KR101250284B1 - 소나무잔나비버섯으로부터 분리된 열안정성 셀로비오하이드롤라제 및 이의 생산방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 소나무잔나비버섯으로부터 분리한 셀로비오하이드롤라제에 관한 것으로, 고온에서도 뛰어난 열안정성을 갖는 셀로비오하이드롤라제를 제공한다.

Description

소나무잔나비버섯으로부터 분리된 열안정성 셀로비오하이드롤라제 및 이의 생산방법 {Thermostable cellobiohydrolase purified from Fomitopsis pinicola and method of production thereof}

본 발명은 소나무잔나비버섯(Fomitopsis pinicola)으로부터 분리한 우수한 열안정성을 갖는 셀로비오하이드롤라제 및 이를 생산하는 방법에 관한 것이다.

식물 세포벽의 주성분인 셀룰로스는 지구상에서 얻을 수 있는 가장 풍부한 재생가능한 바이오매스이다. 셀룰로스는 β-1,4-D-글루코시드 결합에 의해 결합된 100-10,000 β-D-글루코피라노실 유닛으로 구성된 선형 생-중합체이다. 식물 다당류의 가수분해를 촉매하는 미생물성 셀룰라아제는 산업 및 농업 셀룰로스-함유 잔류물을 당화하고 제지 산업에서 셀룰로스 펄프 폐기물을 처리하고 맥주 양조 및 알코올 발효 산업 등에서 발효가능한 물질의 추출을 증가시키는데 사용된다. 셀룰로스 분해에는 다음의 세가지 활성성분으로 구성된 다중효소 시스템이 필요하다: 엔도-1,4-β-글루카나제 (EG, EC 3.2.1.4), 셀로비오하이드롤라제 (CBH, EC 3.2.1.91), 및 β-글루코시다제 (BGL, EC 3.2.1.21). EG 및 CBH는 셀룰로스를 셀로비오스 및 짧은 다당류로 해중합시키는 과정에 협력적이고 상조적으로 작용하며, 해중합물은 BGL에 의해 글루코스로 변화된다. CBH는 고도로 정렬된 결정 셀룰로스에서 가장 효과가 좋으며 글루코스 사슬의 반대 말단으로부터 주로 셀로비오스를 절단하며 EG는 사슬의 중간부, 아마도 셀룰로스에서 좀더 무정형인 영역에 무작위로 작용한다.

셀룰로스 가수분해 과정에서, 효소 생성은 여전히 가장 결정적이고 비용이 많이 드는 단계이다. 사상 진균류는 셀룰라제 및 헤미셀룰라제의 주요 원천이다. 셀로비오하이드롤라제(Cellobiohydrolases; CBHs)는 다중효소 셀룰라제 복합체에서 중요한 성분이고 이들은 중합체 기질에서 엑소-타입(exo-type)의 공격을 보이며 셀룰로스에서의 이들의 작용으로 인한 주요 생성물은 셀로비오스이다. 이들은 아미노산 서열 유사성에 따라 세 가지 글루코시드 히드롤라제 패밀리 (GH6, GH7 및 GH48)로 분류된다. 이러한 패밀리 중, GH7만이 독점적으로 진균류인 것으로 생각되며 이 패밀리는 자낭균류 및 연자균류의 진균류 둘 다로부터의 CBHI 셀로비오하이드롤라제 및 EGI 엔도글루카나제를 포함한다. 잠재성있는 셀룰로스분해 진균류는 일반적으로 두 개의 상이한 CBH인 CBHI 및 CBHII를 생산한다. 서열 동일성에 기초하여 분류된 상기 두 유형의 효소는 연장된 터널형 활성 부위를 가지며 엔도글루카나제의 도움 없이도 셀룰로스 결정을 느리지만 완전하게 용해시킬 수 있다.

셀룰로스 분해 효소인 셀로비오하이드롤라제는 농업, 제지 산업, 주류 양조 분야 뿐만 아니라 바이오 연료 생산 분야에서도 사용되는 등 그 수효가 늘어나고 있다. 따라서, 기존의 셀로비오하이드롤라제가 아닌 신규의 미생물 및 효소 시스템을 탐색하여 높은 온도 조건 하에서도 활성도를 유지하는 셀로비오하이드롤라제를 개발하기 위한 노력이 계속되고 있다.

본 발명은 상기와 같은 점들을 감안하여 예의 연구를 진행한 결과 안출한 것으로, 특히 소나무잔나비버섯(Fomitopsis pinicola)으로부터 분리한 우수한 열안정성을 갖는 셀로비오하이드롤라제(CBH) 및 이의 생산방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 상기 목적은 소나무잔나비버섯으로부터 셀로비오하이드롤라제(CBH)를 분리하고 이의 특이 활성, pH, 환원당 수치를 측정하고, 분자량을 결정하고 pH 또는 온도에 따른 활성을 측정하고, 열 불활성화를 평가하고, 활성에서 기질 농도의 효과를 측정함으로써 달성하였다.

본 발명의 소나무잔나비버섯으로부터 분리된 셀로비오하이드롤라제(CBH)는 고온에서도 우수한 활성을 나타내는 뛰어난 효과가 있다.

도 1은 볏짚에서 소나무잔나비버섯 KMJ812에 의한 CBH 생성시 시간 경과에 따른 특이 활성, pH 및 잔여 환원당 수치를 나타낸 것이다.
도 2a 및 도 2b는 소나무잔나비버섯으로부터 정제된 CBH의 PAGE 및 분자량 결정을 나타낸 것이다. 도 2a는 소나무잔나비버섯으로부터 정제된 CBH의 PAGE로서, 라인 1은 분자량 마커이고 라인 2는 세포 추출물이며 라인 3은, DEAE 이온-교환 분획이고 라인 4는 MonoQ 이온 교환 분획의 SDS-PAGE이다. 도 2b는 세파크릴 S-300 고해상도 컬럼 상의 겔 여과 크로마토그래피에 의한 소나무잔나비버섯 CBH의 분자량 결정을 나타낸 것이다. 컬럼을 알도스(168 kDa), 오브알부민(43 kDa), 키모트립시노겐(25 kDa) 및 리보누클레아제 A(13.7 kDa)와 같은 표준 분자량 단백질로 조정했다.
도 3은 소나무잔나비버섯 CBH의 활성에서 pH 및 온도의 효과를 나타낸 것이다. 도 3의 (A)는 소나무잔나비버섯 KMJ812로부터 정제된 CBH의 활성에서 pH의 효과를 나타낸 것이다. 효소 활성을 요구되는 pH를 얻기 위해 버퍼를 바꾸면서 표준 검정 방법으로 측정하였다. 버퍼로는 시트르산염(pH 3.0 내지 4.5), 아세트산나트륨(pH 4.5 내지 6.0) 및 인산염(pH 6.0 내지 8.0)을 사용했다. 도 3의 (B)는 소나무잔나비버섯 KMJ812로부터 정제된 CBH의 활성에서 온도의 효과를 나타낸 것이다. 효소 활성을 표준 검정 방법을 사용하여 다양한 온도에서 검정했다. 각 수치는 3회 측정치의 평균이며 평균으로부터 15% 이상 변하지 않는다.
도 4는 소나무잔나비버섯 CBH의 열 불활성화를 나타낸 것이다. 효소를 40℃, 50℃, 65℃ 및 70℃에서 시간을 달리하여 배양했다. 시료는 각 시간 간격에서 회수되었으며 상대적 활성도를 측정했다.
도 5는 소나무잔나비버섯 CBH의 활성에서 기질 농도의 효과를 나타낸 것이다. 효소(1 유닛)의 CBH 활성을 pH 5.0의 pNPC의 다양한 농도에서 측정했다. 그래프는 초기 속도 대 다양한 고정된 pNPC 농도의 라인위버-버크 플롯을 나타낸다. 각 수치는 삼중 측정치의 평균이며 평균으로부터 15% 이상 변하지 않는다.

여러 균주로부터의 CBH의 정제 및 특성이 보고되었지만, 담자균류인 소나무잔나비버섯으로부터 CBH를 정제하고 특성화하는 것은 본 발명에서 처음으로 보고되었다. 그리고 본 발명에서는 지금까지 보고된 가장 높은 CBH 활성을 나타내는 유일한 소나무잔나비버섯 CBH를 나타낸다.

소나무잔나비버섯으로부터 정제된 세포외 CBH는 64 kDa의 분자량을 갖는 단량체이다. 이 CBH의 분자량은 다른 진균류 원천으로부터 특성화된 많은 세포외 CBH의 분자량과 일치한다.

본 발명의 CBH는 1) 소나무잔나비버섯 배양액을 원심분리한 후 세척하는 단계; 2) 세척액과 상청액을 혼합하고 농축한 후 여과하여 조효소액을 수득하는 단계; 및 3) 상기 조효소액을 컬럼 크로마토그래피로 정제하는 단계를 통해 생산된다.

실시예 1. CBH 생성 균주의 스크리닝

모든 진균류 균주들은 KACC(Korean Agricultural Culture Collection)로부터 입수했다. CBH 생성 진균류의 초기 스크리닝을 10 mM MUC를 포함하는 한천 평면배지에서 실시했다. 관찰된 형광 부분을 기초로, 15개 균주를 펩톤 8 g/l, 이스트 추출물 2 g/l, KH₂PO₄ 5 g/l, K₂HPO₄ 5 g/l, MgSO₄ㆍ7H₂O 3 g/l, 티아민ㆍHCl 0.005 g/l 및 셀룰로스 20 g/l(Sigma, MO, USA)을 포함하는 3 ml 성장 배지에 접종하고 28 ℃에서 7일간 200 rpm으로 교반하면서 배양했다. 배약액의 CBH 활성을 p-니트로페닐-β-D-셀로비오사이드(pNPC, Sigma, MO, USA)를 사용하여 분석했다 분석 후에, 가장 높은 CBH 활성을 갖는 균주를 선택했다. 15개 균주 이외에, 효과적인 CBH-생산 소나무잔나비버섯 KMJ812를 추가 연구를 위해 선택했다. 표 1은 상이한 균주들에서 CBH 생산 수준을 나타낸다.

실시예 2. 소나무잔나비버섯의 배양

플라스크 배양에서, 소나무잔나비버섯 KMJ812의 균사를 100 ml의 포테이토 덱스트로스 배양액에 접종했다. 전배양체(5 ml)를 1L 발효조 내에서 200 ml 셀룰로스분해 배지에 접종했다. 이 배양 배지는 펩톤 8 g/l, 효모 추출물 2 g/l, KH₂PO₄ 5 g/l, K₂HPO₄ 5 g/l, MgSO₄ㆍ7H₂O 3 g/l, 티아민ㆍHCl 0.005 g/l 및 미세결정 셀룰로스 20 g/l을 포함한다. CBH 생성에서 탄소원 또는 질소원의 효과를 50 g/l의 탄소원 및 다양한 질소원으로 구성된 배지를 함유하는 플라스크에서 17일간 배양한 후 조사했다. 질소원의 농도는 Kjeldahl 방법을 사용하여 질소의 동일 함량으로 조절했다. CBH 생산에 사용된 배지는 펩톤 8 g/l, 효모 추출물 2 g/l, KH₂PO₄ 5 g/l, K₂HPO₄ 5 g/l, MgSO₄ㆍ7H₂O 3 g/l, 티아민ㆍHCl 0.005 g/l 및 볏짚 20 g/l을 포함한다.

실시예 3. CBH 생성을 위한 탄소원 및 질소원의 최적화

CBH 생성을 위한 적합한 탄소원을 선택하기 위해, 소나무잔나비버섯 KMJ812을 효모 추출물(10 g/l) 및 다양한 탄소원(셀룰로스, 볏짚, 밀기울, 자일란, 아비셀, CMC, 셀로비오스, 글루코스, 말토스, 락토스, 수크로스 또는 나무 섬유)를 포함하는 배지에 배양했다. 실험된 탄소원 중에서, 볏짚이 CBH 생성에 가장 적합한 탄소원임을 발견하였으며, 이는 플라스크 배양액 내에서 4.1 U mg-단백질^-1의 CBH-특이 활성을 이끌어낸다(표 2 참조).

세포외 효소의 형성을 좌우하는 메가니즘이 단백질 합성을 위한 전구체의 유효성에 의해 영향을 받으므로, CBH 합성에서 무기 및 유기 질소원의 효과 또한 실험했다(표 2 참조). 볏짚(20 g/l)을 탄소원으로 사용했다. 다양한 질소원(펩톤, 옥수수 침출 분말, 효모 추출물, 요오드, 황산암모늄, 질산칼륨 및 질산나트륨) 중에서, 효모 추출물(5 g/l) 및 펩톤(5 g/l)의 조합에서 CBH 생성이 최대였고(4.6 U mg-단백질^-1) 그 다음이 효모 추출물이었으며, 그외 다른 질소원은 pH 조절이 없는 조건 하에서 적합하지 못했다. 볏짚, 효모 추출물 및 펩톤에서 성장한 소나무잔나비버섯에 의한 CBH 생성의 시간 경로를 실험했다(도 1 참조). CBH 활성은 17일까지 증가한 후 차츰 감소했다.

실시예 4. 효소 검정

CBH 활성을 기질로서 p-NPC (Sigma)을 사용하여 검정했다. 100 mM 아세트산나트륨 버퍼(pH 5.0)에 용해된 100 ml 의 효소 용액 및 10 mM p-NPC (최종 농도) 를 포함하는 효소학적 작용 혼합물(1ml)을 50 ℃에서 15분간 배양했다. 반응 혼합물에 2M Na₂CO₃을 첨가한 후 방출된 p-니트로페놀의 양을 405nm에서 측정했다. p-NPC-가수분해 활성의 한 유닛은 분 당 1 μmol의 p-니트로페놀이 방출되는 효소 등가물의 양으로서 규정되었다.

실시예 5. 셀로비오하이드롤라제의 정제

모든 과정을 4℃에서 실시했으며 다르게 언급되지 않는 한 1 mM 디티오트레이톨(dithiothreitol; DTT)을 포함하는 50 mM 인산칼륨 버퍼(pH 7.0)를 정제 과정에 사용했다. 단백질을 우혈청 알부민을 표준으로 사용하여 Bradford 방법(Bradford, M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 1976, 72, 248-254)으로 측정했다. 컬럼 유출물 내의 단백질을 280 nm에서 흡광도를 측정하여 찾아냈다. 모든 크로마토그래피 분리는 AKTA FPLC 시스템(AKTA, Sweden)을 사용하여 실시했다.

1단계: 조효소의 제조. 30분간 10,000 x g으로 원심분리하여 배양 육즙으로부터 세포를 회수했다. 20 mM 아세트산나트륨 버퍼(pH 5.0)로 세척한 후, 세척액과 상청액을 혼합하고 농축한 후 교반 셀(Amicon, Beverly, MA, USA)에서 폴리에스테르 술폰 맴브레인(30kDa 컷오프)를 통한 한외여과로 탈염시켰다.

2단계: DEAE 세파로스 크로마토그래피. 투석된 효소 용액을 pH 5.0의 20 mM 아세트산나트륨 버퍼로 평형화시킨 DEAE Sepharose^TM 패스트 플로우(Fast Flow) 컬럼 (1.6 x 10 cm, Amersham Biosciences)에 충진시킨 후 1.0 ml/분의 유속에서 동일한 버퍼 내의 0-0.5 M NaCl의 180-분 선형 구배로 단백질을 용출시켰다. 각각 1　mL의 구획을 모아 CBH 활성에 대해 검정했다. 활성 구획을 모아 동일한 버퍼에 대해 투석한 후 추가 정제를 위해 한외여과로 농축시켰다.

3 단계: 세파크릴(Sephacryl)겔 여과 크로마토그래피. 농축된 효소 용액을 pH 5.0의 100　mM NaCl을 포함하는 20 mM 아세트산나트륨 버퍼로 평형화시킨 HiPrep 16/60 세파크릴 S-300 HR 컬럼(1.0 cm x 120 cm, Amersham Biosciences)에 충진시키고 0.5 ml/분의 유속으로 동일한 버퍼로 단백질을 용출시켰다. 활성 분획을 모아 동일한 버퍼에 대해 투석시키고 한외여과하여 농축시켰다.

4 단계: MonoQ이온 교환 크로마토그래피. 미리 20 mM 아세트산나트륨(pH 5.0)으로 평형화시킨 MonoQ 이온 교환 크로마토그래피 컬럼 5/50 GL　(1.0 x 10 cm, Amersham Biosciences)로 효소를 추가 정제하였다. 효소를 0.5 ml/분의 유속으로 동일한 버퍼 내의 0-0.5 M NaCl의 180-분 선형 구배로 단백질을 용출시켰다. 결합된 활성 분획을 모아 농축하고 동일한 버퍼에 대해 투석하고 30 kDa 분자량 컷오프의 센트리온(Centricon) (Millipore, Bedford, MA, USA) 한외여과 장치로 농축시킨 후 다음 실험에서 정제된 효소로서 사용했다.

CBH 를 상기와 같이 정제하고 그 결과를 표 3에 나타냈다.

한외여과에 의한 분획화는 CBH 활성의 13% 회수율로, 특이 활성이 약 2배 증가했다. 활성 분획을 DEAE 세파로스 컬럼에 적용시키고 CBH를 대략 0.1 M NaCl로 용출시켰다. 그 후의 겔 여과 단계로 단백질을 함유하는 3개의 피크를 생성했다; 두 번째 피크가 CBH 활성을 나타냈다. 0.5 M NaCl을 수반하는 MonoQ 이온 교환 크로마토그래피 컬럼의 FPLC 용출로 활성 CBH 단백질 피크를 생성했다. 이러한 크로마토그래피 방법으로 0.1%의 회수율을 갖는 7배 정제된 CBH를 산출했다. SDS의 존재 하에 겔 전기영동에 의한 정제 효소의 분석(도 2A-4 레인)은 64,000±1,000의 M _r을 갖는 하나의 밴드를 나타낸다. 세파크릴 S-300 고해상도 컬럼(high resolution column) 상의 크기 배제 크로마토그래피로 대략 64,000 의 M _r 에 상응하는 대칭 피크로서 효소 활성의 용출을 실시했다(도 2B). 이러한 결과들은 효소가 온화한 조건 하에서 겔 여과시 단량체로서 이동하므로 또한 용액 내에서 단량체로 존재하고 활성화될 수 있음을 나타낸다.

실시예 6. pH 및 온도 최적조건 결정

CBH의 최적pH를 50　℃에서 상이한 버퍼(시트르산염(100　mM, pH 3-4.5), 아세트산나트륨(100　mM, pH 4.5-5.5), 인산염(100　mM, pH 5.5-8)) 내에 15분간 정제된 효소를 배양하여 결정했다. 최적 온도를 결정하기 위해, 효소를 30 내지 80　℃의 상이한 온도에서 15분간 아세트산나트륨 버퍼(100　mM, pH 5)에서 배양했다. CBH의 열안정성을 결정하기 위해, 정제된 효소를 기질 없이 상이한 온도(30℃- 70℃)에서 배양시켰다. 일정 시간 동안(0-25d) 동안 유지시킨 후, 잔여 CBH 활성을 상기와 같이 결정했다.

CBH의 최적 pH는 5.0으로, pH 4.5 및 5.5에서 각각 90% 및 93%의 최대 활성을 나타낸다(도 3의 A 참조). 산성 pH 최적조건 및 약 pH 4.5에서의 최대 활성이 다른 종류의 미생물 시스템으로부터 분리된 유사한 CBH 효소의 공통적인 특성이다. 등전점(pI)은 5.1로 결정되었으며, 이는 세포외 CBH에서 일반적인 것이다. 가수분해 작용을 위한 최적 온도는 50℃이며 45 및 55℃에서 각각 80% 및 95%의 최대 활성을 나타낸다(도 3의 B 참조).

실시예 7. 소나무잔나비버섯 CBH의 열안정성

정제된 CBH의 열안정성을 40℃ 내지 80℃의 다양한 온도에서 실험했다. 열안정성 검정에 따라, 정제된 소나무잔나비버섯 CBH는 60℃에서 24시간 동안 배양했을 때 매우 안정하고 90%까지의 활성을 유지한다. 70℃에서 8시간 배양한 후 약 90%의 활성을 유지했다. 80℃ 이상의 온도에서, CBH 활성은 배양 시간에 따라 급격하게 감소한다. 효소는 40℃, 50℃, 60℃ 및 70℃에서 각각 552 시간, 144 시간, 96시간 및 42 시간의 t_1/2 수치를 나타낸다(도 4).

실시예 8. PAGE 및 분자 질량 결정

서브유닛 분자량의 결정에서, Laemmli의 문헌(Laemmli. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 1970, 227, 680-685)에 기재된 바와 같이 10% 겔에서 SDS-PAGE(sodium dodecylsulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)를 실행했다. 단백질 밴드를 쿠마시 브리릴언트 블루 R-250 (Sigma)로 발색시켰다. 정제된 효소의 분자 질량을 AKTA FPLC 시스템(GE health care)에 수반된 Superose^TM 12 (Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden) 컬럼을 사용하여 크기 배제 크로마토그래피하여 결정했다. 효소를 0.5 ml/분의 유속으로 20 mM 아세트산나트륨(pH 5.0)으로 용출시켰다.

실시예 9. 기질 특이성

CBH의 기질 특이성을 기질로서 10mM 농도로 p-니트로페닐-β-D-셀로비오사이드 (pNPC), p-니트로페닐-β-d-글루코피라노사이드 (pNPG), pNP-β-갈락토피라노사이드 (pNPgal), pNP-β-D-만노피라노사이드 (pNPM), pNP-β-D-자일로피라노사이드 (pNPX), pNP-β-D-락토피라노사이드 (pNPL), 셀로비오스, 셀로트리오스, 셀로테트라오스, 셀로펜토스를 사용하여 결정했다. 다당류 카르복시메틸셀룰로스(polysaccharides carboxymethylcellulose; CMC), 자일란, 리케난(lichenan), 라미나린 및 아비셀(1%)에서의 CBH 활성 또한 실험했다. 방출된 p-니트로페놀을 표준 효소 검정 조건 하에서 결정했다. 올리고당의 활성을 GOD-POD 방법(Lin, J.; Pillay, B.; Singh, S. Purification and biochemical characterization of β-glucosidase from a thermophilic fungus, Thermomyces lanuginosus - SSBP.Biotechnol. Appl. Biochem. 1999, 30, 81-87)을 사용하여 방출된 글루코스의 양을 검정하여 측정했다. 다당류에서의 활성을 표준으로서 글루코스 또는 자일로스를 사용한 DNS 방법(Miller, G.L. Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar. Anal. Chem. ,1959, 31, 426-428)에 의해 방출된 한원당을 측정하여 평가했다.

다양한 기질과 함께하는 소나무잔나비버섯 CBH의 활성을 표 4에 나타냈다. pNPL, 아비셀 및 리케난이 각각 42.1%, 29.6% 및 33.8%의 활성을 보이는 반면, 다른 화합물들은 기질로서 작용하지 않았다. 소나무잔나비버섯 CBH는 중합체 셀룰로스 및 자일란에 대해서 거의 완전하게 불활성을 나타내나 pNPC에 대해서는 높은 활성을 나타낸다.

실시예 10. 동역학적 파라미터 및 저해 상수의 결정

CBH의 미카엘리스 상수(Michaelis constant) (K_m) 및 최대 속도(maximum velocity) (V_max)의 수치를 0.5 내지 50　mM 범위 농도의 오트스펠트 pNPC와 함께 50℃에서 100 mM 아세트산나트륨 버퍼(pH 5) 내에 배양시켜 결정했다. 셀로비오스에 의한 CBH의 저해를 pNPC를 기질로서 사용하여 결정했다. K_m 및 V_max 및 K_i 의 수치를 표준 선형 회귀 기술을 사용하여 라인위버-버크 플롯(Lineweaver-Burk plots)으로부터 결정했다.

초기 속도를 pH 5.0의 표준 검정 혼합물에서 결정했다. 실험된 모든 기질은 쌍곡선 포화 곡선을 나타내며 상응하는 이중-역수 플롯은 선형이다. pNPC의 농도는 0 내지 50 mM로 다양하다. 도 5는 pNPC 농도 증가에 따른 CBH 활성에 대한 통상적인 미카엘리스-멘텐-유형 동역학을 나타낸다. 표준 검정 조건 하에서 pNPC의 변환에 대해 산출된 라인위버-버크 플롯(도 5에 삽입됨)은 2.1의 K _m 및 31.1μmol min^-1 mg^-1의 V_max를 나타낸다. 불포화 조건 하에서의 산물 저해 연구는 14.8 mM의 K _i 수치로, 셀로비오스가 CBH 경쟁성을 억제함을 나타낸다.

실시예 11. 금속 및 시약의 효과

CBH 활성에서 1　mM의 다양한 금속 이온 및 시약의 효과를 30℃에서 20 mM 아세트산나트륨 버퍼(pH 5.0) 내에 개별 시약과 함께 효소를 30분간 미리 배양하여 결정했다. 그런 다음 활성을 금속 이온 또는 시약의 존재 하에 50℃에서 15분간 측정했다. 금속 이온 및 시약 없이 검정된 활성을 100%로 기록했다.

CBH 활성은 BaCl₂, MgCl₂, MnCl₂, ZnCl₂, CaCl₂, NiCl₂, or CoCl₂ (각각 1 mM 농도)에 의해 자극되지 않았으며, 1 내지 10 mM 범위 농도의 EDTA에 의해서 저해되지도 자극되지도 않았다. 이와는 반대로, Hg²⁺ 이온은 기질 pNPC에 대해 경쟁적인 유의할만한 저해(60%)를 나타냈다. N-에틸말레이미드(N-ethylmaleimide; NEM)는 종종 효소를 불활성시키는데 사용되는데 이는 아마도 시스테인 잔기가 티올기와 작용함에 의한 것이다. 10 mM NEM과 함께 정제된 CBH를 배양하면 CBH 활성의 대략 30% 저해를 야기하는데, 이는 시스테인이 CBH 활성에 적어도 부분적으로 반응한다는 것을 보여준다. NEM으로 절반-최대 저해(t_1/2)에 도달하는데 걸리는 시간은 대략 6분이다.

실시예 12. CBH의 내부 아미노산 서열

정제된 단백질을 SDS-PAGE로 분해시킨 후 폴리비닐리덴 트리플루오라이드 맴브레인(Bio-Rad) 상에 일렉트로블롯팅시켰다(electroblotted). 펩티드 맴핑을 위해 100 ng 의 엔도프로테나제 Asp-N 또는 엔도프로테나제 Lys-C 또는 트립신(Promega, Madison, WI, USA)과 함께 37℃에서 4시간 동안 단백질 절단을 실시하여 50 ㎕의 100 mM (NH₄)₂CO₃ (pH 8.5) 내의 20㎍의 정제된 효소를 분해했다. 결과적으로 생성된 펩티드 단편을 SDS-PAGE (15% 폴리아크릴아미드)로 분리하고, 분리된 펩티드를 일렉트로블롯팅하여 폴리비닐리덴 트리플루오라이드 맴브레인 상으로 옮겼다. 펩티드 밴드를 40% 메탄올 내의 0.1% 쿠마시 브릴리언트 블루 R-250 염색으로 발색시켰다. 부분 아미노산 서열을 농업과학공동기기센터(The National Instrumentation Center for Environmental Management; Seoul, Korea)에서 자동 단백질 서열기(model 491A; Applied Biosystems, Division of Perkin-Elmer)를 사용하여 에드만 분해로 결정했다. 부분 아미노산 서열을 논리던던트 단백질 데이터베이스(nonredundant protein database)의 BLAST 검색을 통해 유사 단백질을 확인하는데 사용했다.

실시예 13. 부분적 펩티드 단편의 동정

순수한 효소(1.5-mg)를 10% SDS-PAGE로 분리하고 폴리비닐리덴 플루오라이드(polyvinylidene fluoride; PVDF) 맴브레인으로 블로팅시켰다. 효소 단백질의 자동화 에드만 분해가 실패하였는데 이는 효소의 N-말단이 차단되었음을 의미한다. CBH를 트립신, 엔도프로테나제 Asp-N 및 엔도프로테나제 Lys-C로 부분적으로 절단한 후, 12.5% SDS-PAGE로 분리하고 PVDF 맴브레인 상에 블롯팅했다. Lys-C 단편(LYS), Asp-N 단편(ASP) 및 트립신 단편(TRY)의 3개 단편을 자동화 단백질 서열결정기로 서열결정했다. LYS 단편은 RFLEQYDK 절편을 포함한다. TRY 및 ASP 단편은 각각 GGLEAMGESLDR 및 TYLMQD 절편을 포함한다.

실시예 14. 다양한 CBH의 특성 비교

표 5는 다른 미생물 유래의 다양한 CBH의 특성 비교를 나타낸다. 비교에서, 다른 진균류로부터 pNPC에 대한 정제된 CBH의 K _m 수치는 0.58 내지 6.8 범위이다. 그러므로, 소나무잔나비버섯 CBH의 K _m 수치 (2.1 mM)는 다른 진균류 유래의 CBH에 대해 보고된 것과 일치한다. 그러나, 소나무잔나비버섯 CBH의 촉매 효능 수치 (k _cat/K _m = 15.8 mM^-1s^-1)는 트리코데르마 레세이(Trichoderma reesei) (0.045 mM^-1s^-1), 탈라로마이세스 에메르소니(Talaromyces emersonii) (2.52 mM^-1s^-1), 크리소스포리움 룩노웬제(Chrysosporium lucknowense) (0.17 mM^-1s^-1), 셀룰로모나스 피미(Cellulomonas fimi) (8.0 mM^-1s^-1) 등으로부터 유래한 다른 CBH보다 상당히 높다. 소나무잔나비버섯으로부터 정제된 세포외 CBH는 64 kDa의 분자량을 갖는 단량체이다. 이 CBH의 분자량은 다른 진균류 원천으로부터 특성화된 많은 세포외 CBH의 분자량과 일치한다.

알맞은 호열성 진균류인 탈라로마이세스 에메르소니(Talaromyces emersonii)의 CBH1A는 80℃에서 0.57 시간의 t_1/2 수치를 나타낸다. 트리코데르마 레세이(Trichoderma reesei)가 70℃의 최적 온도를 보이지만, 65 ℃ 에서 이의 t_1/2 는 1시간 미만이다. 소나무잔나비버섯 CBH의 t_1/2 수치 (70℃에서 42시간)는 체토미움 터모필루스(Chaetomium thermophilus) CT2 (70℃에서 1시간), 페니실리움 잔티넬리움(Penicillium janthinellum) (65℃에서 0.67시간), 트라메테스 베르시컬러(Trametes versicolor) (60℃에서 0.5 시간) 등으로부터 유래된 다른 CBH보다 더 높다. 그러므로, 소나무잔나비버섯 CBH는 진균류로부터 분리된 CBH 중 가장 높은 열안정성을 나타내며, 이는 이들이 잠재직인 산업 용도를 가진다는 것을 제시하는 것이다.

아미노산 서열 유사성에 기초하여, GH는 7가지 패밀리로 분류되는데 대부분의 CBH는 패밀리 6, 패밀리 7 또는 패밀리 48에 속한다. 이러한 패밀리 중에서 GH7만이 독점적으로 진균류인 것으로 여겨지며, 이 패밀리는 자낭균류 및 담자균류 유래CBHI 셀로비오하이드롤라제 및 EGI 엔도글루카나제를 포함한다. 중온성 진균류인 트리코데르마 레세이(Trichoderma reesei)(Divne, C.; Stahlberg, J.; Reinikainen, T.; Ruohonen, L.; Pettersson, G.; Knowles, J.K.; Teeri, T.T.; Jones, T.A. The three-dimensional crystal structure of the catalytic core of cellobiohydrolase I from Trichoderma reesei. Science 1994, 265, 524-528) 및 파네로체데 크리소스포리움(Phanerochaete chrysosporium)(Munoz, I.G.; Ubhayaseker,a W.; Henriksson, H.; Szabo I.; Pettersson, G.; Johansson, G.; Mowbray, S.L.; Stahlberg, J. Family 7 cellobiohydrolases from Phanerochaete chrysosporium: crystal structure of the catalytic module of Cel7D (CBH58) at 1.32 A resolution and homology models of the isozymes. J. Mol. Biol. 2001, 314, 1097-1111), 호열성 진균류인 탈라로마이세스 에메소니(Talaromyces emersonii)(Grassick, A.; Murray, P.G.; Thompson, R.; Collins, C.M.; Byrnes, L.; Birrane, G.; Higgins, T.M.; Tuohy, M.G. Three-dimensional structure of a thermostable native cellobiohydrolase, CBH IB, and molecular characterization of the cel7 gene from the filamentous fungus, Talaromyces emersonii. Eur. J. Biochem. 2004, 271, 4495-506) 및 멜라노카르푸스 알보마이세스(Melanocarpus albomyces)(Parkkinen, T.; Koivula, A.; Vehmaanpera, J.; Rouvinen, J. Crystal structures of Melanocarpus albomyces cellobiohydrolase Cel7B in complex with cello-oligomers show high flexibility in the substrate binding. Protein Sci. 2008, 17, 1383-1394) 유래의 CH7 CBH 촉매 모듈의 삼차원 구조를 풀었다. 전체 폴드는 β-샌드위치로, β-샌드위치로부터 연장된 루프는 소나무잔나비버섯 단편 GGLEAMGE와 유사한 GGLKQMGE 서열을 갖는 파네로체데 크리소스포리움(P. chrysosporium)의 수반되는 셀룰로스-결합 터널 CBH를 형성한다. 소나무잔나비버섯 CBH의 펩티드 단편인 RFLEQYDK 및 GGLEAMGESLDR은 각각 CH7에 속하는 celA[셀룰로모나스 플라비제나 DSM20109 (Cellulomonas flavigena DSM 20109)] 및 cel3A[쉬조필룸 콤무네 (Schizophyllum commune)] CBH의 단편과 동일하다. 효소학적 및 생물정보학적 실험으로부터의 증거들이 소나무잔나비버섯 CBH가 GH7의 맴버로 분류됨을 확실히 증명했다.

본 발명의 셀로비오하이드롤라제는 뛰어난 열안정성을 갖는 특징이 있어 산업상 매우 유용한 발명인 것이다.

Claims (1)

1. 소나무잔나비버섯 균사 배양액을 볏짚을 포함한 발효배지에서 발효한 다음 원심분리한 후 아세트산 나트륨 버퍼로 세척하는 단계;
   상기 세척액과 상청액을 혼합하고 농축한 후 한외여과하여 탈염시켜 조효소액을 수득하는 단계;
   및
   상기 조효소액을 DEAE 세파로스 컬럼 크로마토그래피로 정제한 후 활성분획을 한외여과로 농축한 다음, 세파크릴겔 여과 크로마토그래피를 수행하여 활성분획을 한외여과하고 다시 모노큐이온 교환 컬럼 크로마토그래피를 수행하는 단계로 구성된 것이 특징인 소나무잔나비버섯 균사 유래의 열 안정성 셀로비오하이드롤라제 생산방법.

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