KR101240209B1

KR101240209B1 - 대식세포의 자식작용 억제제 및 촉진제

Info

Publication number: KR101240209B1
Application number: KR1020100115388A
Authority: KR
Inventors: 전태훈; 박훈정; 이석준
Original assignee: 고려대학교 산학협력단
Priority date: 2010-11-19
Filing date: 2010-11-19
Publication date: 2013-03-07
Also published as: KR20120088059A

Abstract

본 발명은 대식세포의 자식작용 억제제 및 촉진제에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 인터루킨-10을 유효성분으로 함유하는 대식세포의 자식(autophagy)작용 억제제 및 인터루킨-10과 IL-10 수용체의 결합 저해제 또는 PI3 kinase Ⅰ의 활성화 저해제를 유효성분으로 포함하는 대식세포의 자식(autophagy)작용 촉진제에 관한 것이다.
본 발명에 따르면 기아(starvation)에 의해 유도된 대식세포의 자식(autophagy)작용을 IL-10이 효과적으로 억제함을 확인하였으며, IL-10에 의한 자식작용의 억제는 IL-10의 세포내 신호전달 과정 중 PI3 kinase Ⅰ의 활성화를 유도하여 일어나는 것을 증명하였다.

Description

대식세포의 자식작용 억제제 및 촉진제 {Inhibiting and promoting agent for autophagy of Dendritic cell}

본 발명은 대식세포의 자식작용 억제제 및 촉진제에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 인터루킨-10을 유효성분으로 함유하는 대식세포의 자식(autophagy) 작용 억제제 및 인터루킨-10과 IL-10 수용체의 결합 저해제 또는 PI3 kinase Ⅰ의 활성화 저해제를 유효성분으로 포함하는 대식세포의 자식(autophagy) 작용 촉진제에 관한 것이다.

자식(自食, autophagy) 작용은 오토파고좀(autophagosome)을 형성하여, 기아(starvation)와 같은 스트레스 상황에서 오래된 단백질이나, 기능을 잃은 기관(organ) 또는 세포질안의 구성물들을 제거하고, 병원체 감염 시에는 병원체를 제거하는 등 세포의 항상성을 유지하는 중요한 라이소좀 분해 작용이다 [Baehrecke, E.H., 2005. Autophagy: dual roles in life and death? Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6, 505-510; Yang, Z. and Klionsky, D.J., 2009. An overview of the molecular mechanism of autophagy. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 335, 1-32]. 자식작용은 결핵균(Mycobacterium tuberculosis), 바이러스(virus)와 같은 병원체 감염기간 동안 내재면역(innate immunity) 기능을 수행하며, MHC class Ⅱ를 통한 항원 제시와 같은 적응면역 기능 또한 수행한다 [Tallet al., 2002. Regulation of starvation- and virus-induced autophagy by the eIF2alpha kinase signaling pathway. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 190-195; Gutierrez et al., 2004. Autophagy is a defense mechanism inhibiting BCG and Mycobacterium tuberculosis survival in infected macrophages. Cell 119, 753-766; Deretic, V., 2006. Autophagy as an immune defense mechanism. Curr. Opin. Immunol. 18, 375-382]. 자식작용의 조절기작은 주로 사이토카인(cytokine)과 관련되어 있다. 한 예로, IFN-γ와 TNF-α는 자식작용의 양성 조절자이며, IL-4와 IL-13은 자식작용을 억제한다 [Petiot et al., 2000. Distinct classes of phosphatidylinositol 30-kinases are involved in signaling pathways that control macroautophagy in HT-29 cells. J. Biol. Chem. 275, 992-998; Arico et al., 2001. The tumor suppressor PTEN positively regulates macroautophagy by inhibiting the phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B pathway. J. Biol. Chem. 276, 35243-35246; Yamamoto et al., 2006. Autophagy-mediated clearance of huntingtin aggregates triggered by the insulin signaling pathway. J. Cell. Biol. 172, 719-731].

한편, IL-10은 처음에는 Cytokine synthesis inhibitory factor로 알려져 있을 만큼, 염증 반응을 억제하는 사이토카인으로 알려져 있다 [Mosmann et al., 1986. Two types of murine helper T cell clone. I. Definition according to profiles of lymphokine activities and secreted proteins. J. Immunol. 136, 2348-2357]. IL-10은 B 림프구, 2형 보조 T 림프구(Th2 lymphocyte), 비만세포, 단핵구, 대식세포, 수지상세포, 조절 T 림프구(regulatory T lymphocyte) 등에서 발현되며, 대식세포, 단핵세포, 수지상세포에서 주요 염증 사이토카인의 합성을 억제하고, MHC class Ⅱ의 발현 등을 억제함으로, 주요 항 염증 사이토카인으로 알려져 있다 [O’Garra, A. and Murphy, K.M., 2009. From IL-10 to IL-12: how pathogens and their Products stimulate APCs to induce T(H)1 development. Nat. Immunol. 10, 929-932].

IL-10과 자식(autophagy) 작용은 둘 다 면역반응에서 중요한 역할을 하고 있으나, 자식작용에서 IL-10이 어떠한 영향을 미치는 지에 대해서는 아직 연구되어지지 않았다.

이에, 본 발명자들은 상기 종래기술들의 문제점들을 극복하기 위하여 예의 연구 노력한 결과, 자식작용을 유도시킨 대식세포에 IL-10을 처리하는 경우, 자식작용에 의해 생성되는 오토파고좀을 효과적으로 억제시킴을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 주된 목적은 인터루킨-10(IL-10)을 이용한 대식세포의 자식작용 억제제를 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 IL-10과 IL-10 수용체의 결합 저해제 또는 PI3 kinase Ⅰ의 활성화 저해제를 이용한 대식 세포의 자식작용 촉진제를 제공하는데 있다.

본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 인터루킨(Interleukin)-10을 유효성분으로 함유하고, 상기 인터루킨-10은 세포내 신호전달과정 중 PI3 kinase Ⅰ의 활성화를 유발하여 자식작용을 억제하는 것을 특징으로 하는 대식세포의 자식(autophagy)작용 억제제를 제공한다.

본 발명의 억제제에 있어서, 상기 인터루킨-10(IL-10)은 대식세포의 세포막에 있는 IL-10 수용체에 결합하는 것을 특징으로 한다.

인터루킨-10은 염증 반응에 관여하는 사이토카인으로서 대식세포, 단핵세포, 수지상세포에서 주요 염증 사이토카인의 합성을 억제하고, MHC class Ⅱ의 발현 등을 억제한다.

상기 PI3 kinase Ⅰ은 IL-10과 IL-10 수용체의 신호 전달 역할을 하는 신호 분자(signaling molecule)로서, IL-10이 IL-10 수용체에 결합하게 되면 PI3 kinase Ⅰ의 활성화가 일어난다. 도 5에 나타낸 바와 같이, IL-10에 의한 자식(autophagy) 작용의 억제 경로는 IL-10에 의해 활성화된 PI3 kinase Ⅰ은 하부 신호 분자인 Akt 및 p70S6K의 인산화(phosphoorylation)를 촉진시켜 결과적으로 대식세포의 자식작용을 억제시킨다.

본 발명의 상기 대식세포의 자식작용은 기아(starvation)와 같은 스트레스 상황이나 결핵균이나 바이러스와 같은 병원체의 감염에 의해 유발된다.

본 발명의 구체적인 실시예에서 확인한 바에 따르면, 대식세포를 아미노산 및 우혈청을 제거한 배지에 배양시키면 기아(starvation) 현상이 나타나게 되며, 상기 세포를 공초점 현미경으로 관찰해본 결과 오토파고좀(autophagosome)으로 볼 수 있는 1 μm 크기 이상의 LC3.EGFP 점(dot)이 기아를 유발시키지 않은 정상 세포에 비해 증가된다. 하지만 상기 기아가 유발된 세포에 IL-10을 처리하게 되면 1 μm 크기 이상의 LC3.EGFP 점(dot)이 감소한다 (도 3a 참조).

본 발명의 억제제에 있어서, 상기 자식작용 억제제는 자식작용의 촉진으로 발병되는 질환, 예컨대 자가면역 질환인 염증성 창자병(inflammatory bowel disease)과 제 1형 당뇨병 및 자식작용이 활성화된 일부 암의 치료 또는 예방에 사용되는 것을 특징으로 한다 [Levine B. and Kroemer G., 2008. Autophagy in the pathogenesis of disease. Cell 32, 27-42; Lleo A., 2007. Autophagy: Highlighting a novel player in the autoimmunity scenario. J. autoimmun. 29, 61-68].

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 인터루킨-10과 IL-10 수용체의 결합 저해제 또는 PI3 kinase Ⅰ의 활성화 저해제를 유효성분으로 포함하는 대식세포의 자식(autophagy) 작용 촉진제를 제공한다.

본 발명의 촉진제에 있어서, 상기 PI3 kinase Ⅰ의 활성화 저해제는 PI3 kinase Ⅰ의 활성을 저해시키는 어떠한 물질도 가능하나, 바람직하게 22-(4-몰폴리닐)-8-페닐-4H-1-벤조피란-4-온 (22-(4-Morpholinyl)-8-phenyl-4H-1-benzopyran-4-one; LY294002)인 것을 특징으로 한다.

상기 LY294002에 의한 PI3 kinase Ⅰ의 활성화 저해를 본 발명의 실시예에서 확인하였다. PI3 kinase Ⅰ의 하부 신호 분자인 Akt의 인산화(phosphoorylation) 측정 시, 기아를 유발시킨 대식세포에 상기 LY294002를 처리하는 경우 Akt의 인산화가 감소되었다. 또한 IL-10의 처리에 의해 Akt의 인산화가 증가되었지만, IL-10과 LY294002를 함께 처리하였을 시에는 인산화가 매우 감소되었다 (도 4a 참조). 따라서 LY294002는 IL-10에 의해 활성화된 PI3 kinase Ⅰ의 활성을 저해시킴으로, 이로 인해 대식세포의 자식작용이 촉진될 것으로 사료된다.

본 발명에 있어서, 상기 자식작용 촉진제는 자식작용의 기능 이상으로 발병되는 질환, 예컨대 퇴행성 신경질환, 근육병, 박테리아 또는 바이러스와 같은 감염성 질환 또는 초기 암의 치료 또는 예방에 사용되는 것을 특징으로 한다 [Levine B. and Kroemer G., 2008. Autophagy in the pathogenesis of disease. Cell 32, 27-42].

최근 실험동물모델에서 자식작용이 알츠하이머, 파킨슨 및 헌팅톤 질환을 포함하는 다양한 퇴행성 신경질환에 대해 방어 기능을 갖는다는 것이 보고되었으며[Martinez-Vicente and Cuervo, 2007; Rubinsztein et al., 2007; Williams et al., 2006], 자식작용이 다양한 퇴행성 신경질환과 연관된 응집-유발(aggregate-prone) 돌연변이 단백질의 제거에 중요한 역할을 한다고 보고되었으며[Levine B. and Kroemer G., 2008], 자식작용의 약학적 활성화가 돌연변이 헌팅톤 단백질의 응징 형태 수준을 감소킨다고 보고되었다[Rubinsztein et al., 2007]. 또한, 퇴행성 신경질환과 유사하게 근육퇴행성(myodegenerative) 질환도 미스폴링된 단백질의 응집과 관련이 있다고 알려졌으며, 산발 봉입체 근육염(sporadic inclusion body myositis), 지대형근이영양증(limb girdle muscular dystrophy) 및 미요시 근육병증(Miyoshi myopathy)과 같은 근육병에서 자식작용이 질병-유발 단백질의 제거를 촉지한다고 보고되었다 [Levine B. and Kroemer G., 2008]. 또한, 자식작용은 미생물 또는 바이러스와 같은 병원체의 분해성 라이소좀에의 선택적 전달을 통해 제거함으로써 상기 감염성 질환에 대한 방어 기능을 한다고 보고되었다 [Levine B. and Kroemer G., 2008]. 또한, 자식작용은 종양생성을 조절하는 신호전달 패스웨이(pathway)의 다양한 단계에서 종양 억제(tumor suppression) 기능을 한다고 보고되었다 [Levine B. and Kroemer G., 2008].

본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 하기의 단계들을 포함하는 대식세포의 자식작용 억제제 또는 촉진제의 스크리닝 방법을 제공한다:

a) 재조합 GFP.LC3B 융합 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 레트로바이랄(retroviral) 벡터를 대식세포에 형질도입시키는 단계;

b) 상기 형질도입된 대식세포의 임의의 약제를 처리한 후 기아(starvation)에 의해 자식작용을 유발하는 단계; 및

c) 공초점현미경으로 오토파고좀(autophagosome)으로 볼 수 있는 LC3.EGFP 점(dot)을 관찰하는 단계; 및

d) 상기 임의의 약제를 처리한 대식세포가 처리 안한 대조군에 비해 LC3.EGFP 점(dot)의 숫자가 감소하면 자식작용 억제제로 동정하고, LC3.EGFP 점(dot)의 숫자가 증가하면 자식작용 촉진제로 동정하는 단계.

본 발명의 스크리닝 방법에 있어서, 상기 a) 단계의 레트로바이랄 벡터는 도 2b의 개열지도를 갖는 GFP.LC3B/pLNCX2 이며, 상기 b) 단계의 기아(starvation)는 아미노산과 우혈청을 제거한 평형 염용액(balanced salt solution) 배지에서 배양하여 유발시켰다.

본 발명에 있어서, 상기 c) 단계의 오토파고좀(autophagosome)으로 볼 수 있는 LC3.EGFP 점(dot)은 1 μm 이상의 크기를 가지는 것을 특징으로 한다 [Kabeya Y et al., 2000. LC3, a mammalian homologue of yeast Apg8p, is localized in autophagosome membranes after processing. EMBO J. 19, 5720-5728; Harris J et al., 2007. T helper 2 cytokines inhibit autophagic control of intracellular Mycobacterium tuberculosis. Immunity 27, 505-517].

이상 설명한 바와 같이, 본 발명에 따르면 기아(starvation)에 의해 유도된 대식세포의 자식(autophagy)작용을 IL-10이 효과적으로 억제함을 확인하였으며, IL-10에 의한 자식작용의 억제는 IL-10의 세포내 신호전달 과정 중 PI3 kinase Ⅰ의 활성화를 유도하여 일어나는 것을 증명하였다.

도 1a는 대식세포에서의 IL-10 수용체 발현을 RT-PCR로 확인한 결과이며 (N.C.; negative contorl, J774; 생쥐 대식세포), 도 1b는 대식세포에서의 IL-10 수용체 발현을 유세포 분석기로 확인한 결과이다 (가는 실선; isotype control, 굵은 실선; 항 IL-10 수용체 항체).
도 2a는 LC3B/pEGFP-C1 벡터 모식도 이며, 도 2b는 GFP.LC3B를 발현하는 GFP.LC3B/pLNCX2 벡터 모식도를 나타낸 것이다.
도 3a는 IL-10 처리에 따른 자식작용의 억제 효과를 공초점 현미경을 통해 확인한 결과이며, 도 3b는 RT-PCR을 통해 autophagy 표지자인 LC3B의 발현을 확인하여 자식작용 억제 효과를 확인한 결과이다.
도 4a 및 4b는 IL-10 처리에 따른 PI3 kinase Ⅰ의 활성화를 RT-PCR을 통해 확인한 결과이며, 도 4c는 IL-10 처리에 따른 자식작용의 억제 효과를 공초점 현미경을 통해 확인한 결과이다.
도 5는 IL-10에 의한 자식작용 억제 경로를 도식화한 것이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.

실시예 1. RT - PCR 과 유세포 분석기에 의한 대식세포( J774 )에서 IL -10 수용체 발현 확인

J774 세포(cat # TIB-67)는 생쥐 대식 세포주로서 ATCC(American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA)에서 구입하여 세포배양 하였다. 이후 RT-PCR과 유세포 분석기(flow cytometry)를 이용하여 J774 세포에서 IL-10 수용체 발현을 확인하였다.

우선 RT-PCR을 수행하기 위해, 대식세포(J774)를 트리졸(Trizol; Invitrogen) 1 ml당 200 μl의 클로로포름(Chloroform; Sigma)을 넣고 전체 RNA를 분리한 후, 추출한 5 μg의 mRNA를 주형으로 역전사 연쇄중합반응(RT-PCR)에 의해 cDNA를 복제하였다. 이후 하기에 나타낸 IL-10의 수용체와 GAPDH의 프라이머를 제작하여 연쇄중합반응을 수행하였다. 이때 사용한 역전사 효소는 Superscript Ⅲ(Invitrogen)를 사용하였으며, 중합효소는 Tag polymerase(Gene craft)를 사용하였다. 음성대조구(negative control, N.C.)로는 생쥐 myoblast 세포주인 C2C12(cat # CRL-1772; ATCC)의 mRNA를 사용하였다. RT-PCR 결과는 도 1a에 나타내었다.

RT-PCR 결과, 400 bp의 생쥐 IL-10 수용체의 mRNA transcript 산물이 J774 세포에서만 발견되었으며, Internal control인 GAPDH 산물(271 bp)은 음성대조구와 J774 세포 모두에서 발견되었다.

[표 1. 프라이머]

그리고 유세포 분석기를 이용하여 대식세포(J774)에서 IL-10 수용체 발현을 확인하기 위해, PE-conjugated 항 IL-10 수용체 항체(BDpharmingen)를 처리하고, 유세포 분석기를 이용해 형광강도를 측정하였다. 이때 사용된 isotype control은 ratIgG1κ로 BDpharmingen에서 구입하여 사용하였다.

측정 결과 도 1b에 나타낸 바와 같이, 대식세포(J774)에서 IL-10 수용체가 발현됨을 확인하였다.

실시예 2. GFP . LC3B 융합 단백질을 발현하는 774 세포 구축

IL-10이 자식(autophagy) 작용을 억제하는지를 공초점현미경(confocal microscopy)으로 확인하기 위해, autophagy 표지자로 쓰이는 rat LC3B의 cDNA(GenBank access NM_BC0835556)를 ThermoScientific Open Biosystems(Huntsville, AL, USA)에서 구입하였다. 이후 EFG 유전자가 있는 pEFG-C1 벡터(Clontech Laboratories, Inc., Mountain View, CA, USA)에 BglⅡ와 EcoRⅠ 제한효소로 삽입하여 GFP.LC3B 융합 단백질의 cDNA를 클로닝 하였다. 이때 사용된 프라이머는 하기 표 2에 나타내었다. 정방향 프라이머에서 밑줄 친 부분은 BglⅡ site를 나타낸 것이며, 역방향 프라이머에서 밑줄 친 부분은 EcoRⅠ site를 나타낸 것이다. 그 결과, 재조합 벡터 LC3B/pEGFP-C1(도 2a)을 완성하였다.

[표 2. 프라이머]

클로닝 완료 후, GFP.LC3B 융합 단백질을 레트로바이럴 벡터(retroviral vector)에 의해 J774 세포주에서 발현시키기 위해, GFP.LC3B 융합 단백질의 cDNA를 pLNCX2 벡터(Invitrogen)에 넣어 클로닝 하였다. 이때 사용된 제한효소는 NotⅠ이었으며, 프라이머는 하기와 같다. 하기 프라이머에서 밑출친 부분은 NotⅠ site를 나타낸 것이다. 클로닝 결과, GFP.LC3B 융합 단백질을 발현하는 재조합 벡터 GFP.LC3B/pLNCX2(도 2b)를 완성하였다.

[표 3. 프라이머]

실시예 3. 형질전환세포주 제작

재조합 GFP.LC3B 융합 단백질을 코딩하는 유전자를 클로닝한 후, 각각 Tetracycline off system의 293GPG 세포와 J774 세포를 사용하여 형질전환 시켰다. 우선, 293GPG 세포를 6-웰(well) 조직 배양 플레이트에 웰(well)당 1×10⁵ 세포가 되도록 접종한 후, 10% 송아지 혈청을 함유한 DMEM 배지에서 24 시간 동안 배양하였다. 배양 완료 후, 세포가 웰(well) 표면의 70 ~ 80% 정도를 덮을 정도로 자라면, 혈청이 무첨가된 DMEM 배지에서 1 ~ 2 μg의 재조합 GFP.LC3B 융합 단백질의 유전자 발현 벡터 DNA를 6 ~ 8 μg의 Lipofectamine plus(Invitrogen)를 사용하여 293GPG 세포에 도입시켰다. 그 후, 상기 발현 벡터가 도입된 293GPG 세포를 24 시간 동안 배양하여 바이러스(레트로바이러스, retrovirus)를 포함하는 배양 상층액으로 이용하여 숙주세포(J774 세포)를 4 ~ 5 시간 동안 배양한 후, 혈청이 10% 함유된 배지로 바꿔서 24 시간 배양하였으며, 이 과정을 3회 반복하였다. 상기 숙주세포(J774 세포)는 형질도입된 세포를 얻기 위해 G418 항생제 1.5 mg/ml을 처리하여 유전자가 발현되는 세포를 얻었다. 그 후, 공초점현미경(confocal microscopy)으로 재조합 GFP.LC3B 융합 단백질이 발현되는 J774 세포주에서 오토파고좀(autophagosome)으로 볼 수 있는 1 μm 크기 이상의 LC3.EGFP 점(dot)을 확인하였다.

실시예 4. IL -10에 의한 대식세포의 자식( autophagy )작용 억제

대식세포의 자식(autophagy)작용을 유도하기 위해, LC3B.EGFP 융합 단백질을 발현하는 대식세포(LC3B.EGFP/J774)를 아미노산과 우혈청을 제거한 EBSS 배지(Earle's balanced salts solution; Invitrogen)에서 2 시간 동안 배양하여 기아(starvation)에 의한 autophagy를 유도하였다 [Gutierrez et al., 2004. Autophagy is a defense mechanism inhibiting BCG and Mycobacterium tuberculosis survival in infected macrophages. Cell 119, 753-766]. 이때 IL-10의 처리는 대식세포(LC3B.EGFP/J774)를 아미노산과 우혈청을 제거한 EBSS 배지로 옮기기 10 시간 전부터 처리하였다. IL-10 처리 10 시간 후, 대식세포(LC3B.EGFP/J774)를 EBSS 배지로 옮기기 전 PBS로 3번 세척하였다. LC3B.EGFP 융합 단백질을 발현하는 대식세포(LC3B.EGFP/J774)에 IL-10을 처리하여 기아(starvation)에 의한 autophagy를 유도하고, IL-10을 처리하지 않고 기아만을 유도한 대조군 및 정상군(기아를 유도하지 않은 군)과 autophagy 유발 정도를 비교분석 하였다. 이때 사용된 정상군(control)은 IL-10 처리하지 않고, 기아를 유도하지 않은 LC3B.EGFP 융합 단백질을 발현하는 대식세포(LC3B.EGFP/J774)를 이용하였다.

Autophagy 유발정도를 측정하기 위해, LC3B.EGFP/J774 세포주에서 오토파고좀(autophagosome)으로 볼 수 있는 1 μm 크기 이상의 LC3.EFGP 점(dot)을 공초점 현미경으로 확인하였으며, 상기 점(dot)을 정량화하여 그래프로 나타내었다 (도 3a 참조). 측정 결과, 기아(starvation)를 유도한 경우에는 대조군보다 오토파고좀(autophagosome)으로 볼 수 있는 1 μm 크기 이상의 LC3.EGFP 점(dot)이 증가한 반면, 기아를 유도한 후 IL-10을 처리하는 경우에는 1 μm 크기 이상의 LC3.EGFP 점(dot)이 감소함을 확인할 수 있다.

또한 웨스턴 블롯(western blot)을 이용하여 autophagy 유발 정도를 분석하기 위해, 세포를 phosphatease inhibitor cocktail(Sigma)이 포함된 세포 용해 용액(50 mM Tris, pH 7.2, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 200 ng/ml phenylmethylsulfonyl fluoride)에 용해(lysis)시킨 후, 15% SDS polyacrylamide gel에 전기영동시켜, Immobilon P membrane(Millipore Corporation, Billerica, MA, USA)에 transfer하였다. 이후 정제된 항 LC3B(Cell Signaling Technology, Inc., Boston, MA, USA)를 membrane에 처리한 후, ECL system(GE Healthcare, Buckinghamshire, UK)에서 발색시켜, LC3B 밴드(band)를 확인하였다. 측정 결과는 도 3b에 나타내었다.

측정 결과, 기아(starvation)를 유도한 경우 정상군(control)보다 autophage 표지자인 LC3BⅠ band의 감소와 LC3BⅡ band의 증가로 보아 autophage가 증가함을 알 수 있으며, 기아를 유도한 후 IL-10을 처리하는 경우에는 LC3BⅠ band는 증가하고 LC3BⅡ band는 감소한 것으로 보아 autophage가 억제되었음을 알 수 있다. 이때 사용된 internal control은 항 β-actin 항체에 의한 β-actin의 발현량으로, 모든 샘플에서 동일한 β-actin이 검출되었으므로 동일한 양의 단백질을 전기영동한 것을 알 수 있다. 이상의 결과들로 보아, IL-10은 autophagy 유발을 억제함을 알 수 있다.

실시예 5. IL -10의 PI3 kinase Ⅰ의 활성화에 의한 대식세포의 자식( autophagy )작용 억제

IL-10이 어떠한 경로로 대식세포의 autophagy 유발을 억제하는지를 알아보기 위해, IL-10과 IL-10 수용체의 신호(signal)를 전달하는 PI3 kinase Ⅰ의 하부 신호 분자(signaling molecule)인 Akt의 인산화(phosphorylation)를 웨스턴 블롯(western blot)에 의해 측정하였다 [Rusten et al., 2004. Programmed autophagy in the Drosophila fat body is induced by ecdysone through regulation of the PI3K pathway. Dev. Cell 7, 179-192]. 이때 사용된 항체는 항 Akt 항체(Akt; Cell Signaling Technology)와 항 인산화 Akt 항체(p-Akt; Cell Signaling Technology)를 사용하였으며, 웨스턴 블롯은 상기 실시예 4에서 수행한 방법과 동일하게 수행하였다. 그리고 Akt의 인산화는 PI3 kinase inhibitor인 LY294002 [Sanchez-Marget al., 1994. Role of phosphatidylinositol-3-kinase in insulin receptor signaling: studies with inhibitor, LY294002. Biochem. Biophys. Res. Commun. 204, 446-452]를 처리함으로써 함께 비교 분석하였다. Akt 인산화 결과는 도 4a에 나타내었다.

측정 결과, IL-10을 처리한 J774 세포주에서는 Akt의 인산화(phosphoorylation)가 증진됨을 확인할 수 있으며, LY294002를 처리하는 경우에는 Akt 인산화가 감소됨을 알 수 있다. 따라서 IL-10은 PI3 kinase Ⅰ의 활성화에 의해 대식세포의 autophagy를 억제함을 알 수 있다.

IL-10이 PI3 kinase Ⅰ의 활성화에 의해 대식세포의 autophagy를 억제하는 것을 검증하기 위해, PI3 kinase Ⅰ의 좀 더 하부구조 신호 분자인 p70S6K의 인산화(phosphoorylation)를 웨스턴 블롯(western blot)으로 측정하였다 [Jung et al., 2010. mTOR regulation of autophagy. FEBS letters 584, 1287-1295]. 이때 사용된 항체는 항 p70S6K 항체(p70S6K; Cell Signaling Technology)와 항 인산화 p70S6K 항체(p-p70S6K; Cell Signaling Technology)가 사용되었으며, 웨스턴 블롯은 상기 기술한 바와 동일하게 수행하였다. 또한 p70S6K의 인산화는 p70S6K의 상부 신호 분자인 mTOR Ⅰ의 inhibitor인 Rapamycin [Abraham, R.T. and Wiederrecht, G.J., 1996. Immunopharmacology of rapamycin. Ann. Rev. Immunol. 14, 483-510]을 처리함으로써 함께 비교 분석하였다. p70S6K의 인산화 결과는 도 4b에 나타내었다.

측정 결과, 기아(starvation)를 유발시킨 J774 세포주에 IL-10을 처리하는 경우 p70S6K의 인산화가 증진됨을 알 수 있으며, Rapamycin을 처리하는 경우에는 p70S6K의 인산화가 감소되었다.

그리고 상기 p70S6K의 인산화를 관찰하기 위해 사용된 세포주들을 공초점 현미경으로 관찰하여 LC3.EFGP 점(dot)을 측정하였으며, 상기 점(dot)을 정량화하여 그래프로 나타내었다 (도4c 참조). 도 4c에 나타낸 바와 같이 mTOR Ⅰ의 inhibitor인 Rapamycin을 처리 시 오토파고좀(autophagosome)으로 볼 수 있는 1 μm 크기 이상의 LC3.EGFP 점(dot)이 IL-10을 단독으로 처리하는 경우보다 증가하였으므로 Rapamycin이 IL-10의 autophagy 억제 작용을 차단하는 것으로 사료된다. 뿐만 아니라, 기아를 유발시킨 세포주에 IL-10과 Rapamycin을 함께 처리하게 되면 p70S6K의 인산화가 감소되며, 1 μm 크기 이상의 LC3.EGFP 점(dot)도 관찰된다. 상기의 결과들을 통해 IL-10은 PI3 kinase Ⅰ을 활성화시켜 대식세포의 autophagy를 억제함을 확인하였다.

따라서 IL-10이 PI3 kinase Ⅰ의 활성화를 일으켜 대식세포의 자식(autophagy)작용을 억제하는 signaling pathway는 도 5에 나타낸 바와 같이 모식화될 수 있다.

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하기의 단계들을 포함하는 대식세포의 자식작용 억제제 또는 촉진제의 스크리닝 방법:
a) 재조합 GFP.LC3B 융합 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 레트로바이랄(retroviral) 벡터를 대식세포에 형질도입시키는 단계;
b) 상기 형질도입된 대식세포의 임의의 약제를 처리한 후 기아(starvation)에 의해 자식작용을 유발하는 단계;
c) 공초점현미경으로 오토파고좀(autophagosome)으로 볼 수 있는 LC3.EGFP 점(dot)을 관찰하는 단계; 및
d) 상기 임의의 약제를 처리한 대식세포가 처리 안한 대조군에 비해 LC3.EGFP 점(dot)의 숫자가 감소하면 자식작용 억제제로 동정하고, LC3.EGFP 점(dot)의 숫자가 증가하면 자식작용 촉진제로 동정하는 단계.
제 6항에 있어서, 상기 오토파고좀(autophagosome)으로 볼 수 있는 LC3.EGFP 점(dot)은 1 μm 이상의 크기를 가지는 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.