KR101223359B1 - 아트라릭산의 분리, 아트라릭산 유도체의 합성, 및전립선비대증, 전립선암종 및 척수연수 근위축증의 치료를위한 아트라릭산 및 그 유도체의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 생물학적 재료로부터 아트릭산을 분리하는 방법, 아트라릭산 유도체, 그들의 화학적 합성 및, 전립선비대증, 전립선암종, 또는 척수연수 근위축증의 치료 또는 치료용 약제의 제조를 위한 아트라릭산 및 그 유도체의 용도, 및 전립선비대증, 전립선암종, 또는 척수연수 근위축증 치료용의 다른 약제의 개발을 위한 기초 물질로서 아트라릭산 및 그 유도체의 용도에 관한 것이다.

Description

아트라릭산의 분리, 아트라릭산 유도체의 합성, 및 전립선비대증, 전립선암종 및 척수연수 근위축증의 치료를 위한 아트라릭산 및 그 유도체의 용도{ISOLATION OF ATRARIC ACID, SYNTHESIS OF ATRARIC ACID DERIVATIVES, AND USE OF ATRARIC ACID AND THE DERITIVES THEREOF FOR THE TREATMENT OF BENIGN PROSTATE HYPERPLASIA, PROSTATE CARCINOMA AND SPINOBULBAR MUSCULAR ATROPHY}

본 발명은 생물학적 재료로부터 아트릭산의 분리, 아트라릭산 유도체, 그들의 화학적 합성뿐만 아니라, 전립선비대증(benign prostatic hyperplasia) 및/또는 전립선암종(prostate carcinoma), 특히 치료 내성 전립선암종, 및 척수연수 근위축증(spinobulbar muscular atrophy)의 치료 또는 치료용 약제의 제조를 위한 아트라릭산 및 그 유도체의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한 전립선비대증 및/또는 전립선암종, 특히 치료 내성 전립선암종, 및 척수연수 근위축증의 치료 또는 치료용으로 사용되는 약제의 제조를 위한, 신규 활성 물질의 개발에 있어서의 선도(lead) 물질로서 아트라릭산 및 그 유도체의 용도에 관한 것이다.

전립선비대증(BPH)은 전립선의 이행부위(transitional zone)에 있는 평활근 과, 연결 조직 및 선상피(glandular epithelium)의 양성(benign) 팽창이다. BPH로 60세 이상 남성의 50%가 고통받고 있으며, 75세 이상의 남성에게선 그 백분율이 75%에 달한다. 따라서, BPH는 남성에서 방광 기능장애의 가장 빈번한 형태의 원인이 된다.

BPH의 증상은 폐색성 및 자극성 호소증상(complaint)을 포함한다. 폐색성 증상은 소변량의 감소, 배뇨(micturation) 시간의 연장, 방울떨어짐(dribbling) 및 잔뇨를 포함하는 반면, 자극성 증상은 배뇨 빈도의 증가, 고통스런 배뇨, 및 절박 요실금으로 나타난다. BPH의 병인에 대해서는 다양한 가설이 현재 논의 중에 있다.

전립선암종은 서구 국가에서 남성들에게 영향을 미치는 가장 일반적인 암이고, 폐암 다음으로 가장 일반적인 암 사망의 두 번째 원인이 된다. 비록, 그 병인에 있어서, 전립선암종이 BPH와 직접적으로 관련되어 있지는 않지만, 심각한 형태의 BPH로 고통받는 환자들은 전립선암 환자와 매우 유사한 유전자 이상을 나타낸다. BPH는 전립선의 모든 이행부위 상에 영향을 미치는 반면, 암종은 주변구역(peripheral zone)에 빈번히 발생한다.

전립선암종의 발생에 대한 이유는 다양한 유전자 결함이며, 이는 가족의 소인(predisposition)에 기인한 것일 수 있다. 따라서, 안드로겐 수용체의 다양한 변이가 전립선암종으로 고통받는 사람들에게서 발생한다. 그러나, 5α-환원효소 타입 II의 활성의 감소는 암종의 발달의 위험성을 감소시킨다. 또한, 염색체 13 q 상에 있는 Rb 유전자와 같은, 상이한 종양 억제 유전자는 변이에 의해 영향받을 수 있고, 그에 따라 불활성으로 될 수 있다. 한편, 종양유전자의 기능항진이 종양 형성의 원인이 되기도 한다. 또한, 중요한 성장-조절 및 해독 유전자의 메틸화가 중요한 역할을 하며, 상기 유전자들은 그에 따라 기능할 수 없게 되고 암에 걸리기 쉽게 된다. 가장 최근의 과학 기술에 따르면, 발암전 또는 종양성 병변을 발산하는 염증 프로세스가 큰 기여를 한다.

전립선암종을 치료하기 위한 최초의 요법은 통상 라디칼 전립선절제술에 의한 전립선의 제거, 또는 변질된 세포를 제거하기 위한 방사선조사(irradiation)로 구성된다. 진행된 전이(metastasising) 전립선암종은 고식적(palliative) 호르몬 요법으로 치료할 수 있다. 전체 안드로겐 차단은, 근래에 적용된 것으로, 수술적 및 화학적 거세(거세)의 조합을 포함한다. 순수한 항남성호르몬제 비칼루타미드(Casodex^?), 플루타미드(Fugerel^?) 및 닐루타미드(Anandron^?)는 목표 장기의 안드로겐 수용체에 선택적으로 작용하는 반면, 사이프로테론 아세테이트(Androcur^?)는 또한 프로게스테론 수용체 및 글루코코르티코이드 수용체를 차지한다. 그러나, 호르몬 요법은 진행된 전립선암을 치료할 수 없다. 상기 치료는 처음에는 종양 성장의 항안드로겐-의존성 억제를 유발한다. 그러나, 2년 후, 평균적으로, 치료에 대한 내성이 발생한다. 우선, 다양한 보조활성인자(coactivator)의 과잉발현은 비-안 드로겐성 스테로이드를 통해 안드로겐 수용체의 활성화를 가능하게 한다. 나중에는, 활성 플루타미드 대사산물인, 2-하이드록시플루타미드와 같은 항안드로겐도, 안드로겐 수용체를 활성화할 수 있고, 또한 종양은 안드로겐에 비의존성이 된다.

따라서 본 발명의 목적은 BPH 및/또는 전립선암종을 치료하기 위한 신규의 활성 물질, 특히 안드로겐-비의존성(androgen-independent) 전립선암 세포의 성장도 억제하는 활성 물질을 발견하는 것이다.

척수연수 근위축증(spinobulbar muscular atrophy, SBMA)은 근위축증과 연관되고, 남성들에게서만 발생하는 유전성 신경 근육 질병 또는 신경변성질환이다. 척수에 위치하고, 그 프로세스가 근육으로 연장되는, 말초 운동뉴런(척수 전각 세포)의 사멸은, 근위축증, 근무력증(부전마비(pareses)), 불수의근 연축(섬유속성 연축(fasciculations)) 및 진전(떨림(tremor))을 초래한다. 근무력증은 처음에 근위 영역(상완, 대퇴)에 영향을 미친다. 만일 뇌간(bulbus)에 위치하는 운동뉴런, 다시 말해 대뇌피질과 척수에 대한 연결부에 있는 신경 세포에 영향을 미칠 경우, 말하는 근육, 씹는 근육, 및 삼키는 근육이 또한 약해진다. 게다가, 중추운동 시스템의 질병은 근육 긴장(경직 마비)의 증가를 초래한다.

척수연수 근위축증의 유전적 원인은 성-결정 X 염색체 상에 존재하는 안드로겐 수용체 유전자의 엑손 1에 있는 CAG 염기 트리플릿의 수의 증가에 있는 것으로 생각된다. 이는 안드로겐 수용체에 있는 폴리글루타민 영역의 확장을 초래한다. 그에 따라 병적으로 변성된 안드로겐 수용체는 시간이 갈수록 축적되고, 세포 핵 내에 세포함유물(inclusion)을 형성하며, 뉴런의 사멸을 초래하는 것으로 보인다.

세포 핵에 있는 병적으로 변성된 안드로겐 수용체의 리간드-의존성 축적은 척수연수 근위축증의 발병기전(pathogenesis)의 원인이다. 증가된 수의 CAG 염기 트리플릿을 갖는 인간의 안드로겐 수용체 유전자를 포함하는 트랜스제닉 마우스는 특히 수컷 실험 동물에서 현저한 신경운동 장애를 나타냈다. SBMA와 유사했던 이러한 랫트의 장애는 거세로 경감되거나, 테스토스테론의 투여로 악화될 수 있었다. 이러한 실험적 결과는 SBMA 환자에서 안드로겐 수용체의 불활성화가 질환의 진행을 경감할 수 있을 것이라는 가설을 도출하였다. 안드로겐 수용체의 응집에 대한 리간드 결합의 중요성은 또한 안드로겐 및 안드로겐 길항제의 보조로 실험되었다. 병적으로 변성된 안드로겐 수용체를 발현하는 세포를 테스토스테론으로 자극함으로써, 세포질에서 특징적인 세포함유물을 발생시켰다. 반대로, 이러한 세포를 부분적인 안드로겐 길항제 사이프로테론으로 처리한 경우, 적은 수의 세포함유물만이 관찰되었으며, 이들을 플루타미드로 처리한 경우 세포함유물이 전혀 관찰되지 않았다. 이러한 관찰은 안드로겐 길항제가 안드로겐 수용체 응집체의 형성을 예방할 수 있다는 가설을 지지한다. 그러나, 현재까지 안드로겐 수용체 응집체의 형성이 척수연수 근위축증의 진행에 대한 원인이 된다는 어떠한 증거도 없다.

따라서 본 발명의 다른 목적은 척수연수 근위축증의 치료를 위한 신규의 활성 물질을 발견하는 것이다.

본 발명의 목적은 아프리카 자두 나무(P. africana)의 나무껍질로부터 항안드로겐성 활성을 가지는 물질을 분리함으로써 달성되었다.

놀랍게도, 물질 아트라릭산은 P. africana의 나무껍질로부터 또는 P. africana의 나무껍질에 자생하는 지의류로부터 분리되었고, 이러한 물질이 높은 항안드로겐성 활성을 갖는 것으로 나타났다. 아트라릭산은 또한 하이드로플루타미드로 치료하는 것에 반응하지 않는 전립선암 세포의 성장을 억제할 수도 있다. 또한, 아트라릭산은 두 개의 에스트로겐 수용체(에스트로겐 수용체 알파(ERα) 및 에스트로겐 수용체 베타(ER β))에 대해 작용제(agonistic) 효과를 갖는 것으로 입증되었다.

독사조신(Cardura^?)과 같은 α 아드레날린수용체 차단제, 및 피나스테라이드(Propecia^?)와 같은 5α 환원효소 억제제와는 별도로, BPH의 약물 치료를 위한, 시판중인 다수의 식물성약제들(phytopharmaceuticals)이 있다. Debat사의 제제인 Tadenan^?은 Prunus africana (Hook. f.) Kalkm. (Pygeum africana)의 나무껍질로부터의 클로로포름 추출물을 함유한다. 상기 제제는 프랑스에서는 이미 1969년 이후로 전립선비대증의 치료용으로 승인받았고, 한편 이탈리아 및 미국에서도 널리 사용되고 있다. 그러나, 독일에서는 이러한 클로로포름 추출물이 승인되지 않았다. 그 나라에서는, 미국 톱 야자(Sabal serrulata = Serenoa repens, Permixon^?)의 열매, 쐐기풀(stinging mettle)(Urtica dioica)의 뿌리, 호박씨(Cucurbita pepo), 호밀 꽃가루(Secale cereale) 및 아프리카 백합(Hypoxis rooperi)의 뿌리로부터의 추출물 및 제제가 BPH의 치료용으로 승인받았다.

퇴화된 식물학의 분류학명으로 피지움 아프리카나(Pygeum africana)(Hook. f.)인, Prunus africana (Hook. f.) Kalkm.은, 장미과(Rosaceae ) 내의 앵두나무아과(subfamily of the Prunoideae )에 속한다. Prunoideae는 핵과류를 갖는 목본 식물을 포함한다. 벗나무 속(genus of Prunus)은 이러한 아과에서 가장 포괄적인 속이며, 이는 예를 들어, 체리(Prunus avium L.), 복숭아(Prunus persica L.), 자두(Prunus domestica L.) 및 아몬드(Prunus dulcis (Mill.) D.A. Webb)를 포함한다. 아프리카 자두 나무인, Prunus africana (Hook. f.) Kalkm.은 이러한 속 중 아프리카 대륙에서 발견되는 유일한 종이고, 따라서 그 성분의 관점에서 동일한 아과의 다른 식물들과는 상이하다.

본 연구의 목적은, Prunus africana의 나무껍질로부터 항-안드로겐성 활성 천연 물질을 분리하는 것이며, 그 이유는 그들의 작용의 정확한 강도를 포함하여, 모든 활성 물질들이 알려져 있을 때에만, 다수의 성분들을 함유하는 추출물이 표준화될 수 있고, 또한 그러한 추출물이 유기체에 더 큰 스트레스를 유발할 수 있기 때문이다. 다른 목적은 P. africana로부터 분리된 항안드로겐성 활성 물질을 기초로 하여, 신규의 항안드로겐성 활성 물질을 생산하는 것이다.

도 1은 P. africana 유래의 상이한 추출물에 의한 루시페라아제 분석에서 안드로겐의 활성의 억제를 도시한다.

도 2는 P. africana 유래의 선택적인 메틸렌 클로라이드 추출물 분획의 항안드로겐성 작용을 도시한다.

도 3은 선택적인 메틸렌 클로라이드 추출물의 분획 F8로부터 분리된 화합물의 항안드로겐성 작용을 나타낸다.

도 4는 아트라릭산에 의한 인간 전립선암종 세포의 성장 억제를 나타낸다.

도 5는 아트라릭산(AA) 및 아트라릭산 유도체(A1 내지 A6)의 구조식을 나타낸 것이다.

도 6은 10^-6 M의 농도에서 아트라릭산(AA)의 합성된 구조적 변형체로 루시페라아제 분석한 결과를 도시한다.

도 7은 아트라릭산과 구조적으로 유사한 화합물의 항안드로겐성 작용을 나타 낸다.

도 8은 에스트로겐 수용체 베타에 대한 아트라릭산의 작용제(agonistic) 효과를 나타낸다.

도 9는 에스트로겐 수용체 알파에 대한 아트라릭산의 작용제 효과를 나타낸다.

우선, 상이한 피지움(Pygeum) 추출물의 항안드로겐성 효능을 비교하였다. 이어서 활성 화합물을 활성분획추적법(activity-guided fractionation)에 의해 분리하였다. P. africana (Hook. f.) Kalkm.의 나무껍질 물질의 선택적인 분획을 위해, 우선 선택적인 추출물을 준비하였다.

일반적으로, 식물 약제의 성분들은 다수의 가장 변형된 화합물에 반영된 고도의 생물다양성(biodiversity)을 특징으로 한다. 그럼에도 불구하고 다루기 쉬운 수의 성분을 갖는 추출물을 얻기 위해서는, 증가하는 극성의 용매 중에서 용해성에 따라 예비분획(prefractionation)을 수행하는 것이 유용한 것으로 입증되었다. 더 낮은 농도의 물질의 농축(enrichment) 및 극성의 범위의 제한 때문에, 결과로 얻어지는 선택적인 추출물은 크로마토그래피로 다루기가 더 쉽고, 따라서 후속의 추가 분획은, 궁극적으로 활성 성분의 분리를 가능하게 한다.

본 연구에서, 선택적인 추출 절차는 두 번 수행된다. 작은 조각으로 축소되었던 식물 재료를 체질(sieve)하고, 이어서 Ultra-Turrax를 사용하여, n-헥산에서 크기를 더욱 축소시키고, 마지막으로 양단이 스틸 프릿(steel frit)으로 막힌 스테인리스 스틸 카트리지(40 x 10 cm 및 80 x 10 cm)에 채웠다. HPLC 펌프를 이용하여, 증가된 극성에 따라 채워진 카트리지를 통해 용매를 통과시켰다(n-헥산, 디클로로메탄, 메탄올, 메탄올/물 (50/50) 및 물). 각각의 케이스에서 이러한 추출을 소진될 때까지 수행하였고, 이어서 얻어진 추출물을, 감압 하에서 건조시켰다. 이러한 추출법은 매우 마일드한 것이고, 따라서 약물에 대한 산소와 빛의 직접적인 작용 및 온도 스트레스가 방지된다. 그러나, 필수적인 것은, 성분들이 그에 의해 극성에 따른 순서로 추출물에서 예비분류되고(presorted), 그에 따라 더 쉽게 크로마토그래피될 수 있는 것이다.

추출물의 전체 양에서 선택적인 추출물의 질량 비율을 고려하면, 식물 재료가 메탄올-용해성 성분을 주로 함유하고 있는 것이 명백하다. n-헥산 및 디클로로메탄으로부터의 친유성(lipophile) 추출물의 양은 그다지 중요하지 않다. 일반적으로, 헥산 추출물에는 수지, 오일, 지방 또는 지방 유사 물질이 함유된다. 따라서 P. africana로부터의 지방산 및 장쇄 알콜이 그 추출물에서 발견되어야만 한다. 피토스테롤(phytosterol) 및 펜타사이클릭 트리터펜은 디클로로메탄 추출물에 함유되어 있는 것으로 생각할 수 있다. 그러나, 아미노산, 무기염 또는 사카라이드와 같은, 매우 극성인 식물 성분들은 메탄올/물 또는 물로만 추출된다.

선택적인 추출물과는 별도로, P. africana (Hook. f.)의 나무껍질로부터 에탄올성의 완전한 추출물도 준비하였다. 이를 위해, 무수 에탄올에서 300 g의 체질한 식물 재료를, Ultra-Turrax를 사용하여 크기를 더욱 축소시키고, 총 5ℓ의 에탄올로 몇(several) 부분으로 추출하였다. 이어서, 추출물을 여과하고 최종적으로 감압 하에서 건조하였다.

얻어진 추출물의 잠재적인 항안드로겐성 효능을, 다음의 루시페라아제 분석으로 지정된 안드로겐 수용체-의존성 MMTV-luc 수용체 유전자 분석으로 시험하였다.

그러한 분석에서, 효소인 루시페라아제는 정보제공 유전자(reporter gene)로서 작용한다. 루시페라아제는 북아메리카 반딧불(Photinus pyralis) 유래의 산화환원효소이며, 이는 대기 산소, ATP 및 Mg^{2 +} 이온의 존재 하에 기질 루시페린을 옥시루시페린으로 탈수한다. 상기 프로세스 중 방출되는 에너지는 빛으로 방출된다.

정보제공 유전자 루시페라아제는 플라스미드 pMMTV-luc(MMTV = 마우스 유방 종양 바이러스(Mouse mammary tumour virus)) 상에 위치하고, 거기에는 안드로겐-반응성 요소(ARE)도 위치한다. 안드로겐 수용체 발현 벡터와 함께, 플라스미드 pMMTV-luc는 원숭이 신장의 섬유모세포 내로 트랜스펙트된다. 안드로겐이 그곳에 가해지면, 이 안드로겐은 안드로겐 수용체와 복합체로, 안드로겐-반응성 요소에 결합할 것이다. 이어서 이 프로세스는 다음 유전자, 즉 루시페라아제 정보제공 유전자의 전사를 개시한다. 발현된 루시페라아제의 양은 루시페린을 가하였을 때 방출되는 광량과 정비례하고, 광량은 λ = 562 nm에서의 방출을 측정함으로써 정량할 수 있다. 안드로겐과 별도로 항안드로겐성 물질 또는 항안드로겐성 추출물도 있는 경우, 안드로겐-반응성 요소에 의한 루시페라아제 정보제공 유전자의 트랜스활성화(transactivation)가 억제되고, 그 후 기질이 가해질 때, 그에 따라 더 작은 양의 빛 에너지가 방출된다. 광량의 감소는 항안드로겐의 억제 효과와 비례하기 때문에, 이러한 분석은 신규한 항안드로겐성 선도 구조의 탐색용으로 매우 적합하다.

이어서 추출물을 루시페라아제 분석을 사용하여, 그 항안드로겐성 생활성(bioactivity)에 대해 두 가지 농도(300 ㎍/ml 및 600 ㎍/ml)에서 시험하였다. 평가를 위해, 순수한 용매만이 가해진 대조군에 대한 퍼센트 억제로서 항안드로겐성 효과를 측정하였다. 이어서 가장 효과적인 추출물을 추가의 활성분획추적법의 대상으로 하였다.

도 1은 P. africana 유래의 선택적인 헥산 추출물이 약한 항안드로겐성 활성을 갖는 것을 도시하며, 이는 아마도 높은 함량의 유리(free) 및 에스테르화된(esterified) 지방산과 장쇄 알콜에 기인한 것이다.

P. africana 유래의 선택적인 디클로로메탄 추출물은 상기 분석에서 가장 높은 항안드로겐성 효과를 나타냈으며; 따라서 이 추출물을 추가의 활성분획추적법을 위해 선택하였다.

선택적인 피지움 추출물의 친수성의 증가로, 항안드로겐성 활성은 유의하게 감소하였다.

한편 P. africana로부터의, 에탄올성의 완전한 추출물은 강한 효과를 나타낸다. 이는 에탄올로 선택적인 디클로로메탄 추출물에서와 같은 동일한 항안드로겐성 물질이 추출되었음을 시사한다. 후자는 훨씬 더 강력한데, 그 이유는 이러한 추출물에서 활성 물질의 농축이 성공적으로 수행되었기 때문이다.

수많은 물질의 복합 혼합물에서 활성 화합물을 탐색함에 있어서, 활성분획추적법의 방법이 유용한 것으로 입증되었다. 이를 위해, 식물 추출물을 생활성(bioactivity)에 대해서 우선 테스트한다. 효과가 발견되면, 샘플을 크로마토그래피에 의해 분리하고, 모든 분획을 생활성에 대해 다시 테스트한다. 일반적으로, 활성은 모든 분획에 걸쳐서 분포하는 것이 아니라, 소수의 명확히 정의된 분획에서만 발견되는데, 그 이유는 그러한 분획들에서 활성 물질의 축적이 발생하기 때문이다. 이어서 이러한 활성 분획을 선택하여 다른 분리 방법으로 추가로 분획한다. 활 성 물질이 최종적으로 분리될 때까지 점차 특이적인 분리 방법으로 이러한 절차를 반복한다. 상이한 분리 방법(선택적 추출, 진탕(shaking out)에 의한 추출, 정상(normal phase) 크로마토그래피 및 역상(reversed phase) 크로마토그래피 등)의 조합은 분획 단계의 수 및 그에 따른 필요한 시간을 감소시킨다. 이어서 분리된 물질을 동정(identify)하고 다양한 분석법을 사용하여 정량하고, 마지막으로 개개의 물질로서 및 모든 활성 화합물의 혼합물에서 그들의 효능을 테스트한다. 참고 물질 및 추출물로부터 분리된 화합물 간에 대응관계가 있는 경우, 동정된 물질이 확인된 것으로 간주한다.

이러한 방법이 또한 본 연구에서 적용되었다. 우선, 가장 높은 효능을 보이는 추출물을 선택하였다. 이는 P. africana 유래의 선택적인 디클로로메탄 추출물이었는데, 선택적인 추출의 접근법 때문에 이미 예비분획되었다. 상기 추출물의 추가의 분획을 농도구배 엑스트로그래피(gradient extrography) - 정상(normal phase)에서의 크로마토그래피에 의해 수행하였다.

엑스트로그래피(extrography)의 프로세스는 원유 증류 잔류물의 분획을 위해 개발되었다. 이는 복합 혼합물을 분리하는 역할을 하며, 상기 복합 혼합물의 성분은 넓은 범주의 극성을 포함한다. 복합 혼합물은 조제(coarse) 단계의 농도구배로, 다루기 쉬운 수의 분획으로 분리되고, 각각의 분획은 하나 전단계보다 더 적은 범위의 극성을 갖는다. 이는 각각의 분획에서 한정된 극성의 물질의 축적을 가져온 다. 이 방법은 특히 샘플 영역을 수(a few) 센티미터로 줄이는 것에 의해, 식물 추출물의 분리용으로 변형되었다. 이런 식으로, 대량의 추출물을 상대적으로 짧은 시간 내에 분획하는 것이 가능하다.

엑스트로그래피에서, 추출물은 우선 적절한 용매에 용해되고, 조제 실리카 겔의 대략적으로 다섯 배의 양으로 흡착된다. 이를 위해, 실리카 겔을 순수한 추출물 용액과 혼합하고, 이 혼합물을 초음파로 처리하고, 그 후 건조한, 유동성(flowable) 물질이 남을 때까지, 용매를 회전 증발기 상에서, 피스톤을 천천히 회전시키면서 제거한다. 이러한 프로세스는 실리카 겔 상에서 샘플 분자의 예비분류를 가져온다. 매우 극성인 실리카 겔의 실라놀기는 처음에는 가장 높은 극성의 샘플 분자의 표면에 흡착한다. 극성 화합물의 이러한 새로운 표면은 이어서 추출물로부터 다소 덜 극성인 물질을 흡착한다. 이는 실리카 겔 세공에서 극성이 감소하는 샘플 분자의 수개의(several) 층을 가져온다. 그에 따라, 새로운 세공 표면상에, 대부분 무극성(apolar) 물질들이 위치한다. 이는 필연적으로 그로부터, 용해된 추출물의 양이 여러 부분이 아니라, 단일 부분에서 실리카 겔 상에 위치되어야 하고, 이와 달리, 각각의 부분에서, 물질의 모든 극성이 용매의 회수 후 즉시 다시 흡착됨을 초래한다. 추출물이 흡착된 실리카 겔을 미세한 실리카 겔(Macherey - Nagel Si60, 15-25 ㎛)의 크로마토그래피 베드(chromatographic bed)의 앞에 있는 분리 컬럼에 채운다. 이어서 만일 용매 농도구배가 친유성 용리액과 함께 개시되는 경우, 처음에는 친유성 물질만이 표면에서 용해될 것이고, 크로마토그래피의 분리 베드를 통과할 것이다. 농도구배의 과정 중에서, 용리액의 극성이 증가하여 증가하는 물질의 극성이 크로마토그래피가 가능하도록 한다. 따라서, 실리카 겔 상에서 샘플 분자의 예비분류는 대량의 물질을 분획할 수 있도록 한다. 분리 베드의 과부하가 방지되는데, 그 이유는 샘플 분자가 한번에 분리 베드 내로 진입하는 것이 아니라, 점차적으로 상이한 극성의 그룹으로 분리되기 때문이다.

선택적인 디클로로메탄 추출물을 위한 가장 적절한 용매 농도구배는 상이한 농도구배를 이용한 일련의 예비-시험에 의해 결정하였다. 선택적인 추출에서와 같이, n-헥산을 가장 친유성인 용매 성분으로 선택하였다. 농도구배의 추가의 과정에서, 디클로로메탄을 천천히 고르게 혼합하여야 하는데, 그 이유는 결국 용매와 함께 제조되는 추출물의 분리가 디클로로메탄으로 가장 성공적일 수 있기 때문이다. 이어서, 메탄올의 혼합물 및 최종적으로 물의 혼합물이 상대적으로 짧은 시간 내에 뒤따르는데, 그 이유는 그러한 극성의 화합물들이 디클로로메탄 추출물에서 발견될 것으로 거의 생각되지 않기 때문이다. 산 화합물이 분리되는 것을 방지하기 위하여 0.1% 트리플루오로아세트산을 모든 용리액에 가하였다.

P. africana로부터의 선택적인 디클로로메탄 추출물로, 제조용(preparative) 스케일에서 엑스트로그래피를 두 번 수행하였다(엑스트로그래피 1 = E1 및 엑스트로그래피 2 = E2). 큰 스케일로 규모를 늘리는 것은 컬럼 면적 및 용리액의 유속의 조절을 필요로 한다. 컬럼으로서 실리카 겔로 채운 스테인리스 스틸 카트리 지(Merck Prepbar^? 40 x 10 cm)를 사용하였다. 이러한 카트리지의 패킹은 가압 도구 및 가변형 컬럼 헤드의 도움으로 압축되었다. 흡착된 추출물을 구성하는 샘플 영역은 크로마토그래피 튜브의 하부에 위치시켰다. 에어 포켓을 방지하기 위하여, 용리액은 HPLC 펌프를 사용하여, 바닥에서 정상부까지 120 ml/min의 유속으로 펌프하였다.

제조용 농도구배 엑스트로그래피로부터 얻어진 35개의 분획(표 1)을 HPLC 분석기로 구성성분을 시험하고, 서로 간에 그리고 분획되지 않은 선택적인 디클로로메탄 추출물과 비교하였다. 이러한 프로세스 중, 개별의 분획에 있는 동일 화합물의 농도의 직접비교를 UV 흡수 및 그에 따른 크로마토그램의 표면에 기초하여 수행할 수 있도록, 모든 분획은 동일한 양으로 크로마토그래피하였다.

엑스트로그래피 분획의 크로마토그램을 크로마토그래피 전체상(overview)과 비교할 때, 엑스트로그래피가 서로로부터 성분의 물질 분리를 수행하는데 성공적이었음을 명확하게 알 수 있다. 일부 물질은 상응하는 분획에서 강하게 축적되었다.

항안드로겐성 활성을 테스트하기 위해서 35개의 분획을 루시페라아제 분석하였다. 모든 분획은 30 ㎍/ml 및 60 ㎍/ml의 농도에서 테스트하였다. 도 2로부터 알 수 있는 바와 같이, 35개의 분획 중 3개, 즉, 이웃하는 분획 F6, F7 및 F8이 매우 효과적인 것으로 입증되었다.

분획 F6, F7 및 F8의 HPLC 크로마토그램의 비교시, 모든 3개의 분획이 매우 유사한 성분 프로파일을 갖는 것으로 관찰되었다. 분획되지 않은 선택적인 디클로로메탄 추출물과 비교하여 피크의 수는 명확히 감소하였다. 특히 39분의 정체 시간(retention time)에서 이중 피크가 발견되었는데, 이는 나머지 32개의 분획 중에는 어느 것에서도 발견되지 않았다. 이러한 사실은 이중 피크를 나타내는 두 물질 중 어느 하나 또는 양 물질이 P. africana의 활성 성분(들)일 수 있다는 가설을 도출한다.

항안드로겐성 활성 물질을 얻기 위해서, 마지막의 분리 단계, 즉 항안드로겐성 활성 엑스트로그래피 분획으로부터의 추가의 분리를 수행하여야 한다.

세 개의 엑스트로그래피 분획 F6, F7 및 F8 중에서, 충분한 양으로 존재하였던 분획 F8을, 추가의 제조용 분리(preparative separation)를 위해 선택하였다. 분석적 분리법을 축소하고 컬럼 면적 및 유속을 조정하여 제조용 스케일로 바꾸었다. 몇 번의 분리 후, 루시페라아제 분석을 위해 충분한 양으로 물질 P3, P5, P7, P9 및 P10을 얻을 수 있었다.

분리된 물질 P3, P5, P7, P9 및 P10을 루세페라아제 분석에 의해 항안드로겐 성 활성에 대하여 테스트하였다. 결과는 도 3에 도시한다.

도 3으로부터 물질 P9 및 P10이 P. africana로부터의 항안드로겐성 활성 화합물인 것이 매우 명백하다. 루시페라아제 분석에서, 화합물 P5는 보통의 안드로겐성 활성을 보였으며, P3은 약한 안드로겐성인 것으로 나타났으며, P7은 어떠한 유의한 효과도 관찰되지 않았다.

F8의 제조용 분리에 앞서, 상기 분획을 크로마토그래피 개시 조건의 용매 혼합물(20% 아세토니트릴(ACN), 80% 물)에 용해하였다. 여과하여 제거할 수 있고 또한 에탄올/DMSO 중에 용해함으로써 테스트할 수 있는 잔류물이 남았다. 상기 잔류물은 루시페라아제 분석에서 어떠한 효과도 보이지 않았다.

물질 P9의 구조를 명확하게 하기 위해, ¹H-NMR, ¹³C-NMR, UV, IR 및 EI-MS 스펙트럼의 이미지를 사용하였다. P9는 메틸-2,4-디하이드록시-3,6-디메틸벤조산염임을 확인할 수 있으며, 또한 아트라릭산의 종명(trivial name)과 함께, 메틸-β-오르시놀-카르복시산염으로 지정할 수도 있다. "산(acid)"으로 지정하는 것은 다소 오기인데, 그 이유는 아트라릭산의 카르복시산 기능은 유리 형태(free form)에서는 존재하지 않으며, 메탄올과 에스테르화하기 때문이다. 그럼에도 불구하고, 두 페놀성 하이드록실기 및 페닐성(phenylogous) 카르보닐기 때문에, 아트라릭산은 산의 특성을 갖는다. 아트라릭산 (AA)의 구조식은 도 5에 나타낸다.

분획 F8로부터 무색 침으로서 아트라릭산을 분리하였다. 상기 물질은 특징적인 나무 냄새를 갖는다. 메톡시카르보닐기에 대한 흡수 밴드와 별개로, 클로로포름 중 아트라릭산 용액의 IR 스펙트럼은 두 개의 하이드록실기에 대한 두 개의 밴드를 나타낸다. ν_max = 3040 cm^-1에서의 OH 원자가 진동은 카르보닐기 및 위치 C-2에 있는 하이드록실기 사이의 분자에 의해 형성된 분자내 수소 가교(bridge)의 존재를 시사한다. 용액을 희석할 때, 상기 밴드는 동일한 위치에서 유지된다. 그러나, 샘플이 희석될 때 ν_max = 3400 cm^-1에서의 OH 원자가 진동의 흡수 밴드는 더 큰 파수(wavenumber) 쪽으로 이동하며, 이는 분자내 수소 가교의 존재를 시사한다. 희석은 제2 분자의 카르보닐기 및 C-4에 있는 하이드록실기 사이의 분자내 수소 가교가 강제로 열리도록 하고, OH기의 결합 강도의 증가를 초래하여 원자가 진동을 여기(excite)시키는데 더 높은 에너지량이 필요하도록 한다.

분자내 수소 가교는 또한 ¹H-NMR 스펙트럼에서 관찰된다. 분자내 수소 가교와 관련된 C-2에 있는 하이드록실기의 양성자의 신호는 유달리 샤프하고, 깊은 필드(δ = 11.98 ppm) 쪽으로 강하게 이동되어 있다. HD 교환의 경우에, 이러한 양성자는 C-4에 있는 다른 하이드록실기의 양성자로 된 경우와 동일한 정도로 중수소 에 의해 대체되지는 않을 것이다. 이 사실은 분자내 수소 가교가 분자간 가교보다 상당히 더 강해야 한다는 것을 나타낸다. 아트라릭산의 결정 구조의 이미지는 1983년에 성공적으로 기록되었다.

아트라릭산의 ¹H-NMR 스펙트럼은 6개의 단일항(singlet)을 나타낸다. 메틸기의 신호는 δ = 2.03 ppm 및 δ = 2.39 ppm의 시프트에 위치한다. δ = 3.85 ppm의 시프트에서 세 개의 양성자의 신호 강도로 된 단일항은 메톡시카르보닐기를 나타내고, 이는 δ = 51.8 ppm 및 δ = 172.6 ppm에서 ¹³C-NMR 스펙트럼의 신호에 의해 확인할 수 있다. ¹³C-NMR 스펙트럼은 δ = 7.6 ppm에서 C-3에 있는 메틸기에 대한 신호의 매우 높은 필드 시프트를 나타내며, 이는 이웃하는 C 원자에 있는 두 개의 하이드록실기의 강한 전자-끌어당김 효과에 의해 설명할 수 있다. 메틸기의 이러한 위치는 HMBC 실험(HMBC = 이종핵 다중 결합 상관성(Heteronuclear Multiple Bond Correlation))으로 확인할 수 있으며, 이는 그 스펙트럼에서 C-2 및 C-4와 C-3에 있는 메틸 양성자 사이에 ³J(C,H) 커플링에 대한 교차 신호를 나타낸다.

모든 양성자를 상응하는 탄소 원자에 주는 것은 HMQC 스펙트럼(HMQC = 이종핵 다중 양자 간섭성(Heteronuclear Multiple Quantum Coherence))의 기록에 의해 묘사되었다.

아트라릭산의 EI 질량 스펙트럼은 m/z 196에서 분자 이온 피크를 가져온다. 실험식 C₁₀H₁₃O₄는 질량의 정교한 측정에 의해 확인할 수 있다. 상기 스펙트럼은 또한 아트라릭산의 두 가지 특징적인 조각 이온(fragment ion) 피크를 나타낸다. m/z 164에서 조각 이온은 메탄올의 분리에 의해 형성되며, 여기에서 메톡시카르보닐기의 메틸기가 C-2에 있는 수산기의 양성자와 함께 메탄올을 형성하고, 이어서 상기 메탄올과 같이 분할(split off)된다. 이는 메틸 살리실산염 부분 구조의 특성이다. 추가의 단편화(fragmentation)는 일산화탄소의 분리를 초래하여, 제2 조각 이온 피크가 m/z 136에서 형성된다.

아트라릭산의 UV 스펙트럼은 λ= 217, 245 및 307nm에서 3개의 최고점을 나타낸다. 알칼리성 조건은 용액의 황색 컬러를 가져오고 그에 따라 UV 스펙트럼에서 최고점의 장파장쪽 이동(bathochrome shift)을 가져온다.

단사 결정(monocline crystal)을 수용하기 위해서 아세톤으로부터 아트라릭산을 재결정하는 것이 가능하다. 또한, 살리실산염 부분 구조에 기인하여, 이온 (III) 염화물 용액과 함께 아트라릭산은 보라색 컬러를 나타낸다. 모든 분석적인 데이터는 문헌에 나타낸 값과 정확히 일치된다.

P. africana로부터의 선택적인 디클로로메탄 추출물 내의 아트라릭산의 정량 분석을 위하여, 99% 이상 순도의 아트라릭산의 참조 물질로 눈금측정선을 설정하였다. 이는 선택적인 디클로로메탄 추출물에서 아트라릭산 0.16% (m/m)의 함량을 가져왔다.

루시페라아제 분석에서, 아트라릭산은 분명한 항안드로겐성 활성을 나타낸다. 따라서 본 발명은 전립선비대증의 치료 및 전립선비대증 치료용 약제의 제조를 위한 아트라릭산의 용도에 관한 것이다.

아트라릭산은 이미 Newbouldia laevis, Alseodaphne andersonii, Acer nikoense, Xylosma velutina 및 Ekebergia pterophylla와 같은 다양한 고등 식물의 나무껍질 재료로부터 분리되어 왔다.

그러나, 아트라릭산은 또한 지의류 물질로 알려져 있다. 지의류는 착생식물(epiphyte), 다시 말해 균류(mycobiont) 및 조류(photobiont)로 구성된 공생 유기체이다. 아트라릭산은 유리 형태로 지의류에 존재할 수 있으며, 이는 또한 뎁시드(depside) 및 뎁시돈(depsidone)의 성분으로서 기능한다. 예를 들어, 잘 알려진 지의류 물질 아트라노린(atranorin)은 아트라릭산과 헤마토믹산(hematommic acid)의 뎁시드이고, 다양한 지의류 종에 의한 폴리케티드(polyketide) 대사에 의해 합성된다.

이러한 사실은 아트라릭산이 정말로 Prunus africana (Hook. f.) Kalkm.의 2차 대사산물인지 또는 상기 나무의 나무껍질이 아세테이트-폴리말로네이트 (acetate-polymalonate) 합성의 경로를 통해 폴리케티드로서 아트라릭산을 생산하는 지의류에 의해 이식되는지의 여부에 대한 문제를 환기시킨다.

현미경으로 Pygeum africana의 나무껍질 약물을 관찰하면, 하이픈들(hyphens)이 명확히 관찰되는데, 이는 지의류의 존재를 확인하는 것이다. 이는 아트라릭산이 지의류의 폴리케티드 대사로부터 기원하며 Pygeum africana의 2차 식물 대사산물이 아님을 시사한다.

아트라릭산은 지의류 산에 속하는데, 이는 폴리-아세테이트이고 그 생물발생은 식물 엽상체의 진균(fungus) 성분을 통해 일어난다. 다른 지의류 산과 같이, 아트라릭산은 항균 뿐 아니라 선충구제제로 간주된다.

한편 아트라릭산은 또한 3-메틸-4-메틸렌-2-옥세탄 및 아세트산 메틸 에스테르로부터 완전히 합성으로 생산할 수 있다.

전립선 세포 및 전립선암 세포의 성장은 원래 안드로겐 의존성이다. 아트라릭산의 안드로겐 길항작용이 또한 세포 성장에 영향을 미치는지 여부를 테스트하기 위해, 인간의 전립선암 세포주 LNCaP를 사용하였는데, 이는 안드로겐-의존성 성장을 보이는 것으로 알려져 있다. LNCaP 세포를 10 μM 아트라릭산의 존재 하에 배양하였다. 도 4는 10 μM 아트라릭산으로 처리한 세포가 치료 8일째 이미 비처리 세포보다 확실히 더 느린 성장을 보였음을 나타낸다. 이러한 효과는 치료의 18일째 훨씬 더 현저하였다. 10 μM 아트라릭산 중에서, LNCaP 세포는 성장의 감소를 나타낸 반면, OH-F (하이드록시플루타미드)로 처리하는 것으로는 성장에 있어서 어떠한 감소도 가져오지 못하였다. 후자는 OH-F가 이들 세포에서 항안드로겐으로 작용하는 것을 방지하는 인간 안드로겐 수용체의 리간드 바인딩 도메인에서 점 돌연변이를 갖는 LNCaP 세포에 기인한 것이다.

이러한 데이터는 아트라릭산의 안드로겐 길항작용이 또한 돌연변이된 인간 안드로겐 수용체의 경우에도 효과적임을 나타낸다. 따라서, 아트라릭산은 LNCaP 세포의 성장을 억제할 수 있다. 그 결과, 아트라릭산은 또한 하이드록시플루타미드와 같은 기존의 항안드로겐성 활성제에 내성을 가진 전립선암종을 치료하는데 사용할 수 있다.

따라서 본 발명은 또한 전립선암종을 치료하고, 또한 전립선암종, 특히 예를 들어, 비칼루타미드, 플루타미드, 하이드록시플루타미드, 닐루타미드 또는 사이프로테론 아세테이트와 같은 기존의 안드로겐 길항제로 치료하는데 내성을 가진 전립선암종의 치료용 약제를 제조하기 위한 아트라릭산의 용도에 관한 것이다.

또한, 아트라릭산은 전립선비대증 및/또는 전립선암종, 특히 치료 내성 전립선암종의 치료용으로 적합한 신규의 활성 물질의 개발에 있어서 선도 물질로서의 역할을 할 수 있다.

본 발명의 과제는 BPH 및/또는 전립선암종의 치료, 또는 BPH 및/또는 전립선암종의 치료용으로 사용되는 약제를 제조하기 위한 신규의 항안드로겐성 활성 물질을 제공하는 것이다.

이러한 과제는 다수의 화학적으로 합성된 아트라릭산의 유도체를 제공하는 것에 의해 해결할 수 있으며, 여기서 벤젠고리의 측쇄 또는 에스테르의 측쇄는 치환된다. 아트라릭산의 구조를 최적화하기 위해서, 에스테르기에서 아트라릭산과 상이한 다수의 물질을 합성하였다. 이를 위해 최초에는 다양한 1차 지방족 알콜로 2,4-디하이드록시-3,5-디메틸벤조산의 산-촉매된 에스테르화의 수행을 시도하였다. 낮은 카르보닐 활성의 결과로, 카르복시산은 일반적으로 알콜과만 천천히 반응한다. 황산과 같은 강한 무기산의 첨가 및 수시간의 환류는 반응 속도를 상당히 증가시킬 수 있다. 그러나, 예를 들어, 에탄올과 같은 1차 알콜과 2,4-디하이드록시-3,5-디메틸벤조산의 반응으로는 원하는 에스테르를 얻을 수 없는데, 그 이유는 상승된 온도에서 2,4-디하이드록시-3,5-디메틸벤조산이 그 살리실산염 구조 때문에 무기산과 탈카르복실화되기 때문이다.

그러나, 1차 알콜과 아트라릭산의 알칼리-촉매된 재에스테르화로 원하는 에스테르를 얻었다. 이를 위해, 상응하는 1차 지방족 알콜 또는 벤젠 설폰아미드의 용액 중에서, 당량보다 다소 많은 양의 수산화칼륨과 함께, 아트라릭산을 밤새 교반하였다. 이러한 재에스테르화는 정량적으로 일어나지 않았기 때문에, 반응 생성물은 분취용 고속 액체 크로마토그래피(Preparative HPLC)에 의해 혼합물로부터 분리되어야 한다.

이런 식으로, 하기의 아트라릭산 유도체(아트라테이트(atratate))의 합성을 성공적으로 수행하였고, 그 구조식은 도 5에서 볼 수 있다:

A1 = 에틸-2,4-디하이드록시-3,6-디메틸벤조산염; 에틸 아트라테이트

A2 = 프로필-2,4-디하이드록시-3,6-디메틸벤조산염; 프로필 아트라테이트

A3 = 부틸-2,4-디하이드록시-3,6-디메틸벤조산염; 부틸 아트라테이트

A4 = 2-[(페닐술포닐)아미노]에틸-2,4-디하이드록시-3,6-디메틸벤조산염

A5 = (2E)-3,7-디메틸옥타-2,6-디엔-1-일-2,4-디하이드록시-3,5-디메틸벤조산염; 게라닐-2,4-디하이드록시-3,5-디메틸벤조산염; 게라닐 아트라테이트

A6 = 이소프로필-2,4-디하이드록시-3,5-디메틸벤조산염; 이소프로필 아트라테이트.

또한, 아트라릭산의 구조와 유사한 구조를 가진 하기 시판의 화합물을 항안 드로겐성 효과에 대하여 시험하였다:

R0 = 에틸-2,4-디하이드록시-6-메틸벤조산염

R1 = 메틸-3,5-디브로모-2,4-디하이드록시-6-메틸벤조산염

R2 = 메틸-2-하이드록시-3-메틸벤조산염

R3 = 메틸-2,4-디하이드록시벤조산염

R4 = 메틸-2,4-디하이드록시-3-메틸벤조산염

R5 = 메틸-2,6-디하이드록시-3,5-디메틸벤조산염

R6 = 2,4-디하이드록시-3,6-디메틸벤조산

X = 1-(2-하이드록시-4,6-디메톡시페닐)-에탄온; 산토자일린(xanthoxylin).

화합물 A4는 N-부틸벤젠술폰아미드 및 아트라릭산의 키메라이지만, 도 6 및 도 7에 도시한 바와 같이, 항안드로겐성 효과를 나타내지 않는다. 이는 아트라릭산 유도체에는 에스테르와 같은 큰 측쇄가 항안드로겐성 활성 분자를 도출하지 않는다는 가설을 도출한다. 이 가설은 이소프로필기(화합물 A)를 더 크고, 더 소수성인 게라닐기(화합물 A5)로 치환하는 것이 항안드로겐성 활성 분자를 도출하지 않는다는 사실과 부합한다.

화합물 R4 및 A6은 10μM 농도에서 안드로겐 수용체-매개 트랜스활성화를 거의 완벽하게 억제하는 강력한 항안드로겐성 활성을 보였다(도 7). 겨우 1μM의 농 도에서도 R4 및 A6 화합물 양자는 안드로겐 수용체-매개 트랜스활성화를 여전히 불활성화할 수 있었다.

루시페라아제 분석의 결과는 오르토-위치에 있는 메틸기가 항안드로겐성 활성에 필요하지 않은 반면(이는 아트라릭산의 효과를 R4의 효과와 비교함으로서 알 수 있음), 메타-위치에 위치하는 메틸기는 항안드로겐성 활성에 필수적임(R0의 활성 참조)을 시사한다. 이에 따라, 벤젠고리로부터 양 메틸기를 제거하는 것은 항안드로겐성 활성의 완벽한 상실을 가져온다. 또한, 화합물 R1의 활성에 의해 밝혀진 바와 같이, 항안드로겐성 활성의 손실을 가져오지 않고 메틸기를 브롬화물 원자로 대체할 수는 없다. 또한, 다른 위치에서 아트라릭산에서 발견되는 모든 벤젠고리 치환기를 갖는 화합물 R5는 항안드로겐성 활성의 손실을 가져온다. 에스테르의 메틸기 역시 항안드로겐성 활성에 필수인 것으로 보이는데, 그 이유는 그것을 제거하면 항안드로겐성 활성이 상실되기 때문이며, 이는 R6의 활성에 의해 알 수 있다.

안드로겐은 전립선의 정상적인 발생, 정상적인 성장 및 정상적인 분비 활성에 필수이다. 이와 대조적으로, 에스트로겐은 일반적으로 전립선 성장의 억제제인 것으로 간주된다. 그러나, 에스트로겐에 대한 그와 같은 일반적인 평가는 잘못된 것일 수 있는데 그 이유는 ERβ의 활성화가 전립선암 세포의 성장을 억제하는 효과를 갖는 것으로 나타났기 때문이다. 게다가 ERβ의 불활성화는 마우스에서 전립선 비대를 가져왔다.

본 발명에 대해 행해진 연구의 테두리 내에서, 아트라릭산은 또한 항안드로겐성 활성을 가질 뿐 아니라, ERβ에 작용제로도 작용하는 것으로 나타났다. 이러한 발견은 전립선암 세포의 성장에 대한 아트라릭산의 억제 효과가 오로지 그 항안드로겐성 효과에만 기인하는 것이 아니라, 그 ERβ 작용성(agonism)에도 기인한다는 가설을 도출한다. 또한, 예를 들어 신경변성질병과 같은 다른 질환으로 고통받는 환자들 역시 ERβ에 작용제 효과를 갖는 아트라릭산 또는 아트라릭산 유도체로 치료하는 것으로부터 혜택을 받을 수 있다.

따라서 본 발명의 주제는 전립선비대증 및/또는 전립선암종, 특히 안드로겐 길항제 치료에 내성을 가진 전립선암종의 치료 및 치료용 약제의 제조를 위한, 하기 일반식의 2,4-디하이드록시-3-메틸벤조산염의 용도이고, 여기서 R₁은 C₁ 내지 C₄ 알킬이고, R₂는 수소 또는 메틸, 에틸 또는 프로필 잔기(residue)를 나타낸다.

본 발명의 주제는 또한 척수연수 근위축증의 치료 및 치료용 약제의 제조를 위한, 하기 일반식의 2,4-디하이드록시-3-메틸벤조산염의 용도이고, 여기서 R₁은 C₁ 내지 C₄ 알킬이고, R₂는 수소 또는 메틸, 에틸 또는 프로필 잔기를 나타낸다.

본 발명은 또한 전립선비대증, 전립선암종 및 척수연수 근위축증 치료를 위한 신규의 또는 추가의 활성 물질의 개발을 위한 선도 물질로서 전술한 2,4-디하이드록시-3-메틸벤조산염의 용도에 관한 것이다.

본 발명은 또한 전립선비대증 및/또는 전립선암종, 특히 안드로겐 길항제 치료에 내성을 가진 전립선암종의 치료, 및 척수연수 근위축증의 치료를 위한 약제(medicament)에 관한 것이며, 이러한 약제들은 하기 일반식의 2,4-디하이드록시-3-메틸벤조산염을 적어도 하나 함유하는 것을 특징으로 하고, 여기서 R₁은 C₁ 내지 C₄ 알킬이고, R₂는 수소 또는 메틸, 에틸 또는 프로필 잔기를 나타낸다.

또한, 본 발명은 생물학적 재료로부터 아트라릭산을 분리하기 위한 방법에 관한 것이며, 하기 단계들을 포함한다.

a. 생물학적 재료의 사이즈를 축소하는 단계;

b. 1가 C₁ 내지 C₄ 알콜 및 쉽게 휘발하는, (부분적으로) 할로겐화된 C₁ 탄화수소를 포함하는 그룹에서 선택된 용매로 생물학적 재료를 추출하는 단계;

c. 상기 추출물을 분획하는 단계;

d. 아트라릭산을 함유하는 분획으로부터 아트라릭산을 분리하는 단계.

상기 생물학적 재료는 아프리카 자두 나무 P. africana의 나무껍질 또는 P. africana의 나무껍질에서 생육 가능한 지의류일 수 있다. 바람직하게는, 추출은 증가하는 극성의 일련의 연속적인 용매를 사용하여 선택적인 추출로서 수행되고, 추출물의 분획은 증가하는 극성의 용리액으로 농도구배 엑스트로그래피에 의해 수행된다. 특히 바람직하게는, 아트라릭산-함유 분획으로부터 아트라릭산의 분리는 분취용 고속 액체 크로마토그래피에 의해 수행된다.

본 발명의 다른 주제는, 재에스테르화만을 가져오는, 1차 지방족 알콜 용액 중에서 당량의 알칼리 수산화물 또는 알칼리성 토류 수산화물과 함께 아트라릭산을 교반하고, 바람직하게는 분취용 고속 액체 크로마토그래피에 의해 반응 혼합물로부 터 아트라릭산 유도체를 후속하여 분리하는 것을 특징으로 하는 아트라릭산 유도체(아트라테이트)를 합성하기 위한 방법이다.

바람직하게는, 사용된 알칼리 수산화물은 수산화칼륨이고, 특히 바람직하게는 1차 지방족 알콜은 메탄올, 에탄올, n-프로판올, 이소-프로판올 및 부탄올을 포함하는 그룹에서 특히 바람직하게 선택된다.

본 발명의 다른 주제는 하기 일반식의 2,4-디하이드록시벤조산염을 포함하는 아트라릭산 유도체이고, 여기서 R₂는 수소 또는 메틸, 에틸 또는 프로필 잔기이고, R₁은 이소-프로필, 게라닐 및 에틸벤젠술폰아미드 잔기를 포함하는 그룹에서 선택되는 것을 특징으로 한다.

실시예 1: 식물 재료의 추출

아프리카 자두 나무(P. africana)의 건조된 나무껍질을 분쇄하고, 울트라 투렉스(Ultra Turrax)를 사용하여, 빙냉하면서, 1 1 n-헥산에서 1.73kg의 분쇄된 나 무껍질을 균질화하였다. 식물 재료를 컬럼(Merck Prepbar^? 400 x 100 mm)에 채우고 상온에서 25.0ℓ의 n-헥산, 26.0ℓ의 메틸렌 클로라이드, 25.0ℓ의 메탄올(MeOH) 및 12.5ℓ의 물로 연속하여 선택적으로 추출하였다. 결과로 얻어진 추출물의 용매를 40℃에서 진공 중 증발시켰다. 이로써 4.8g의 선택적인 헥산 추출물, 11.03 g 선택적인 메틸렌 클로라이드 추출물, 116.81　g의 선택적인 메탄올 추출물 및 7.00 g의 선택적인 물 추출물을 얻었다.

에탄올성 추출물을 만들기 위해, 300g의 P. africana 나무껍질 재료를 분쇄하고, 매번 5.0ℓ 에탄올(EOH)로, 세 번 추출하였다. 0.7㎛ 세공 크기의 여과지를 통해 추출물을 여과한 후, 회전식 증발기(rotary evaporator)를 사용하여 40℃에서 전체 추출물로부터 용매를 제거하였다. 결과로 얻어지는 추출물의 건조체는 16.02 g이었다.

실시예 2: 메틸렌 클로라이드 추출물의 분획

피지움 아프리카나(Pygeum africana)의 선택적인 메틸렌 클로라이드 추출물을 실리카 겔(Macherey - Nagel Si60, 15 - 25 ㎛)로 분획하였다. 이를 위해 추출물을 2000ml CH₂Cl₂에 용해시키고, 0.7㎛ 세공 크기의 여과지(Schleicher & Schull)를 통해 여과하였다. 25g의 실리카 겔(Merck Si60, 0.063 - 0.2 mm)을 추출물에 가하고 이어서 용매를 40℃에서 진공 중 증발시켰다. 상기와 같이 하여 코팅된 실리 카 겔을 드라이팩(dry packed) 실리카 겔 컬럼(Merck Prepbar^? 400 x 100 mm)의 정상부에 놓고, 120ml·min^-1의 유속에서, 0 min 헥산 (100:0), 50 min 헥산 (100:0), 350 min CH₂Cl₂ (100:0), 500 min CH₂Cl₂ (100:0), 700 min CH₂Cl₂-MeOH (80:20), 750 min MeOH (100:0), 800 min MeOH (100:0), 850 min H₂O (100:0), 885 min H₂O의 선형 구배(linear gradient)로 용출하였다. 크로마토그래피로 245nm의 파장에서 UV광에 의해 탐지되는 35개의 분획을 얻었다(표 1).

표 1: P. africana로부터 선택적인 메틸렌 클로라이드 추출물의 분획

분획	분	질량 (mg)	분획	분	질량 (mg)
F1	0-148	3	F19	615-630	799
F2	149-184	52	F20	631-638	292
F3	185-204	33	F21	639-659	1338
F4	205-229	63	F22	660-663	20
F5	230-238	14	F23	664-671	327
F6	239-261	61	F24	672-692	634
F7	262-266	30	F25	693-703	157
F8	267-293	243	F26	704-724	333
F9	294-331	380	F27	725-749	350
F10	332-338	17	F28	750-771	393
F11	339-356	164	F29	772-784	316
F12	357-369	119	F30	785-803	141
F13	370-373	38	F31	804-820	57
F14	374-375	71	F32	821-828	58
F15	376-562	110	F33	829-836	1
F16	563-581	44	F34	837-858	126
F17	582-592	24	F35	859-880	1
F18	593-614	1537

실시예 3: 아트라릭산의 분리

분취용 고속 액체 크로마토그래피에 의해 분획 F8로부터 아트라릭산을 분리 하였다(250 x 21 mm, 100-5 C18 HD Macherey - Nagel, 22 ml·min^-1, 220nm에서 UV 탐지, 구배: 0 min ACN-H₂O (0.1%의 TFA 첨가) ((20:80), 40 min ACN-H₂O (80:20), 45　min ACN (아세토니트릴) (100:0)). 23분에서 25분까지 아트라릭산을 수집하였다. 그 구조는 ¹H NMR 및 ¹³C NMR, EI-MS, HR-EI-MS, IR 및 UV 스펙트럼을 기초로 하여 밝혔다.

실시예 4: 세포 배양 및 루시페라아제 분석

내생성 안드로겐 수용체가 결여된, 원숭이 신장 세포 주 CV1을, DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium)에서 배양하고, 37℃ 및 5% CO₂에서, 10% (v/v) 소태아혈청, 페니실린 (100 IU/ml) 및 스트렙토마이신(100 IU/ml)을 보충하였다.

트랜스펙션 실험을 위해서, 세포들을 6-웰 배양 플레이트(Nunc, Roskilde, Denmark)에, 웰당 1.2 x 10⁵ 세포의 밀도로 씨딩(seeding)하고, 10% (v/v) 덱스트란-코팅된 활성탄 스트립된 혈청으로 보충된 DMEM 배지에서 성장시켰다. 배양 6시간 후에, 세포를 Ca₃(PO₄)₂ 법을 사용하여 트랜스펙트하였다. 인간 안드로겐 수용체(hAR) 발현 벡터(0.2㎍)를, 트랜스펙션 효율에 대한 내부 조절자로서, 1㎍의 리포터 플라스미드 MMTV-luc 및 0.2㎍의 거대세포바이러스 (CMV)-유도 β-갈락토시다 아제 발현 바이러스로 동시트랜스펙션(cotransfect)시켰다. 14시간 후, 지시된 추출물(도 1), 메틸렌 클로라이드 추출물의 분획(도 2) 또는 개개의 분리된 화합물(도 3)과 함께, 메틸트리에놀론(methyltrienolone)의 첨가(R1881, 3x10^-10 M 최종 농도; 도 1 내지 도 3에서 검은 막대), 또는 첨가 없이(도 1 내지 도 3에서 흰색 막대) 배지를 교체하였다. 추가 48 시간 후, 세포들을 수집하고 루시페라아제 및 β-갈락토시다아제 활성을 분석하였다.

루시페라아제 활성은 루시페린을 주입하고 562nm에서 발광을 측정하여 결정하였고, 루시페라아제 활성의 표준화(normalisation)에 대해 β-갈락토시다아제 활성의 값을 사용하여 상대적인 광 단위(relative light unit, RLU)로서 표현하였다. 나타낸 모든 트랜스펙션 분석은 듀플리케이트로(in duplicate) 수행하였으며 적어도 2회 반복하였다.

P. africana의 나무껍질로부터의 다양한 추출물에서 항안드로겐성 활성을 측정하기 위해서, 추출물들은 300 ㎍/ml의 농도로 사용하였다. 결과는 도 1에 도시한다.

선택적인 메틸렌 클로라이드 추출물의 분획에서 항안드로겐성 활성을 측정하기 위해서, 30 ㎍/ml의 최종 농도에 상응하는, 2μl의 각각의 분획을 사용하였다. 분획 F6 내지 F10은 60 ㎍/ml의 최종 농도에 상응하는, 4μl로 추가로 테스트하였다. 추가의 테스트를 위해서 활성 분획 F7 및 F8을 사용하였다. 결과의 일부는 도 2에 도시한다.

선택적인 메틸렌 클로라이드 추출물의 분획 F8로부터 분리된 물질들의 억제는 안드로겐 활성의 퍼센트 억제로서 도 3에 나타낸다. 상기 물질들은 각각 30 ㎍/ml의 농도로 사용하였다.

실시예 5: 아트라릭산에 의한 인간 전립선암종 세포의 성장 억제

인간 전립선암종 세포(세포주 LNCaP)를 10% (v/v) 소태아혈청, 페니실린 (100 IU/ml) 및 스트렙토마이신 (100 IU/ml), 2 mM 글루타민 및 1 mM 피루빈산 나트륨으로 보충된 RPMI-1640 배지에서 배양하였다.

세포 성장 분석을 위해서, LNCaP 세포를 24-웰 세포 배양 플레이트에, 웰당 5 x 10³ 세포의 밀도로 씨딩하고, 5% 소태아혈청을 함유하는 RPMI-1640 배지에서 배양하였다. 2일째, 배양 배지를 교체하고, 에탄올/DMSO (대조군), 아트라릭산 (1μM 및 10μM) 또는 공지의 항안드로겐 하이드록시플루타미드 (OH-F) (0.1μM)를 가하여 세포를 처리하였다. 이틀마다 배지를 신선한 배지로 교체하고, 화합물을 새로 가하였다. 세포를 트립신화하고(trypsinized) 지시된 날짜에 카운팅 셀 챔 버(counting cell chamber)를 사용하여 계수하였다. 결과는 도 5에 도시한다.

실시예 6: 메틸벤젠 술폰아미드(= S1 )의 합성

실험식: C₁₁H₁₄O₄ (MW = 210.09)

IUPAC: 에틸-2,4-디하이드록시-3,6-디메틸벤조산염

외관 : 흰색 분말

합성 :

392mg의 아트라릭산(2mmol)을 10 ml 에탄올 중에서 118 mg 수산화칼륨 (2.1 mmol)과 함께 밤새 교반하고, 이어서 중화하였다. 용매를 회전식 증발기에서 회수하고, 잔류물을 크로마토그래피 개시 조건의 용매 혼합물에 용해시켰다. 이어서, 반응 생성물을 방법 B4에 의한 분취용 고속 액체 크로마토그래피에 의해 분리하였다.

B4

Macherey - Nagel Nucleosil? 100-5-C-18HD, 5 ㎛, 250 x 21 mm

A: 아세토니트릴 /0.1% TFA B: 물 / 0.1% TFA 등용매(Isocratic): 50% A, 50% B

22.0 ml/min

PDA: λ = 220 nm

정체 시간 : 13 분

수율: 42 mg (10%)

융점: (℃): 127

UV (MeOH) λ_max nm: 217, 265, 308

IR (KBr) ν_max cm^-1: 3450, 3100, 1620, 1310, 1280, 800

¹H-NMR (500 MHz, CDCl₃), δ(ppm):

12.05 (1H, s, C-2-OH)

6.14 (1H, s, C-5-H)

5.02 (1H, s, C-4-OH)

4.32 (2H, q, ³J = 7.0 Hz, C-1'-H)

2.41 (3H, s, C-6-Me)

2.03 (3H, s, C-3-Me)

1.34 (3H, t, ³J = 7.0 Hz, C-2'-H)

¹³C-NMR (125 MHz, CDCl₃), δ(ppm):

172.1 (C-7) 108.5 (C-3) 7.6 (C-3-Me)

163.2 (C-2) 105.4 (C-1)

157.9 (C-4) 61.2 (C-1')

140.2 (C-6) 24.6 (C-6-Me)

110.5 (C-5) 14.2 (C-2')

EI-MS (70 eV): m/z (rel. int.):

210 [M]⁺ (50), 164 (100), 136 (60)

고-정밀도 질량 측정 (HR-EI-MS):

계산값 : [M⁺]에 대하여 210.0892

실제값 : 210.0889

실시예 7 : 프로필 아트라테이트 (A2)의 합성

실험식 : C₁₂H₁₆O₄ (MW = 224.10)

IUPAC : 프로필-2,4-디하이드록시-3,6-디메틸벤조산염

외관 : 흰색 분말

합성 :

392 mg의 아트라릭산 (2)(2 mmol)을 10 ml 프로판올 중에서 118 mg 수산화칼륨 (2.1 mmol)과 함께 밤새 교반하고 이어서 중화하였다. 용매를 회전식 증발기에서 회수하고, 잔류물을 크로마토그래피 개시 조건의 용매 혼합물에 용해시켰다. 이어서, 반응 생성물을 방법 B5에 의한 분취용 고속 액체 크로마토그래피에 의해 분리하였다:

B5

Macherey - Nagel Nucleosil? 100-5-C-18HD, 5 ㎛, 250 x 21 mm

A: 메탄올 B: 물 / 0.1% TFA 등용매 : 72% A, 28% B

22.0 ml/min

PDA: λ = 220 nm

정체 시간 : 10 분

수율 : 31 mg (7%)

융점 (℃): 134

UV (MeOH) λ_max nm: 217, 262, 307

IR (KBr) ν_max cm^-1: 3450, 3000, 1650, 1310, 1200, 800

¹H-NMR (500 MHz, CDCl₃), δ(ppm):

12.09 (1H, s, C-2-OH)

6.14 (1H, s, C-5-H)

5.02 (1H, s, C-4-OH)

4.23 (2H, t, ³J = 6.7 Hz, C-1'-H)

2.41 (3H, s, C-6-Me)

2.04 (3H, s, C-3-Me)

1.73 (2H, m, ³J = 7.0 Hz, C-2'-H)

0.97 (3H, t, ³J = 7.2 Hz, C-3'-H)

¹³C-NMR (125 MHz, CDCl₃), δ(ppm):

173.3 (C-7) 108.5 (C-3) 10.8 (C-3')

163.2 (C-2) 105.4 (C-1) 7.6 (C-3-Me)

157.9 (C-4) 67.0 (C-1')

140.1 (C-6) 24.2 (C-6-Me)

110.5 (C-5) 22.0 (C-2')

EI-MS (70 eV): m/z (rel. int.):

224 [M]⁺ (31), 164 (100), 136 (44)

고-정밀도 질량 측정 (HR-EI-MS):

계산값 : [M⁺]에 대하여 224.1049

실제값 : 224.1051

실시예 8: 부틸 아트라테이트(A3)의 합성

실험식: C₁₃H₁₈O₄ (MW = 238,12)

IUPAC: 부틸-2,4-디하이드록시-3,6-디메틸벤조산염

외관 : 흰색 분말

합성 :

392 mg의 아트라릭산 (2)(2 mmol)을 10 ml 부탄올 중에서 118 mg 수산화칼륨 (2.1 mmol)과 함께 밤새 교반하고 이어서 중화하였다. 용매를 회전식 증발기에서 회수하고, 잔류물을 크로마토그래피 개시 조건의 용매 혼합물에 용해시켰다. 이어서, 반응 생성물을 방법 B7에 의한 분취용 고속 액체 크로마토그래피에 의해 분리하였다:

B7

Macherey - Nagel Nucleosil? 100-5-C-18HD, 5 ㎛, 250 x 21 mm

A: 메탄올 B: 물 / 0.1% TFA 시간[분] A[%] B[%] 0 75 25 20 75 25 25 100 0

22.0 ml/min

PDA: λ = 220 nm

정체 시간 : 13분

수율 : 51 mg (11%)

융점 (℃): 117

UV (MeOH) λ_max nm: 217, 265, 308

IR (KBr) ν_max cm^-1: 3440, 3000, 1700, 1310, 1200, 800

¹H-NMR (500 MHz, CDCl₃), δ(ppm):

12.09 (1H, s, C-2-OH)

6.20 (1H, s, C-5-H)

4.97 (1H, s, C-4-OH)

4.32 (2H, t, ³J = 7.0 Hz, C-1'-H)

2.41 (3H, s, C-6-Me)

2.04 (3H, s, C-3-Me)

1.69 (2H, m, ³J = 7.3 Hz, C-2'-H)

1.42 (2H, m, ³J = 7.3 Hz, C-3'-H)

0.90 (3H, t, ³J = 7.3 Hz, C-4'-H)

¹³C-NMR (125 MHz, CDCl₃), δ(ppm):

167.9 (C-7) 108.6 (C-3) 19.3 (C-3')

163.1 (C-2) 105.5 (C-1) 13.5 (C-4')

157.8 (C-4) 66.3 (C-1') 7.5 (C-3-Me)

140.1 (C-6) 24.1 (C-6-Me)

110.5 (C-5) 30.5 (C-2')

EI-MS (70 eV): m/z (rel. int.):

238 [M]⁺ (31), 164 (100), 136 (30)

고-정밀도 질량 측정 (HR-EI-MS):

계산값 : [M⁺]에 대하여 238.1226

실제값 : 238.1226

실시예 9: N- 부틸벤젠술폰아미드 및 아트라릭산의 하이브리드(A4)의 합성

실험식: C₁₇H₁₉O₆NS (MW = 365.09)

IUPAC: 2-[(페닐술포닐)아미노]에틸 2,4-디하이드록시-3,6-디메틸벤조산염

외관 : 노란빛을 띤 분말

합성 :

1.822g의 2,4-디하이드록시-3,6-디메틸벤조산(0.01 mol) 및 3.522g N-(2-하이드록시에틸)벤젠술폰아미드를 0.05g의 황산 농축물(conc.)의 첨가와 함께 30ml 오르토-톨루엔 중에서 5시간 동안 환류 하에서 처리하였다. 중화 후, 용매를 회전식 증발기에서 회수하고, 잔류물을 크로마토그래피 개시 조건의 용매 혼합물에 용해시켰다. 이어서, 반응 생성물을 방법 B9에 의한 분취용 고속 액체 크로마토그래피에 의해 분리하였다:

B9

Macherey - Nagel Nucleosil? 100-5-C-18HD, 5 ㎛, 250 x 21 mm

A: 메탄올 B: 물 / 0.1% TFA 등용매 : 60% A, 40% B

22,0 ml/min

PDA: λ = 220 nm

정체 시간 : 14분

수율 : 30mg (4%)

융점 (℃): 151

UV (MeOH) λ_max nm: 220, 270, 305

IR (KBr) ν_max cm^-1: 3450, 3310, 2930, 1640, 1310, 1280, 1160, 1100

¹H-NMR (500 MHz, CDCl₃), δ(ppm):

11.69 (1H, s, C-2-OH)

7.79 (2H, d, ³J = 7.0 Hz, C-2''-H 및 C-6''-H)

7.48 (1H, t, ³J = 7.0 Hz, C-4''-H)

7.41 (2H, t, ³J = 7.0 Hz, C-3''-H 및 C-5''-H)

6.13 (1H, s, C-5-H)

5.05 (1H, s, C-4-OH)

4.68 (1H, s, N-H)

4.31 (2H, t, ³J = 5.5 Hz, C-1'-H)

3.32 (2H, t, ³J = 5.5 Hz, C-2'-H)

2.31 (3H, s, C-6-Me)

2.03 (3H, s, C-3-Me)

¹³C-NMR (125 MHz, CDCl₃), δ(ppm):

167.0 (C-7) 133.6 (C-4'') 104.2 (C-1)

163.0 (C-2) 130.2 (C-3'' 및 C-5'') 64.5 (C-1')

153.1 (C-4) 127.8 (C-2'' 및 C-6'') 43.0 (C-2')

142.0 (C-6) 111.6 (C-5) 24.6 (C-6-Me)

141.4 (C-1'') 109.9 (C-3) 7.5 (C-3-Me)

EI-MS (70 eV): m/z (rel. int.):

365 [M]⁺ (23), 170 (26), 164 (100), 141 (26), 136 (24), 77 (27)

고-정밀도 질량 측정 (HR-EI-MS):

계산값 : [M⁺]에 대하여 365.0933

실제값 : 365.0933

실시예 10: 게라닐 아트라테이트(A5)의 합성

실험식: C₁₉H₂₆O₄ (MW = 318.18)

IUPAC: (2E)-3,7-디메틸옥타-2,6-디엔-1-일 2,4-디하이드록시-3,6-디메틸벤조산염

외관 : 노란빛을 띤 분말

합성 :

392 mg의 아트라릭산 (2)(2 mmol)을 10 ml 게라니올 중에서 118 mg 수산화칼륨 (2.1 mmol)과 함께 밤새 교반하고 이어서 중화하였다. 용매를 회전식 증발기에서 회수하고, 잔류물을 크로마토그래피 개시 조건의 용매 혼합물에 용해시켰다. 이어서, 반응 생성물을 방법 B8에 의한 분취용 고속 액체 크로마토그래피에 의해 분리하였다:

B8

Macherey - Nagel Nucleosil? 100-5-C-18HD, 5 ㎛, 250 x 21 mm

A: 아세토니트릴 / 0.1% TFA B: 물 / 0,1% TFA 등용매 : 50% A, 50% B

22.0 ml/min

PDA: λ = 220 nm

정체 시간 : 27분

수율 : 44 mg (7%)

UV (ACN) λ_max nm: 220, 270, 310

IR (KBr) ν_max cm^-1: 3410, 2930, 1640, 1440, 1270

¹H-NMR (500 MHz, MeOH-d4), δ(ppm):

6.20 (1H, s, C-5-H)

2.45 (3H, s, C-6-Me)

5.34 (1H, t, ³J = 6.7 Hz, C-2'-H)

5.10 (1H, t, ³J = 6.7 Hz, C-6'-H)

4.07 (2H, d, ³J = 6.5 Hz, C-1'-H)

2.10 (2H, q, ³J = 8.3 Hz, C-5'-H)

2.01 (2H, t, ³J = 8.3 Hz, C-4'-H)

1.99 (3H, s, C-3 Me)

1.65 (3H, s, C-3'-Me)

1.64 (3H, s, C-7'-Me)

1.59 (3H, s, C-8')

¹³C-NMR (125 MHz, MeOH-d4), δ(ppm):

175.6 (C-7) 132.4 (C-7') 104.9 (C-1) 24.3 (C-6-Me)

164.8 (C-2) 125.1 (C-2') 59.4 (C-1') 17.7 (C-5')

161.3 (C-4) 124.9 (C-6') 40.7 (C-4') 16.2 (C-3'-Me)

141.5 (C-3') 111.3 (C-5) 27.5 (C-8') 7.9 (C-3-Me)

139.4 (C-6) 109.7 (C-3) 25.8 (C-7'-Me)

EI-MS (70 eV): m/z (rel. int.):

318 [M]⁺ (24), 164 (100), 136 (38)

고-정밀도 질량 측정 (HR-EI-MS):

계산값 : [M⁺]에 대하여 318.1834

실제값 : 318.1829

실시예 11: 이소프로필 아트라테이트(A6)의 합성

실험식: C₁₂H₁₆O₄ (MW = 224.10)

IUPAC: 이소프로필-2,4-디하이드록시-3,6-디메틸벤조산염

외관 : 흰색 분말

합성 :

392 mg의 아트라릭산 (2)(2 mmol)을 10 ml 이소-프로판올 중에서 118 mg 수산화칼륨 (2.1 mmol)과 함께 밤새 교반하고 이어서 중화하였다. 용매를 회전식 증발기에서 회수하고, 잔류물을 크로마토그래피 개시 조건의 용매 혼합물에 용해시켰다. 이어서, 반응 생성물을 방법 B6에 의한 분취용 고속 액체 크로마토그래피에 의해 분리하였다:

B6

Macherey - Nagel Nucleosil? 100-5-C-18HD, 5 ㎛, 250 x 21 mm

A: 메탄올 B: 물 / 0.1% TFA 등용매 : 70% A, 30% B

22.0 ml/min

PDA: λ = 220 nm

정체 시간 : 12분

수율 : 38 mg (8%)

융점 (℃): 90

UV (MeOH) λ_max nm: 217, 265, 300

IR (KBr) ν_max cm^-1: 3400, 3000, 1650, 1310, 1200, 800

¹H-NMR (500 MHz, CDCl₃), δ(ppm):

12.11 (1H, s, C-2-OH)

6.13 (1H, s, C-5-H)

5.22 (1H, m, ³J = 6.3 Hz, C-1'-H)

2.40 (3H, s, C-6-Me)

2.03 (3H, s, C-3-Me)

1.31 (6H, d, ³J = 6.2 Hz, C-1'-Me)

¹³C-NMR (125 MHz, CDCl₃), δ(ppm):

171.6 (C-7) 108.5 (C-3) 7.6 (C-3-Me)

163.2 (C-2) 105.7 (C-1)

157.8 (C-4) 69.2 (C-1')

140.1 (C-6) 24.3 (C-6-Me)

110.4 (C-5) 22.0 (C-1'-Me)

EI-MS (70 eV): m/z (rel. int.):

224 [M]⁺ (35), 164 (100), 136 (39)

고-정밀도 질량 측정 (HR-EI-MS):

계산값 : [M⁺]에 대하여 224.1049

실제값 : 224.1051

실시예 12: 에스트로겐 수용체에 대한 작용제로서 아트라릭산

기능성 분석을 위해서, 정보제공 유전자(p2ERE-TATA-luc)로서 루시페라아제에 대한 유전자를 코딩하는 발현 플라스미드와, 인간 ERα 또는 인간 ERβ를 코딩하는 발현 플라스미드로, 유의한 양의 기능성 에스트로겐 수용체를 나타내지 않는 CV1 세포를 동시트랜스펙션시켰다. 에스트로겐 수용체로 일시적인 트랜스펙션 실험을 하기 위해서, 무 페놀 레드(phenol red-free) DMEM 배지(인비트로겐)를 덱스트란-코팅된 숯으로 이미 정제된 10% (v/v) 혈청, 1% (v/v) 글루타민, 1% (v/v) 피루빈산 나트륨 및 1% (v/v) 페니실린 스트렙토마이신으로 보충하였다. 7일 후, 세포를 웰당 1.5x10⁵의 세포 밀도로 6-웰 플레이트(Nunc, Roskilde, Denmark)에 씨딩하였다. 24시간 후, 상기 세포를 인산칼슘법에 따라, 2㎍의 정보제공 유전자-인코딩 발현 플라스미드, 0.2㎍의 ERα- 인코딩 또는 ERβ-인코딩 발현 플라스미드로 및, 표준화(normalisation)의 이유로 0.2㎍의 거대세포바이러스-유도 β-갈락토시다아제로 트랜스펙트하였다. 14 시간 후, 에스트라디올과 함께 또는 없이, 그러나 어떠한 경우라도 상응하는 양의 아트라릭산은 첨가하고, 배양 배지를 신선한 배지로 교체하였다. 48 시간 후, 세포를 수집하고 루시페라아제 및 β-갈락토시다아제 활성에 대해 분석하였다. 모든 트랜스펙션 분석은 듀플리케이트로 수행하고, 적어도 2회 반복하였다.

결과는 도 8 및 도 9에 도표로 나타낸다. 이러한 실험적 결과는 두 에스트로겐 수용체의 활성이 아트라릭산에 의해 영향을 받는다는 것을 나타낸다. 놀랍게도, 두 에스트로겐 수용체의 호르몬-매개 트랜스활성화는 아트라릭산에 의해 영향을 받지 않았다. 그러나, 만일 에스트라디올이 존재하지 않는 경우, 상기 정보제공 유전자의 에스트로겐-반응성 발현은 측정된 루시페라아제 활성으로부터 명백한 바와 같이 10μM 또는 100μM에 의해, 투여량-의존 방식으로 활성화됐다. 따라서, 더 높은 농도에서 아트라릭산은 양 에스트로겐 수용체의 작용제이다.

Claims (16)

1. 전립선비대증(benign prostatic hyperplasia), 전립선암종(prostate carcinoma) 또는 척수연수 근위축증(spinobulbar muscular atrophy)의 치료를 위한, 하기 일반식의 2,4-디하이드록시-3-메틸벤조산염을 하나 이상 포함하는 것을 특징으로 하는 약제.

   

   여기서 R₁은 C₁ 내지 C₄ 알킬이고, R₂는 수소 또는 메틸, 에틸 또는 프로필 잔기(residue)를 나타낸다.
2. 청구항 1에 있어서, 상기 전립선암종은 안드로겐 길항제에 치료 내성(therapy-resistant)을 가진 것을 특징으로 하는 약제.
3. 청구항 2에 있어서, 상기 안드로겐 길항제는 비칼루타미드, 플루타미드, 하이드록시플루타미드, 닐루타미드 및 사이프로테론 아세테이트를 포함하는 그룹에서 선택되는 것을 특징으로 하는 약제.
4. 하기 일반식의 2,4-디하이드록시-3-메틸벤조산염.

   

   여기서 R₂는 수소이고, R₁은 이소-프로필, 게라닐(geranyl) 및 에틸벤젠술폰아미드 잔기를 포함하는 그룹에서 선택되거나, 또는

   R₂는 메틸 잔기이고, R₁은 게라닐 및 에틸벤젠술폰아미드 잔기를 포함하는 그룹에서 선택되거나, 또는

   R₂는 에틸 잔기이고, R₁은 이소-프로필, 게라닐 및 에틸벤젠술폰아미드 잔기를 포함하는 그룹에서 선택되거나, 또는

   R₂는 프로필 잔기이고, R₁은 이소-프로필, 게라닐 및 에틸벤젠술폰아미드 잔기를 포함하는 그룹에서 선택된다.
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