KR101668518B1 - 혈관신생을 촉진하는 마이크로rna-101 - Google Patents

Abstract

본 발명은 마이크로RNA-101(miR-101)의 혈관신생 촉진 효과를 이용한 것으로, 구체적으로 miR-101 또는 이의 효현제를 함유함으로써 큘린3(cullin3)를 저해하는 것을 특징으로 하는 혈관신생용 약제학적 조성물, 또는 허혈성 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 약제학적 조성물을 사용하면 혈관신생이 필요한 곳에 효과적으로 혈관신생을 촉진할 수 있으며, 허혈성 질환 또한 효과적으로 예방 및 치료할 수 있다. 또한, 본 발명의 스크리닝 방법을 사용하면 새로운 혈관생성 촉진제 또는 허혈성 질환의 예방 또는 치료제를 효율적으로 개발할 수 있다.
이 연구는 2011년도 정부[교육과학기술부]의 재원으로 한국연구재단의 지원을 받아 수행된 연구임[No. NRF-2011-0028790].

Description

혈관신생을 촉진하는 마이크로RNA-101{Hypoxia-responsive microRNA-101 promotes angiogenesis via heme oxygenase-1/VEGF axis by targeting Cullin 3}

본 발명은 마이크로RNA-101(miR-101)의 혈관신생 촉진 효과를 이용한 것으로, 구체적으로 마이크로RNA-101 또는 이의 효현제를 함유함으로써 큘린3(cullin3)를 저해하는 것을 특징으로 하는 혈관신생용 약제학적 조성물, 또는 허혈성 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물에 관한 것이다.

이 연구는 2011년도 정부[교육과학기술부]의 재원으로 한국연구재단의 지원을 받아 수행된 연구임[No. NRF-2011-0028790]{This work was supported by the National Research Foundation of Korea[NRF] grant funded by Korea government[MEST][No. NRF-2011-0028790]}.

국소적 조직 저산소증은 태아의 발달에 영향을 미칠 뿐만 아니라 성인에서는 상처치유, 심근경색증, 말초동맥질환, 당뇨망막병증 및 종양의 성장과 전이를 포함하는 여러 병리학적 증상에 영향을 미친다(1 - 4). 이미 존재하던 혈관상(vascular bed)으로부터 새로운 혈관을 생성하기 위하여 복잡한 혈관신생 과정이 저산소 조직에서 활성화되고, 이를 통해 저산소 기관과 조직으로 산소와 영양분이 공급되기 때문이다(1). 이러한 생물학적 과정은 내생적 혈관신생 전구 성장인자(예를 들어, VEGF, FGF, TFGβ 및 EGF)와 항-혈관신생 분자(예를 들어, thrombospodin, angiostain 및 endostatin)의 균형에 의해 엄격하게 조절된다. 국소적 미세환경과 관조직에서 이들 인자가 조절되는 것은 질병 발생과 저산소증-관련 질병의 조직 복구 과정에 기여한다.

기존에 알려진 혈관신생 전구 인자들 중, VEGF가 특히 주목받고 있으며 가장 유력한 혈관신생 인자로 여겨지고 있다(5). 주로 산소-민감성 전사인자이며, 저산소증에 반응하는 주요인자인 HIF-1α에 의해 VEGF의 발현이 상향된다. HIF-1α는 정상산소 조건에서 402번째 및/또는 564번째 프로린 잔기가 prolyl hydroxylase domain protein(PHD)에 의해 수산화되고, von Hippel-Lindau protein과의 상호작용이 증가하며, 이에 따라 유비퀴틴화-의존적 프로테오소말 분해가 유도된다(6). 반면, 저산소증은 hydroxylase의 활성을 저해하고, HIF-1α의 안정화를 유도한다. 반대로, 이 전사인자는 HSP90과의 상호작용 및 번역의 활성화에 의해 산소와는 별개의 방법으로도 조절된다(6, 7). 기존에 본 발명자와 다른 연구자들은 bilirubin과 일산화탄소와 같은 heme oxygenase-1(HO-1)에 의한 heme의 분해산물이 VEGF의 발현을 증가시켜 혈관신생을 촉진(7, 8)하며, 이에 HO-1이 유력한 혈관신생 조절인자라는 것을 밝혔다.

Phase II 효소인 HO-1은 heme의 분해에서 율속단계(rate-limiting step)를 촉진하고, 이에 따라 CO, 철 및 biliverdin(biliverdin reductase에 의해 bilirubin으로 전환된다)이 유리된다(9). HO-1은 heme, 저산소증, cytokine 및 성장인자를 포함하는 여러 자극물질에 노출된 이후 전사인자인 Nrf2(nuclear factor erythroid-derived 2-related factor 2)가 Keap1(Kelch-like ECH-associated protein 1)/Cul3(Cullin 3)/E3 ligase 복합체-매개 분해로부터 보호됨에 따라 유도된다(10). 최근 연구에 따르면, Cul3 돌연변이 또는 siRNA-기초 Cul3 넉다운의 경우 모두 Nrf2를 활성화하고 HO-1를 상위조절하며, 이에 따라 혈관신생이 촉진되는 것으로 나타났다(7, 11, 12). 반면, Cul3의 과발현은 Nrf2의 기능을 음성적으로 조절한다(12). 이러한 증거들은 Cul3의 기능이 소실되면 Nrf2의 안정화가 증가하고, 이때 HO-1 및 혈관신생 시작이 유도될 수 있다는 것을 시사한다.

MicroRNA(miRNA)는 단백질을 암호화하지 않고 한 가닥이며 21 ~ 23 뉴클레오티드의 작은 RNA 분자로, 주로 표적 mRNA의 3'UTR에 결합하여 mRNA의 분해를 촉진하거나 mRNA의 번역을 저해함에 따라 여러 생물체에서 단백질의 발현을 음성조절한다(13, 14). 현재는 miRNA가 관 항상성의 여러 양상과 혈관신생, 관 리모델링 및 심근경색증을 포함하는 심혈관 질환 발생에 관련된 주요 역할을 한다는 것이 명확해졌다(14 - 17). miRNAs(miRs)-221/222가 이들의 리셉터인 c-Kit를 표적화함에 따라 줄기세포 인자의 혈관신생 활성을 조절한다는 것을 Poliseno 등이 처음으로 증명(18)한 이래로, 여러 miRNA들이 혈관신생과 관 기능의 조절에 중요한 역할을 담당한다는 것이 밝혀졌다. 예를 들어, miR-34a는 노쇠화 관련 PNUTS의 발현을 저해하여 심장의 노화와 기능을 조절하는 것으로 알려졌다(19). miRs-199a/590은 또한 성체 심장 근육의 증식을 통해 심장 재생을 촉진하는 것으로 나타났다(20). miRs-10/30 패밀리/126을 포함하는 몇몇 miRNA가 VEGF의 신호전달을 촉진하여 혈관신생을 촉진하는 것으로 나타났지만(12 - 23), miRs-492/195/16/15a는 VEGF의 발현을 저해함으로써 항-혈관신생 분자로 기능하기도 한다(24 - 26). 따라서 새로운 혈관신생 전구 miRNA의 기능을 확인하는 것은 신혈관형성의 분자적 메커니즘을 이해하고 허혈성 질병의 새로운 치료 전략을 확립하는데 매우 중요할 것이다.

본 발명자는 저산소 반응성 miRNA가 혈관신생을 위한 유력한 전구 물질이 될 수 있을 것이라 판단하였고, 여러 miRNA 가운데 miR-101에 주목하였다. miR-101은 인간의 전립선 종양에서 종양이 발달하는 동안 하향 조절되는 반면(30), 건조 스트레스(sear stress)에 노출된 ECs에서는 상향조절되고 내피 항상성을 조절할 수 있는 것으로 조사된 바 있다(31).

본 발명자는 miR-101이 저산소 조건에서 증가한다는 것을 확인하였으며, 이를 바탕으로 혈관신생과 관련된 역할을 조사하기 위한 다양한 연구를 거듭한 끝에, 이 miR-101이 Cul3(Nrf2-매개 HO-1을 유도하는 중요 조절자)를 표적화함에 따라 HO-1/VEGF 시스템에 영향을 미쳐 허혈성 조직에서 혈관의 관류를 개선할 수 있도록 혈관신생을 촉진한다는 것을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.

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따라서 본 발명의 주된 목적은 혈관신생 촉진을 위한 새로운 약제학적 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 허혈성 질환의 예방 또는 치료를 위한 새로운 약제학적 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 마이크로RNA-101(miRNA-101, 이하, 'miR-101'이라 한다) 또는 마이크로RNA-101의 효현제(agonist)를 유효성분으로 함유하여 큘린3(cullin3, 이하 'Cul3'라 한다)를 저해하는 것을 특징으로 하는 혈관신생용 약제학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 miR-101 또는 miR-101의 효현제를 유효성분으로 함유하여 Cul3를 저해하는 것을 특징으로 하는 허혈성 질환 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 miR-101을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 세포에 후보물질을 처리하는 단계; 및 후보물질이 처리된 세포에서 miR-101의 발현을 분석하고, 후보물질을 처리하지 않은 대조군 세포의 miR-101의 발현 양상과 비교하는 단계;를 포함하는 혈관신생 촉진제 스크리닝 방법을 제공한다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 miR-101을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 세포에 후보물질을 처리하는 단계; 및 후보물질이 처리된 세포에서 miR-101의 발현을 분석하고, 후보물질을 처리하지 않은 대조군 세포의 miR-101의 발현 양상과 비교하는 단계;를 포함하는 허혈성 질환 치료제 스크리닝 방법을 제공한다.

본 발명자들은 miR-101이 Cul3의 발현을 저해하고 이에 따라 Nrf2-매개 HO-1의 발현을 증가시키는 등의 과정을 통해 혈관생성을 촉진한다는 것을 발견하였다. 보다 구체적으로는 miR-101의 혈관생성 촉진 효과는 다음과 같은 작용기작을 통해 나타나는 것으로 판단된다.

1. miR-101은 Cul3의 mRNA에서 3'UTR(untranslated region)을 표적화하여 Cul3의 발현을 저해한다.

2. Cul3의 발현이 저해됨에 따라 Nrf2-의존적 HO-1의 발현이 증가한다.

3. HO-1의 발현이 증가함에 따라 HIF-1α의 발현이 증가한다. 이때, miR-101이 HO-1에 의존적으로 HIF-1α 레벨을 높이지만, PHD에는 독립적인 방법을 통해 이루어진다.

4. miR-101은 HIF-1α를 안정화하고 VEGF의 발현 및 HO-1의 발현, 그리고 이의 반응산물을 증가시킴으로써 혈관형성을 유도한다.

5. miR-101에 의해 HO-1이 발현됨에 따라 VEGF의 생산이 증가하고, 이는 eNOS-유래 NO가 Keap1의 S-니트로실화 및 이에 따른 Nrf2 활성화를 유도하는 양성 피드백 과정을 통해 이루어진다.

miR-101은 서열번호 1의 염기서열을 갖는 작은 크기의 RNA분자이다. pre-miRNA의 서열은 서열번호 2로 표시될 수 있는데, 이중 1 ~ 21번의 서열이 센스(sense) 서열이며 31 ~ 51번의 서열이 안티센스(anti-sense) 서열이다.

Cul3는 E3 ubiquitin ligase complex의 결합에 중요한 역할을 하는 구조단백질로 아미노산 서열은 서열번호 3으로 표시될 수 있고 유전자 염기서열은 서열번호 4로 표시될 수 있다.

허혈성 질환은 혈관신생으로 혈류를 개선하면 예방 또는 치료될 수 있으므로, miR-101은 유용한 허혈성 질환 예방 또는 치료제가 될 수 있다.

miR-101 뿐만 아니라 miR-101의 효현제(agonist) 또한 혈관생성 촉진제와 허혈성 질환 예방 또는 치료제가 될 수 있다. miR-101의 효현제는 a) 성숙한 마이크로RNA-101의 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드; b) 마이크로RNA-101의 pre-miRNA(전구체) 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드; c) 마이크로RNA-101의 pri-miRNA(초기전사체) 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드; d) 성숙한 마이크로RNA-101을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 함유하여 포유동물의 세포 내에서 성숙한 마이크로RNA-101을 발현하는 벡터; e) 마이크로RNA-101의 pre-miRNA를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 함유하여 포유동물의 세포 내에서 마이크로RNA-101의 pre-miRNA를 발현하는 벡터; 및 f) 마이크로RNA-101의 pri-miRNA를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 함유하여 포유동물의 세포 내에서 마이크로RNA-101의 pri-miRNA를 발현하는 벡터;일 수 있다.

상기 벡터는 혈관신생을 촉진하고자 하는 부위의 조직 또는 세포에 투여되어 miR-101, 이의 pre-miRNA 또는 pri-miRNA가 안정적으로 발현될 수 있도록 이루어지는 것이 바람직하다. 예를 들어, 도 14와 같은 형태의 벡터일 수 있다.

본 발명에 따른 miR-101 또는 miR-101의 효현제는 식품의약안정청(KFDA)의 통상적인 약제학제 제제로의 제형화 기준 또는 건강보조식품의 제형 기준에 의거하여 제형화할 수 있다.

miR-101 또는 miR-101의 효현제는 그 자체를 사용하거나 약제학적으로 허용이 가능한 산부가염 또는 금속 복합체, 예를 들어 아연, 철 등과 같은 염의 형태로 사용할 수 있다. 좀 더 구체적으로 산부가염은 염화수소, 브롬화수소, 황산염, 인산염, 말레산염, 아세트염, 시트로산염, 벤조산염, 숙신산염, 말린산염, 아스코로브산염, 타르탈산염을 사용할 수 있다. 그리고 miR-101, miR-101의 효현제 및 이들의 염 형태를 유효성분으로 함유하는 조성물은 통상적인 방법으로, 투여방법, 투여형태 및 치료목적에 따라 상기 유효성분을 약제학적으로 허용 가능한 담체와 함께 혼합하여 희석하거나, 용기 형태의 담체 내에 봉입시키는 것이 바람직하다.

상기 담체가 희석제로 사용되는 경우에는 염수, 완충제, 덱스트로스, 물, 글리세롤, 링거액, 락토즈, 수크로즈, 칼슘 실리케이트, 메틸 셀룰로오즈 및 에탄올로 이루어진 군에서 선택된 적어도 1종 이상의 담체를 사용한 경구투여와 비경구투여용으로 분말, 과립, 주사액, 시럽, 용액제, 정제, 좌약, 페사리(pessaries), 연고, 크림 또는 에어로졸 등과 같은 제형으로 제조한다. 다만, 본 발명의 담체가 상기의 담체로 한정되는 것은 아니다. 이때, 비경구 투여는 경구 이외에 직장, 정맥, 복막, 근육, 동맥, 경피, 비강, 흡입 등을 통한 유효성분의 투여를 의미한다.

상기 제형에 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제, 방부제 등을 추가로 포함하여 포유동물에 투여된 후 활성성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 제형화 할 수 있다. 그리고 본 발명의 투여량은 환자의 상태, 투여 경로 및 투여 형태에 따라 조절될 수 있어 한정되지 않으며 증상에 따라 본 발명의 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 자명하게 다양한 범위 내에서 사용할 수 있으나, 통상적으로 본 발명에서는 실험적인 유효량으로 체중 1㎏ 당 0.0001 내지 100㎎을 하루에 연속적 또는 간헐적으로 투여가 가능할 것으로 판단된다.

상기와 같은 miR-101의 효과를 바탕으로, miR-101의 발현을 증가시킬 수 있는 물질을 탐색하는 방법을 사용하여 새로운 혈관생성 촉진제 또는 허혈성 질환 예방 또는 치료제를 스크리닝할 수 있다. 예를 들어, miR-101 유전자를 보유하는 세포에 후보물질을 처리하고 miR-101의 발현 양상을 조사한 다음, 후보물질을 처리하지 않은 대조군 세포와 비교하여 miR-101의 발현이 상향되는 것을 찾는 방법을 사용할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물을 사용하면 혈관신생이 필요한 곳에 효과적으로 혈관신생을 촉진할 수 있으며, 허혈성 질환 또한 효과적으로 예방 및 치료할 수 있다. 또한, 본 발명의 스크리닝 방법을 사용하면 새로운 혈관생성 촉진제 또는 허혈성 질환의 예방 또는 치료제를 효율적으로 개발할 수 있다.

도 1은 EC에서 Cul3를 표적화하는 miR-101의 저산소 유도 상향을 나타낸다. A: 정상 조건(N) 또는 저산소 조건(H)에서 HUVECs, HBMECs(human brain microvascular endothelial cells), ACs(human primary astrocytes), HeLa 및 U937 세포의 miR-101 레벨을 qRT-PCR로 정량하여 나타낸 그래프이다. B: 정상 조건 또는 저산소 조건에서 시간에 따른 miR-101 레벨을 나타낸 그래프이다. C: 정상 조건 또는 저산소 조건에서 대조군 또는 HIF-1α siRNA로 형질감염된 세포들의 miR-101 레벨을 정량하여 나타낸 그래프이다. D 및 E: 12시간 동안 정상 조건 또는 저산소 조건으로 처리된 antagomir-101(Ant-101) 또는 대조군 antagomiR(C-Ant)로 형질감염된 세포들의 Cul3 및 HO-1 발현 레벨을 qRT-PCR 및 웨스턴블롯으로 조사한 결과이다. F: psiCHECK^TM-2/Cul3 3'UTR의 dual-luciferase report 분석 시스템을 사용하여 Cul3 3'UTR의 활성을 조사하여 나타낸 그래프이다. 각 그래프의 결과는 평균±SD(n=3)으로 나타내었다. *P<0.05, **P<0.01. HUVEC, human umbilical vein endothelial cell; qRT-PCR, quantitative real-time PCR; HIF-1a, hypoxia inducible factor-1a; Cul3, cullin3; HO-1, heme oxygenase-1; 3'UTR; 3'-untranslated region.
도 2는 miR-101이 Cul3를 표적화하여 Nrf2-의존적 HO-1 발현을 상향시킨다는 것을 나타낸다. HUVEC을 pSilencer 2.1-U6/pre-miR-101(mir-101), pSilencer 2.1-U6/control pre-miR(C-mir) 또는 p3xFLAG-CMV10-Cul3으로 형질감염시키거나, 또는 야생형 또는 Cul3의 3'UTR 돌연변이를 함유하는 psiCHECK^TM-2 벡터와 함께 형질감염시키고 새로운 배지에서 12시간 배양하였다. A: Cul3 3'UTR 활성을 dual-luciferase report 분석으로 조사하여 나타낸 그래프이다. B: Cul3 및 HO-1의 발현 레벨을 RT-PCR 및 웨스턴블롯으로 조사하여 나타낸 결과이다. C: 4시간 동안 5μM MG132로 처리한 세포에서 Nrf2의 유비퀴틴화를 면역침강 후 웨스턴블롯으로 조사하여 나타낸 결과이다. D: 0.5㎍/㎖ actinomycin D를 각 시간별로 처리한 다음 Nrf2 단백질 레벨을 웨스턴블롯으로 조사하여 나타낸 그래프이다. 각 결과값은 2회의 개별 실험결과값의 평균값이다. E: 세포 용해질을 Keap1 또는 Nrf2 항체로 면역침강하고, Keap1과 Nrf2의 상호작용을 웨스턴블롯으로 조사한 결과이다. F: 세포 내 Nrf2의 핵 전이를 면역조직화학법으로 조사한 결과이다. Scale bar = 25㎛. G: HO-1 프로모터의 항산화 반응성 인자에 Nrf2가 결합하는 것을 CHIP로 분석한 결과이다. H: luciferase 분석 시스템으로 HO-1 프로모터 활성을 조사하여 나타낸 그래프이다. 각 그래프의 결과는 평균±SD(n=3)로 나타내었다. *P<0.05, **P<0.01. pre-miR-101, precursor miR-101; Nrf2, nuclear factor erythroid-derived 2-related factor 2; Keap1, kelch-like ECH-associated protein 1; ChIP, chromatin immunoprecipitation.
도 3은 miR-101이 HO-1 경로의 유도에 의해 HIF-1α-매개 VEGF 발현을 증가시킨다는 것을 나타낸다. HUVEC을 pSilencer 2.1-U6/mir-101(또는 pSilencer 2.1-U6/C-mir)로 형질감염시키거나 대조군 siRNA(siCtrtl), HO-1 siRNA(siHO-1) 또는 pGL3-VEGF-Luc와 함께 24시간 형질감염시킨 다음 SnPP를 12시간 처리하거나 처리하지 않았다. A: HO-1 및 HIF-1α의 단백질 레벨을 RT-PCR 및 웨스턴블롯으로 조사한 결과이다. B: 12시간 5μM MG132로 처리한 HUVEC의 세포 용해질에서 HIF-1α 유비퀴틴화를 조사한 결과이다. C: PHD 활성을 조사하기 위해 세포 용해질에서 [³⁵S]methionine-labeled VHL 단백질과 정제된 GST-ODD 도메인의 상호작용을 조사하여 나타낸 결과이다. D: Hsp90α와 HIF-1α의 상호작용을 Hsp90α 항체로 면역침강하여 조사한 결과이다. E: 세포 용해질을 수크로오스 농도 구배 상에서 초원심분리하여 수득한 분획의 흡광도를 254㎚에서 조사하여 나타낸 그래프이다. F: 16 ~ 22 분획 샘플에서 polysome-결합 HIF-1α mRNA의 레벨을 분석하여 나타낸 그래프이다. 결과값은 평균±SD(n=3)로 나타내었다. **P<0.01. G: HIF-1α의 핵 전이를 면역조직화학법으로 조사한 결과이다. Scale bar = 25㎛. H: pGL3-VEGF-Luc로 형질감염시킨 HUVEC에서 luciferase reporter 활성(평균±SD, n=3)을 조사하여 나타낸 그래프이다. **P<0.01. I: VEGF의 발현레벨을 RT-PCR 및 웨스턴블롯으로 조사하여 나타낸 결과이다. VEGF, vascular endothelial growth factor; SnPP, tin-protoporphyrin IX; PHD, prolyl hydroxylase domain protein; VHL; von Hippel-Lindau; GST-ODD; HSP90, heat shock protein 90.
도 4는 miR-101이 Keap1을 S-니트로실화시켜 VEGF의 발현을 증가시킨다는 것을 나타낸다. mir-101 또는 C-mir를 함유하는 pSilencer 2.1-U6 벡터로 형질감염된 HUVEC을 SnPP, 항-VEGF 항체 및 L-NAME과 함께 또는 그대로 배양하였다. A: DAF-FM을 사용하여 공초점 현미경으로 세포 내 NO 레벨(평균±SD, n=3)을 조사하여 나타낸 그래프이다. **P<0.01. B: S-니트로실화 단백질 detection kit를 사용하여 Keap1의 S-니트로실화를 조사한 결과이다. C: Keap1 또는 Nrf2에 대한 항체로 면역침강한 후 웨스턴블롯으로 Keap1과 Nrf2의 상호작용을 조사한 결과이다. D: pGL3-HO-1-Luc로 형질감염시킨 세포 용해질에서 luciferase 활성(평균±SD, n=3)을 조사하여 나타낸 그래프이다. *P<0.05. E: 웨스턴블롯으로 HO-1, HIF-1α 및 VEGF의 단백질 레벨을 조사하여 나타낸 결과이다. F: 면역조직화학법으로 HIF-1α의 핵 축적을 조사하여 나타낸 결과이다. Scale bar = 25㎛. L-NAME, N ^G-nitro-L-argininemethylester; NO, nitricoxide.
도 5는 miR-101이 HO-1-매개 VEGF 발현을 통해 혈관신생을 촉진한다는 것을 나타낸다. HUVEC을 pSilencer 2.1-U6/mir-101 또는 pSilencer 2.1-U6/C-mir의 둘 중 하나, 또는 대조군 또는 HO-1 siRNA와 함께 24시간 형질감염시키고, SnPP와 항-VEGF를 처리하거나 처리하지 않았다. A: 혈관신생 신호전달 분자들의 인산화를 웨스턴블롯으로 분석한 결과이다. B 및 C: [³H]-thymidine incorporation, Boyden 챔버 및 위상차 현미경을 사용하여 각각 세포 증식, 이동 및 관 형성을 분석한 결과이다. 결과값은 평균±SD(n=3)으로 나타내었다. *P<0.05 및 **P<0.01 vs. miR-101 단독. D: 야생형, HO-1^+/- 및 eNOS^-/- 마우스의 대동맥 고리에 mir-101 또는 C-mir을 함유하는 렌티바이러스로 형질도입하고 마트리겔(Matrigel) 상에서 18시간 동안 SnPP와 항-VEGF를 처리하거나 처리하지 않았다. 대동맥 고리 테두리의 내피 발아 면적을 정량한 결과이다. 결과는 평균±SD(n=그룹 당 6~8개의 대동맥 고리, 서로 다른 마우스에서 2개의 대동맥 고리 준비)로 나타내었다. *P<0.05, **P<0.01. E 및 F: mir-101 또는 대조군 mir(C-mir)을 함유하는 렌티바이러스로 형질감염된 HUVEC을 마트리겔과 혼합하여 누드 마우스에 피하이식하였다. 7일 후 수득한 마크리겔 플러그의 사진(E)과 헤모글로빈을 정량한 그래프(F)이다. 결과는 평균±SD(n=4)로 나타내었다. **P<0.01.
도 6은 허혈 마우스 뒷다리에서 저산소 반응성 miR-101이 신혈관 형성 및 혈류 개선을 증가시킨다는 것을 나타낸다. A 및 B: 넙다리동맥(femoral artery)을 결찰한 마우스 및 대조군 마우스로부터 수술 24시간 및 48시간 후에 장딴지근을 취하여, miR-101의 레벨(A)과 Cul3 mRNA의 레벨(B)을 qRT-PCR(n=그룹 당 5마리)로 분석한 그래프이다. C: Cul3, Nrf2, HO-1 및 VEGF 단백질 레벨을 웨스턴블롯으로 분석한 결과이다. D ~ G: 마우스의 넙다리동맥 결찰 후 mir-101 또는 대조군 mir(C-mir), antagomiR-101(Ant-101) 또는 대조군 antagomiR(C-Ant)를 함유하는 렌티바이러스를 주사하였다. D: 뒷다리 허혈 후 0일 및 21일째 마우스의 laser-Doppler perfusion 이미지이다. E: 혈류 개선을 정량한 그래프이다. F: 허혈 마우스 뒷다리의 장딴지근 횡단면에서 CD31-양성 모세혈관을 면역형광 이미지로 나타낸 것이다. Scale bar = 50㎛. G: 관 밀도를 정량한 그래프이다. 결과는 평균±SD로 나타내었다. *P<0.05, **P<0.01.
도 7은 본 발명에서 입증된 miR-101이 혈관신생을 촉진하는 과정을 도식화한 것이다. 저산소증은 miR-101의 발현을 증가시키고, 이 miR-101은 Cul3 mRNA의 3'UTR에 결합한다. Cul3 레벨의 감소는 Nrf2/HO-1 axis를 활성화하고 CO, biliverdin 및 bilirubin을 생산하기 위해 heme를 분해한다. 이들 산물은 HIF-1α의 안정화와 VEGF의 발현을 유도한다. VEGF/eNOS/NO-의존적인 Keap1의 S-니트로실화를 통해 Nrf2/HO-1 경로를 증폭하는 양성 피드백이 존재한다. CO, carbon monoxide; eNOS, endothelial nitric oxide synthase.
도 8은 miR-101의 표적을 컴퓨터 분석으로 예측한 것이다. A: TargetScan, microRNA.org 및 miRDB로 컴퓨터 분석된 mRNA에서 Cul3가 표적임을 예측한 밴다이어그램이다. 신뢰도가 높은 표적을 선별하기 위해 TargetScan 및 miRDB에서는 cutoff score를 ≤-0.1로, microRNA.org에서는 ≥60으로 하였다. B: 인간의 큘린 유전자 패밀리의 3'UTR에서 가능한 결합 부위를 비교한 것이다. C: 마우스 Cul3의 3'UTR에서 마우스 miR-101의 가능한 결합 부위를 비교한 것이다. D: 리포터 분석에 사용된 Cul3 3'UTR 돌연변이의 서열이다.
도 9는 HO-1의 활성에서 miR-101 전구체의 효과를 나타낸다. HUVEC를 0.5 및 1㎍/㎖의 pSilencer 2.1-U6/pre-miR-101(mir-101) 또는 pSilencer 2.1-U6/C-mir(C-mir)으로 24시간 형질감염시키거나 또는 그대로 12시간 새로운 배지에서 배양하였다. A: qRT-PCR로 완성형 miR-101의 레벨을 분석한 그래프이다. B: bilirubin의 생성을 측정함으로써 HO-1 활성을 분석한 그래프이다. 결과값은 평균±SD(n=3)로 나타내었다. **P<0.01.
도 10은 저산소증 및 miR-101에 의해 HO-1이 유도되는 과정에서 Nrf2의 효과를 나타낸다. HUVEC를 대조군(siCtrl) 및 Nrf2 siRNA(siNrf2)로 또는, pSilencer 2.1-U6/mir-101 또는 pSilencer 2.1-U6/C-mir, antagomiR-101(Ant-101) 또는 대조군 antagomiR(C-Ant)와 함께 24시간 형질감염시키고, 정상조건(A) 또는 저산소 조건(B)로 12시간 유지시켰다. 표적 단백질의 레벨을 웨스턴블롯으로 분석한 결과이다.
도 11은 HIF-1α-의존적 VEGF 발현 및 in vitro 혈관신생에 있어서 HO-1 작용 생성물의 효과를 나타낸다. HUVEC을 50μM CORM-2(CO-배출 물질), biliverdin(BV), bilirubin(BR) 또는 FeCl₂로 처리하였다. A: 12시간 후 HIF-1α 및 VEGF 단백질 레벨을 웨스턴블롯으로 분석한 결과이다. B: 마트리겔 상에서 EC의 관 형성을 위상차 현미경으로 촬영한 사진이다.
도 12는 mir-101을 함유하는 렌티바이러스가 miR-101의 발현을 통해 Cul3를 표적화하고 HO-1/VEGF axis를 활성화한다는 것을 나타낸다. HUVEC을 mir-101을 함유하는 렌티바이러스(Lenti-mir-101) 또는 대조군 mir 렌티바이러스(C-Lenti-mir)로 6시간 형질감염시키고 12시간 새로운 배지에서 배양하였다. miR-101의 발현레벨(A)과 표적 유전자의 발편레벨(B)를 qRT-PCR 및 웨스턴블롯으로 분석한 결과이다.
도 13은 miR-101이 HO-1/VEGF axis를 통해 마우스 대동맥 고리의 내피세포 성장을 촉진한다는 것을 나타낸다. 야생형, HO-1^+/- 및 eNOS^-/- 마우스의 대동맥 고리를 miR-101 또는 대조군 mir(C-mir)을 함유하는 렌티바이러스로 형질감염시키고 SnPP와 중화 VEGF 항체가 존재하거나 없는 마트리겔 상에서 37℃ 18일간 배양한 다음 대동맥 고리의 발아 이미지를 촬영한 것이다. Scale bar = 0.5㎛.
도 14는 본 발명의 일실시예에 따른 miR-101의 발현벡터(pSilencer 2.1-U6/pre-miR-101) 지도이다. pSilencer^TM 2.1-U6 neo 벡터의 BamHI 및 HindIII 제한효소 인식부위 사이에 pre-miR-101 서열을 삽입한 형태이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.

< 실시예 >

1. 실험재료 및 방법

1-1. 세포배양 및 처리

HUVEC의 배양은 기존의 배양방법에 따랐다(53). 1㎍/㎖의 발현벡터(pSilencer 2.1-U6, psiCHECK™-2 및 pGL3)와 100nM의 HO-1 siRNA, antagomir-101 또는 대조군 miRNA로 형질감염(transfection)시켰으며, 마이크로포레이터(microporator)를 사용하여 24시간 수행하였다. 20μM SnPP, 1mM L-NAME 또는 0.5㎍/㎖ VEGF의 중화항체(neutralizing antibody)는 12시간 처리하였다. 각 세포는 이후 분석에 사용하였다.

1-2. 저산소증 처리

세포를 저산소 챔버(Coy Laboratory Products Inc.)에 두고 94% N2와 5% CO2를 함유하는 혼합가스를 주입하였다. 이 조건하에서 배지의 O₂ 레벨은 2±1%로 하였다.

1-3. 플라스미드 확립

pre-miR-101 발현벡터인 pSilencer 2.1-U6/pre-miR-101을 제작하기 위해, 인간의 pre-miR-101 올리고뉴클레오티드를 바이오니아(Bioneer, Daejeon, Korea)에서 구입하고 pSilencer 2.1-U6(Invitrogen Life Technologies)의 BamHI 및 Hind III 부위에 클로닝하였다.

Cul3의 3'UTR은 인간의 게놈 DNA으로부터 다음 프라이머를 사용한 PCR을 수행하여 준비하였다.

5'-GGACTCGAGCCCTGCCCCTAAATATATATTTTGGTG-3' (forward)

5'-GGAGCGGCCGCGTACTACTCAAGTATGGTAAAAGTGTCCTG-3' (reverse)

PCR 산물을 정제하고, XhoI 및 NotI을 처리한 다음, 다시 정제하여 psiCHECK™-2 벡터(Promega, Fitchburg, WI)에 접합(ligation)하였다. 루시퍼라제(luciferase) 리포터 벡터인 pGL3-HO-1-Luc와 pGL3-VEGF-Luc는 프로모터 활성 분석을 위해 사용하였다. GFP 또는 GFP-pre-miR-101을 함유한 렌티바이러스 입자(Lentiviral particle)는 Thermo Fisher Scientific Inc(Pittsburgh, PA)에서 얻었다.

1-4. 생화학적 분석

세포질 및 핵 조각 뿐만 아니라 전체 세포 용해질에서 표적단백질의 웨스턴 블롯을 기존의 방법에 따라 수행하였다. Keap1의 S-니트로실화는 S-nitrosylated protein detection kit(No. 10006518, Cayman)를 사용하여 제조사의 프로토콜에 따라 측정하였다. 세포 내 NO 레벨은 DAF-FM diacetate를 사용하여 기존 프로토콜에 따라 측정하였다.

1-5. 면역조직화학법 및 관 밀도

HUVEC를 상온에서 15분간 3.7% 포름알데히드에서 고정하고, 세척한 다음 0.1% 사포닌으로 permeabilization하였다. 세포를 Nrf2 및 HIF-1α에 대한 항체(1:100)와 2시간 반응시킨 다음 Alexa Fluor 항체(1:200, Invitrogen)와 반응시켰다. 핵 염색을 위해 세포를 DAPI(1㎍/㎖, Sigma, MO)와 30분간 반응시켰다. 이후 전사인자들의 핵 전이를 공초점 현미경으로 관찰하였다. 관 밀도 측정을 위해 허혈 마우스의 뒷다리에서 장딴지근(gastrocnemius)을 절개해 내고, 관상 절단면(10㎛)을 포르말린으로 고정한 다음 Texas Red-conjugated mouse CD31 항체(DB Pharmingen, San Diego, CA)로 혈관을 염색하였다.

1-6. In vitro 혈관생성 분석

HUVEC을 pSilencer 2.1-U6/pre-miR-101 또는 HO-1 siRNA와 조합하여 형질감염시킨 다음 SnPP 그리고 VEGF 중화 항체를 처리하였다. HUVEC의 증식, 이동 및 관 형성은 기존의 방법에 따라 분석하였다(55).

1-7. Ex vivo 대동맥 및 마트리겔 플러그 분석

모든 동물 연구는 강원대학교의 동물실험윤리위원회의 승인에 따라 진행하였다.

생후 7주된 암컷 C57Bl/6J 마우스(Orient, Sungnam, Korea)의 대동맥에 GFP 또는 GFP-pre-miR-101을 함유하는 렌티바이러스(lentivirus)를 형질도입하고, 37℃에서 21일간 배양하였다. 생성된 관의 길이를 기존의 방법에 따라 정량하였다(56). 마트리겔 플러그(Matrigel plug) 분석을 위해 HUVEC에 렌티바이러스(MOI = 4)를 형질도입하고 마트리겔과 혼합하였다. 1×10⁶의 세포를 함유하는 마트리겔(400㎕)을 누드 마우스(생후 7주된 수컷)에 피하 주입하였다. 7일 후 마트리겔 플러그를 떼어내고 디지털 현미경으로 촬영하였다.

1-8. 뒷다리 허혈

GFP 또는 GFP-pre-miR-101을 함유하는 렌티바이러스와 antagomir-101을 생후 8주된 암컷 C57Bl/6J 마우스의 오른쪽 장딴지근에 ketamine(100mg/kg)과 xylazine (2mg/kg)으로 마취한 상태에서 3번의 주사(마우스 당 총 2.5×10⁶의 바이러스 입자가 함유된 50㎕, antagomir-101 총 8㎎/㎏)로 도입하였다. 30분 후, 심부 넙다리동맥에 인접하는 표피 넙다리동맥과 말초 넙다리동맥의 이중 결찰을 수행하여 일측정 넙다리동맥 폐색(unilateral femoral artery occlusion)을 유도하였다. 또한 뒷다리 허혈 후 7일 및 14일에 8㎎/㎏의 antagomir-101을 i.v. 주사하였다. 대조군도 동일한 외과적 처리를 수행하였으나, 넙다리동맥을 결찰하지 않았다. 각 뒷다리의 혈류는 laser-Doppler perfusion imaging(Moor Instruments, Axminster, UK)으로 조사하였다. 각 실험군 사이의 폐색/비폐색 다리의 유량비를 비교하였다. miR-101 분석, 표적 유전자 발현 및 면역조직화학 실험을 위해 장딴지근을 떼었다.

1-9. 통계적 분석

최소 3회 독립적으로 수행된 정량적 실험결과를 평균±표준편차(SD)로 나타내었다. 통계적 유의성은 분석된 실험그룹의 수에 의존적인 1-way ANOVA 또는 독립 스튜던트 T 검정(1-tailed)을 사용하여 결정하였다. 유의성은 P value < 0.05으로 설정하였다.

2. 실험결과

2-1. 저산소-유도 miR-101은 HUVEC에서 Cul3의 발현을 조절한다.

저산소증이 miR-101 생성을 조절하는지 확인하기 위하여, HUVEC(human umbilical vascular endothelial cell)을 정상산소 조건과 저산소 조건에 노출시키고, real-time PCR을 통해 miR-101의 발현 레벨을 조사하였다. 정상산소 조건과 비교하여 저산소 조건에서 6시간 째에 miR-101의 발현이 약 3.5배 증가하였고, 12시간 째에는 더 이상의 증가가 없었으며(도 1A 및 B), 이러한 증가 양상은 HIF-1α을 넉다운시킬 경우 차단되었다(도 1C). 인간의 뇌 미세혈관 내피세포에서도 저산소-유도 miR-101 발현에서 유사한 반응을 나타냈고, 별아교세포(astrocyte), HeLa 및 U937을 포함하는 다른 세포에서도 증가하였다(도 1A). 흥미롭게도, 정상산소 조건의 HeLa 세포에서 miR-101의 기본 레벨이 정상산소 조건의 다른 세포들에 비해 유의적으로 높았다(도 1A).

다음으로 TargetScan, microRNA.org 및 miRBase를 이용하여 miR-101의 기능적인 표적을 예측하고자 하였다. 100가지 이상의 공통되는 표적 유전자들 사이에서 Cul3가 혈관신생을 조절하는 HO-1의 저산소-관련 발현에서 중요한 역할을 한다는 것이 알려져 있어(32), miR-101의 새로운 표적으로 선택하였다. Cul3가 miR-101의 실제 표적이 맞는지 확인하기 위하여, 저산소 조건에서 발현이 하향조절되는지 실험하였다. 이의 결과, 저산소증은 Cul3 mRNA의 발현 레벨을 감소시켰고, 이러한 현상은 antagomir-101을 형질도입하면 완전히 복구되었다(대조군 miRNA의 경우에는 복구되지 않았다)(도 1D). 이와 유사한 결과가 HUVEC의 Cul3 발현에서 관찰되었고, Cul3의 하위 표적인 HO-1의 발현이 조절되었다(도 1E).

컴퓨터 분석을 통해 Cul3 mRNA의 3'UTR에 miR-101을 위한 4개의 보존 부위가 포함되어 있는 것으로 판단하였고, 두 번째와 세 번째 부위가 다른 부위 보다 중요한 것으로 판단되었다(도 8B). 이에 따라 miR-101이 두 부위를 포함하는 Cul3 3'UTR 영역을 표적화하는지 조사하였다. 정상산소 조건에 비해 저산소 조건에서 Cul3의 3'UTR 활성이 감소하였고, 이 현상은 antagomir-101의 형질도입에 의해 역전되었다(대조군 miRNA의 경우에는 역전되지 않았다)(도 1F). 이러한 결과는 저산소-반응성 miR-101이 Cul3 3'UTR 활성을 불안정화하여 Cul3의 발현을 저해한다는 것을 나타낸다.

2-2. miR-101은 Cul3를 직접적으로 표적화하여 Nrf2-의존적 HO-1의 발현을 상위조절한다.

Cul3는 Nrf2-Keap1 시스템으로부터 Nrf2의 유비퀴틴화-매개 프로테오소말 분해를 통해 HO-1을 음성적으로 조절하는 E3 ligase 복합체의 골격 단백질이므로(33), Cul3의 하향조절에 의한 Nrf2-의존적 HO-1의 발현에서 miR-101의 기능적인 역할을 확인하기 위한 실험을 실시하였다. 이의 결과 miR-101 전구체 발현 벡터를 형질도입하면 대조군에 비해 Cul3 3'UTR 활성이 저해되었다(도 2A). 예상했던 바와 같이, miR-101 전구체의 과발현은 Cul3 mRNA와 단백질 레벨을 감소시켰고, 이에 따라 HO-1 발현을 증가시켜(도 2B), HO-1 효소 활성을 증가시켰다(도 9).

생화학적 방법을 사용하여 miR-101이 Cul3-기초 E3 ligase 활성의 조절을 통해 Nrf2-의존적 HO-1의 발현을 유도하는지를 조사하였다. 이의 결과, miR-101이 대조군과 비교하여 Nrf2의 유비퀴틴화를 유의적으로 저해하고(도 2C), Nrf2의 반감기가 약 5배 증가(46 vs. 228분)하는 것을 확인하였다(도 2D). 또한, miR-101의 과발현으로 인해 Keap1과 Nrf2의 상호작용이 현저히 저해되는 것으로 나타났다(도 2E). 이러한 저해의 결과로, miR-101이 Nrf2의 핵 전이를 증가시키는 것을 공초점현미경(confocal microscopy)을 통해 확인하였다(도 2F).

다음으로 HO-1 프로모터 활성화에서 miR-101에 의해 축적되는 핵 Nrf2의 기능적 역할을 조사하였다. CHIP 분석을 통해 miR-101을 과발현하는 HUVEC에서 Nrf2가 HO-1 프로모터에 기능적으로 결합하는 것이 증가하는 것으로 나타났다(도 2G). 또한, luciferase 리포터 분석으로 miR-101이 대조군과 비교하여 HO-1 프로모터의 전사 활성을 유의적으로 증가시키는 것으로 나타났다(도 2H). 이러한 결과는 miR-101이 Cul3 3'UTR의 직접적인 표적화를 통해 Nrf2-의존적 HO-1의 발현을 증가시킨다는 것을 나타낸다.

2-3. miR-101은 HO-1을 유도하여 HIF-1α-매개 VEGF의 발현을 촉진한다.

HO-1의 작용으로 생성되는 일산화탄소는 HIF-1α 단백질의 번역 활성화와 안정화의 두 가지 매커니즘을 통해 HIF-1α 단백질 레벨을 증가시켜 VEGF의 발현을 증가시킨다(7). 우리는 miR-101이 VEGF의 발현에서 중요한 역할을 하는 HIF-1α의 HO-1-매개 안정화를 일으키는지 조사하였다. miR-101이 과발현되는 HUVEC에서 HO-1의 발현이 상위조절되었고, 이에 따라 HIF-1α 단백질이 안정화되었으며, 이러한 현상은 HO-1 siRNA의 형질도입으로 저해되었다(도 3A). 이러한 결과는 miR-101이 HO-1 의존적인 방법에서 HIF-1α 단백질의 번역 후 증가를 조절한다는 것을 의미한다. 반면, miR-101은 PHD(정상산소 조건에서 HIF-1α의 유비퀴틴화-의존적 분해의 중요 제한효소이다)(34)의 활성에 영향을 미치지 않으면서 HIF-1α의 유비퀴틴화를 저해하였고, 이러한 현상은 HO-1이 넉다운되면 전환되었다(도 3B, C). 이는 miR-101이 HO-1에 의존적으로 HIF-1α 단백질 레벨을 높이지만, PHD에 독립적인 방법을 통한다는 것을 나타낸다. HSP90α가 물리적으로 HIF-1α와 상호작용하여 HIF-1α의 유비퀴틴화를 저해하고 이에 따라 PHD-독립적 분해로부터 HIF-1α를 보호하기 때문에(7), 우리는 HSP90α와 HIF-1α의 상호작용에서 miR-101의 효과를 조사하였다. miR-101의 과발현은 HIF-1α와 HSP90α의 상호작용을 높였고, 이들 상호작용은 HO-1 저해제인 tin-protoporphyrin IX(SnPP)에 의해 부분적으로 방해되었다(도 3D). 흥미롭게도, miR-101은 고분자량의 polysome 복합체의 형성을 증가시켰는데, 이는 16 ~ 22 합동 polysome 분획에서 HIF-1α mRNA의 레벨이 높은 것과 관련이 있고, 이러한 효과는 SnPP를 함께 처리하면 감쇠되었는데(도 3E, 3F), 이는 HIF-1α mRNA의 번역활성이 증가한다는 것을 반영한다. 결과적으로 miR-101은 HIF-1α의 핵 축적을 증가시키고, 이것은 SnPP와 HO-1 siRNA를 함께 처리하면 효과적으로 억제된다(도 3G). 추가로, miRNA-101은 VEGF의 프로모터 활성과 발현을 유의적으로 증가시키며, 이 두 효과는 SnPP와 HO-1 siRNA에 의해 감소된다(도 3H, I). HO-1의 부산물인 CO, biliverdin 및 bilirubin(Fe²⁺는 제외)은 HIF-1α 및 VEGF의 단백질 레벨 뿐만 아니라 관 형성을 증가시킨다(도 11A, B). 이러한 결과는 miR-101이 HIF-1α 단백질을 안정화하고 VEGF의 발현 및 HO-1의 발현과 이것의 반응산물의 증가에 의한 혈관형성을 유도한다는 것을 나타낸다.

2-4. miR-101은 Keap1을 S-니트로실화하여 HO-1 활성 및 VEGF/eNOS 축 사이의 양성 피드백 순환을 통해 VEGF의 발현을 증폭시킨다.

VEGF는 EC에서 eNOS-유도 NO 생산을 촉진하고, NO는 단백질 티올의 변형을 통해 다양한 생리적 시스템에서 중요한 역할을 한다(35, 36). 우리는 EC의 세포내부 NO 레벨 상에서 miRNA-101의 효과를 조사하였다. miRNA-101을 발현하는 HUVEC는 NO 생산이 유의적으로 증가하는 것으로 나타났고, 이는 SnPP, VEGF 중화 항체 및 NOS 저해제인 N^G-nitro-L-arginine methyl ester(L-NAME)의 처리로 인해 저해되었다(도 4A). 다음으로 우리는 S-니트로실화 검출 키트를 사용하여 Keap1의 자유 티올 그룹의 NO-매개 변형 상에서 miR-101의 효과를 조사하였다. miRNA-101은 HUVEC에서 Keap1의 S-니트로실화를 증가시켰고, 이는 SnPP, 항-VEGF 항체 및 L-NAME에 의해 저해되었다(도 4B). 또한, miR-101은 Keap1-Nrf2 복합체의 형성을 유의적으로 저해하였고, 이러한 효과는 L-NAME에 의해 방해되었다(도 4C). 우리는 miR-101-매개 HO-1의 발현과 VEGF의 생산에서 NO의 역할을 조사하였다. miR-101-매개 HO-1 프로모터 활성의 증가는 항-VEGF 항체 및 L-NAME에 의해 저해되었다(도 4D). 웨스턴 블롯 분석 결과, miR-101에 의한 HO-1, HIF-1α 및 VEGF 발현의 증가 또한 항-VEGF 항체와 L-NAME을 함께 처리하면 억제되었다(도 4E). 이와 유사하게, miR-101-매개 HIF-1α 핵 축적 증가가 항-VEGF 항체 및 L-NAME에 의해 저해되었다(도 4F). 이러한 결과는 miR-101에 의해 HO-1이 발현됨에 따라 VEGF의 생산이 증가하고, 이는 eNOS-유래 NO가 Keap1의 S-니트로실화 및 이에 따른 Nrf2 활성화를 유도하는 양성 피드백 과정을 통해 이루어진다는 것을 나타낸다.

2-5. miR-101은 in vitro 및 ex vivo 상에서 혈관생성을 촉진한다.

miRNA-101이 HO-1의 유도를 통해 VEGF의 생산을 증가시킨다(도 3 및 4)는 우리의 결과를 기초로, 우리는 혈관생성 신호 매개인자들의 활성화(7) 상에서 miR-101의 효과를 조사하였다. miR-101의 과발현은 VEGF receptor-2 KDR 및 이의 하위 작용인자들(Src, FAK, Akt, eNOS 및 ERK를 포함)의 인산화를 증가시켰고, 이러한 효과는 HO-1 siRNA, SnPP 및 항-VEGF 항체에 의해 유의적으로 억제되었다(도 5A). 예상한 바와 같이, miRNA-101은 HUVEC의 증식, 이동 및 관 형성을 유의적으로 증가시켰고, 이들 효과는 HO-1 siRNA, SnPP 및 항-VEGF 항체에 의해 효과적으로 억제되었다(도 5B, C). mir-101 렌티바이러스로 형질감염된 마우스 대동맥 고리(HUVEC에서 성숙형 miR-101의 발현하고 Cul3-매개 HO-1/VEGF axis를 활성화하는 것으로 확인됨. 도 12A, B)는 대조군 대동맥 고리에 비해 더 길고 더 풍부한 발아가 유도되었다. 이러한 효과는 SnPP와 항-VEGF 항체의 처리로 차단되었다(도 5D 및 도 13). 또한 miR-101의 혈관생성 sprout 활성은 HO-1^+/- 및 eNOS^-/- 마우스의 대동맥 링에서 유의적으로 감소하였다(도 5D 및 도 13). 이러한 결과는 miRNA-101이 HO-1과 eNOS 경로 사이의 교차 상호작용을 통해 VEGF의 생산을 증폭함으로써 혈관생성을 촉진한다는 것을 나타낸다. 우리는 추가로 누드 마우스의 마트리겔 플러그 분석을 통해 기능적 맥관구조 발달에서 miR-101의 역할을 연구하였다. mir-101-과발현 HUVEC 플러그는 암적색으로 나타났고(도 5E), 헤모글로빈 함량 측정을 통해 온전한 적혈구(RBC)로 풍부하게 채워져있는 것으로 나타났다(도 5F). 한편, 대조군 mir이 발현되는 HUVEC 플러그는 마트리겔 단독의 경우와 비교하여 엷은 색이고 RBC가 매우 적게 유입되었다(도 5E, F). 이러한 결과는 miR-101이 in vivo 혈관신생을 통해 기능적 맥관구조를 촉진할 수 있다는 것을 나타낸다.

2-6. 저산소-반응성 miR-101은 혈관신생을 촉진한다.

다음으로 우리는 miR-101의 발현이 허혈성 뒷다리 모델에서 조절되는지를 조사하였다. miR-101의 레벨은 결찰(ligation) 후 24 및 48시간이 지난 다음 수득한 비복근(장딴지근)에서 샴-처리(sham-operated) 근육(대조군)에 비해 8 및 2배 증가하였다(도 6A). 예상했던 바와 같이, Cul3 단백질 레벨은 결찰한 뒷다리 근육에서 샴 조직에 비해 효과적으로 억제되었다(도 6B, C). 또한, Nrf2, HO-1 및 VEGF의 단백질 레벨은 결찰 조직에서 인상적으로 증가하였다(도 6C). 이러한 발현 변화는 antagomiR-101의 처리로 복원되었다(도 6B, C). 이에 더하여 우리는 뒷다리의 허혈 이후 혈관신생 및 혈류에서 저산소-반응성 miR-101의 in vivo 상에서의 역할을 조사하였다. miR-101-발현 렌티바이러스를 처리한 마우스에서 대조군 바이러스를 형질도입한 마우스에 비해 허혈성 뒷다리의 혈류가 유의적으로 개선되었다(도 6D, E). 이에 반해, antagomir-101을 처리한 마우스는 대조군과 비교하여 허혈성 뒷다리의 관류회복이 감소하는 것으로 나타났다(도 6D, E). 관류회복이 개선되는 것과 일치하여, miR-101을 처리한 마우스의 허혈성 근육은 대조군(mock-treated) 마우스 보다 높은 모세관 밀도를 나타냈다. 또한, antagomir-101 처리로 허혈성 뒷다리의 모세관 수가 감소하였다(도 6F, G). 종합하여 우리의 연구결과는 miR-101이 기능적 혈관생성을 촉진하고, 뒷다리 허혈 이후 혈류 개선에 관여한다는 것을 나타낸다.

<110> KNU-Industry Cooperation Foundation <120> Hypoxia-responsive microRNA-101 promotes angiogenesis via heme oxygenase-1/VEGF axis by targeting Cullin 3 <130> PA140417-C02 <160> 4 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 1 uacaguacug ugauaacuga a 21 <210> 2 <211> 51 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 2 uacaguacug ugauaacuga auucaagaga uucaguuauc acaguacugu a 51 <210> 3 <211> 774 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Met Leu Arg Ile His Phe Phe Ser Phe Ser Phe Asn Leu Ser His Asp 1 5 10 15 Val Val Leu Ser Val Ile Thr Glu Pro Ser Arg Cys Met Thr Met Asp 20 25 30 Glu Lys Tyr Val Asn Ser Ile Trp Asp Leu Leu Lys Asn Ala Ile Gln 35 40 45 Glu Ile Gln Arg Lys Asn Asn Ser Gly Leu Ser Phe Glu Glu Leu Tyr 50 55 60 Arg Asn Ala Tyr Thr Met Val Leu His Lys His Gly Glu Lys Leu Tyr 65 70 75 80 Thr Gly Leu Arg Glu Val Val Thr Glu His Leu Ile Asn Lys Val Arg 85 90 95 Glu Asp Val Leu Asn Ser Leu Asn Asn Asn Phe Leu Gln Thr Leu Asn 100 105 110 Gln Ala Trp Asn Asp His Gln 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atcaattgta ggtcatgtat tttactatat 5760 gttgcatagt attttgcatt ctgtaaatac gaatgttaaa acatttcagg tcagcaaaat 5820 tagaagtcat ttctagtcct caaagcagaa ataattagaa atgttaacat ttaagtgctt 5880 atcatatgcc agatactatt ctgaatattt tatgtatatt cattcattta gttgtcatat 5940 tggctttatg tgacataact gtcattatac cagtgttgtc caaggttgct agcaggaaat 6000 ggcagagcca ggagttggac ctaggtttaa tcctatccat attccatgtt acaaattgac 6060 atgattttcc atattaaaaa attttcattt attttgtacc tcattcacat gaatagtaat 6120 gtgacaaact aaagttaata catgaagcat tgcaatatgg aattttgcac atttttgtta 6180 gctttacatt atttgctgat accaactttt ggtaggaagg aaaacaggga aggtgattgc 6240 tgctattctg gaatgtgtcc attgaaaaga aaataggcgc tttgtctcct acaatcttag 6300 agaaagtttt acatacttaa gtgggtacca cagataggca tgtaccttaa attcaaatct 6360 acagttttac aaaatgtttt cctttgtgtg cctttcctat gtcaaattag ccagaaggaa 6420 gaagagacgt taagaatggc agataaattt aacaggtaat gatacagaga ttggccatta 6480 cgccagctct caggagaaaa acaactagga tgtcttgaaa cccgtgcatt taattttaga 6540 aatggcaaat ttgtaagcgt gtcatttaag taatttgatg ctcagtttta gggtctaagt 6600 tgacctcgag tgagccatgc aaaaatagct ttaaaattat acatgagcag ctcaaagtaa 6660 acgtgtattt tttagtaaca atgaaattgt caaatttcaa gattttaata acaggacagt 6720 tcaactaata aactttattg catacaagat ttattgcaat gtgggaaaat taaaattctc 6780 agtctcagaa 6790

Claims (6)

1. 삭제
2. 삭제
3. 마이크로RNA-101(miRNA-101, miR-101) 또는 마이크로RNA-101의 효현제(agonist)를 유효성분으로 함유하여 큘린3(cullin3)를 저해하는 것을 특징으로 하는 허혈성 질환 치료용 약제학적 조성물로,
   상기 마이크로RNA-101의 효현제는
   a) 성숙한 마이크로RNA-101의 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드;
   b) 마이크로RNA-101의 pre-miRNA(전구체) 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드;
   c) 마이크로RNA-101의 pri-miRNA(초기전사체) 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드;
   d) 성숙한 마이크로RNA-101을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 함유하여 포유동물의 세포 내에서 성숙한 마이크로RNA-101을 발현하는 벡터;
   e) 마이크로RNA-101의 pre-miRNA를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 함유하여 포유동물의 세포 내에서 마이크로RNA-101의 pre-miRNA를 발현하는 벡터; 및
   f) 마이크로RNA-101의 pri-miRNA를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 함유하여 포유동물의 세포 내에서 마이크로RNA-101의 pri-miRNA를 발현하는 벡터; 중에서 선택된 것을 특징으로 하는 허혈성 질환 치료용 약제학적 조성물.
4. 삭제
5. 시험관내에서 마이크로RNA-101(miR-101)을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 단리된 세포에 후보물질을 처리하는 단계; 및
   후보물질이 처리된 단리된 세포에서 마이크로RNA-101(miR-101)의 발현을 분석하고, 후보물질을 처리하지 않은 단리된 대조군 세포의 마이크로RNA-101(miR-101)의 발현 양상과 비교하는 단계;를 포함하는 혈관신생 촉진제 스크리닝 방법.
6. 시험관내에서 마이크로RNA-101(miR-101)을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 단리된 세포에 후보물질을 처리하는 단계; 및
   후보물질이 처리된 단리된 세포에서 마이크로RNA-101(miR-101)의 발현을 분석하고, 후보물질을 처리하지 않은 단리된 대조군 세포의 마이크로RNA-101(miR-101)의 발현 양상과 비교하는 단계;를 포함하는 허혈성 질환 치료제 스크리닝 방법.
   

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