어레이 칩을 사용하여 개 파보바이러스 유전형을 감별진단하는 과정을 전반적으로 보여주는 모식도로서, 처음 토탈 DNA 추출에서부터 PCR에 의한 표적 DNA 증폭 및 하이브리드화 이후 장비에 의한 스캔 및 판독 등의 일련의 과정을 보여준다.Figure 3 is a schematic diagram showing the differential diagnosis of the dog parvovirus genotype using the PNA microarray chip according to the present invention, the first DNA extraction from the first DNA PCR by target DNA amplification and hybridization after scanning and equipment Shows a series of processes such as reading.
도 4a 및 4b는 본 발명에 의한 PNA 마이크로어레이 판독 매뉴얼로서, 개 파보바이러스 음성일 경우 무반응이고, CPV-2인 경우에는 프로브 CP1과 CP4; 또는 CP1과 CP3 반응 시 나타나며, CPV-2a인 경우에는 프로브 CP2와 CP3 반응 시, CPV-2b인 경우에는 프로브 CP2와 CP5 반응 시 나타나고, 또한 CPV-2c인 경우에는 프로브 CP6와 반응하여 나타난다.4A and 4B are PNA microarray reading manuals according to the present invention, which are non-responsive when dog parvovirus negative, and probes CP1 and CP4 when CPV-2; Or when CP1 and CP3 are reacted, and when CPV-2a is used, probes CP2 and CP3 are reacted, and when CPV-2b is shown, when probes CP2 and CP5 are reacted, and when CPV-2c, it is reacted with probe CP6.
본 발명에 의하나 개 파보바이러스 유전자형 감별진단은 SNP가 가능하므로 민감도 및 특이도가 매우 낮은 기존의 DNA 마이크로어레이법으로는 감별되지 않았던 개 파보바이러스의 유전자형을 신속하고 정확하게 감별진단할 수 있는 것이 특징이다.According to the present invention, the canine parvovirus genotype differential diagnosis can be SNP, so that the genotype of canine parvovirus that is not discriminated by the conventional DNA microarray method with low sensitivity and specificity can be quickly and accurately differentiated. to be.
이하, 본 발명의 내용을 실시예 및 시험예를 통하여 보다 구체적으로 설명한다. 이들 실시예는 본 발명의 내용을 이해하기 위해 제시되는 것일 뿐 본 발명의 권리범위가 이들 실시예로 한정되는 것은 아니고, 당업계에서 통상적으로 주지된 변형, 치환 및 삽입 등을 수행할 수 있으며, 이에 대한 것도 본 발명의 범위에 포함된다.Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to examples and test examples. These examples are provided only for understanding the contents of the present invention, and the scope of the present invention is not limited to these examples, and modifications, substitutions, and insertions commonly known in the art may be performed. This is also included in the scope of the present invention.
[실시예 1] PNA 프로브 제작Example 1 Preparation of PNA Probe
VP2 단백질의 305 아미노산과 406 아미노산 자리는 검출감도 조사에서 10에서 100 카피(copies) 정도의 감도를 보였으며, 절단 시그널(Cut off signal)은 2500으로 정하였다. 또한 116개의 야외샘플들에 대한 적용시험에서 개 파보바이러스 타입 2a와 2b가 단독감염으로 나타났으며, 타입 2a 및 2b가 동시에 검출된 것은 1개의 샘플에서 나타나 민감성과 특이성이 매우 우수한 것으로 판명되었다.The 305 amino acids and 406 amino acid sites of the VP2 protein showed sensitivity of 10 to 100 copies in the sensitivity detection, and the cut off signal was set to 2500. In addition,
따라서, 개 파보바이러스 4가지 유전자형(CPV-2, -2a, -2b 및 -2c)을 감별하기 위한 PNA 프로브 합성 부위를 VP2 유전자 내에 913 부터 915 bp 위치의 GTA(CPV-2)와 TAT(CPV-2a, -2b 및 -2c)로 선정하고, 또한 VP2 유전자 내에 핵산 1,276 부터 1,278 bp 위치의 AAT(CPV-2 및 CPV-2a), GAT(CPV-2b) 및 GAA(CPV-2c)를 추가로 선정한 후 서열번호 1 내지 6의 PNA 프로브를 다음과 같이 합성하였다.Therefore, a PNA probe synthesis site for discriminating four canine parvovirus genotypes (CPV-2, -2a, -2b, and -2c) was selected from GTA (CPV-2) and TAT (CPV-2) at positions 913 to 915 bp in the VP2 gene. -2a, -2b and -2c), and also added AAT (CPV-2 and CPV-2a), GAT (CPV-2b) and GAA (CPV-2c) at nucleic acids 1,276 to 1,278 bp in the VP2 gene. After selecting the PNA probe of SEQ ID NO: 1 to 6 was synthesized as follows.
PNA 프로브 합성은 15-20 mer로 벤조티아졸-2-설포닐(Bts: benzothiazole-2-sulfonyl)을 사용하였으며, 아질런트(Agilent) 1100 액체크로마토그라피 기기를 사용하여 순도를 측정하였고, 정성검사는 MALDI-TOF를 이용하였다. 또한 농도는 나노드롭(NanoDrop ND-1000) 기기를 이용하여 측정하였으며, PNA 프로브는 슬라이드 글라스 표면 위에 50 μM/10 ㎕ 씩 부착하였다. 부착기기는 aQu 솔리드 핀(aQu solid pins: PNA 프로브를 유리글래스 위에 심는 방식으로서 위로 바르게 선방향으로 로딩하는 방법) 방식이 부착된 정밀 PNA 배열기(Qarray mini Microarrayer)를 사용하였으며, 습도는 75-85%를 유지하였다.PNA probe synthesis was carried out using 15-20 mer benzothiazole-2-sulfonyl (Bts: benzothiazole-2-sulfonyl), and the purity was measured using an Agilent 1100 liquid chromatography device. MALDI-TOF was used. In addition, the concentration was measured using a NanoDrop ND-1000 instrument, and PNA probes were attached to the surface of the slide glass by 50 μM / 10 μl. The attachment device used a precision PNA array (Qarray mini Microarrayer) attached with aQu solid pins (a method of loading the PNA probe on the glass glass and loading it upright linearly). 85% was maintained.
[실시예 2] 개 파보바이러스 유전형 감별진단Example 2 Differential Diagnosis of Canine Parvovirus Genotype
상기 실시예 1에서 제조한 PNA 프로브들을 도 4a에 도시된 바와 같이 배열한 PNA 마이크로어레이 칩을 제조하였다. A PNA microarray chip was prepared in which the PNA probes prepared in Example 1 were arranged as shown in FIG. 4A.
야외 샘플에서 채취한 개 파보바이러스 4개 유전자(CPV-2, -2a, -2b 및 -2c)의 DNA를 추출하여 플라스미드에 클로닝하였고, PCR 증폭을 위하여 하기 표 2에 기재된 바이오틴 라벨된 프라이머 2쌍을 제작하였다. 이때, PCR 증폭조건은 95℃에 5분간 예비변성(predenature)을 수행하고, 이어서 95℃ 30초간 변성, 50℃에서 60초간 어닐링, 및 72℃에서 60초간 확장(elongation)하는 사이클을 45회 수행한 후 마지막으로 72℃에서 7분간 확장하였다. DNA of four dog parvovirus genes (CPV-2, -2a, -2b and -2c) taken from an outdoor sample was extracted and cloned into plasmids, and two pairs of biotin-labeled primers described in Table 2 below for PCR amplification Was produced. At this time, PCR amplification conditions were performed for 5 minutes predenature (predenature) at 95 ℃, followed by 45 cycles of denaturation at 95 ℃ 30 seconds, annealing at 50 ℃ 60 seconds, and elongation at 72 ℃ 60 seconds. Finally, the mixture was expanded at 72 ° C. for 7 minutes.
하이브리드화 과정은 토탈 하이브리다이제이션 용량은 80 ㎕로 PCR 산물인 바이오틴 라벨된 표적 DNA 10 ㎕와 3 ㎕ Cy5-스트렙타비딘이 포함된 PNA 하이브리드화 완충액(5ⅹSSC, 0.5% SD) 70 ㎕를 혼합한 다음 상기 PNA 마이크로어레이 칩에 40℃로 2시간동안 반응시켰다. The hybridization process was 80 μl of total hybridization, and 10 μl of PCR product biotin-labeled target DNA and 70 μl of PNA hybridization buffer (5 μSSC, 0.5% SD) containing 3 μl Cy5-streptavidin. Next, the PNA microarray chip was reacted at 40 ° C. for 2 hours.
상기 하이브리드화 반응이 완료되면 5분씩 2회 세척 완충액(3x SSPE 완충액(0.005% 트리톤 X-100 함유))으로 세척하고 건조한 후 비공초점 형광 스캐너(non-confocal fluorescent scanner GenePix 4000B)로 반응물을 스캔하였다. 형광 시그날은 프로브 표적 듀플렉스(probe-target duplexes)의 하이브리드화 시그날로 계산하여 유전자형을 판정하였다. 최적의 컷-오프(cut-off) 형광시그날 값은 2500 이상으로 고정하였다.Upon completion of the hybridization reaction, the reaction was washed twice with 5 minute wash buffer (3 × SSPE buffer (containing 0.005% Triton X-100)), dried and scanned with a non-confocal fluorescent scanner GenePix 4000B. . Fluorescent signals were calculated by hybridization signals of probe-target duplexes to determine genotypes. The optimal cut-off fluorescence signal value was fixed at 2500 or higher.
상기 과정을 거쳐 CPV-2, -2a, -2b 및 -2c의 연속계대희석에 따른 시그날 감도를 관측한 결과를 도 5에 나타내었다[A: CPV-2, B: CPV-2a, C: CPV-2b, D: CPV-2c]. 각 커브는 3번 반복한 값의 평균이고, 에라바는 시그날 감도의 평균차를 의미한다.Through the above process, the result of observing the signal sensitivity according to the continuous passage dilution of CPV-2, -2a, -2b and -2c is shown in Figure 5 [A: CPV-2, B: CPV-2a, C: CPV -2b, D: CPV-2c]. Each curve is the average of the values repeated three times, and errava means the average difference of signal sensitivity.
상기 도 5의 결과에서 알 수 있듯이, 본 발명에 의한 개 파보바이러스 감별진단용 PNA 마이크로어레이 칩은 기존에 개발된 개 파보바이러스 진단용 PCR법 및 실시간 유전자검출법보다 재현성 및 정확성이 탁월하였으며, 116개 야외샘플에 대하여 특이도와 민감도가 100%인 결과를 보였다. As can be seen from the results of FIG. 5, the PNA microarray for diagnosing canine parvovirus according to the present invention was superior in reproducibility and accuracy than the previously developed canine parvovirus diagnostic PCR and real-time gene detection method, and 116 field samples. The specificity and sensitivity were 100% for.
본 발명에 의한 개 파보바이러스 유전형 감별진단용 PNA 마이크로어레이 칩은 기존의 DNA 마이크로어레이 칩을 사용할 때 보다 개 파보바이러스 유전형에 따른 질병을 정확하고 신속하게 진단할 수 있으며, 일선 대학동물병원 및 민간병성감정기관 등에서 이를 이용한 정확한 진단 및 치료가 가능하므로 복합감염에 따른 치사율을 감소시킬 수 있다. PNA microarray chip for canine parvovirus genotype differential diagnosis according to the present invention can diagnose diseases according to canine parvovirus genotype more accurately and faster than when using conventional DNA microarray chips, and can be used for front-line university animal hospitals and folk diseases. It is possible to reduce the mortality rate due to the complex infection because it is possible to accurately diagnose and treat it in institutions.
따라서, 본 발명에 의한 개 파보바이러스 유전형 감별진단용 PNA 마이크로어레이 칩은 차세대 진단체계에 도입이 가능하며, 동물 질병, 축산물 및 식중독 분야 등에서 다양하게 응용이 가능하고, 동물복지 차원에서 반려견의 귀중한 생명을 보장할 수 있을 것으로 사료된다.Therefore, the PNA microarray chip for canine parvovirus genotype differential diagnosis according to the present invention can be introduced into the next generation diagnostic system, and can be applied in various fields such as animal diseases, animal products, and food poisoning, and can save valuable lives of dogs in terms of animal welfare. It can be guaranteed.
도 1은 개 파보바이러스 유전자타입 감별진단을 위한 PNA 마이크로어레이 칩과 표적 DNA의 반응 모식도이다. Figure 1 is a schematic diagram of the reaction of the target DNA and PNA microarray chip for the differential diagnosis of dog parvovirus genotype.
도 2는 PNA 어레이 화학반응 모식도이다. 2 is a schematic diagram of PNA array chemistry.
도 3은 본 발명에 의한 PNA 마이크로어레이 칩을 사용하여 개 파보바이러스 유전형을 감별진단하는 과정을 전반적으로 보여주는 모식도이다. Figure 3 is a schematic diagram showing the overall process of differential diagnosis of the dog parvovirus genotype using the PNA microarray chip according to the present invention.
도 4a 및 4b는 본 발명에 의한 PNA 마이크로어레이 판독 매뉴얼이다.4A and 4B are PNA microarray read manuals according to the present invention.
도 5는 CPV-2, -2a, -2b 및 -2c의 연속계대희석에 따른 시그날 감도를 보여준다[A: CPV-2, B: CPV-2a, C: CPV-2b, D: CPV-2c].5 shows signal sensitivity according to serial passage dilution of CPV-2, -2a, -2b and -2c [A: CPV-2, B: CPV-2a, C: CPV-2b, D: CPV-2c] .
<110> REPUBLIC OF KOREA(Management: Ministry for Food, Agriculture, Forestry and Fisheries. National Veterinary Research and Quarantine Service(NVRQS)) <120> PNA array chip for a differential diagnosis of the genotype of canine parvovirus and the method for diagnosing using the same <130> YPD/200911-0044 <160> 10 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 17 <212> DNA <213> Canine parvovirus <400> 1 tcctatatca ccaaagt 17 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Canine parvovirus <400> 2 ctcctatata accaaagtt 19 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Canine parvovirus <400> 3 tacattatca tttgttacag 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Canine parvovirus <400> 4 tacattatca ttcgttacag 20 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Canine parvovirus <400> 5 aatacattat catctgttac a 21 <210> 6 <211> 18 <212> DNA <213> Canine parvovirus <400> 6 attatcttct gttactgg 18 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CPV 305 forward primer <400> 7 acaaatagag cattgggctt 20 <210> 8 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CPV 305 reverse primer <400> 8 ctcataatag tagcttcag 19 <210> 9 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CPV 426 forward primer <400> 9 caacaggaga aacacctg 18 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CPV 426 reverse primer <400> 10 aatatattag tatagttaat t 21 <110> REPUBLIC OF KOREA (Management: Ministry for Food, Agriculture, Forestry and Fisheries.National Veterinary Research and Quarantine Service (NVRQS)) <120> PNA array chip for a differential diagnosis of the genotype of canine parvovirus and the method for diagnosing using the same <130> YPD / 200911-0044 <160> 10 <170> Kopatentin 1.71 <210> 1 <211> 17 <212> DNA <213> Canine parvovirus <400> 1 tcctatatca ccaaagt 17 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Canine parvovirus <400> 2 ctcctatata accaaagtt 19 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Canine parvovirus <400> 3 tacattatca tttgttacag 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Canine parvovirus <400> 4 tacattatca ttcgttacag 20 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Canine parvovirus <400> 5 aatacattat catctgttac a 21 <210> 6 <211> 18 <212> DNA <213> Canine parvovirus <400> 6 attatcttct gttactgg 18 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CPV 305 forward primer <400> 7 acaaatagag cattgggctt 20 <210> 8 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> CPV 305 reverse primer <400> 8 ctcataatag tagcttcag 19 <210> 9 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CPV 426 forward primer <400> 9 caacaggaga aacacctg 18 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CPV 426 reverse primer <400> 10 aatatattag tatagttaat t 21
Claims (3)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020090128806A KR101258614B1 (en) | 2009-12-22 | 2009-12-22 | PNA microarray chip for a differential diagnosis of the genotype of canine parvovirus and the method for diagnosing using the same |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020090128806A KR101258614B1 (en) | 2009-12-22 | 2009-12-22 | PNA microarray chip for a differential diagnosis of the genotype of canine parvovirus and the method for diagnosing using the same |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20110072039A KR20110072039A (en) | 2011-06-29 |
| KR101258614B1 true KR101258614B1 (en) | 2013-04-29 |
Family
ID=44403015
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020090128806A KR101258614B1 (en) | 2009-12-22 | 2009-12-22 | PNA microarray chip for a differential diagnosis of the genotype of canine parvovirus and the method for diagnosing using the same |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR101258614B1 (en) |
-
2009
- 2009-12-22 KR KR1020090128806A patent/KR101258614B1/en active IP Right Grant
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| J Clin Microbiol, Vol. 47, No. 6, pp1785-1790 (2009.08.15 온라인 공개) * |
| J Clin Microbiol, Vol. 47, No. 6, pp1785-1790 (2009.08.15 온라인 공개)* |
| J Vet Med Sci, Vol. 70, No. 8, pp769-775 (2008.08) * |
| J Vet Med Sci, Vol. 70, No. 8, pp769-775 (2008.08)* |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR20110072039A (en) | 2011-06-29 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR101378214B1 (en) | Sample analysis method and assay kit for use in the method | |
| KR100702415B1 (en) | Kits and method for detecting human papilloma virus with oligo nucleotide bead array | |
| KR101810786B1 (en) | PNA probe set for detecting Kudoa septempunctata | |
| CN104928355A (en) | Method and kit thereof for detecting BRAF gene mutation | |
| KR20220024253A (en) | High sensitive multiplex loop-mediated isothermal amplification primer set for detection of novel coronavirus-19 | |
| CN110241259A (en) | A kind of the HRM detection method and its primer of 1 type astrovirus of quick differentiation goose and 2 type astrovirus of goose | |
| US20090258342A1 (en) | Optimized probes and primers and methods of using same for the detection, quantification and grouping of hiv-1 | |
| KR101623489B1 (en) | High Definition Probe for detecting microorganism causing sexually transmitted disease and kit using the same | |
| KR101258614B1 (en) | PNA microarray chip for a differential diagnosis of the genotype of canine parvovirus and the method for diagnosing using the same | |
| KR101334054B1 (en) | Probes for discriminating whiteflies, DNA chip and kit for discriminating whiteflies, and method for discriminating whiteflies using the same | |
| KR101335483B1 (en) | Method of Detecting Human Papilloma Virus and Genotyping Thereof | |
| JP5613160B2 (en) | Method for detecting or analyzing a target sequence in genomic DNA | |
| KR102149373B1 (en) | Primer set for detecting rift valley virus and uses thereof | |
| KR102293563B1 (en) | Composition for simultaneous detection of swine enteric coronavirus and use thereof | |
| KR101247972B1 (en) | PNA microarray for differential diagnosis of aerobic gram-negative food poisoning bacteria and the method for differential diagnosis using the same | |
| An et al. | Peptide nucleic acid-based (PNA) array for the antigenic discrimination of canine parvovirus | |
| US7927804B2 (en) | Method of forming signal probe-polymer | |
| KR101423303B1 (en) | Probe and primer for gene diagnosis of NDC viral pathogens, and method of diagnosis using the same | |
| JP2011004733A (en) | Microarray for detecting target nucleic acid in a plurality of specimens | |
| KR20100042464A (en) | Method for detecting at least one of salmonella pullorum and salmonella gallinarum in sample and kit | |
| CN104611470A (en) | Gene chip for detecting bluetongue virus and detecting method of same | |
| KR101247975B1 (en) | PNA microarray for differential diagnosis of aerobic gram-positive food poisoning bacteria and the method for differential diagnosis using the same | |
| KR102496413B1 (en) | Primer sets for simultaneous detection of human rhinovirus and enterovirus D68 | |
| KR102470988B1 (en) | Single nucleotide polymorphism marker for identification of Brucella abortus and primer set for detection | |
| KR101293674B1 (en) | PNA probes, PNA array chips and the method for identifying anaerobic bacteria of food poisoning |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A201 | Request for examination | ||
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| E601 | Decision to refuse application | ||
| J201 | Request for trial against refusal decision | ||
| J301 | Trial decision |
Free format text: TRIAL DECISION FOR APPEAL AGAINST DECISION TO DECLINE REFUSAL REQUESTED 20120426 Effective date: 20121203 |
|
| GRNT | Written decision to grant |