KR101237719B1

KR101237719B1 - 난포액으로부터 얻은 세포에서 염색체 이상의 확인

Info

Publication number: KR101237719B1
Application number: KR1020077000328A
Authority: KR
Inventors: 샤일라자 가다 사세나; 아메트 파트키; 라타 셰왈르
Original assignee: 리라이언스 라이프 사이언시스 프라이빗. 리미티드
Priority date: 2004-06-11
Filing date: 2005-06-07
Publication date: 2013-02-27
Also published as: RU2395584C2; IL180129A0; EP1766088A2; ATE507304T1; AU2005252470B2; DK1766088T3; IL180129A; AU2005252470A1; CN101001962A; CA2572884A1; DE602005027699D1; US20050277147A1; RU2007101160A; WO2005121365A3; WO2005121365A2; EP1766088B1; KR20070031997A; HK1096127A1

Abstract

본 발명은 난포액으로부터 얻은 세포에서 염색체 이상을 확인하기 위한 방법을 설명하며, 예를 들어 생식선 염색체 섞임증 또는 낮은 등급의 생식선 염색체 섞임증을 확인하기 위한 것이다. 염색체 이상은 세포에서 염색체, DNA 또는 유전자 발현 이상을 검출할 수 있는 유전자 분석을 사용하여 확인된다.

염색체, 염색체 이상, 염색체 섞임증, 난포액, 세포, 유전자

Description

난포액으로부터 얻은 세포에서 염색체 이상의 확인{IDENTIFYING CHROMOSOMAL ABNORMALITIES IN CELLS OBTAINED FROM FOLLICULAR FLUID}

관련 출원의 상호 참조

본 출원은 2004년 6월 11일자로 출원된 인도 가 특허출원 번호 642/MUM/2004의 우선권을 주장한다.

기술분야

본 명세서는, 난포액으로부터 얻은 세포에서, 생식선 염색체 섞임증(gonadal mosaicism)을 포함하는, 개체에서 염색체 이상을 확인하는 방법에 관한 것이다.

진핵세포의 핵에 존재하는 염색체는 세포의 유전정보를 지니고 있다. 사람에게는 각 배수체세포에 보통 23쌍의 염색체가 있으며 총 염색체는 46개이다. 염색체 구조나 수의 편차는 발달 및 생리학적 이상을 가져올 수 있다. 구조적인 염색체 이상은 전좌(상호 및 로버트소니안), 결실, 역위(편동원체 및 협동원체), 환염색체, 및 동완염색체일 수 있다. 또, 구조적인 염색체 이상은 염색체 재배열을 포함하며, 이것은 염색체가 절단된 다음에 다른 형태로 재결합하는 것으로서, 균형 재배열 또는 불균형 재배열이 있을 수 있다(Mueller R.F. 및 Young I.D.; Emery's Elements of Medical Genetics Ninth Edition, 1995, p. 37).

수적 염색체 이상은 1개 이상의 염색체의 상실이나 획득(이수성체), 완전한 한 세트의 염색체의 상실(일배체), 또는 1개 이상의 완전한 세트의 염색체의 획득(배수체)이다. 이수성체는 영염색체(한 쌍의 상동성 염색체 상실, 2n-2), 일염색체(단일 염색체 상실, 2n-1), 삼염색체(단일 염색체 획득, 2n+1), 또는 사염색체(한 쌍의 상동성 염색체 획득, 2n+2)의 형태로 발생할 수 있다. 이수성체는 쌍을 이룬 염색체가 세포분열 동안 분리되는데 실패했을 때 비-분리의 결과로서 일어날 수 있다. 비-분리가 배우자 형성 동안 일어난다면, 결과의 생식세포의 반(제2 감수분열 동안의 비-분리) 또는 전체(제1 감수분열 동안의 비-분리)가 이수성체가 될 것이다. 또한, 비-분리는 유사분열 동안에 일어날 수 있는데, 이때는 상이한 수의 염색체를 갖는 2개의 셀라인을 생성한다.

결과적으로, 단일 개체는 상이한 핵형 또는 유전적 구성을 갖는 2개 이상의 세포 집단을 가질 것이며, 이것은 섞임증, 염색체 섞임증 또는 생식선 염색체 섞임증이라고 말할 수 있다. 본원에서 사용된 섞임은 2개 이상의 상이한 유전형을 가진 세포들로 이루어진 생물이다. 비-분리 사건이 개체의 발생 초기에 일어난다면, 개체의 신체의 각 부분들은 총 염색체 수나 염색체 내용이 상이한 세포를 가질 수 있다. 또한, 섞임증은 유전자 돌연변이 사건의 결과일 수 있다. 유사하게, 돌연변이가 배 생장 초기에 일어난다면, 개체의 세포 중 일부가 돌연변이를 가질 수 있다.

염색체 섞임증은 많은 조직에서 발생할 수 있으며, 비-분리 사건의 타이밍과 그것이 발생하는 세포 타입에 의존한다. 결과적으로, 염색체 섞임증을 갖는 개체 에서 증상의 종류나 심한 정도를 예측하는 것은 어렵다. 섞임증이 생식선에 제한된 경우, 이것은 생식선 염색체 섞임증으로 알려져 있다(Goldstein 등, J. Pedia-trics, 1977, 90:604). 생식선 염색체 섞임증은 발달중인 태아의 생식선에서 발생하는 돌연변이로 인해 일어날 수 있다.

또한, 염색체 이상은 난소의 이상 세포의 퍼센트에 따라서 난소 발달 및 기능에 영향을 미친다고 알려져 있다(Cunniff 등, Hum. Genet., 1991, 86:553-556). 예를 들어, X 염색체의 카피가 없는 여성(45,X)이나 X 염색체의 카피를 하나 더 갖는 여성(46,XX)은 조기 난소 부전증의 위험이 증가한 것으로 나타났다(Cunniff 등, Hum. Genet., 1991, 86:553-556; Zinn 등, Trends Genet., 1993, 9:90-93). 연구 결과 45,X 일염색체성 임신 중의 99%는 초기에 유산되는 것으로 나타났다(Hook 및 Warburton, Hum. Genet., 1983, 64:24-27; Hassold 등, Am. J. Hum. Genet., 1988, 42:534-541). 섞임증 X 염색체 일염색체증(45,X/46,XX)은 난포폐쇄, 생식선 발생장애와 관련되며, 또한 유산의 공통적인 원인이기도 하다(Zinn 등, Trends Genet., 1993, 9:90-93; Shreck 등 Emery and Rimoni's Principles of Practice of Medical Genetics, Vol. 1, Churchill Livingstone, 2002, 982-97).

생식선 염색체 섞임증을 가진 여성은 염색체 이상 난모세포를 가질 수 있는데, 이것은 불임이나 발달중인 태아에서 염색체 이상을 일으킬 수 있다. 이런 가능한 영향은 난모세포/배아 기증, 착상 전 유전자 진단, 또는 출생 전 진단과 같은 상담이나 치료 옵션을 용납한다. 결과적으로, 생식선 염색체 섞임증의 확인 또는 진단에서의 개선은 환자 관리를 개선할 것이다.

염색체 이상을 확인 또는 진단하는 현재의 접근법은 생식선 염색체 섞임증에 대해 제한적이며, 이용가능한 기술은 침습적이거나 낮은 등급의 섞임증을 검출하는데 효과적이지 않다. 예를 들어, 개체에서 염색체 이상이 의심될 때, 그것은 혈액 샘플의 분석을 통해 확증되거나 무시될 수 있다. 그러나, 이 접근법은 하나의 기관 또는 조직이나 주어진 조직의 한정된 비율의 세포에 제한된 섞임증을 반드시 검출할 수는 없다. 더욱이, 생식선 염색체 섞임증을 가진 개체는 사는 동안 주로 증상을 나타내지 않을 수 있고, 더구나 진단받을 기회도 적다.

단일 조직에 제한된 섞임증을 진단하기 위해서는 이 특정 조직으로부터의 세포가 분석되어야 한다. 주어진 조직에서 섞임증의 검출은 이상 세포의 수와 분석될 세포의 수에 따를 것이다. 핵형분석이 염색체 분석에 흔히 사용되는 유전자 검사이며, 이것은 염색체를 이미지화하고 카운팅함으로써 개체의 세포의 완전한 염색체 구조를 시험한다. 염색체는 세포분할의 중기단계에서 가장 잘 시각화되기 때문에, 핵형분석되는 세포는 배양하여 세포분할의 중기단계에서 정지시키는 것이 바람직하다. 이것은 핵형분석을 시간-소모적인 지루한 과정으로 만들며, 아주 많은 수의 세포의 분석을 허용하지 않는다. 결과적으로, 핵형분석으로는 기관이나 조직에서 단지 낮은 비율의 세포만 이상이 있는 낮은 등급의 섞임증을 확인하는데 실패할 수 있다.

현재, 생식선 염색체 섞임증을 검출하기 위해서, 생식선 조직이 생식선 생체검사에 의해 분리된다. 생식선 생체검사는 일반적 과정은 아니며, 개복술이나 복강경에 의해 얻어지는 미소바늘 흡인 생체검사 또는 쐐기 생체검사에 의해 수행된 다. 그 다음, 얻어진 조직 샘플이 핵형분석되는데, 이것은 낮은 등급의 생식선 섞임증을 확인하지 못할 수 있다. 결과적으로, 염색체 이상을 검출하기 위한 현재의 접근법은 생식선 염색체 섞임증, 특히 낮은 등급의 생식선 염색체 섞임증을 검출하는데 있어서 제한된 능력을 가진다.

따라서, 생식선 염색체 섞임증을 포함하는 염색체 이상을 확인하기 위한 최소로 침습적인 방법을 제공하는 것이 바람직하며, 이것은 바람직하게는 낮은 등급 생식선 염색체 섞임증을 확인할 수 있다.

발명의 개요

본 발명은 난포액으로부터 얻은 세포에서 한 가지 이상의 염색체 이상을 확인하는 방법에 관한 것으로,

a) 난포액으로부터 세포를 획득하는 단계;

b) 세포를 유전자 분석하는 단계

를 포함하며, 여기서 세포의 일부는 한 가지 이상의 염색체 이상을 가진다. 어떤 구체예에서, 본 발명은 생식 시스템 이상을 확인하는 방법에 관한 것으로, 여기서 난포액으로부터 얻은 세포의 일부에서 한 가지 이상의 염색체 이상의 확인이 생식 시스템 이상의 징표이다. 본 명세서의 다른 구체예는, 동일한 방법을 사용하여 난포액으로부터 얻은 세포에서 한 가지 이상의 염색체 이상을 확인함으로써, 생식선 염색체 섞임증을 확인하는 방법에 관한 것이다. 어떤 구체예에서, 생식선 염색체 섞임증은 낮은 등급 생식선 염색체 섞임증이며, 여기서는 조직 또는 기관에서 세포의 바람직하게는 10% 미만, 더 바람직하게는 세포의 10% 내지 5%가 염색체 이상을 가진다. 바람직한 구체예에서, 난포액은 동물로부터, 더 바람직하게는 사람으로부터 얻어진다. 난포액으로부터 얻어진 세포는 생식 조직에서 비롯된 것일 수 있으며, 어떤 구체예에서는 체세포이다. 바람직한 구체예에서는, 난포액은 시험관 수정 과정 또는 세포질내 정자 주입 과정 동안에 얻어진다. 다른 구체예에서, 난포액은 이들 과정 중 어느 것과도 연결되어 얻어지지 않는다. 바람직하게, 난포액은 피험자의 한쪽 또는 양쪽 난소로부터 얻어진다.

또한, 본 발명은 동물에서 불임의 증가된 위험을 분석하기 위한 방법에 관한 것으로,

a) 동물의 난포액으로부터 세포를 획득하는 단계; 및

b) 세포를 유전자 분석하는 단계

를 포함하며, 여기서 세포의 일부에서 한 가지 이상의 염색체 이상의 확인이 불임의 증가된 위험의 징표이다. 바람직한 구체예에서 동물은 사람이다. 난포액으로부터 얻어진 세포는 생식 조직에서 비롯된 것일 수 있으며, 어떤 구체예에서는 체세포이다. 바람직한 구체예에서, 난포액은 시험관 수정 과정 또는 세포질내 정자 주입 과정 동안에 얻어진다. 다른 구체예에서, 난포액은 이들 과정 중 어느 것과도 연결되어 얻어지지 않는다. 바람직하게, 난포액은 피험자의 한쪽 또는 양쪽 난소로부터 얻어진다. 바람직한 구체예에서, 동물이 불임의 증가된 위험을 갖는다고 확인되었을 때, 동물은 시험관 수정 과정을 받게 되고, 동물로부터 분리된 난모세포로부터의 배아는 착상 전에 유전자 분석을 할 수 있다. 더 바람직한 구체예에서, 유전자 분석 결과 배아가 염색체 이상을 갖지 않는다고 증명되었을 때, 배아는 바람직하게는 동물의 자궁으로 전이된다.

본원에 개시된 방법 중 어느 것도 난포액으로부터 얻은 세포에서 염색체 이상을 확인하기 위해서 당업자에게 잘 공지된 유전자 분석 방법을 사용할 수 있다. 바람직한 구체예에서, 유전자 분석은 형광동소교잡법, 핵형분석, 또는 DNA 시퀀싱이다. 다른 바람직한 구체예에서, 유전자 분석은 비교유전자교잡법(CGH)(예를 들어, 중기 염색체 또는 CGH-어레이를 가지고 수행된다), 멀티컬러-밴딩(MCB), 정량 FISH(Q-FISH), 중합효소 연쇄반응(PCR), 유전자 비트 분석(GBA), 멀티플렉스 시퀀싱, SNaPshot, MassEXTEND, MassArray, 마이크로어레이 리게이션, 마이크로어레이 Miniseq, 택 어레이, 어레이드 프라이머 익스텐젼(APEX), 마이크로어레이 프라이머 익스텐젼, GOOD 분석, 코드화 마이크로스피어, 제한 단편 길이 다형성 분석(RFLP), 대립유전자 특이적 올리고뉴클레오티드(ASO) 분석, 메틸화-특이적 PCR(MSPCR), 피로시퀀싱 분석, AcycloPrime 분석, 역점적법, GeneChip 마이크로어레이, 동적 대립유전자-특이적 교잡법(DASH), 펩티드 핵산(PNA) 및 잠금핵산(LNA) 프로브, TaqMan, 분자 비콘, 삽입 색소, FRET 프라이머, AlphaScreen, SNPstream, Invader 분석, 주형-지정 혼입법(TDI), 형광 편광, 서열-코드화 올리고뉴클레오티드 리게이션 분석, 리가제 연쇄반응, 패드락 프로브, 롤링 서클 증폭, 또는 색채 올리고뉴클레오티드 리게이션 분석(OLA)이다.

난포액으로부터 분리된 세포에서는 다수의 염색체 이상이 확인될 수 있으며, 이것은 생식선 염색체 섞임증 또는 낮은 등급의 생식선 염색체 섞임증의 징표일 수 있다. 어떤 구체예에서, 난포액의 세포 전부 또는 일부에서 확인된 염색체 이상은 이수성체, 전좌, 결실, 미소결실, 역위, 또는 중복이다. 확인된 이수성체는 완전한 또는 부분적 삼염색체, 예를 들어 13번 삼염색체, 16번 삼염색체, 18번 삼염색체, 21번 삼염색체, 22번 삼염색체, XXY, XYY 또는 XXX; 완전한 또는 부분적 일염색체, 예를 들어 X 일염색체, 13번 일염색체, 16번 일염색체, 18번 일염색체, 21번 일염색체, 또는 22번 일염색체; 또는 완전한 또는 부분적 영염색체, 예를 들어 13번, 16번, 18번, 21번, 22번, X 또는 Y 염색체에 대한 영염색체일 수 있다.

다음의 도면은 본 명세서의 부분을 형성하며, 본 발명의 어떤 양태를 더 증명하기 위해서 포함된다. 본 발명은 본원에 제시된 특정한 구체예의 상세한 설명과 함께 이들 도면 중 하나 이상의 참조하여 더 잘 이해될 수 있다.

도 1은 난포액으로부터 얻어진 사람 여성의 정상 배수체 세포를 FISH 분석한 현미경 사진이다. X 염색체(녹색), Y 염색체(오랜지색), 및 18번 염색체(물색)에 특이적인 프로브를 사용했고, 세포는 DAPI 암청색으로 대조염색했다. 18번 염색체에 대한 2개의 물색 신호와 X 염색체에 대한 2개의 녹색 신호가 보이며, 이것은 여성 정상 배수체 세포임을 암시한다.

도 2는 사람 여성의 난포액으로부터 얻어진 18번 일염색체 세포를 FISH 분석한 현미경 사진이다. X 염색체(녹색), Y 염색체(오랜지색), 및 18번 염색체(물색)에 특이적인 프로브를 사용했고, 세포는 DAPI 암청색으로 대조염색했다. 18번 염색체에 대한 1개의 물색 신호와 X 염색체에 대한 2개의 녹색 신호가 보이며, 이것 은 여성 세포의 18번 염색체가 일염색체임을 암시한다.

도 3은 사람 여성의 난포액으로부터 얻어진 X 일염색체 세포를 FISH 분석한 현미경 사진이다. X 염색체(녹색), Y 염색체(오랜지색), 및 18번 염색체(물색)에 특이적인 프로브를 사용했고, 세포는 DAPI 암청색으로 대조염색했다. 18번 염색체에 대한 2개의 물색 신호와 X 염색체에 대한 1개의 녹색 신호가 보이며, 이것은 여성 세포의 X 염색체가 일염색체임을 암시한다.

도 4는 사람 여성의 난포액으로부터 얻어진 18번 삼염색체 세포를 FISH 분석한 현미경 사진이다. X 염색체(녹색), Y 염색체(오랜지색), 및 18번 염색체(물색)에 특이적인 프로브를 사용했고, 세포는 DAPI 암청색으로 대조염색했다. 18번 염색체에 대한 3개의 물색 신호와 X 염색체에 대한 2개의 녹색 신호가 보이며, 이것은 여성 세포의 18번 염색체가 삼염색체임을 암시한다.

도 5는 사람 여성의 난포액으로부터 얻어진 X 삼염색체 세포를 FISH 분석한 현미경 사진이다. X 염색체(녹색), Y 염색체(오랜지색), 및 18번 염색체(물색)에 특이적인 프로브를 사용했고, 세포는 DAPI 암청색으로 대조염색했다. 18번 염색체에 대한 2개의 물색 신호와 X 염색체에 대한 3개의 녹색 신호가 보이며, 이것은 여성 세포의 X 염색체가 삼염색체임을 암시한다.

도 6은 사람 여성의 난포액으로부터 얻어진 정상 세포를 FISH 분석한 현미경 사진이다. 13번 염색체(녹색)와 21번 염색체(오랜지색)에 특이적인 프로브를 사용했고, 세포는 DAPI 암청색으로 대조염색했다. 13번 염색체에 대한 2개의 녹색 신호와 21번 염색체에 대한 2개의 오랜지색 신호가 보이며, 이것은 13번과 21번 염색 체의 정상 보체를 갖는 배수체 세포임을 암시한다.

도 7은 사람 여성의 난포액으로부터 얻어진 13번 삼염색체 세포를 FISH 분석한 현미경 사진이다. 13번 염색체(녹색)와 21번 염색체(오랜지색)에 특이적인 프로브를 사용했고, 세포는 DAPI 암청색으로 대조염색했다. 13번 염색체에 대한 3개의 녹색 신호와 21번 염색체에 대한 2개의 오랜지색 신호가 보이며, 이것은 이 여성 세포의 13번 염색체가 삼염색체임을 암시한다.

도 8은 사람 여성의 난포액으로부터 얻어진 21번 삼염색체 세포를 FISH 분석한 현미경 사진이다. 13번 염색체(녹색)와 21번 염색체(오랜지색)에 특이적인 프로브를 사용했고, 세포는 DAPI 암청색으로 대조염색했다. 13번 염색체에 대한 2개의 녹색 신호와 21번 염색체에 대한 3개의 오랜지색 신호가 보이며, 이것은 이 여성 세포의 21번 염색체가 삼염색체임을 암시한다.

도 9는 사람 여성의 난포액으로부터 얻어진 X 일염색체 세포의 핵형을 분석한 것이다. 이 핵형에서는 단일 X 염색체가 보이며, 이것은 이 세포의 X 염색체가 일염색체임을 암시한다. 동일한 난포액 샘플로부터 세포를 더 분석한 결과, 분석된 20개 세포 중 3개가 유사한 패턴을 나타냈는데, 이것은 일염색체 X의 생식선 염색체 섞임증을 시사한다.

도 10은 사람 여성의 난포액으로부터 얻어진 21번 삼염색체 세포의 핵형을 분석한 것이다. 이 핵형에서는 3개의 21번 염색체가 보이며, 이것은 이 세포의 21번 염색체가 삼염색체임을 암시한다.

발명의 상세한 설명

본 명세서는 난포액으로부터 세포를 획득하고, 염색체 이상에 대해서, 예를 들어 유전자 분석에 의해, 이들 세포를 분석하는 것에 의한, 피험자에서 염색체 이상을 확인하는 방법을 설명한다. 바람직하게, 개시된 방법은 생식선 염색체 섞임증 또는 낮은 등급의 염색체 섞임증을 가진 피험자를 확인한다. 낮은 등급의 염색체 섞임증은, 피험자의 조직 또는 기관의 세포의 바람직하게는 10% 미만, 더 바람직하게는 세포의 5% 내지 1%가 섞임증을 나타내는 경우이다. 한 구체예에서, 본원에 개시된 방법에 의해 분석되는 세포는 난포액 샘플을 분리한 피험자의 체세포이며, 난포액에 존재하는 난모세포와 같은 어떤 생식세포는 제외한다. 염색체 이상은 당업자에게 공지된 많은 유전자 분석 방법 중 어느 하나를 이용하여 확인될 수 있다. 본원에서 사용된 "유전자 분석"이란 문구는, 개체의 세포에서, 또는 바람직하게는 난포액으로부터 얻은 세포에서, 염색체, DNA 또는 유전자 발현 이상을 검출할 수 있는 어떤 염색체, DNA 또는 RNA 기초 분석을 말한다.

또한, 난포액으로부터 얻은 세포를 DNA 분석하여, 염색체 수준의 이상이 아니라 단일 유전자 장애를 확인할 수도 있다. 단일 유전자 장애, 각인 장애, 또는 암에 대한 소인의 확인은, 1개 이상의 핵산 치환, 예를 들어 단일 뉴클레오티드 다형성(SNP)의 확인에 적합한 어느 방법을 이용해서도 수행될 수 있다. 상기 열거된 유전자 분석 기술이 바람직하지만, 난포액의 세포를 사용하여 생식선 염색체 섞임증 또는 낮은 등급의 염색체 섞임증을 포함하는 염색체 이상을 확인할 수 있는 다른 방법들도 본 발명의 범위 및 당업자의 지식 범위 내에 들어간다.

염색체 이상은 불임 및 선천적인 출생 결함의 공통적인 원인이며, 구조적인 이상과 수적인 이상을 모두 포함한다. 다른 세포들은 정상이면서 특정 세포 집단이나 계통에서만 염색체 이상이 발견될 때 생물은 섞임증을 가질 수 있다. 생물은 전체적으로 섞임증일 수도 있으며, 생식선 염색체 섞임증과 같이 섞임증이 특정 기관이나 조직에 제한될 수도 있다. 생식선 염색체 섞임증은 이상 개체가 주로 증상을 나타내지 않을 수 있기 때문에 검출되지 않은 채로 있을 수 있다. 그러나, 생식선 염색체 섞임증이 불임의 원인으로 의심될 때는, 생식선 염색체 섞임증을 확인 또는 검출하는 현재의 방법은 분석용 조직 샘플을 채취하기 위해 수술 과정을 필요로 한다. 따라서, 현재의 분석 기술은 시간-소모적이며, 분석될 수 있는 세포 수에 있어 제한적이고, 때문에 낮은 등급의 생식선 염색체 섞임증의 검출에 제한적이다.

본 발명은 난포액으로부터 얻은 세포를 유전자 분석에 의해 분석하여 염색체 이상을 검출하고, 생식선 염색체 섞임증, 예를 들어 낮은 등급의 생식선 염색체 섞임증을 진단한다. 예를 들어, 난포액은 시험관 수정을 위해 난모세포를 채취한 환자로부터 분리된다. 이 과정에서 난모세포를 함유한 난포액이, 예를 들어 질경유 초음파를 사용하여 환자의 난소로부터 흡인된다. 더미세포로 둘러싸여 있는 난모세포를 확인하여 난포액으로부터 분리한 다음, 액은 보통 버린다. 결과적으로, 이미 난모세포가 채취된 환자에 대해서 본 발명은 생식선 염색체 섞임증의 검출을 위한 추가의 수술 과정을 요하지 않는다.

바람직한 구체예에서, 난포액은 시험관 수정을 위해 난모세포를 채취하는 동안 채취된다. 난포 흡인 과정은 부인과 및 산과 분야의 전문가들에게 잘 공지되어 있다. 일반적으로, 난모세포는 배란유도 36시간 후에 난포 흡인에 의해 채취되고, 그 다음 세포로 둘러싸인 난모세포로부터 과잉의 난포액을 제거한다. 남은 난포액으로부터 세포를 획득하는 바람직한 과정은 원심분리이며, 어떤 공지의 세포 흡인 기술이라도 사용될 수 있다. 바람직하게, 난포액은 약 20℃ 내지 약 40℃의 어떤 온도에서, 그리고 약 1000rpm 내지 3000rpm에서, 약 1분 내지 약 30분의 어떤 시간 길이 동안 원심분리된다. 다른 구체예에서, 난포액은, 예를 들어 난포 흡인 또는 복강경에 의해서 시험관내 수정을 위해 난모세포를 채취하는 동안에 채취되지 않는다.

일단 세포가 난포액으로부터 분리되었다면, 세포를 유전자 분석하여 염색체 이상을 검출한다. 바람직한 구체예에서 세포는 FISH 분석된다. 예를 들어, 세포는 약 20℃ 내지 약 40℃의 온도에서 약 5분 내지 45분간 저장성 용액으로 처리되고, 그 다음 약 1℃ 내지 약 25℃에서 Carnoy 고정제와 같은 적합한 고정제를 사용하여 적합한 표면 위에 고정된다. 일단 고정되면, 당업자에게 공지된 방버을 사용하여 적합한 프로브가 샘플 세포와 교잡될 수 있다. 바람직하게, 분석될 염색체용의 표지된 DNA 프로브를 차단 DNA와 미리 혼합한 다음, 교잡 완충액을 난포액 샘플로부터의 고정된 세포에 적용한다. 다음에, 프로브와 샘플을 약 73℃에서 약 5분간 변성시키고, 약 37℃에서 약 16 내지 18시간 동안 어두운 교잡 챔버에서 인큐베이션하여 교잡시킨다. 교잡 후, 1mL 20xSSC, 49mL RO H₂O 및 150㎕ Igepal 또는 다른 유사한 계면활성제의 용액 중에서 약 73℃에서 약 2분간 슬라이드를 세척하고, 그 다음 5mL 20xSSC, 45mL RO H₂O 및 50㎕ Igepal 또는 다른 유사한 계면활성제 중에서 실온에서 약 1분간 세척한다. 헹군 후에 슬라이드를 건조하고 바람직하게는 DAPI를 사용하여 대조염색한다. 그 다음, 세포는 형광 현미경을 이용하여 분석될 수 있다. 이들 바람직한 방법을 사용하여, 주어진 난포액 샘플로부터 약 20 내지 1000개 세포가 분석될 수 있다. FISH 접근법은 하나의 난포액 샘플로부터 많은 수의 세포의 분석을 허용하기 때문에, 난소의 세포의 단지 낮은 비율만이 이상을 나타내는 낮은 등급의 생식선 염색체 섞임증이 검출될 수 있다.

바람직한 구체예에서, 난포액으로부터 분리된 세포는 당업자에게 잘 공지된 유전자 분석 방법을 사용하여 검출될 수 있는 어떤 염색체의 염색체 이상, 예를 들어 영염색체, 일염색체 또는 삼염색체와 같은 이수성체에 대해 분석된다. 바람직한 구체예에서, 난포액으로부터 분리된 세포는 염색체 13, 15, 16, 18, 21, 22, X 또는 Y에서 이수성체의 여부를 측정하기 위해 분석된다. 염색체 이상은 이들 염색체에 특이적인 프로브를 사용하는 FISH 분석을 이용하여 검출될 수 있다. 유사하게, 염색체 13, 15, 16, 18, 21, 22, X 또는 Y가 일염색체인 세포를 검출하는 것이 이들 염색체에 특이적인 프로브를 사용하여 수행될 수 있다. 염색체 15, 16, 21 및 22의 일염색체증은 유산에 관련된다고 알려져 있다(Munne, S. 등 2004, Reprod. Biomed. Online, 8:91-90).

다른 바람직한 구체예에서, 핵형분석을 사용하여 세포의 염색체 이상을 분석할 수 있다. 핵형분석의 바람직한 과정에서는 먼저 난포액으로부터 얻어진 세포가 적합한 배양 배지를 사용하여 배양된다. 상업적으로 이용가능한 배양 배지의 예는 Amniomax, F10 배지, 또는 로즈 파크 메모리얼 인스티튜트 배지를 포함한다. 세포는 바람직하게는 컨플루언트 성장이 얻어질 때까지 유리한 온도(예를 들어, 37℃)에서 당업자에게 공지된 표준 기술을 사용하여 배양된다. 다음에, 배양된 세포가 바람직하게는 종래의 방법을 이용하여 수집되고, 약 1℃ 내지 약 25℃의 온도에서 Carnoy 고정제와 같은 적합한 고정제를 사용하여 적합한 표면 위에 고정된다. 당업자에게 공지된 방법을 사용하여 슬라이드의 밴딩을 수행하고, 슬라이드를 적합한 현미경 아래에서 중기 염색체에 대해 분석한다. 이들 바람직한 방법을 사용하여, 주어진 난포액 샘플로부터 약 1 내지 40개 세포가 분석된다.

다른 바람직한 구체예에서, 비교유전자교잡법(CGH)을 사용하여, 포착하기 어려운 염색체 이상을 포함하는 염색체 이상을 확인한다. CGH는 정량적 2-색 FISH를 기초로 하는데, 이것은 시험 샘플, 예를 들어 난포액으로부터 얻은 세포, 및 정상 대조기준 샘플로부터 합성된 프로브들을 사용한다. 바람직하게, 프로브들은 정상 기준 샘플로부터의 중기 염색체와 동시에 교잡된다. 교잡된 프로브의 신호 강도를 비교하여 난포액 세포에서 이상 영역을 나타낼 수 있다.

다른 구체예에서, 상기와 같이 구성된 프로브들은 CGH-어레이라고 하는 기술의 DNA 어레이에 적용될 수 있다. CGH-어레이는, 삼염색체 20의 섞임증(Schaeffer 등, Am.J.Hum.Genet., 2004, 74:1168-1174), 불균형 전좌(Klein 등, Clin. Genet., 2004, 65:477-82), 불균형 아종말체 재배열(subtelomeric rearrangement)(Ness 등, Am.J.Med.Genet, 2002, 113:125-136), 및 불균형 역위 또는 염색체 재배열(Daniely 등, Cytogenet. Cell. Genet., 1999, 86:51-5)과 같은 이상을 확증하는 것으로 밝혀졌다. CGH 어레이 방법과 염색체 특이적 DNA 라이브러리를 제조하는 방법은 본 분야에서 설명되며 공지이다(Hu 등, Mol. Hum. Reprod., 2004, 10:283-289; Bolzer 등, Cytogenet. Cell. Genet., 1999, 84:233-240). 또한, 세포 집단 내의 유전자 섞임증을 측정하기 위해 어레이-기초 CGH를 사용하는 것이 Mansoor Mohammed에 의한 미국 특허출원 공개 No. 20030124584에 개시되었으며, 이것의 전체가 본원에 참고자료로서 포함된다.

염색체 및 유전자 이상을 분석하는 당업자에게 잘 공지된 다른 방법은, 제한은 없지만, 멀티컬러-밴딩(MCB), 정량 FISH(Q-FISH), 중합효소 연쇄반응(PCR), 유전자 비트 분석(GBA), 멀티플렉스 시퀀싱, SNaPshot, MassEXTEND, MassArray, 마이크로어레이 리게이션, 마이크로어레이 Miniseq, 택 어레이, 어레이드 프라이머 익스텐젼(APEX), 마이크로어레이 프라이머 익스텐젼, GOOD 분석, 코드화 마이크로스피어, 제한 단편 길이 다형성 분석(RFLP), 대립유전자 특이적 올리고뉴클레오티드 (ASO) 분석, 메틸화-특이적 PCR(MSPCR), 피로시퀀싱 분석, AcycloPrime 분석, 역점적법, GeneChip 마이크로어레이, 동적 대립유전자-특이적 교잡법(DASH), 펩티드 핵산(PNA) 및 잠금핵산(LNA) 프로브, TaqMan, 분자 비콘, 삽입 색소, FRET 프라이머, AlphaScreen, SNPstream, Invader 분석, 주형-지정 혼입법(TDI), 형광 편광, 서열-코드화 올리고뉴클레오티드 리게이션 분석, 리가제 연쇄반응, 패드락 프로브, 롤링 서클 증폭, 및 색채 올리고뉴클레오티드 리게이션 분석(OLA)을 포함한다.

시험관 수정 프로그램에서, 난모세포 및 배아의 착상 전 유전자 진단은 배아 전이 전에 이상 배아를 골라내기 위한 정선된 기술로 되어 있다. 따라서, 다른 구체예에서, 생식선 염색체 섞임증을 가진 것으로 확인된 피험자에서, 임신 동안 생존할 배아를 골라서 착상시킬 확률을 높이기 위해서, 착상 전 유전자 진단 및 난모세포와 배아의 염색체 이상의 진단이 수행될 수 있다.

마지막으로, 생식선 염색체 섞임증을 포함하는 염색체 이상의 확인은 그 밖의 동물들, 바람직하게는 포유동물, 그리고 특히 트랜스젠 동물에서 이용될 수 있다. 유전자 섞임증은 전핵 미소주입법에 의해 생산된 트랜스젠 동물에서 흔히 발생한다. 교배 전에 배계열 섞임증에 대해 개시 동물을 스크리닝하는 성공적인 방법으로, 트랜스젠 계열의 번식 비용을 줄이고, 트랜스젠 포유동물을 생산하기 위한 교배 전에 배계열 섞임증에 대해 개시 동물을 스크리닝함으로써 트랜스젠 동물 생산의 효율을 개선할 수 있다.

본원에 개시되고 청구된 방법은 본 명세서에 비추어 과도한 실험 없이 행해지고 실행될 수 있다. 본 명세서의 방법은 바람직한 구체예와 관련하여 설명되었지만, 본 발명의 개념, 정신 및 범위로부터 벗어나지 않으면서 본원에 설명된 방법 및 단계 또는 방법 단계의 순서에 변화가 적용될 수 있다는 것이 당업자에게 분명할 것이다. 더 구체적으로, 화학적 또는 생리학적으로 관련된 어떤 제제가 본원에 설명된 제제를 대체할 수 있으며, 동일한 또는 유사한 결과가 달성된다는 것이 분명할 것이다. 당업자에게 자명한 모든 그러한 유사한 대체물 및 변형은 첨부된 청구항에 의해 한정되는 본 발명의 정신, 범위 및 개념에 들어가는 것으로 간주한다.

다음 실시예는 본 발명의 바람직한 구체예를 증명하기 위해서 포함된다. 다 음의 실시예에 개시된 기술은 본 발명을 실시하는데 있어 잘 기능하도록 본 출원인에 의해 발견된 기술을 나타내며, 따라서 그것의 실시가 바람직한 방식을 구성하는 것으로 간주될 수 있다는 것이 당업자에 의해 인정되어야 한다. 그러나, 당업자는 본 명세서에 비추어 개시된 특정한 구체예에서 많은 변화가 만들어질 수 있고, 본 발명의 정신 및 범위로부터 벗어나지 않는 비슷하거나 유사한 결과가 여전히 얻어짐을 인정해야 한다.

실시예 1

1) 난포액 샘플로부터 세포 채취 및 프로세싱

시험관 수정을 받은 환자로부터 나머지 난포액 샘플을 약 5 내지 10mL 알리쿼트로 원심분리 튜브에 채취했다. 다음에, 약 1000rpm으로 10분간 샘플을 원심분리했다. 다음에, 상청액의 대부분을 제거하고 펠릿 위에 약 0.5mL의 액을 남겼다. 37℃로 미리 가온한 약 8mL의 75mM KCl을 펠릿에 가하고 혼합한 다음 37℃에서 20분간 인큐베이션했다. 인큐베이션 후, 튜브를 약 1000rpm으로 10분간 원심분리했다. 다음에, 상청액을 버리고 펠릿 위에 약 0.5mL의 액을 남겼다. 계속 혼합하면서 약 8mL의 차가운 Carnoy 고정제를 가했다. 튜브를 2-8℃에서 30분 이상 인큐베이션한 다음 1000rpm으로 10분간 원심분리했다. 원심분리한 후, 상청액을 버리고 펠릿 위에 약 0.5mL의 액을 남겼다. 고정제를 사용한 세척 단계를 2회 반복했다.

2) 슬라이드 제조 및 FISH 분석

1개나 2개의 작은 칸을 깨끗한 슬라이드의 이면에 다이아몬드 마커로 표시했 다. 고정된 세포 10㎕를 각 칸에 가하고 슬라이드를 공기 건조시켰다. 슬라이드를 알코올 중에서 연속 탈수시켰다(70% 1분, 85% 1분, 100% 2분). 다음에, 커버슬림을 샘플 면적의 크기대로 자르고, 프로브 1-2㎕를 커버슬립에 도포했다. 슬라이드를 커버슬립 위에 거꾸로 놓은 다음 고무 시멘트로 밀봉했다. 다음에, 슬라이드 워머에 슬라이드를 놓고 73℃에서 5분간 변성시켰다. 그 다음 슬라이드를 곧바로 교잡 상자 안에 넣어 37℃에서 16 내지 18시간 동안 인큐베이션했다. 인큐베이션 후, 5mL 20xSSC 및 45mL RO H₂O 중에서 커버슬립을 제거했다. 다음에, 슬라이드를 1mL 20xSSC 및 49mL RO H₂O 및 150㎕ Igepal(Sigma)로 2분간 세척하고, 5mL 20xSSC, 45mL H₂O, 및 50㎕ Igepal의 용액 중에서 1분 더 세척했다. 슬라이드를 공기 건조시키고, 10㎕ 장착 배지(Vectashield 중의 200ng/mL DAPI, Vector Lab)로 장착하여 커버슬립 위에 두었다. 슬라이드를 고무 시멘트로 밀봉하여 형광 현미경 아래에서 관찰했다.

3) FISH 분석용 프로브

18번, X 및 Y 염색체에 대한 생식선 염색체 섞임증을 검출하기 위해서, CEP 18 스펙트럼 아쿠아/X 스펙트럼 그린/Y 스펙트럼 오랜지(AneuVysion EC DNA 프로브 키트, Vysis)를 함유하는 프로브 칵테일을 사용했다. 칵테일을 사용했지만, 18번, X 및 Y 염색체에 대한 각각의 프로브를 별도로 사용할 수도 있다. 이들 분석의 실험 결과를 아래 표 1에 나타낸다.

도 1-5는 상기 샘플로부터 선택된 번호의 세포의 FISH 분석 결과를 도시하고 있다. 도 1은 연구 샘플 FF-205에서 난포액으로부터 얻어진 18번 염색체와 X 염색체에 대해 정상 상태를 나타낸 세포 중 하나의 FISH 분석의 현미경 사진을 도시한다. 도 2는 연구 샘플 FF-070에서 18번 염색체 일염색체증을 나타낸 난포액으로부터 얻어진 세포 중 하나의 FISH 분석의 현미경 사진을 도시한다. 도 3은 연구 샘플 FF-097에서 X 염색체 일염색체증을 나타낸 난포액으로부터 얻어진 세포 중 하나의 FISH 분석의 현미경 사진을 도시한다. 도 4는 연구 샘플 FF-200에서 18번 염색체 삼염색체증을 나타낸 난포액으로부터 얻어진 세포 중 하나의 FISH 분석의 현미경 사진을 도시한다. 도 5는 연구 샘플 FF-318에서 X 염색체 삼염색체증을 나타낸 난포액으로부터 얻어진 세포 중 하나의 FISH 분석의 현미경 사진을 도시한다.

표 1에 제시된 데이터를 표 2에 정리하여 나타낸다.

FISH로 확인했을 때 정상 X 염색체를 가진 환자나 이상 X 염색체 이수성체증을 가진 환자의 임신 또는 유산 상태에 대한 소급분석을 아래 표 3에 나타낸다.

어느 한쪽 난소로부터 프로세싱된 478개 난포액 샘플 중 19건의 케이스에서는 분석을 위한 충분한 세포가 얻어지지 않았다. 나머지 459건의 케이스에서 난포액 세포에 대한 FISH의 결과를 표 1에 나타낸다. 우리 실험실에서 1-4%의 이수성체 세포는 정상 범위에 들어가는 것으로 간주한다. 이것은 다른 실험실에서도 그러하다(Vysis AneuVysion

Multicolor DNA 프로브 키트(파트 No 32-161075 & 33-161075 & 35-161075) 패키지 삽입, 표 4, 첨부 A로 여기 첨부됨, 본원에 참고자료로 포함됨). FISH로 분석된 샘플 중 415명의 환자는 정상 X 염색체 패턴을 나타냈고, 44명의 환자는 섞임증 난포액 패턴(X 염색체의 5% 이상이 이수성체)을 나타냈다. X 염색체에 대해 섞임증 이수성체증을 나타낸 개체에 대해서, 혈액 샘플을 가지고 핵형분석과 FISH 분석을 다시 수행했다. 이들 44명의 환자 중에 18명(40.9%)이 또한 혈액의 X 염색체에 대해 낮은 등급의 섞임증(5% 이상이 이수성체)을 가졌으며, 이는 난포액의 결과를 확증하는 것이다. 나머지 26명의 환자는 혈액 분석으로부터는 X 염색체 이수성체증에 대해 정상이었는데, 이것은 이들 26명의 환자에서는 섞임증이 생식선에 제한적일 수 있다는 것을 시사한다(생식선 염색체 섞임증).

더 이상의 분석에 의해, 우리는 FISH에 의해 검출된 이수성체증을 가진 44명의 환자 중 11명(25%)이 임신했었음을 알았다. 한편, 정상 난포액 FISH 결과를 가진 415명의 환자 중에는 148명(35.66%)이 임신했었다. 그러므로, 난포액 세포에서 검출된 이수성체증을 가진 환자의 임신 비율은 정상 난포액 FISH 데이터를 가진 환자보다 낮았다. 이것은 생식선 염색체 섞임증이 임신을 위해 시험관 수정을 받은 여성에서 수태율의 감소와 상호 관련된다는 것을 시사한다. 더욱이, 임신했었던 X 염색체 이수성체증을 가진 11명의 환자 중 7명은 유산되었다(63.63%). 반면, 임신했었던 정상 난포액 FISH 결과를 가진 148명의 환자 중에서는 단지 21명만이 유산되었으며(14.19%), 이것은 일반적인 집단에서의 정상적인 유산 비율과 상호 관련된다. 이것은 X 염색체 이수성체증의 생식선 염색체 섞임증이 유산 위험 증가와 상호 관련된다는 것을 시사한다.

실시예 2

13번 및 21번 염색체의 이상에 대해 FISH에 의한 어느 한쪽 난소로부터 얻은 난포액의 세포를 사용한 생식선 염색체 섞임증의 확인

실시예 1에 설명된 대로 세포와 슬라이드를 준비했다. 그러나, 난포액 샘플은 13번 또는 21번 염색체 삼염색체증의 병력이 있는 아이를 가진 환자로부터 얻었다. 또, 혈액 분석을 통해서 환자들은 13번 또는 21번 염색체에 대해 이수성체증의 섞임증 패턴을 갖는 것으로 진단되었다. 13번 염색체(LSI 13 스펙트럼 그린)와 21번 염색체(LSI 21 스펙트럼 오랜지)에 특이적인 프로브를 사용했다(Aneu Vysion EC DNA 프로브 키트, Vysis). 이들 분석 결과를 아래 표 4에 나타낸다.

도 6-8은 상기 샘플로부터 선택된 번호의 세포의 FISH 분석 결과를 도시하고 있다. 도 6은 연구 샘플 FF-A01에서 13번 및 21번 염색체에 대해 정상 상태를 나타낸 난포액으로부터 얻어진 세포 중 하나의 FISH 분석의 현미경 사진을 도시한다. 도 7은 연구 샘플 FF-A03에서 13번 염색체 삼염색체증을 나타낸 난포액으로부터 얻어진 세포 중 하나의 FISH 분석의 현미경 사진을 도시한다. 도 8은 연구 샘플 FF-A05에서 21번 염색체 삼염색체증을 나타낸 난포액으로부터 얻어진 세포 중 하나의 FISH 분석의 현미경 사진을 도시한다.

실시예 3

18번, X 및 Y 염색체의 이상에 대해 FISH에 의한 개체의 양쪽 난소로부터 얻어진 난포액의 세포를 사용한 생식선 염색체 섞임증의 확인

이 실험은 실시예 1과 동일한 방식으로 수행되었으나, 다만 실시예 1과 달리 난포액의 세포 샘플을 양쪽 난소로부터 얻었다. 이들 분석 결과를 아래 표 5에 나타낸다.

표 5의 데이터를 정리 분석하여 그 결과를 아래 표 6에 나타낸다.

FISH 분석에 의해 측정했을 때 X 염색체 이수성체증을 가진 환자와 정상 환자에서 비교한 임신 및 유산 상태를 소급분석하여 비교한 것을 아래 표 7에 나타낸다.

프로세싱한 81개의 난포액 샘플 중 67개의 샘플은 X 염색체 이상을 나타내지 않았다(5% 이하의 이수성체 세포; 표 6). 나머지 14건의 케이스 중 6건은 이수성체증이 한쪽 난소의 샘플에서만 발견되었고, 나머지 8건의 케이스에서는 이수성체증이 양쪽 난소의 난포액 샘플에서 모두 검출되었다(표 6).

소급분석에서, 양쪽 난소에서 X 염색체 이수성체증을 가진 8명의 환자 중 2명은 임신했었으나 둘 다 유산했다. 분석된 양쪽 난소 중 어느 한쪽에서 X 염색체 이수성체증을 가진 6명의 환자 중 2명이 임신했었고 이 중 한 명은 유산했다. 비교하여 X 염색체가 정상인 67명의 환자 중에서는 16명이 임신했었고(23.88%) 이 중 단지 3명만이 유산했다.

실시예 4

핵형분석에 의한 난포액의 세포를 사용한 생식선 염색체 섞임증의 확인( 커버 슬립 방법)

1) 난포액으로부터 세포의 채취

시험관 수정 치료를 받은 4명의 환자로부터 실시예 1에 설명된 대로 난포액으로부터 세포를 채취했다.

2) 세포 배양

각 환자로부터의 난포액 샘플을 1000rpm으로 10분간 원심분리하여 세포를 펠릿으로 만들었다. 상청액을 버려 펠릿 위에 약 4mL의 액을 남긴 다음, 펠릿을 나머지 액에 재현탁했다. 페트리 접시에 놓인 멸균 커버슬립 위에 약 0.5mL를 피펫팅했다. 샘플을 몇 분 건조시킨 후, 배양 배지(Amniomax; Sigma) 0.5mL를 가하고 37℃의 온도에서 5% CO₂ 하에 하룻밤 인큐베이션했다. 다음 날 배양 배지를 약 2mL 가하고 플레이트를 2일 더 인큐베이션했다. 배양물을 현미경 아래에서 섬유아세포 형성에 대해 매일 모니터했고, 필요에 따라서 배양 배지를 추가로 가했다. 배양물이 컨플루언트를 형성했을 때, 상청액을 제거하고 신선한 배지를 가했다. 2일 후에, 배양물에 Demicolcine(Sigma) 20㎕를 가하고, CO₂ 인큐베이터에서 20분간 인큐베이션하고, 저장성 용액(0.75M KCl 및 0.6% 나트륨 시트레이트) 2mL를 가하여 세포를 수집했다. 그 다음, 배양물을 37℃에서 20분간 인큐베이션했다.

3) 세포 고정 및 핵형분석

실온에서 신선한 고정제 다섯 방울을 배양물에 서서히 가하고, 배양물을 37℃에서 10분간 인큐베이션했다. 고정제 1mL 알리쿼트를 더 가하고, 10분 후에 2mL를 더 가했다. 실온에서 20분 후에 고정제를 전부 제거하고, 신선한 고정제 2mL를 가하고 실온에서 20분간 다시 인큐베이션했다. 이 마지막 고정 단계를 2번 반복했다. 커버슬립을 페트리 접시에서 분리하고 축축한 조직이 건조되도록 두었다. 다음에, DPX 장착 배지를 사용하여 커버슬립을 깨끗한 건조된 슬라이드 상에 장착했다. 슬라이드를 GTG 밴딩 방법(AGT Cytogenetics Laboratory Manual, 3판, 1997, P 259-324)에 따라 염색하고 공기 건조시켰다. 그 다음, 슬라이드를 오일에 담근 상태에서 관찰하여 날카로운 밴딩을 체크했다. 수적 및 구조적 이상에 대해 최소 20 내지 30개의 중기 세포를 분석했다.

4) 결과

한 개체로부터의 샘플에서 분석된 20개의 중기 세포 중 3개의 중기 세포에서 X 염색체 일염색체증이 검출되었다(도 9). 이 결과는 또한 혈액 샘플에서 분석된 20개의 중기 세포에서 확증되었다.

실시예 5

핵형분석에 의한 난포액의 세포를 사용한 생식선 염색체 섞임증의 확인(배양 플라스크 방법)

1) 난포액 세포 채취

시험관 수정 과정을 받은 6명의 개체로부터 실시예 1에 설명된 대로 난포액 샘플을 채취했다.

2) 세포 배양 및 고정

각 개체로부터의 난포액 샘플을 1000rpm으로 10분간 원심분리하여 세포를 펠릿으로 만들었다. 상청액을 버려 펠릿 위에 약 4mL의 액을 남겼다. 그 다음, 펠릿을 나머지 상청액에 재현탁했다. 세포 현탁액 2mL를 2개의 조직 배양 플라스크에 각각 가했다. 배양 배지(Amniomax; Sigma)를 플라스크에 가하고, 배양물을 37℃에서 6-8일 동안 인큐베이션했다. 각 플라스크에 배양 배지 2mL를 추가로 가하고, 플라스크를 2일 더 인큐베이션했다. 배양물을 현미경 아래에서 섬유아세포 형성에 대해 매일 관찰했고, 필요에 따라서 배양 배지를 보충했다. 배양물에서 섬유아세포 콜로니가 발견되었을 때, Demicolcine(Sigma) 50㎕를 가하고 약 37℃에서 2 내지 3시간 인큐베이션하여 세포를 수집했다. 다음에, 세포를 원심분리 튜브로 옮겼다. 플라스크에 EDTA 용액을 가하고, 플라스크를 톡톡 두드린 다음 내용물을 원심분리 튜브에 다시 옮겼다. 그 후, 플라스크를 2-3분간 트립신 용액으로 세척하고, 다시 원심분리 튜브로 옮겼다.

약 2mL의 저장성 용액(0.75M KCl 및 0.6% 나트륨 시트레이트)을 배양된 세포가 담긴 원심분리 튜브에 가하고 튜브를 약 37℃에 약 20분간 두었다. 여기에 신선한 실온 고정제를 10-12 방울 서서히 가하고 튜브를 약 37℃에서 약 10분간 두었다. 다음에, 튜브를 1000rpm으로 10분간 원심분리했다. 상청액을 버리고 펠릿 위에 약 0.5mL의 용액을 남겼다. 펠릿을 남아 있는 상청액에 재현탁시켰다. 신선한 냉장된 고정제 1mL를 먼저 가하고, 여기에 약 5mL의 고정제를 더 가한 다음, 현탁액을 2-8℃에서 16-20시간 그대로 두었다. 고정된 샘플을 원심분리했고, 상청액을 버리고 펠릿 위에 약 0.5mL 용액을 남겼다. 신선한 차가운(2 내지 8℃) Carnoy 고정제 약 6mL를 가하고 내용물을 원심분리한 다음 고정제를 더 가했다. 이 고정 단계를 2번 반복했다.

3) 핵형분석

세포 현탁액 몇 방울을 냉장된 젖은 슬라이드 위에 놓았다. 다음에, 슬라이드를 60 내지 68℃의 수조 위에서 2초간 가열한 다음, 45℃로 설정된 핫 플레이트로 옮겨서 1분간 두었다. 슬라이드를 길고 잘 펼쳐져 있는 염색체를 갖는 중기 세포에 대해 위상차 현미경 아래에서 10x 배율로 관찰했다. 슬라이드를 상기 설명된 GTG 밴딩 방법에 의해 염색하고 공기 건조시켰다. 다음에, 슬라이드를 오일에 담근 상태에서 관찰하여 양호한 날카로운 밴딩을 체크했다. 수적 및 구조적 이상에 대해 최소 20개의 중기 세포를 분석했다.

4) 결과

다운증후군의 병력이 있는 자손을 갖는 환자의 샘플에서 분석된 30개의 중기 세포 중, 4개의 중기 세포에서 21번 염색체 삼염색체증이 검출되었다(도 10). 반면, 혈액 샘플 분석을 통해 관찰된 중기 세포는 모두 정상이었다. 이들 결과는 이 개체에 생식선 염색체 섞임증이 존재한다는 것을 시사한다.

실시예 1 내지 5에 나타낸 바와 같이, 낮은 등급 생식선 염색체 섞임증을 포함하는 생식선 염색체 섞임증이 난포액으로부터 얻어진 세포에서 확인될 수 있다. 이것은 난포액으로부터 얻어진 세포가 증상을 나타내는 개체와 증상을 나타내지 않는 개체의 집단에서 염색체 이상을 확인하기 위한 효과적인 수단으로서 작용할 수 있다는 것을 암시한다.

Claims

난포액 유래 세포를 시험관에서(in vitro) 유전자 분석하는 단계를 포함하는 생식 시스템 이상을 확인하는 방법으로서,

여기에서 상기 세포의 일부에서의 한 가지 이상의 염색체 이상의 확인은 생식 시스템 이상의 징표이며, 상기 염색체 이상은 생식선 염색체 섞임증 또는 이수성체인 것을 특징으로 하는 생식 시스템 이상을 확인하는 방법.
동물의 난포액 유래 세포를 시험관에서(in vitro) 유전자 분석하는 단계를 포함하는 동물에서 불임의 증가된 위험을 분석하는 방법으로서,

여기에서 상기 세포의 일부에서의 한 가지 이상의 염색체 이상의 확인은 불임의 증가된 위험의 징표이며, 상기 염색체 이상은 생식선 염색체 섞임증 또는 이수성체인 것을 특징으로 하는 불임의 증가된 위험을 분석하는 방법.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 세포는 사람 난포액으로부터 유래하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 3 항에 있어서, 상기 세포는 체세포인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 세포는

(a) 시험관 수정 과정 동안;

(b) 세포질내 정자 주입 과정 동안;

(c) 피험자의 한쪽 난소로부터; 또는

(d) 피험자의 양쪽 난소로부터의 난포액으로부터 유래하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 또는 제 2 항에 있어서, 상기 유전자 분석은

(a) 인 시투(in situ) 형광동소교잡법;

(b) 핵형분석;

(c) DNA 시퀀싱; 또는

(d) 비교 유전자 교잡법(CGH), 멀티컬러-밴딩 (MCB), 정량 FISH (Q-FISH), 중합효소 연쇄반응(PCR), 유전자 비트 분석(GBA), 멀티플렉스 시퀀싱, SNaPshot, MassEXTEND, MassArray, 마이크로어레이 리게이션, 마이크로어레이 Miniseq, 택 어레이, 어레이드 프라이머 익스텐젼(APEX), 마이크로어레이 프라이머 익스텐젼, GOOD 분석, 코드화 마이크로스피어, 제한 단편 길이 다형성 분석(RFLP), 대립유전자 특이적 올리고뉴클레오티드(ASO) 분석, 메틸화-특이적 PCR(MSPCR), 피로시퀀싱 분석, AcycloPrime 분석, 역점적법, GeneChip 마이크로어레이, 동적 대립유전자-특이적 교잡법(DASH), 펩티드 핵산(PNA) 및 잠금핵산(LNA) 프로브, TaqMan, 분자 비콘, 삽입 색소, FRET 프라이머, AlphaScreen, SNPstream, Invader 분석, 주형-지정 혼입법(TDI), 형광 편광, 서열-코드화 올리고뉴클레오티드 리게이션 분석, 리가제 연쇄반응, 패드락 프로브, 롤링 서클 증폭, 및 색채 올리고뉴클레오티드 리게이션 분석(OLA)으로 구성되는 군에서 선택되는 방법

인 것을 특징으로 하는 방법.
제 6 항에 있어서, 상기 비교 유전자 교잡법(CGH)은 중기 염색체 또는 CGH-어레이를 가지고 수행하는 것으로 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 또는 제 2 항에 있어서, 상기 생식선 염색체 섞임증은 낮은 등급의 생식선 염색체 섞임증인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 이수성체는 완전한 혹은 부분적인 삼염색체, 일염색체 또는 영염색체인 것을 특징으로 하는 방법.
제 9 항에 있어서,

(a) 상기 삼염색체는, 13번 삼염색체, 16번 삼염색체, 18번 삼염색체, 21번 삼염색체, 22번 삼염색체, XXY, XYY, 또는 XXX이고,

(b) 상기 일염색체는, X 일염색체, 13번 일염색체, 16번 일염색체, 18번 일염색체, 21번 일염색체, 또는 22번 일염색체이고, 또는

(c) 상기 영염색체는, 13번, 16번, 18번, 21번, 22번, X 또는 Y 염색체에 대한 영염색체인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 유전자 분석은, 난포액 유래 세포에서의 염색체, DNA 또는 유전자 발현의 이상을 검출하기 위한 여하의 염색체, DNA 또는 RNA 기초 분석을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 염색체 이상은 불임 또는 선천적 출생 결함의 원인인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 세포가 유래하는 개체는, 증상을 나타내는 개체 또는 증상을 나타내지 않는 개체인 것을 특징으로 하는 방법.
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