KR101232119B1

KR101232119B1 - ｍｉＲＮＡ를 유효성분으로 포함하는 종양성 질환 예방 또는 치료용 조성물

Info

Publication number: KR101232119B1
Application number: KR1020100138549A
Authority: KR
Inventors: 김호근; 김원규
Original assignee: 연세대학교 산학협력단
Priority date: 2010-12-30
Filing date: 2010-12-30
Publication date: 2013-02-12
Also published as: KR20120090110A; WO2012091220A1

Abstract

본 발명은 마이크로RNA-494(miR-494) 또는 miR-494 과다발현을 유도하는 제제(agents)를 유효성분으로 포함하는 KIT(v-kit Hardy-Zuckerman 4 feline sarcoma viral oncogene homolog)-매개된 질환, 질병 또는 상태(KIT-mediated diseases, disorders or conditions)의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물 및 이를 이용한 스크리닝 방법에 관한 것이다. 본 발명의 miR-494는 KIT 3’-UTR 내에 두 개의 다른 핵심 서열 위치(seed match sites/sequences)에 직접적으로 결합하여 KIT를 하향-조절하고, KIT 시그널링 전이 경로의 다운스트림 분자들(예컨대, 포스포-AKT 및 포스포-STAT3)의 발현을 감소시켰으며, 본 발명의 miR-494 과다발현 유도는 종양세포, 바람직하게는 GIST 세포주의 성장을 억제시켰다. 따라서, 본 발명의 miR-494 및 이의 발현을 촉진시키는 물질 또는 KIT 발현을 억제시키는 물질을 유효성분으로 포함하는 본 발명의 조성물은 KIT-매개된 질환, 질병 또는 상태의 예방 또는 치료에 유용하게 적용될 수 있다.

Description

ｍｉＲＮＡ를 유효성분으로 포함하는 종양성 질환 예방 또는 치료용 조성물{Compositions for Preventing or Treating Neoplastic Disorders Comprising miRNA as an Active Ingredient}

본 발명은 GIST에서 KIT의 음성적 조절인자로서 miR-494 및 이의 용도에 관한 것이다.

위장관 간질종양(gatrointestinal stromal tumors, GISTs)의 분자유전학은 인간 종양 중에서 가장 잘 이해된 종양 중 하나이다[1]. 수용체 타이로신 키나제 패밀리의 종양유전자들 중 두 개의 유전자, 즉 KIT(v-kit Hardy-Zuckerman 4 feline sarcoma viral oncogene homolog) 및 PDGFRA는 각각 GIST의 약 70% 및 15%에서 기능획득 돌연변이(gain-of-function mutations)로 나타난다[2, 3]. 상기 유전자들의 돌연변이는 자신의 지속적인 활성화를 야기하여 KIT 및 PDGFRA의 다운스트림 시그널링 경로의 끊임없는 자극을 초래한다[4, 5]. 이들 중, 특히 KIT의 활성화가 GIST의 발병 및 진행에 중요하다[3]. KIT 돌연변이 후 GIST 종양형성 과정(tumorigenesis)에 포함된 다운스트림 분자 경로들은 PI3-키나제, Src 패밀리 키나제, Ras-E가 및 JAK-STAT 등을 포함한다[6]. KIT 활성화 후 상술한 분자 경로들의 활성화는 세포 증식 활성화 및 아팝토틱 시그널 억제를 통해 GIST 종양형성 과정을 초래한다[4, 6, 7].

GIST의 진행은 ATP 결합 포켓에 경쟁적으로 결합하는 이마티닙(imatinib; STI571)에 의해 성공적으로 차단된다. 상기 이마티닙의 처리는 KIT 활성화를 억제하고 다운스트림 MAP 키나제 및 PI3-키나제-AKT 경로를 분자적으로 차단한다[7, 8]. 하지만, 이마티닙 처리 동안 이마티닙-저항성을 가지게 된 GIST 환자는 이마티닙의 억제 효과에 저항성을 가진다. 따라서, 전사후(posttranscriptional) 조절 및 해독후(posttranslational) 조절 모두에 의해 활성화된 KIT를 억제할 수 있는 보다 더 다양한 접근방법이 KIT 활성화가 중요한 GIST 환자에 요구되고 있다[9-11].

KIT의 과다발현(overexpression)은 GIST의 전형적인 특징으로 보고되었으며, KIT 돌연변이의 존재는 항상 강력한 KIT 발현으로 이어진다[12, 13]. 비록 KIT 돌연변이가 약 70%의 GIST 환자에 존재할 지라도, KIT의 과다발현이 90% 이상의 GIST 환자에서 발견되는데, 이는 또 다른 보충 기작이 KIT 과다발현에 존재한다는 것을 의미한다[2, 14]. 마이크로 RNA(microRNAs, miRNAs)가 암에서 유전자 발현을 조절하는 데 중요한 역할을 하기 때문에, 이의 이상조절이 가능한 기작이다[15, 16]. 현재, KIT를 타겟팅한다고 알려진 miRNA는 오직 miR-221 및 miR-222이다[17]. 이전에, 본 발명자들은 GIST 환자에서 KIT 발현과 miRNA 발현 프로파일을 비교하여 KIT 발현에 상대적으로 반비례적인 발현을 나타내는 다섯 개의 후보 miRNA들을 동정하였다[13].

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 위장관 간질종양(gatrointestinal stromal tumors, GISTs)을 치료하기 위한 신규한 타겟을 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 miR-494가 KIT mRNA 내에 존재하는 두 개의 다른 핵심 서열 위치(seed match sites)에 직접적으로 결합하여 KIT 발현을 하향-조절하고, KIT 시그널링 전이 경로의 다운스트림 분자들(예컨대, 포스포-AKT 및 포스포-STAT3)의 발현을 감소시켜 KIT-활성화 돌연변이를 가지는 GIST 세포주(예컨대, GIST882 세포주)의 성장 및 증식을 억제시킨다는 것을 발견함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 KIT(v-kit Hardy-Zuckerman 4 feline sarcoma viral oncogene homolog)-매개된 질환, 질병 또는 상태(KIT-mediated diseases, disorders or conditions)의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 다른 목적은 상기 질환, 질병 또는 상태의 예방 또는 치료용 뉴클레오타이드 서열을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 종양성 질환(neoplastic disorder) 치료제의 스크리닝 방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 마이크로RNA-494(miR-494) 또는 miR-494 과다발현을 유도하는 제제(agents)를 유효성분으로 포함하는 KIT(v-kit Hardy-Zuckerman 4 feline sarcoma viral oncogene homolog)-매개된 질환, 질병 또는 상태(tyrosine kinase-mediated diseases, disorders or conditions)의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 서열목록 제2서열의 뉴클레오타이드 서열 중 8번째부터 15번째 뉴클레오타이드 서열에 상보적인 서열을 가지는 안티센스 올리고뉴클레오타이드 서열을 포함하는 종양성 질환 치료용 20-100개의 연속 뉴클레오타이드 서열을 제공한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 서열목록 제3서열의 뉴클레오타이드 서열 중 8번째부터 15번째 뉴클레오타이드 서열에 상보적인 서열을 가지는 안티센스 올리고뉴클레오타이드 서열을 포함하는 종양성 질환 치료용 20-100개의 연속 뉴클레오타이드 서열을 제공한다.

본 발명자들은 위장관 간질종양(gatrointestinal stromal tumors, GISTs)을 치료하기 위한 신규한 타겟을 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 miR-494가 KIT mRNA 내에 존재하는 두 개의 다른 핵심 서열 위치(seed match sites)에 직접적으로 결합하여 KIT 발현을 하향-조절하고, KIT 시그널링 전이 경로의 다운스트림 분자들(예컨대, 포스포-AKT 및 포스포-STAT3)의 발현을 감소시켜 KIT-활성화 돌연변이를 가지는 GIST 세포주(예컨대, GIST882 세포주)의 성장 및 증식을 억제시킨다는 것을 발견하였다.

KIT 키나제는 수용체 타이로신 키나제의 하나로, 특이적인 리간드인 SCF(stem cell factor)와 결합한다. 상기 결합은 키나제의 다이머화를 야기하고 이후, 키나제의 활성화를 초래한다. 그 결과, KIT 키나제의 많은 기질들이 인산화된다(Blume-Jensen P. et al., EMBO J. 10, 4121-4128, 1991; and Lev S. et al., EMBO J., 10, 647-654, 1991). KIT 키나제의 비정상적인 활성화는 특정 형태의 암세포에서 증식 시그널을 발생시키는데, 이는 암 발생 또는 악성 형질전환의 원인으로 생각되고 있다. 상기 KIT 키나제의 비정상적인 활성화에 의해 야기되는 대표적인 질환들은 위장관 간질종양(gastrointestinal stromal tumors, GIST), 소세포 폐암(Small cell lung cancer, SCLC), 급성 골수성 백혈병(Acute myelogenous leukemia, AML), 지방세포 백혈병(Mast cell leukemia) 및 암을 포함한다.

본 발명의 “위장관 간질종양(gastrointestinal stromal tumors, GIST)”은 KIT 키나제를 발현하는 위장관에서 발병하는 간질종양을 의미하며, 약 50%의 빈도로 KIT 키나제의 돌연변이가 활성화되고, 매우 높은 악성을 가진 GIST 환자는 더 높은 빈도로 상기 돌연변이가 발견되었는데, 이는 상기 돌연변이의 가능성이 진단인자일 수 있다는 것이다(Lasota J. et al., Am. J. Pathol., 157, 1091-1095, 2000; and Taniguchi M. et al., Cancer Res., 59, 4297-4300, 1999). 하지만, KIT 발현과 miRNA 간의 상관관계에 대해 보고된 바는 아직까지 없다.

본 발명은 위장관 간질종양을 유발하는 KIT 키나제에 대한 음성 조절자로서 miR-494의 기능을 밝혀낸 최초의 발명이다. 본 발명에 따르면, 본 발명의 miR-494는 KIT mRNA의 3’-UTR(untranslated region)에 직접적으로 결합하여 KIT의 발현을 하향-조절하였다. 또한, 본 발명의 miR-494는 KIT 시그널링 전이 경로의 다운스트림 분자들의 인산화(예컨대, 포스포-AKT 및 포스포-STAT3)를 감소시켰다(참고: 도 5).

본 명세서의 용어 “마이크로RNA(microRNA, miRNA)”는 21-25 nt의 단일가닥 RNA 분자로서 mRNA(messengerRNA)의 3'-UTR에 결합하여 진핵생물의 유전자 발현을 제어하는 물질이다[Bartel DP et al., Cell. 2004 Jan 23;116(2):281-297]. miRNA의 생성은 Drosha(RNaseⅢ type 효소)에 의해 스템-루프 구조의 전구체 miRNA(pre-miRNA)로 만들어지고, 세포질로 이동하여 다이서(Dicer)에 의해 절단되어 성숙한 miRNA로 만들어진다[Kim VN et al., Nat Rev Mol Cell Biol. 2005 May;6(5):376-385]. 상술한 바와 같이 제조된 miRNA는 표적단백질의 발현을 조절함으로써 발생, 세포증식 및 사멸, 지방대사, 종양형성 등에 관여한다[Wienholds E et al., Science, 309(5732): 310-311(2005); Nelson P et al., Trends Biochem Sci., 28: 534-540(2003); Lee RC et al., Cell, 75: 843-854(1993); 및 Esquela-Kerscher A et al., Nat Rev Cancer. 6: 259-269(2006)].

본 발명의 조성물에 있어서, 상기 miRNA의 넘버는 작은 RNA(small RNA)의 발견된 순서에 따라 매겨진 번호로써, miR-494는 494번째에 발견된 miRNA를 의미하며, 이는 당업자에게 자명하다(http://www.mirbase.org).

본 명세서의 용어 “miR-494 과다발현을 유도하는 제제(agents)”는 본 발명의 miR-494의 과다발현을 유도하는 모든 제제를 포괄하는 것으로, 화학물질, 뉴클레오타이드, 안티센스-RNA, siRNA(small interference RNA) 및 천연물 추출물을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

바람직하게는, 상기 miR-494는 사람 염색체의 14번에 위치하며 서열목록 제1서열에 기재되어 있다. 상기 염기서열은 miRNA-494의 성숙한 형태로써, miR-494헤어핀 구조의 전구체 miRNA(precusor microRNA)로부터 유래한다. 서열목록 제1서열에서 2번째부터 8번째까지의 뉴클레오타이드 서열은 miR-494의 핵심 서열이다. 일반적으로, miRNA의 핵심 서열(seed sequence)은 타겟 인지에 매우 중요한 서열로서(Krenz, M. et al., J. Am. Coll. Cardiol. 44: 2390-2397(2004); H. Kiriazis, et al., Annu. Rev. Physiol. 62: 321(2000)), 다양한 종에 대하여 보존적(conserved)이다. 따라서, 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 miR-494의 타겟(바람직하게는, KIT) 내에 존재하는 서열에 결합할 수 있는 서열이고, 바람직하게는 서열목록 제2서열 및 서열목록 제3서열에 결합할 수 있는 서열이며, 보다 바람직하게는 서열목록 제2서열의 뉴클레오타이드 서열 중 8번째부터 15번째 뉴클레오타이드 서열에 상보적인 서열을 가지는 안티센스 올리고뉴클레오타이드 서열을 포함하는 20-100개의 연속 뉴클레오타이드 서열 또는 서열목록 제3서열의 뉴클레오타이드 서열 중 8번째부터 15번째 뉴클레오타이드 서열에 상보적인 서열을 가지는 안티센스 올리고뉴클레오타이드 서열을 포함하는 20-100개의 연속 뉴클레오타이드 서열이고, 가장 바람직하게는 서열목록 제2서열의 뉴클레오타이드 서열에 상보적인 서열을 가지는 안티센스 올리고뉴클레오타이드 서열을 포함하는 20-100개의 연속 뉴클레오타이드 서열 또는 서열목록 제3서열의 뉴클레오타이드 서열에 상보적인 서열을 가지는 안티센스 올리고뉴클레오타이드 서열을 포함하는 20-100개의 연속 뉴클레오타이드 서열이다.

본 명세서에서 용어 “안티센스 올리고뉴클레오타이드”는 miRNA, 특히 miRNA의 핵심 서열(seed sequence)에 대한 상보적인 서열을 가지고 있어 miRNA의 타겟 서열에 혼성화할 수 있는 핵산-기반 분자를 포함한다. 따라서, 본 명세서에서 용어 “안티센스 올리고뉴클레오타이드”는 “상보적 핵산-기반 억제제”로 기재될 수 있다.

본 명세서에서 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 언급하면서 사용되는 용어 “상보적”은 소정의 혼성화 또는 어닐링 조건, 바람직하게는 생리학적 조건 하에서 안티센스 올리고뉴클레오타이드가 miR-494 타겟에 선택적으로 혼성화 할 정도로 충분히 상보적인 것을 의미하는 것으로 하나 또는 그 이상의 미스매치(mismatch) 염기서열을 가질 수 있으며, 실질적으로 상보적(substantially complementary) 및 완전히 상보적(perfectly complementary)인 것을 모두 포괄하는 의미를 가지며, 바람직하게는 완전히 상보적인 것을 의미한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 miR-494의 핵심 결합 위치/서열(seed match sites/sequence)은 서열목록 제2서열 및 서열목록 제3서열에 기재되어 있다. 가장 바람직하게는, 상기 위치/서열은 KIT mRNA의 3’-UTR에 존재한다.

본 발명에서 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 다양한 분자를 포함한다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 DNA 또는 RNA 분자이며, 보다 바람직하게는 RNA 분자이다. 선택적으로 , 본 발명에서 이용되는 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 리보뉴클레오타이드(RNA), 디옥시리보뉴클레오타이드(DNA), 2‘-O-변형 올리고뉴클레오타이드, 포스포로티오에이트-백본 디옥시리보뉴클레오타이드, PNA(peptide nucleic acid) 또는 LNA(locked nucleic acid)이다. 2‘-O-변형 올리고뉴클레오타이드는 바람직하게는 2’-O-알킬 올리고뉴클레오타이드이고, 보다 바람직하게는 2’-O-C_1-3 알킬 올리고뉴클레오타이드이며, 보다 더 바람직하게는 2’-O-C_1-3 메틸 올리고뉴클레오타이드이다.

상술한 바와 같이, 본 발명에서 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 miR-494의 타겟 서열에 상보적인 서열을 가지는 핵산-기반 억제제를 포함하는 포괄적인 의미를 갖는다. 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오타이드에 포함되는 것은, 예를 들어 좁은 의미의 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 포함한다.

본 발명의 miR-494 타겟에 대한 기능의 억제는 전형적인 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 투여하여 달성될 수 있다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 리보뉴클레오타이드 또는 디옥시리보뉴클레오타이드이다. 바람직하게는, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 적어도 하나의 화학적 변형을 포함한다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 하나 또는 그 이상의 LNAs(Locked nucleic acids)를 포함할 수 있다. LNA는 변형 리보뉴클레오타이드로서 리보오스 당 부위의 2‘ 내지 4’ 탄소 사이에 추가적인 브리지를 포함하여 잠금(locked) 형태를 가지게 되며 이에 LNA가 있는 올리고뉴클레오타이드는 개선된 열 안정성을 가지게 된다[J Weiler, J Hunziker and J Hall Gene Therapy (2006) 13, 496.502]. 택일적으로, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 PNAs(peptide nucleic acids)를 포함할 수 있으며, 이는 당-포스페이트 백본 대신에 펩타이드-기반 백본을 포함한다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드가 포함할 수 있는 다른 화학적 변형은, 2'-O-알킬(예컨대, 2'-O-메틸, 2'-O-메톡시에틸), 2'-플루오로 및 4'-티오 변형과 같은 당 변형; 포스포로티오에이트, 모포리노 또는 포스포노카복실레이트 결합과 같은 백본 변형(예컨대, 미국 특허 제6,693,187호 및 제7,067,641호)을 포함한다. 다른 구현예에서, 적합한 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 2'-O-메톡시에틸 "갭머"이며 이는 5‘-말단 및 3’-말단에 2'-O-메톡시에틸-변형 리보뉴클레오타이드를 포함하며 중앙에 적어도 10개의 디옥시리보뉴클레오타이드를 갖는다. 이 "갭머"는 RNA 타겟의 RNase I-의존성 파쇄 기전을 촉발시킬 수 있다. 안틴센스 올리고뉴클레오타이드의 길이는 7-50 뉴클레오타이드, 바람직하게는 10-40 뉴클레오타이드, 보다 바람직하게는 15-30 뉴클레오타이드, 가장 바람직하게는 20-25 뉴클레오타이드이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 miR-494 또는 miR-494 과다발현을 유도하는 제제(agents)는 KIT의 발현을 억제시키거나 또는 AKT 또는 STAT3의 인산화를 억제한다. 본 발명의 miR-494에 의해 상기 KIT의 발현이 mRNA 또는 단백질 레벨에서 억제되고, 상기 AKT 또는 STAT3의 인산화가 억제되었다(참고: 도 4b 및 도 5). 또한, 본 발명의 miR-494의 과다발현을 유도하는 것은 GIST 세포 성장을 억제하였다(세포주기의 G₁기 및 S기의 변화와 일치: 참고, 도 6).

택일적으로, 본 발명의 miR-494와 유사한 다른 접근 방식은 억제 RNA 분자를 투여하는 것이며, 상기 억제 RNA 분자는 miR-494의 타겟 서열에 상보적인 서열을 포함한다. 이러한 억제 RNA 분자는 siRNA(small interference RNA), shRNA(short hairpin RNA), 리보자임(ribozyme), DNAzyme 또는 PNA(peptide nucleic acids)를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에서 용어 "siRNA”는 RNA 방해 또는 유전자 사일런싱을 매개할 수 있는 핵산 분자를 의미한다(참조: WO 00/44895, WO 01/36646, WO 99/32619, WO 01/29058, WO 99/07409 및 WO 00/44914). siRNA는 표적 유전자의 발현을 억제할 수 있기 때문에 효율적인 유전자 넉다운 방법으로서 또는 유전자치료 방법으로 제공된다. siRNA는 식물, 벌레, 초파리 및 기생충에서 처음으로 발견되었으나, 최근에 siRNA를 개발/이용하여 포유류 세포 연구에 응용되었다(Degot S, et al. 2002; Degot S, et al. 2004; Ballut L, et al. 2005).

한편, 본 발명의 약제학적 조성물에 의해 치료될 수 있는 질환은 KIT-매개된 질환, 질병 또는 상태로, KIT 유전자 또는 단백질이 과다발현되거나 또는 돌연변이된 형태에 의해 유도되는 질환, 질병 또는 상태를 포함하고, 보다 바람직하게는 종양성 질환(neoplastic disorder), 염증성 질환, 자가면역질환, 암, 알러지 질환, 과민성 대장증후군(IBS), 이식편대 숙주질환(GVHD), 대사성 증훈군, CNS(central nervous system)-관계된 질환, 퇴행성 신경질환, 비만세포-관련 질환(mast-cell associated disease), 고통, 물질-남용 질환, 프라이온 질환, 심장 질환, 섬유성 질환, 특발성 폐동맥고혈압(IPAH), 일차성 폐고혈압(PPH), 신경교종 또는 심혈관 질환을 포함하며, 보다 더 바람직하게는 종양성 질환을 포함한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 종양성 질환은 위장관 간질종양(gatrointestinal stromal tumors, GISTs), 소세포 폐암(small cell lung cancer), 비-소세포성 폐암, 급성 골수성 백혈병(acute myelocytic leukemia), 급성 림프구성 백혈병, 골수이형성증후군(myelodyplastic syndrome), 만성 골수성 백혈병, 대장 암종, 위 암종, 고환암(testicular cancer), 신경교종(glioblastoma), 성상세포종(astrocytoma) 또는 비만세포종(mastocytosis)을 포함하고, 가장 바람직하게는 위장관 간질종양이다.

본 발명의 바람직한 구현 예에 따르면, 본 발명의 암종은 고환암, 난소암, 폐암, 유방암, 대장암, 뇌암, 결장암, 신경내분비 암, 위암, 간암, 기관지암, 비인두암, 후두암, 췌장암, 방광암, 부신암, 자궁경부암, 전립선암, 골암, 피부암, 갑상선암, 부갑상선암 또는 요관암을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구 투여(예컨대, 정맥내 투여, 피하 투여 또는 국부 투여)할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 한편, 본 발명의 약제학적 조성물의 투여량은 바람직하게는 1일 당 0.0001-100 mg/kg(체중)이다.

본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 마이크로RNA-494(miR-494)-인코딩 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 세포에 시험물질을 처리하는 단계; 및 (b) 상기 세포에서 miR-494의 발현을 분석하는 단계를 포함하는 종양성 질환(neoplastic disorders) 치료제의 스크리닝 방법으로, 상기 시험물질이 miR-494의 발현을 증가시키면 종양성 질환 치료제로 판단된다.

본 발명의 방법에 따르면, 우선 본 발명 타겟의 뉴클레오타이드 서열(바람직하게는, miR-494-인코딩 뉴클레오타이드 서열)을 포함하는 세포에 분석하고자 하는 시료를 접촉시킨다. 본 발명 타겟의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 세포는 특별하게 제한되지 않으며, 바람직하게는 KIT를 과다발현하거나 KIT-활성화 돌연변이를 포함하는 세포이고, 보다 바람직하게는 위장관 간질종양 세포주이다. 상기 세포는 바람직하게는 초기배양 세포(primary cultured cells), 구축세포주(established cell line) 또는 종양세포이다. 가장 바람직하게는, 본 발명의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 세포는 인간의 위장관 간질종양 세포주이다. 본 발명 스크리닝 방법을 언급하면서 사용되는 용어 “시험물질”은 본 발명의 마커의 발현량에 영향을 미치는 지 여부를 검사하기 위하여 스크리닝에서 이용되는 미지의 물질을 의미한다. 상기 시험물질은 화학물질, 뉴클레오타이드, 안티센스-RNA, siRNA(small interference RNA) 및 천연물 추출물을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

이어, 시험물질이 처리된 세포에서 본 발명의 타겟의 발현량을 측정한다. 발현량의 측정은 하기 기재한 바와 같이 실시할 수 있으며, 측정 결과, 본 발명의 마커의 뉴클레오티드 서열의 발현이 증가되거나 또는 이의 타겟인 KIT의 발현이 억제되는 경우에는 상기 시험물질은 종양성 질환의 예방 또는 치료용 물질로 판정될 수 있다.

본 발명의 miR-494 및 KIT의 발현량 변화의 측정은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 실시될 수 있다. 예를 들어, RT-PCR(Sambrook 등, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)), 노던 블롯팅(Peter B. Kaufma et al., Molecular and Cellular Methods in Biology and Medicine, 102-108, CRC press), cDNA 마이크로어레이를 이용한 혼성화 반응(Sambrook 등, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)) 또는 인 시투(in situ) 혼성화 반응(Sambrook 등, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001))을 이용하여 실시할 수 있다.

RT-PCR 프로토콜에 따라 실시하는 경우에는 우선, 시험물질을 처리한 세포에서 총 RNA를 분리한 다음, 올리고 dT 프라이머 및 역전사효소를 이용하여 제1쇄 cDNA를 제조한다. 이어, 제1쇄 cDNA를 주형으로 이용하고, miR-494- 또는 KIT-특이적 프라이머 세트를 이용하여 PCR 반응을 실시한다. 그런 다음, PCR 증폭 산물을 전기영동하고, 형성된 밴드를 분석하여 miR-494 또는 KIT의 발현량 변화를 측정한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 증폭은 실-시간(real-time) PCR에 따라 실시된다.

실-시간 PCR은 PCR 증폭 산물의 증가를 실-시간으로 모니터링하여 분석하는 기술이다(Levak KJ, et al., PCR Methods Appl., 4(6): 357-62(1995)). PCR 생산물의 증가가 타겟 템플레이트의 초기 양과 비례하는 지수기(exponential phase) 동안 각 사이클에서 형광 방출량을 기록하여 PCR 반응을 모니터링할 수 있다. 핵산 타겟의 출발 카피 수가 높을수록, 형광 증가가 더 빨리 관찰되고 더 낮은 C _T 값(threshold cycle)을 가지게 된다. 3-15 사이클 사이에서 측정된 기준값보다 높은 형광의 뚜렷한 증가는 축적된 PCR 생산물의 검출을 의미한다. 종래의 PCR 방법에 비해, 실-시간 PCR은 다음과 같은 장점을 가진다: (a) 종래의 PCR은 정체 상태(plateau)에서 측정되는 반면에, 실-시간 PCR은 지수성장기(exponential growth phase) 동안 데이터를 얻을 수 있다; (b) 리포터 형광 시그널의 증가는 발생된 앰플리콘(amplicons)의 수와 직접적으로 비례한다; (c) 분해된 프로브는 앰플리콘의 영구적인 기록 증폭(record amplification)을 제공한다; (d) 검출 범위의 증가; (e) 종래 PCR 방법에 비해 1,000배 이상 적은 핵산을 필요로 한다; (f) 전기영동을 통한 분리 없이 증폭된 DNA의 검출이 가능하다; (g) 작은 앰플리콘 크기를 이용하여 증가된 증폭 효율을 획득할 수 있다; 및 (h) 오염 위험성이 적다.

PCR 증폭 산물량은 형광으로 검출 가능한 양에 도달하면 증폭곡선이 일어나기 시작해 지수적으로 시그널이 상승하다가 정체 상태에 도달한다. 초기 DNA량이 많을수록 증폭 산물량이 검출 가능한 양에 달하는 사이클 수가 적어지므로 증폭곡선이 빨리 나타난다. 따라서, 단계적으로 희석한 표준시료를 사용하여 실-시간 PCR 반응을 하면 초기 DNA량이 많은 순서로 같은 간격으로 늘어선 증폭 곡선이 얻어진다. 여기서 적당한 지점에 한계치(threshold)를 설정하면 한계치와 증폭 곡선이 교차하는 지점 C _T 값이 산출된다.

실-시간 PCR에서는 PCR 증폭 산물을 형광을 통해 검출한다. 검출 방법은 크게 인터킬레이팅(interchelating) 방법(SYBR 그린 I 방법), 형광 표지 프로브를 이용하는 방법(TaqMan 프로브 방법) 등이 있다.

먼저, 인터킬레이팅 방법은 이중 가닥 DNA 결합 다이를 이용하는 방법으로, 비-서열 특이적 형광 인터킬레이팅 시약(SYBR 그린 I 또는 ethidium bromide)을 이용하여 비-특이적 증폭 및 프라이머-다이머 복합체를 포함하는 앰플리콘 생산을 정량하는 것이다. 상기 시약은 ssDNA와는 결합하지 않는다. SYBR 그린 I은 이중 가닥 DNA의 마이너 그루브(minor groove)에 결합하는 형광성 다이로, 용액 상에서는 거의 형광을 보이지 않지만 이중 가닥 DNA와 결합하면 강한 형광을 나타내는 시약(interchelator)이다(Morrison TB, Biotechniques., 24(6): 954-8, 960, 962(1998)). 따라서, SYBR 그린 I과 이중 가닥 DNA 간의 결합을 통해 형광을 방출하기 때문에 증폭 산물의 생성량을 측정할 수 있다. SYBR 그린 실-시간 PCR은 앰플리콘 동정을 위해 융해점(melting point) 또는 해리 곡선(dissociation curve) 분석과 같은 최적화 과정을 동반한다. 정상적으로 SYBR 그린은 싱글플렉스(singleplex) 반응에 이용되지만, 융해곡선(melting curve) 분석이 동반되면 멀티플렉스(multiplex) 반응에 이용될 수 있다(Siraj AK, et al., Clin Cancer Res., 8(12): 3832-40(2002); 및 Vrettou C., et al., Hum Mutat., Vol 23(5): 513-521(2004)).

C _T (threshold cycle) 값은 반응에서 발생된 형광이 역치(threshold)를 넘어서는 사이클 수를 의미하며, 이는 초기 카피 수의 대수에 반비례한다. 그러므로, 특정 웰에 할당된 C _T 값은 반응에서 앰플리콘의 충분한 수가 축적된 사이클의 수를 반영한다. C _T 값은 ΔRn의 증가가 처음으로 검출된 사이클이다. Rn은 각 시점에서 PCR 동안 발생된 형광 시그널의 크기를 의미하며, ΔRn은 레퍼런스 다이의 형광 방출 강도로 나뉘어진 리포터 다이의 형광방출 강도(표준화된 리포터 시그널)를 의미한다. C _T 값은 LightCycler에서는 Cp(crossing point)로도 명명된다. C _T 값은 시스템이 로그-선형 단계(log-linear phase)에서 PCR 생산물의 지수성장과 관련된 형광 시그널의 증가를 검출하기 시작하는 시점을 나타낸다. 이 시기는 반응에 대한 가장 유용한 정보를 제공한다. 로그-선형 단계의 기울기는 증폭 효율(amplification efficiency, Eff)을 나타낸다(http://www.appliedbiosystems.co.kr/).

한편, 택맨(TaqMan) 프로브는 전형적으로 5’-말단에 형광물질 및 3’-말단에 퀀처(예컨대, TAMRA 또는 비-형광 퀀처(NFQ))를 포함하는 프라이머(예컨대, 20-30 뉴클레오타이드) 보다 더 긴 올리고뉴클레오타이드이다. 여기된 형광물질은 형광을 내기 보다는 근처의 퀀처에 에너지를 전달한다(FRET = For fluorescence resonance energy transfer; Chen, X., et al., Proc Natl Acad Sci USA, 94(20): 10756-61(1997)). 그러므로, 프로브가 정상인 경우, 어떠한 형광도 발생되지 않는다. 택맨 프로브는 PCR 생산물의 내부 부위에 어닐링할 수 있도록 고안된다. 바람직하게는, 택맨 프로브는 서열목록 제1서열의 내부서열로 고안될 수 있다.

택맨 프로브는 어닐링 단계에서 템플레이트 DNA에 특이적으로 혼성화하지만, 프로브 상에 퀀처에 의해 형광 발색이 억제된다. 연장 반응 시에 Taq DNA 폴리머라제가 갖는 5’to 3’뉴클레아제 활성에 의해 템플레이트에 혼성화한 택맨 프로브가 분해되어 형광 색소가 프로브로부터 유리되면서 퀀처에 의한 억제가 해제되어 형광은 나타낸다. 이 때, 택맨 프로브의 5’-말단은 상기 연장 프라이머의 3’-말단의 다운스트림에 위치하여야 한다. 즉, 연장 프라이머의 3’-말단이 주형-의존성 핵산 중합효소에 의해 연장되는 경우, 이 중합효소의 5’to 3’뉴클레아제 활성에 의해 택맨 프로브의 5’-말단이 절단되어 리포터 분자의 형광 시그널이 발생하게 된다.

택맨 프로브에 결합되어 있는 상기 리포터 분자 및 퀀처 분자는 모두 형광성 물질이다. 본 발명에 이용될 수 있는 형광성 리포터 분자 및 퀀처 분자는 당업계에 공지되어 있는 어떠한 것도 이용할 수 있으며, 그 예는 다음과 같다(괄호의 숫자는 나노미터 단위로 표시한 발광 최대 파장이다): Cy2™(506), YO-PRO™-1(509), YOYO™-1(509), Calcein(517), FITC(518), FluorX™(519), Alexa™(520), Rhodamine 110(520), 5-FAM(522), Oregon Green™ 500(522), Oregon Green™ 488(524), RiboGreen™(525), Rhodamine Green™(527), Rhodamine 123(529), Magnesium Green™(531), Calcium Green™(533), TO-PRO™-1(533), TOTO1 (533), JOE(548), BODIPY530/550(550), Dil(565), BODIPY TMR(568), BODIPY558/568(568), BODIPY564/570(570), Cy3™(570), Alexa™ 546(570), TRITC(572), Magnesium Orange™(575), Phycoerythrin R&B(575), Rhodamine Phalloidin(575), Calcium Orange™(576), Pyronin Y(580), Rhodamine B(580), TAMRA(582), Rhodamine Red™(590), Cy3.5™(596), ROX(608), Calcium Crimson™(615), Alexa™ 594(615), Texas Red(615), Nile Red(628), YO-PRO™-3(631), YOYO™-3(631), R-phycocyanin(642), C-Phycocyanin(648), TO-PRO™-3 660), TOTO3(660), DiD DilC(5)(665), Cy5™(670), Thiadicarbocyanine(671) 및 Cy5.5(694).

적합한 리포터-퀀처 쌍은 많은 문헌에 개시되어 있다: Pesce et al., editors, FLUORESCENCE SPECTROSCOPY (Marcel Dekker, New York, 1971); White et al., FLUORESCENCE ANALYSIS: A PRACTICAL APPROACH (Marcel Dekker, New York, 1970); Berlman, HANDBOOK OF FLUORESCENCE SPECTRA OF AROMATIC MOLECULES, 2nd EDITION (Academic Press, New York, 1971); Griffiths, COLOUR AND CONSTITUTION OF ORGANIC MOLECULES (Academic Press, New York, 1976); Bishop, editor, INDICATORS (Pergamon Press, Oxford, 1972); Haugland, HANDBOOK OF FLUORESCENT PROBES AND RESEARCH CHEMICALS (Molecular Probes, Eugene, 1992); Pringsheim, FLUORESCENCE AND PHOSPHORESCENCE (Interscience Publishers, New York, 1949); Haugland, R. P., HANDBOOK OF FLUORESCENT PROBES AND RESEARCH CHEMICALS, Sixth Edition, Molecular Probes, Eugene, Oreg., 1996; U.S. Pat. Nos. 3,996,345 and 4,351,760.

본 발명에서 이용되는 타겟 핵산은 특별하게 제한되지 않으며, DNA(gDNA 또는 cDNA) 또는 RNA 분자를 모두 포함하며, 보다 바람직하게는 RNA 분자이다.

타겟 핵산을 연장 프라이머 및 프로브에 어닐링 또는 혼성화 시키는 방법은 당업계에 공지된 혼성화 방법에 의해 실시할 수 있다. 본 발명에서, 적합한 혼성화 조건은 최적화 절차에 의하여 일련의 과정으로 결정될 수 있다. 이런 절차는 연구실에서 사용을 위한 프로토콜을 수립하기 위하여 당업자에 의하여 일련의 과정으로 실시된다. 예를 들어, 온도, 성분의 농도, 혼성화 및 반응 시간, 완충액 성분 및 이들의 pH 및 이온세기 등의 조건은 올리고뉴클레오타이드의 길이 및 GC 양 및 타깃 뉴클레오타이드 서열 등의 다양한 인자에 의존한다. 혼성화를 위한 상세한 조건은 Joseph Sambrook, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001); 및 M.L.M. Anderson, Nucleic Acid Hybridization, Springer-Verlag New York Inc. N.Y.(1999)에서 확인할 수 있다.

본 발명에 이용되는 주형-의존성 핵산 중합효소는 5’to 3’뉴클레아제 활성을 가지는 효소이다. 본 발명에 이용되는 주형-의존성 핵산 중합효소는 바람직하게는 DNA 중합효소이다. 통상적으로 DNA 중합효소들은 5’to 3’뉴클레아제 활성을 가지고 있다. 본 발명에 이용되는 주형-의존성 핵산 중합효소는 E. coli DNA 중합효소 I, 열안정성 DNA 중합효소 및 박테리오파아지 T7 DNA 중합효소를 포함한다. 바람직하게는, 주형-의존성 핵산 중합효소는 다양한 박테리아 종으로부터 얻을 수 있는 열안정성 DNA 중합효소이고, 이는 Thermus aquaticus(Taq), Thermus thermophilus(Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis, Pyrococcus furiosus(Pfu), Thermus antranikianii, Thermus caldophilus, Thermus chliarophilus, Thermus flavus, Thermus igniterrae, Thermus lacteus, Thermus oshimai, Thermus ruber, Thermus rubens, Thermus scotoductus, Thermus silvanus, Thermus species Z05, Thermus species sps 17, Thermus thermophilus, Thermotoga maritima, Thermotoga neapolitana 및 Thermosipho africanus의 DNA 중합효소를 포함한다.

주형-의존성 핵산 중합효소에 의해 촉매되는 “주형-의존성 연장반응”은 주형의 서열에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 합성하는 반응을 의미한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 실-시간 PCR은 택맨 프로브 방식으로 실시된다.

또한, KIT 단백질의 양의 변화는 당업계에 공지된 다양한 면역분석 방법을 통해 실시될 수 있다. 예를 들어, 과립형성 인자 단백질의 양의 변화는 면역염색, 방사능면역분석, 방사능면역침전, 웨스턴 블롯팅, 면역침전, ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay), 캡처-ELISA, 억제 또는 경쟁 분석, 그리고 샌드위치 분석을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 면역분석 또는 면역염색의 방법은 Enzyme Immunoassay, E. T. Maggio, ed., CRC Press, Boca Raton, Florida, 1980; Gaastra, W., Enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA), in Methods in Molecular Biology, Vol. 1, Walker, J.M. ed., Humana Press, NJ, 1984; 및 Ed Harlow and David Lane, Using Antibodies:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999에 기재되어 있으며, 상기 문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.

예를 들어, 본 발명의 방법이 방사능면역분석 방법에 따라 실시되는 경우, 방사능동위원소(예컨대, C¹⁴, I¹²⁵, P³²및 S³⁵)로 레이블링된 항체가 본 발명의 마커 분자를 검출하는 데 이용될 수 있다.

본 발명의 방법이 ELISA 방식으로 실시되는 경우, 본 발명은 (i) 분석하고자 하는 미지의 세포 시료 분해물을 고체 기질의 표면에 코팅하는 단계; (ⅱ) 일차항체로서의 타겟에 대한 항체와 상기 세포 분해물을 반응시키는 단계; (ⅲ) 상기 단계 (ⅱ)의 결과물을 효소가 결합된 이차항체와 반응시키는 단계; 및 (ⅳ) 상기 효소의 활성을 측정하는 단계를 추가적으로 포함한다.

상기 고체 기질로 적합한 것은 탄화수소 폴리머(예컨대, 폴리스틸렌 및 폴리프로필렌), 유리, 금속 또는 젤이며, 가장 바람직하게는 마이크로타이터 플레이트이다.

상기 이차항체에 결합된 효소는 발색반응, 형광반응, 발광반응 또는 적외선 반응을 촉매하는 효소를 포함하나, 이에 한정되지 않으며, 예를 들어, 루시퍼라아제, 알칼린 포스파타아제, β-갈락토시다아제, 호스 래디쉬 퍼옥시다아제 및 사이토크롬 P₄₅₀을 포함한다. 상기 이차항체에 결합하는 효소로서 알칼린 포스파타아제가 이용되는 경우에는, 기질로서 브로모클로로인돌일 포스페이트(BCIP), 니트로 블루 테트라졸리움(NBT), 나프톨-AS-B1-포스페이트(naphthol-AS-B1-phosphate) 및 ECF(enhanced chemifluorescence)와 같은 발색반응 기질이 이용되고, 호스 래디쉬 퍼옥시다아제가 이용되는 경우에는 클로로나프톨, 아미노에틸카바졸, 디아미노벤지딘, D-루시페린, 루시게닌(비스-N-메틸아크리디늄 니트레이트), 레소루핀 벤질 에테르, 루미놀, 암플렉스 레드 시약(10-아세틸-3,7-디하이드록시페녹사진), HYR(p-phenylenediamine-HCl and pyrocatechol), TMB(tetramethylbenzidine), ABTS(2,2‘-Azine-di[3-ethylbenzthiazoline sulfonate]), o-페닐렌디아민(OPD) 및 나프톨/파이로닌, 글루코스 옥시다아제와 t-NBT(nitroblue tetrazolium) 및 m-PMS(phenzaine methosulfate)과 같은 기질이 이용될 수 있다.

본 발명의 방법이 캡처-ELISA 방식으로 실시되는 경우, 본 발명의 특정 실시예는 (i) 포획항체(capturing antibody)로서 본 발명의 타겟에 대한 항체를 고체 기질의 표면에 코팅하는 단계; (ⅱ) 포획항체와 세포 시료를 반응시키는 단계; (ⅲ) 상기 단계 (ⅱ)의 결과물을 시그널을 발생시키는 레이블이 결합되어 있고, 과립형성 인자 단백질에 특이적으로 반응하는 검출항체(detecting antibody)와 반응시키는 단계; 및 (ⅳ) 상기 레이블로부터 발생하는 시그널을 측정하는 단계를 포함한다.

상기 검출 항체는 검출 가능한 시그널을 발생시키는 레이블을 가지고 있다. 상기 레이블은 화학물질(예컨대, 바이오틴), 효소(알칼린 포스파타아제, β-갈락토시다아제, 호스 래디쉬 퍼옥시다아제 및 사이토크롬 P₄₅₀), 방사능물질((예컨대, C¹⁴, I¹²⁵, P³²및 S³⁵), 형광물질(예컨대, 플루오레신), 발광물질, 화학발광물질( chemiluminescent) 및 FRET(fluorescence resonance energy transfer)을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 다양한 레이블 및 레이블링 방법은 Ed Harlow and David Lane, Using Antibodies:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999에 기재되어 있다.

상기 ELISA 방법 및 캡처-ELISA 방법에서 최종적인 효소의 활성 측정 또는 시그널의 측정은 당업계에 공지된 다양한 방법에 따라 실시될 수 있다. 이러한 시그널의 검출은 본 발명의 타겟의 정성적 또는 정량적 분석을 가능하게 한다. 만일, 레이블로서 바이오틴이 이용된 경우에는 스트렙타비딘으로, 루시퍼라아제가 이용된 경우에는 루시페린으로 시그널을 용이하게 검출할 수 있다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(a) 본 발명은 GIST에서 KIT의 음성적 조절인자로서 miR-494의 신규한 기능에 관한 것이다.

(b) 본 발명의 miR-494는 KIT 3’-UTR 내에 두 개의 다른 핵심 서열 위치(seed match sites/sequences)에 직접적으로 결합하여 KIT를 하향-조절하고, KIT 시그널링 전이 경로의 다운스트림 분자들(예컨대, 포스포-AKT 및 포스포-STAT3)의 발현을 감소시켰다.

(c) 또한, 본 발명의 miR-494 과다발현 유도는 종양세포, 바람직하게는 GIST 세포주의 성장을 억제시켰다.

(d) 따라서, 본 발명의 miR-494 및 이의 발현을 촉진시키는 물질 또는 KIT 발현을 억제시키는 물질을 유효성분으로 포함하는 본 발명의 조성물은 KIT-매개된 질환, 질병 또는 상태의 예방 또는 치료에 유용하게 적용될 수 있다.

도 1은 KIT 단백질 발현 상에 다섯 개 후보 miRNA들의 효과를 조사한 웨스턴 블롯 결과이다. 총 25 nM의 다섯 개 후보 miRNA들(miR-9, miR-142-5p, miR-370, miR-494 및 miR-510)을 각각 KIT-과다발현 GIST882 세포주에 트랜스펙션시켰다. GAPDH는 로딩 대조군으로 이용하였다. N.C.는 음성 대조군을 나타낸다.
도 2는 miR-494에 의해 억제되는 KIT 발현을 조사한 결과이다. GIST882 세포에 25 nM의 비타겟팅 miRNA, miR-221, miR-494 또는 miR-494 억제제를 트랜스펙션시켰다. 3일 후, 세포를 수득하여 웨스턴 블롯으로 분석하였다(도 2a). miR-494로 트랜스펙션된 세포에서의 KIT 발현은 비타겟팅 miRNA로 트랜스펙션된 세포에서의 발현에 비해 약 57%까지 감소하였다. qRT-PCR 분석 결과, KIT mRNA 레벨은 miR-494 및 miR-221로 트랜스펙션된 세포에서 감소하였다(도 2b). N.C.는 음성 대조군을 나타낸다.
도 3은 31명의 GIST 환자에서 측정된 KIT 단백질(3a), miR-494 레벨(3b) 및 이를 동시에 표현한 그래프(3c) 결과이다. 케이스 1부터 25까지의 GIST 환자 조직은 KIT 돌연변이를 가지고, 케이스 26부터 31까지의 GIST 환자 조직은 KIT 돌연변이를 포함하지 않는다. 각 케이스는 동일한 조직으로부터 RNA 및 단백질 모두를 추출하였다. KIT 발현 레벨은 웨스턴 블롯 결과로부터 정량하였다. 성숙한 형태의 miR-494 양은 택맨 miRNA 어세이를 이용하여 측정하였다. miR-494 및 KIT의 발현 레벨은 각각 U6 RNA 및 GAPDH로 표준화하고 miR-494 및 KIT 발현 레벨의 표준화된 값은 비교를 위해 miR-494 및 KIT의 평균값으로 나누었다. KIT 단백질과 miR-494 발현 간의 역상관관계가 명확하였다(r; -0.490, P = .005).
도 4는 KIT 3’-UTR 부위 내에 존재하는 miR-494 결합 위치를 결정하기 위한 리포터 어세이 결과이다. 도 4a는 리포터 어세이에서 이용된 벡터 컨스트럭트들을 도식적으로 나타내는 도면이다. 원 벡터(N 벡터)는 레닐라 루시퍼라제-인코딩 부위 및 GIST882 cDNA로부터 얻은 KIT의 3’-UTR 부위의 총 서열을 포함한다. M 컨스트럭트는 타겟 스캔 3.0에 따라 예측된 miR-494의 결합 핵심 염기서열(binding seed sequence)로부터 4개의 돌연변이된 뉴클레오타이드 서열(GTTTCCGG)을 포함한다. Ma, Mb 및 Mc 컨스트럭트는 발명자들에 의해 발견된 가능한 miR-494의 결합 위치들을 M 컨스트럭트에서 4개의 뉴클레오타이드 서열(GTTTCCGG)로 대체하여 제조하였다. O 벡터는 모든 컨스트럭트가 이전에 KIT의 3’-UTR을 타겟팅한다고 보고된 miR-221 및 miR-222(GTAGCAGA)를 이용하여 적합하게 기능한다는 것을 확인하는 데 이용하였다. 도 4b는 HeLa 세포주에 miR-494를 포함하는 M 컨스트럭트 또는 miR-221을 포함하는 O 컨스트럭트를 트랜스펙션시켰다. 트랜스펙션 2일 후, 세포를 수득하여 듀얼 루시퍼라제 어세이를 실시하였다. 예측된 miR-221 및 miR-222 결합 위치가 돌연변이된 경우, 루시퍼라제 활성은 회복되었다. miR-494 및 M 돌연변이 벡터를 이용한 트랜스펙션은 단지 약간의 회복을 초래하였다(도 4b, 위쪽 패널). 1760-1763 위치에 추가적으로 돌연변이된 뉴클레오타이드 서열 및 miR-494를 포함하는 Mb 컨스트럭트가 트랜스펙션된 경우, M 컨스트럭트가 트랜스펙션된 시료에 비해 상대적으로 루시퍼라제 활성이 완전히 회복되었다(도 4b, 아래쪽 패널).
도 4c는 다른 암세포주에서 miR-494의 발현 레벨을 조사한 택맨(Taqman)-miRNA 어세이 결과이고(위쪽 패널), 이로부터 HeLa, SNU216 및 GIST882 세포주를 향후 연구를 위해 선택하였다(아래쪽 패널). HeLa 및 SNU216 세포들은 miR-494의 높은 발현 레벨을 나타냈다. 상기 세포주에 50 nM miR-494 억제제를 포함하는 N 벡터를 트랜스펙션한 경우, 비타겟팅 miRNA(음성 대조군)로 트랜스펙션된 세포와 비교하여 현저하게 증가된 루시퍼라제 활성을 나타냈다. GIST882 세포주는 miR-494의 낮은 발현 레벨을 나타냈으며, 비타겟팅 miRNA(음성 대조군)로 트랜스펙션된 세포와 비교하여 루시퍼라제 활성에서 뚜렷한 변화를 나타내지 않았다(아래쪽 패널). 상술한 결과들은 내인성 miR-494가 직접적으로 KIT를 하향-조절한다는 것을 나타낸다. N.C.는 음성 대조군을 나타낸다. miRNA^* - 트랜스펙션된 miRNA; 벡터^** - 리포터 어세이에 이용된 트랜스펙션된 벡터.
도 5는 miR-494로 트랜스펙션된 세포주에서 p-AKT 및 p-STAT의 발현을 측정한 웨스턴 블롯 결과이다. miR-494의 GIST882 세포주로의 트랜스펙션은 AKT 및 STAT 시그널링 경로에서 현저한 변화를 야기하였다. GIST882 세포주에 50 nM의 비타겟팅 miRNA, miR-221, miR-494 또는 miR-494 억제제로 트랜스펙션시켰다. KIT, 포스포-KIT, STAT3, 포스포-STAT3, AKT, 포스포-AKT, ERK, 포스포-ERK 및 GAPDH에 대한 웨스턴 블롯을 각 항체에 대해서 동일한 블롯에서 반복적으로 실시하였다. KIT 및 포스포-KIT의 발현 레벨이 GIST882에 miR-494로 트랜스펙션시킴으로써 뚜렷하게 감소하였다. KIT 시그널링 경로의 다운스트림 분자들인 포스포-AKT 및 포스포-STAT3가 모두 감소하였다. 다른 결과들은 대조군이 처리된 시료들과 miR-494 억제제가 처리된 시료들 간에 거의 차이가 없었다. N.C.는 음성 대조군을 나타낸다.
도 6은 GIST 세포 증식이 miR-494에 의해 억제된다는 것을 보여주는 결과이다. 도 6a는 트랜스펙션 후 12일 째의 GIST882 형태를 보여주는 결과이다. 세포는 60-mm 세포배양 디쉬에서 배양하였으며, 사진은 세포 카운팅 전에 얻었다. miR-494로 트랜스펙션된 GIST882 세포주에서 빈약한 세포 클러스터 및 불규칙한 세포 형태가 12일 째에 나타났다(오른쪽 패널). 도 6b는 GIST882 세포를 2×10⁶ 세포 수로 60-mm 디쉬에 배양하여 각 디쉬에 분주하였다. 트랜스펙션 후 3일, 6일 및 12일 째에 세포를 손수 두 번에 걸쳐서 카운팅하고 카운팅된 평균값을 이용하였다. 세포에 0일 및 6일 째에 두 번에 걸쳐서 트랜스펙션하였다. 비타겟팅 miRNA로 처리된 GIST882 세포(음성 대조군) 및 miR-494로 처리된 GIST882 세포 간의 세포 수의 차이는 3일 째에 작았고 6일 째에 더 커졌으며, 12일 째에는 거의 세 배 가까이 증가하였다(위쪽 패널). 증식 어세이에서 모든 시료들에 대한 웨스턴 블롯팅을 실시한 결과, miR-494로 처리된 GIST882 세포들이 감소된 레벨의 KIT를 나타냈다(아래쪽 패널). 도 6c는 GIST882 세포에 비타겟팅 miRNA(위쪽 패널) 또는 miR-494(아래쪽 패널)로 4일 째에 트랜스펙션시킨 후, 세포를 수득하여 프로피디움 이오다인으로 염색한 결과이다. 두 시료는 유세포분석법으로 분석하였다. miR-494 처리는 비타겟팅 miRNA로 트랜스펙션된 세포와 비교하여 G₀-G₁기의 세포가 상대적으로 5.6% 증가하였으며, S기 세포가 상대적으로 5.7% 감소하였다. N.C.는 음성 대조군을 나타낸다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실험재료 및 실험방법

세포주 및 세포배양

활성화된 KIT 돌연변이(엑손 13, K642E7)를 가지는 GIST882 세포주는 하버드 대학교(Cambridge, MA)의 조나단 플레처 박사로부터 친절하게도 선물받았다. SNU216, SNU638, SNU1, NCI-N-87 및 HeLa 세포주는 한국세포주은행(Korean Cell Line Bank; Cancer Research Institute, Seoul, Korea)으로부터 구입하였다. 세포배양 이미지는 IX71(Olympus, Tokyo, Japan)를 이용하여 얻었다.

환자 및 조직 시료

본 연구에 포함된 31명의 GIST 환자들은 분자 마커 연구를 위해 1997년부터 2006년 7월 사이에 연세대학교 의과대학 병리학 교실에서 동정된 환자들이었다. 상기 조직들을 연구 목적으로 이용하기 위한 승인은 연세대학교 의과대학의 윤리심의위원회로부터 얻었다. 몇몇 신선한 표본들은 간암검체은행(Liver Cancer Specimen Bank of the National Research Resource Bank Program of the Korea Science and Engineering Foundation of the Ministry of Science and Technology)으로부터 얻었다. 상기 GIST 환자들로부터 유래한 시료들 중 17개의 시료는 이전에 miRNA 프로파일 및 프로테옴 분석을 위해 사용하였다[12, 13, 31, 32]. 분자 데이터의 확인 없이 해부학적 위치, 위험인자(risk) 및 종양 크기 같은 종래의 병리학적 매개변수들을 조사하였다(표 1).

31개의 GISTs의 임상병리학적 및 유전적 상태.

케이스	나이/성	돌연변이 상태		종양				세포 형태	면역조직화학
케이스	나이/성	KIT	PDGFR	크기(cm)	위치	유사분열수(/50HPF)	위험인자	세포 형태	KIT	CD34
1	76/F	V560 del	야생형	8	위	4	중간	방추형	+¹⁾	+
2	56/F	V559A	야생형	5.5	위	1	중간	방추형	+	+
3	64/F	D579 del	야생형	17	위	20	높음	방추형	+	+
4	45/M	T574_R586 ins	야생형	10	위	1	중간	방추형	+	+
5	68/F	V559D	야생형	8	위	6	높음	방추형	+	+
6	58/M	Y553_Q556 del	야생형	6	위	14	높음	방추형	+	+
7	58/M	V559D	야생형	16	위	2	높음	혼합형	+	+
8	74/F	D579 del	야생형	3	위	4	낮음	방추형	+	+
9	51/M	W557R	야생형	3.5	위	1	낮음	방추형	-	+
10	67/F	K550_Q556 del	야생형	9	위	14	높음	혼합형	+	+
11	43/F	W557R	야생형	9.8	위	5	중간	방추형	+	+
12	42/F	L556_D569 ins	야생형	33	위 및 비장	4	높음	방추형	+	+
13	65/M	A504_Y505 ins	야생형	6.5	복강	23	높음	혼합형	+	+
14	41/F	V559D	야생형	3.5	위	5	낮음	방추형	+	+
15	49/F	V555_W557 del	야생형	13	소장	15	높음	방추형	+	-
16	64/F	W557_K558 del	야생형	7.5	위	10	높음	방추형	+	+
17	50/M	W557_K558 del	야생형	8	위	23	높음	혼합형	+	+
18	39/F	V559D	야생형	6.3	위	8	높음	방추형	+	+
19	69/F	V559D	야생형	7	위	2	중간	방추형	+	+
20	74/M	Q556_V559 del	야생형	6	위	40	높음	혼합형	+	+
21	46/F	M552_N572 del	야생형	5	소장	74	높음	혼합형	+	+
22	61/F	F509_F511 ins	야생형	5	소장	0	낮음	혼합형	+	-
23	79/F	W557_K558 del	야생형	6.5	소장	28	높음	방추형	+	+
24	64/M	A504_Y505 ins	야생형	9.5	소장	0	높음	방추형	+	+
25	47/M	A504_Y505 ins	야생형	9	소장	20	높음	방추형	+	-
26	57/F	야생형	야생형	15	위	1	높음	방추형	+	+
27	78/M	야생형	야생형	17	위	49	높음	상피형	+	+
28	66/M	야생형	D842V	3	위	0	낮음	혼합형	-	-
29	44/F	야생형	야생형	1.3	위	0	매우 낮음	방추형	+	+
30	38/F	야생형	야생형	5.5	소장	0	높음	방추형	+	+
31	26/M	야생형	야생형	5.5	위	4	중간	방추형	-	+

1) +, KIT를 발현하는 종양세포; -, KIT를 발현하지 않는 종양세포.

GIST 환자들은 플레처 등[33]의 기준에 따른 종양 위험도에 기반하여 4개의 군으로 분류하였다.

RNA 제조 및 택맨(Taqman) miRNA 어세이

총 RNA를 TRIZOL(Life Technology, Rockville, MD)을 이용하여 동결된 조직으로부터 추출하였다. 택맨 miRNA 어세이(Applied Biosystems)에 의해 miRNA의 발현 레벨을 정량하고 Applied Biosystems 7300 실-시간 PCR 시스템(Applied Biosystems)을 이용하여 분석하였다. 모든 어세이는 세 쌍으로(triplicate) 실시하였다.

정량적 RT-PCR(qRT-PCR)

KIT(PrimerBank ID; 4557695a2) 및 GAPDH(PrimerBank ID; 2282013a2)에 대한 qRT-PCR 프라이머 서열은 Primerbank 데이타베이스(http://pga.mgh.harvard.edu/primerbank/)로부터 얻었다. 반응은 제조자의 지시에 따라 Premix Ex Taq(TAKARA, Tokyo, Japan)을 포함하는 총 용량 20 ㎕로 실시하였다. 모든 반응은 ABI Prism 7300 실-시간 PCR 시스템에서 세 쌍으로 진행하였다.

miRNA 모방체(mimics) 및 형질전환

본 연구에서 이용된 miRNA 모방체(비타겟팅 miRNA, miR-221, miR-222, miR-494 및 miR-494 억제제)의 모든 성숙한 형태는 miRIDIAN miRNA 모방체(Thermo Scientific, Waltham, MA, USA). 모든 형질전환 실험들은 리포펙타민 2000(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)을 이용하여 실시하였다. 형질전환 후 3일 째, 모든 세포들을 수득하여 이후의 웨스턴 블롯 분석에 이용하였다.

웨스턴 블롯

시료로부터 총 용해물을 수동성 용해 완충액(passive lysis buffer; Promega, Madison, WI, USA)을 얻었다. 본 발명에서 이용된 일차 항체는 GAPDH(Trevigen, Gaitherburg, MD, USA), c-KIT, STAT3, ERK, 포스포-ERK(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), 포스포-c-KIT(Invitrogen), AKT, 포스포-AKT 및 포스포-STAT3(Cell Signaling, Danvers, MA USA)였다. 웨스턴 블롯 이미지는 LAS-4000 Mini(Fujifilm, Tokyo, Japan)를 이용하여 분석하였다.

루시퍼라제 리포터 어세이

다른 컨스트럭트를 제조하기 위해 우선 N 벡터를 제조하였다. PCR 증폭을 통해 GIST882로부터 얻어진 총 3’-URT 서열이 pRL3 벡터(Promega) 내의 SV40 인헨서 및 초기 프로모터-조절된(dirven) 레닐라 루시퍼라제 카세트의 다운스트림에 클로닝되었다. 이후, N 벡터는 miR-494, miR-221 또는 miR-222 결합 부위에 상보적인 핵심 염기서열(seed sequences)의 돌연변이를 대체하기 위한 다섯 개의 돌연변이 컨스트럭트를 제조하기 위해 이용하였다. pGL3 루시퍼라제 리포터 벡터는 듀얼 루시퍼라제 어세이(Promega)를 위한 대조군 벡터로 이용하였다. 벡터 컨스트럭트를 위해 이용된 올리고뉴클레오타이드 서열은 표 2에 나열되어 있다.

컨스트럭트	서열
N-컨스트럭트 F¹⁾	5’-GCAGAATCAGTGTTTGGGTCA-3’
N-컨스트럭트 R²⁾	5’-CAGGAATAAAACACGTGGAACA-3’
M-컨스트럭트 F	5’-TAATTTTTTCTTACATCAGATCCGGCTTTGCAGTGGCTTAATGT-3’
M-컨스트럭트 R	5’-ACATTAAGCCACTGCAAAGCCGGATCTGATGTAAGAAAAAATTA-3’
O-컨스트럭트 F	5’-TGTAAATATTGAAATCAGACAATAATGTCTTTTGAATATT-3’
O-컨스트럭트 R	5’-AATATTCAAAAGACATTATTGTCTGATTTCAATATTTACA-3’
Ma-컨스트럭트 F	5’-TCATTATTAGTACTGCTCTTCCGGCTTTTCACATAGCTGTCTAGA-3’
Ma-컨스트럭트 R	5’-TCTAGACAGCTATGTGAAAAGCCGGAAGAGCAGTACTAATAATGA-3’
Mb-컨스트럭트 F	5’-TGTCTGAAAAATTCCTTTGTCCGGCTATTGACTTCAATGATAGTA-3’
Mb-컨스트럭트 R	5’-TACTATCATTGAAGTCAATAGCCGGACAAAGGAATTTTTCAGACA-3’
Mc-컨스트럭트 F	5’-CCGGCTTTGCAGTGGCTTAATCCGGGAAATTATTTTGTGGCTTTT-3’
Mc-컨스트럭트 R	5’-AAAGCCACAAAATAATTTCCCGGATTAAGCCACTGCAAAGCCGG-3’

듀얼 루시퍼라제 어세이는 매번 N, M, O, Ma, Mb 또는 Mc 벡터와 함께 대조군 벡터를 공동-트랜스펙션함으로써 실시하였다. 모든 miRNA 모방체는 5 nM로 트랜스펙션시켰다. 트랜스펙션 2일 후, 루시퍼라제 활성을 제조자의 지시에 따라 측정하였다.

세포 증식 어세이

GIST882 세포를 2×10⁶ 세포 수로 60-mm 디쉬에 분주한 후, 50 nM의 비타겟팅 miRNA 또는 miR-494로 트랜스펙션시켰다. 세포 수를 3일, 6일 및 12일에 손수 카운팅하였다. 12일 째 카운팅될 시료에 대해 6일 째에 또 다른 트랜스펙션을 실시하였다. 세포 형태를 매일 확인하였다. 시료는 두 쌍으로 구성되었으며 평균값이 추가 분석에 이용되었다. 각 시료를 수득하여 웨스턴 블롯으로 분석함으로써 KIT 발현에 대한 지속적인 억제를 확인하였다.

세포주기 분석

GIST882 세포를 60-mm 디쉬에서 50 nM의 비타겟팅 miRNA 또는 miR-494로 트랜스펙션시켰다. 트랜스펙션 4일 째에, 각 시료의 세포들을 PBS, 프로피디움 이오다인(Abcam, Cambridge, MA, USA) 및 RNase A로 구성된 용액으로 염색하였다. 모든 시료들을 FACS Calibur(BD Biosciences, San Jose, CA, USA)로 분석하였다.

통계 분석

miR-494 발현 레벨과 KIT 발현 레벨 간의 상관관계는 miR-494 qRT-PCR 값 및 KIT 웨스턴 블롯의 밴드 강도를 조사하여 스피어만 상관계수(Spearman correlation)를 분석함으로써 결정하였다. P 값(< 0.05)이 유의한 것으로 판단되었다. 통계 분석은 SPSS 소프트웨어 version 10.0(SPSS, Inc., Chicago, IL, USA)을 이용하여 실시하였다.

실험 결과

KIT의 음성 조절자로서의 miR-494의 동정

본 발명자들의 이전 마이크로어레이 데이터는 GIST에서 KIT 발현과 통계적으로 유의한 상관관계를 가짐으로 인해 선택된 다섯 개의 후보 miRNA들의 KIT 발현 상의 효과를 평가하는 데 이용되었다[13]. 총 25 nM의 다섯 개 후보 miRNA들(miR-9, miR-142-5p, miR-370, miR-494 및 miR-510)을 각각 KIT-과다발현 GIST882 세포주에 트랜스펙션시켰다. 트랜스펙션된 시료들에 대한 웨스턴 블롯 분석 결과, miR-494 만이 KIT 단백질 발현을 지속적으로 감소시켰다(도 1). 이후, 본 발명자들은 miR-494에 대한 추가적인 연구를 실시하였다. KIT 하향-조절을 유도하는 miR-494의 능력은 25 nM의 비타겟팅 miRNA, miR-494, miR-221 또는 miR-494 억제제를 GIST882 세포주에 트랜스펙션시킴으로써 확인되었다. 비타겟팅 miRNA는 miR-494와 비교하여 음성 대조군이고, miR-221은 miR-494와 비교하여 양성 대조군이었다. miR-221 및 miR-222는 모두 KIT mRNA의 3’-UTR을 직접적으로 타겟팅하는 것으로 알려져 있다[17]. 트랜스펙션 후 3일 째, 세포를 수득하여 정량적 RT-PCR(quantitative reverse transcription polymerase chain reaction, qRT-PCR) 및 웨스턴 블롯팅을 실시하였다. 세포에 miR-494 또는 miR-221을 트랜스펙션시킨 경우(miR-494가 miR-221보다 보다 더 우수한 효과를 나타냄), 웨스턴 블롯팅 분석을 통해 KIT 발현의 현저한 하향-조절을 확인하였다. KIT 하향-조절 상에 miR-221 또는 miR-222의 효과는 뚜렷한 차이를 나타내지 않았다(결과를 보이지 않음). miR-494 억제제로 트랜스펙션된 세포주는 음성 대조군 시료와 동일한 KIT 발현을 보였는데, 이는 GIST882 세포주에서 miR-494가 매우 낮은 발현 레벨을 가지기 때문일 것이다(도 2a). miR-494 억제제들로 트랜스펙션된 세포에서 KIT mRNA의 다소 증가된 레벨을 나타내는 점을 제외하고는 웨스턴 블롯 분석과 마찬가지로 qRT-PCR 분석에서도 동일한 패턴을 확인할 수 있었다(도 2b). 상술한 결과들은 KIT 발현이 miR-494에 의해 조절된다는 것을 의미한다.

GIST에서 miR-494 발현과 KIT 발현 간의 역상관관계

본 발명자들은 miR-494의 발현 레벨을 분석하기 위한 miRNA qRT-PCR을 실시하고 KIT 단백질의 발현 레벨을 분석하기 위한 웨스턴 블롯을 실시하여 GIST에서 KIT 발현과 miR-494 발현의 역상관관계(inverse correlation)를 확인하였다. 상기 분석은 KIT 돌연변이를 포함하는 25명의 GIST 환자 및 KIT 돌연변이를 포함하지 않는 6명의 GIST 환자로 구성된 GIST 환자의 신선하게-동결된 31개 시료를 이용하였다(표 1). 택맨 miRNA 어세이를 이용하여 miR-494 레벨을 결정하고 각 케이스 마다 세 개의 독립적인 실험들로부터 얻어진 평균값을 이용한 ABI 실-시간 PCR 7300으로 분석하였다. 각 케이스로부터 KIT 및 miR-494의 레벨은 각각의 발현 레벨과 비교하여 KIT 및 miR-494의 평균값에 대한 상대적인 증가 배수(fold change)로서 제시하였다(도 3a-3c). 상기 분석은 KIT 및 miR-494의 발현 간의 역상관관계를 나타냈다(r = -0.490 및 P = .005). 예상한 바와 같이, KIT 돌연변이를 포함한 케이스들이 KIT 돌연변이를 포함하지 않은 케이스들보다 더 높은 KIT 발현을 나타냈다. 상술한 발견들은 KIT 과다발현이 KIT 돌연변이 상태와 밀접하게 연관되어 있을 지라도 KIT 발현량은 GIST에서 miR-494 발현과 반대로 연관되어 있다는 것을 나타낸다.

KIT의 3’-UTR 내 두 개의 핵심 매치 위치(seed match sites)의 동정

본 발명자들은 KIT mRNA의 3’-UTR에 대한 miR-494의 결합 위치를 동정함으로써 KIT mRNA가 miR-494의 직접적인 타겟이라는 것을 확인하였다. KIT mRNA의 3’-UTR에 대한 miR-494의 알고리즘-기반된 결합 위치를 발견하기 위한 타겟 스캔 3.0 데이터베이스(Target scan 3.0 database; http://www.targetscan.org/)을 통해 1897-1903에 위치한 하나의 결합 위치를 예상하였다(도 4a). 본 발명자들은 레닐라 루시퍼라제(Renilla luciferase) 및 GIST883 세포주의 cDNA로부터 얻어진 KIT mRNA의 총 3’-UTR 서열에 대한 인코딩 서열을 포함하는 N으로 명명된 벡터(N 벡터)를 제조함으로써 리포터 어세이를 고안하였다. PCR을 통해 KIT 3’-UTR 위치를 증폭하여 pRL3 벡터 내 레닐라 루시퍼라제 인코딩 서열 뒤 오른쪽에 클로닝하였다. 본 발명자들의 N 벡터 컨스트럭트가 적절하게 기능한다는 것을 확인하기 위한 모의 실험(pilot experiment)으로, 비타겟팅 miRNA, miR-494, miR-221 또는 miR-222를 포함하는 N 벡터(5 nM)를 HeLa 세포주에 트랜스펙션시켰다. 트랜스펙션하고 2일 째에 세포를 수득하고 DLR(dual luciferase assay) 어세이 키트를 이용하여 듀얼 루시퍼라제 어세이를 실시하였다. N 벡터 및 miR-494로 처리된 시료들은 N 벡터 및 비타겟팅 miRNA로 트랜스펙션된 시료의 루시퍼라제 활성에 비해 거의 반 정도에 불과하였고, miR-221 및miR-222로 처리된 시료보다도 더욱 현저한 감소를 나타냈다(도 4b, 위쪽 패널). N 벡터의 KIT mRNA의 3’-UTR의 위치-지정된 돌연변이유발법(site-directed mutagenesis)을 통해, 1899-1902의 뉴클레오타이드 서열이 변화된(GTTTCCGG) miR-494에 대한 M 벡터 및 1961-1964의 뉴클레오타이드 서열이 변화된(GTAGCAGA) miR-221/miR-222에 대한 O 벡터를 제작하였다. N, M 또는 O 벡터에 비타겟팅 miRNA, miR-494, miR-221 또는 miR-222를 트랜스펙션시키고, 리포터 어세이를 실시하였다. miR-221 또는 miR-222를 포함하는 O 벡터로 트랜스펙션된 세포에서 루시퍼라제 활성은 음성 대조군(비타겟팅 miRNA를 포함하는 N 벡터로 트랜스펙션된 세포)과 비교하여 완전하게 회복하였는데, 이는 miR-221 및 miR-222가 KIT mRNA를 직접적으로 타겟팅한다는 것을 의미한다. 하지만, M 벡터 및 miR-494로 트랜스펙션된 시료들은 음성 대조군과 비교하여 아주 약간 회복된 루시퍼라제 활성을 나타냈다(도 4b, 위쪽 패널). 상술한 결과는 miR-494가 KIT mRNA의 3’-UTR을 직접적으로 타겟팅하거나 또는 추가적인 결합 위치가 존재할 수 있다는 것을 보여준다.

본 발명자들은 보다 강력한 miR-494 결합 위치들에 대해 벡터 NTI 소프트웨어(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)를 이용하여 손수 조사하였다(도 4a). 그 결과, KIT mRNA의 3’-UTR은 miR-494에 대한 6-7개의 핵심 염기서열(seed match sequences)를 포함하는 세 개의 잠재적인 miR-494 결합 위치를 가졌다. 검색된 잠재적인 miR-494 결합 위치는 다음과 같았다: 5’-TGTTTCT-3’(위치, 1222-1228), 5’-GTGTTTCT-3’(위치, 1758-1765) 및 5’-ATGTTT-3’(위치, 1918-1923). 상술한 발견을 통해, 본 발명자들은 잠재적인 miR-494 결합 위치들의 추가적인 돌연변이(GTTTCCGG)에 의해 M 벡터로부터 유래된 세 개의 벡터(Ma, Mb 및 Mc 벡터)를 제작하였다. 리포터 어세이는 miR-494를 포함하는 M, Ma, Mb, Mc 벡터를 각각 HeLa 세포주에 트랜스펙션함으로써 실시하였다. Mb 및 miR-494로 트랜스펙션된 세포만이 음성 대조군에 비하여 완전하게 회복된 루시퍼라제 활성을 나타냈다(도 4b, 아래쪽 패널). 다음 5’-GTGTTTCT-3’(위치, 1753-1760)의 G 염기가 워블 매치(wobble match)에 의해 U 염기와 수소결합을 이룰 수 있기 때문에, 상기 위치는 타겟 스캔 3.0에 의해 제안된 고유의 결합 위치와 마찬가지로 거의 동일하게 기능하였다. 상술한 결과들을 종합해 보면, 두 개의 다른 위치들은 miR-494가 KIT mRNA의 3’-UTR 부위에 결합하는 데 중요하다는 것을 결론지을 수 있다.

miR-494 억제 후 KIT 발현의 회복

또한, 본 발명자들은 N 벡터 및 miR-494 억제제들을 이용한 리포터 어세이를 통해 KIT mRNA의 3’-UTR 부위에 결합할 수 있는 내인성 miR-494의 능력을 확인하였다. 상기 억제 어세이 전에, 본 발명자들은 여섯 개의 세포주에서 택맨 miRNA 어세이에 의해 miR-494의 발현 레벨을 측정한 후, 다음 세 개의 세포주를 선택하였다: HeLa, GIST882 및 SNU216. HeLa 및 SNU216 세포주는 상대적으로 높은 발현 레벨의 miR-494를 가지는 반면에, GIST882 세포주는 miR-494 발현이 거의 검출되지 않았다(도 4c, 위쪽 패널). 상술한 세 개의 세포주들은 음성 대조군으로서 비타겟팅 miRNA를 포함하는 N 벡터 또는 miR-494 억제제들을 포함하는 N 벡터로 각각 트랜스펙션시켰다. 세포를 이틀 후에 수거하여 DLR 어세이를 실시하였다. miR-494 억제제들로 트랜스펙션된 SNU216 및 HeLa 세포들의 루시퍼라제 활성은 음성 대조군의 활성보다 두 배 이상 증가하였으나, GIST882 세포들의 활성은 거의 변화가 없었다(도 4c, 아래쪽 패널). 상술한 결과들은 KIT 발현이 HeLa 및 SNU216같은 KIT를 발현하지 않는 세포주 내에서 조차 내인성 miR-494에 의해 직접적으로 조절된다는 것을 나타낸다.

miR-494 처리 후 교란된 시그널링

KIT 다운스트림 분자 경로는 세포 증식, 분화 및 아팝토시스에 관계한다고 알려져 있다. 많은 연구들[6]에 의해 제안된 바와 같이, KIT 발현의 조절은 AKT, ERK 및 JACK-STAT 경로를 포함하는 중요한 경로들에 영향을 미친다. 상기 경로들 상에 miR-494의 효과는 miR-494 트랜스펙션 후 p-AKT, p-ERK, p-KIT 및 p-STAT3의 상태를 분석함으로써 검증하였다. GIST882 세포주에 50 nM의 비타겟팅 miRNA, miR-494, miR-221 또는 miR-494 억제제들을 트랜스펙션시켰다. miR-494로 트랜스펙션된 세포들에서 KIT 발현이 현저하게 감소되었다. 또한, miR-221로 트랜스펙션된 세포들에서 KIT 발현이 감소하였으나, miR-494보다 덜 하였다. 하지만, miR-494 억제제들은 KIT 발현에 영향을 미치지 않았는데, 이는 아마도 GIST882 세포주 내 miR-494의 발현 레벨이 매우 낮기 때문일 것이다. 포스포-특이적 항체를 이용해 p-KIT(pY703)의 발현도 테스트하였는데, 발현 레벨이 현저하게 감소하였다. 또한, KIT 시그널링 경로의 세 개의 다운스트림 분자들(AKT, ERK 및 STAT3)의 활성화 형태도 분석하였다. 포스포-AKT 특이적 항체로 측정된 바와 같이, 포스포-AKT 레벨이 miR-221 및 miR-494 처리 후 감소하였으며(도 5), miR-221 처리보다 miR-494 처리 후 더 많은 정도로 포스포-AKT의 하향-조절이 일어났다. miR-494 억제제의 처리는 측정될 만한 변화를 야기하지 않았다. p-STAT3의 변화 패턴은 p-STAT3의 레벨이 miR-221 및 miR-494 처리 후 감소하고 그 감소가 miR-494 처리 후에 더 크다는 점에서 포스포-AKT와 유사하였다. p-ERK 레벨의 변화는 관찰되지 않았다. 상술한 발견들은 KIT가 KIT 활성화를 억제하는 이마티닙 또는 KIT shRNA에 의해 불활성화되는 경우에 p-AKT 및 p-STAT3의 발현이 영향받는다는 이전 보고들[4, 8, 9, 18]과 일치한다. 종합해 보면, 상술한 결과들은 miR-494 처리가 KIT 하향-조절을 유도하고 이마티닙 또는 KIT shRNA 같은 KIT-억제 분자들과 동일한 방식으로 다운스트림 분자들에 영향을 미친다는 것을 나타낸다.

유도된 miR-494 과다발현에 의한 GIST 세포 증식의 억제

GIST882 세포의 증식 상에 miR-494의 효과는 GIST882 세포를 2×10⁶ 세포 수로 60-mm 디쉬에 분주하여 배양하는 세포 증식 어세이로 확인하였다. 정상적인 세포 형태로 정기적으로 확인하였으며, 계대 배양 3일 째에 총 12개의 디쉬에서 트랜스펙션을 실시하였다. 세포들은 50 nM의 비타겟팅 miRNA 또는 miR-494로 각각 첫 번째 날 및 여섯 번째 날에 트랜스펙션시키고, 최초 트랜스펙션 후 3일, 6일 및 12일 째에 세포수를 카운팅하였다. 각 실험은 두 쌍으로 실시하여 얻은 평균값을 데이터 분석에 이용하였다. 3일 후에는 뚜렷한 변화가 발생하지 않았다. miR-494로 트랜스펙션된 세포는 최초 트랜스펙션 후 6일째에 세포 및 세포 클러스터의 수가 현저하게 감소하였으며, 이러한 변화는 어세이 12일 째에 더욱 심화되었다. GIST882 세포의 경우, 정상 세포 형태가 핀-포인트 말단 구조를 가지는 방추형이지만, miR-494 처리된 GIST882 세포들은 12일 째에 변화된 세포 형태를 나타냈으며(도 6a), 세포수도 대조군 세포수에 비해 거의 37%까지 감소하였다(도 6b, 위쪽 패널). KIT의 지속된 하향-조절은 증식 어세이에서 이용된 동일한 시료의 웨스턴 블롯팅에 의해 확인되었다(도 6b, 아래쪽 패널).

유세포분석을 통해, miR-494 트랜스펙션 후 세포주기의 변화를 조사하였다. GIST882 세포에 50 nM의 비타겟팅 miRNA 또는 miR-494를 각각 트랜스펙션하였다. 트랜스펙션 4일 째에 시료를 수득하여 프로피디움 이오다인으로 염색하여 유세포분석을 실시하였다. miR-494로 처리된 세포주는 비타겟팅 miRNA로 트랜스펙션된 세포와 비교하여 G₀-G₁기의 세포가 6% 증가하였으며, S기 세포가 5% 감소하였다. 상술한 발견들은 miR-494가 세포주기를 조절함으로써 GIST882 세포 증식을 억제한다는 것을 의미한다.

추가논의사항

마이크로RNA는 타겟 유전자들 및 타겟 유전자 조절 경로의 구성성분을 전사 후 방식으로 조절하여 직접적으로 및 간접적으로 시그널 전달과정(signal transduction)에 영향을 미칠 수 있다. 상기 발견들은 miRNA들이 시그널 전달과정 및 종양형성 과정에서 주된 조절 기능을 할 수 있다는 것을 의미한다[15, 16]. KIT의 돌연변이 및 과다발현은 KIT-유도된 종양형성 과정과 내적 연관성을 가지며 이상조절된 miRNA는 KIT 과다발현 및 이후의 종양형성 과정을 설명할 수 있다[12, 13]. miR-221 및 miR-222는 KIT를 타겟팅함으로써 적혈구계 세포 증식에 대한 음성 조절자로서 보고되었다[17]. 하지만, KIT를 타겟팅하여 GIST 종양형성 과정에 포함되는 miRNA들은 아직까지 보고된 적이 없다. 본 발명에서, 본 발명자들은 내인성 miR-494가 KIT 하향-조절을 유도한다는 것을 증명함으로써 miR-494가 KIT를 직접적으로 타겟팅하고 miR-494의 억제가 KIT 과다발현을 유도한다는 것을 제안한다. KIT의 하향-조절은 KIT-타겟팅 miRNA들로 이전에 보고된 miR-221 및 miR-222보다 miR-494에 의해 인 비트로에서 더욱 더 강력하게 일어난다. 더 나아가, miR-221 및 miR-222의 발현 레벨은 GIST에서 KIT 발현과 관련이 없었다[13]. 따라서, 본 발명자들은 miR-494가 GIST에서 KIT 발현을 조절하는 주요한 miRNA라고 결론지을 수 있었다. 이제까지, miR-494의 기능에 대한 보고는 miR-494가 화학적으로 형질전환된 세포주에서 PTEN의 하향-조절을 유도하고 miRNA 프로파일 연구에 따라 miR-494의 발현이 림프종 및 두경부편평세포암종에서 감소한다고 보고들 이외에는 없었다[19-21]. 하지만, miR-494의 직접적인 타겟에 대한 것은 아직까지 보고된 바 없다. 본 연구는 miR-494가 GIST에서 KIT의 직접적인 타겟이라는 것을 증명한 최초의 연구이다.

KIT 단백질은 RTK 패밀리에 속하는 높은 종양유발성(oncogenic) 타이로신 키나제이며, PI3-키나제, Src 패밀리 키나제 및 Ras-Erk의 주된 시그널 전달경로 및 JAK-STAT의 마이너 시그널 전달경로에 포함된다[6]. 막통과 도메인의 돌연변이는 지속적으로 KIT 수용체의 다이머화를 활성화시켜 다운스트림 시그널을 활성화시킨다[22]. 기능획득 돌연변이는 KIT 유전자의 엑손 9, 11, 13 및 17에서 종종 발견되고 이는 GIST 종양형성 과정에 기여한다[3, 23]. 본 연구는 miR-494에 의해 유도된 KIT의 하향-조절이 p-AKT 및 p-STAT3의 레벨에 영향을 미친다는 것을 증명하였다. 상기 발견은 활성화된 KIT를 가지는 GIST882 세포가 이마티닙 또는 KIT shRNA로 처리된 경우에 p-AKT 및 p-STAT3 발현이 감소하고 이로 인한 세포 증식의 차단 및 증가된 아팝토시스에 따라 세포 성장이 최종적으로 억제된다는 것을 보여준 이전 보고들과 일치한다[4, 8, 9, 18]. 이마티닙은 ATP 결합 포켓을 통해 KIT를 억제하고 이는 KIT 인산화에 영향을 미쳐 다운스트림 분자들을 활성화시킨다[24-26]. 본 발명자들의 연구는 miR-494 처리가 시그널링 경로를 교란하고 세포 증식을 억제하는 이마티닙과 유사한 방식으로 GIST882 세포주에 영향을 미친다는 것을 보여준다. 상술한 발견들은 miR-494가 GIST를 치료하기 위한 또 다른 선택수단일 수 있다는 것을 의미한다. KIT의 3’-UTR에서 miR-494의 두 개의 서로 다른 핵심 염기서열 위치(seed match sites)에 대한 본 발명자들의 동정은 miR-494의 직접적인 타겟으로서의 KIT mRNA에 대한 개념을 추가적으로 지지하며, KIT 활성화를 가지는 GIST 환자에 대한 보다 구체적인 치료 가능성을 도출한다.

종양단백질은 해독 후 방식으로 또는 전사 후 방식으로 억제될 수 있다[27]. 이마티닙에 의한 KIT의 억제는 KIT의 ATP 결합 포겟에 대한 경쟁적인 결합을 통한 해독 후 억제의 예이다. 하지만, 이마티닙에 의한 KIT 억제는 처리 과정 동안 발생할 수 있는 아미노산 잔기의 잠재적인 돌연변이 변화를 통한 저항성이 일어날 수 있기 때문에 불완전하다. 그 결과, KIT의 ATP 결합 포겟에 대한 이마티닙의 결합을 억제함으로써 이마티닙 저항성이 일어난다[11]. 상기 가능한 돌연변이-유래된 저항성은 miR-494를 포함하는 보다 강력한 치료수단을 시급히 요구하고 있다. KIT를 불활성화시키기 위한 miR-494의 치료적 용도는 종래의 RNA-기반된 치료법이 역설적으로 siRNA(small interfering RNAs)의 거대한 분자 크기와 함께 혈액 내에서 불안정하기 때문에 보완해야 할 점이 많을 것이다. 하지만, 상술한 많은 문제들은 앱타머, 나노입자 및 리포좀 같은 신규한 운반 시스템에 의해 해결되고 있다[28-30]. 상기 신규한 운반 시스템을 적용함으로써, miR-494가 GIST를 치료하기 위한 신규한 치료수단으로서 이용될 수 있을 것이다.

결론적으로, miR-494는 GIST에서 KIT의 강력한 조절자이며, GIST 환자에게 miR-494를 도입하는 것은 종양 진행을 억제하기 위한 신규한 방식일 수 있다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명 의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

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Claims

KIT(v-kit Hardy-Zuckerman 4 feline sarcoma viral oncogene homolog) 억제제로서 마이크로RNA-494(miR-494)를 유효성분으로 포함하는 종양 질환(neoplastic disorders)의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
삭제
제 1 항에 있어서, 상기 miR-494는 AKT 또는 STAT3의 인산화를 억제시키는 것을 특징으로 하는 조성물.
삭제
삭제
삭제
제 1 항에 있어서, 상기 종양 질환은 위장관 간질종양(gatrointestinal stromal tumors, GISTs), 소세포 폐암(small cell lung cancer), 비-소세포성 폐암, 급성 골수성 백혈병(acute myelocytic leukemia), 급성 림프구성 백혈병, 골수이형성증후군(myelodyplastic syndrome), 만성 골수성 백혈병, 대장 암종, 위 암종, 고환암(testicular cancer), 신경교종(glioblastoma), 성상세포종(astrocytoma) 또는 비만세포종(mastocytosis)인 것을 특징으로 하는 조성물.
서열목록 제2서열의 뉴클레오타이드 서열 중 8번째부터 15번째 뉴클레오타이드 서열에 상보적인 서열을 가지는 안티센스 올리고뉴클레오타이드 서열을 포함하는 종양 질환(neoplastic disorders) 예방 또는 치료용 20-100개의 연속 뉴클레오타이드 서열.
서열목록 제3서열의 뉴클레오타이드 서열 중 8번째부터 15번째 뉴클레오타이드 서열에 상보적인 서열을 가지는 안티센스 올리고뉴클레오타이드 서열을 포함하는 종양 질환(neoplastic disorders) 예방 또는 치료용 20-100개의 연속 뉴클레오타이드 서열.
제 8 항 또는 제 9 항에 있어서, 상기 안티센스 올리고뉴클레오타이드 서열은 miR-494의 핵심 결합 서열(seed match sequences)에 상보적인 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 서열.
제 10 항에 있어서, 상기 miR-494의 핵심 결합 서열은 KIT의 3’-UTR(untranslated region) 내 1222-1228번째 염기서열 또는 1918-1923번째 염기서열의 위치에 결합하는 서열인 것을 특징으로 하는 서열.
제 8 항 또는 제 9 항에 있어서, 상기 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 DNA 또는 RNA 분자인 것을 특징으로 하는 서열.
(a) 마이크로RNA-494(miR-494)-인코딩 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 세포에 시험물질을 처리하는 단계; 및 (b) 상기 세포에서 miR-494의 발현을 분석하는 단계를 포함하는 종양 질환(neoplastic disorders) 치료제의 스크리닝 방법으로, 상기 시험물질이 miR-494의 발현을 증가시키면 종양 질환 치료제로 판단된다.
제 13 항에 있어서, 상기 miR-494는 KIT의 발현을 억제시키거나 또는 AKT 또는 STAT3의 인산화를 억제시키는 것을 특징으로 하는 방법.
제 13 항에 있어서, 상기 종양 질환은 위장관 간질종양, 소세포 폐암, 비-소세포성 폐암, 급성 골수성 백혈병, 급성 림프구성 백혈병, 골수이형성증후군, 만성 골수성 백혈병, 대장 암종, 위 암종, 고환암, 신경교종, 성상세포종 또는 비만세포종인 것을 특징으로 하는 방법.