KR101220455B1 - 산왕거미 추출물을 포함하는 면역세포증가용 약학적 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 산왕거미 추출물을 포함하는 면역세포증가 또는 암세포 전이 억제 또는 간염 바이러스 증식 억제용 약학적 조성물에 관한 것으로서, 가열 처리한 산왕거미에 물, C₁ 내지 C₄의 저급알코올 또는 이들의 혼합용매 가용 추출물을 유효성분으로 포함하는 면역세포증가 또는 암세포 전이 억제용 약학적 조성물 및 식품 조성물을 제공한다. 상세하게는 상기 조성물이 면역세포를 증가시키거나 암세포의 전이를 억제시키는 것을 특징으로 한다. 보다 상세하게는 상기 면역세포는 NK 세포이고, 상기 암세포는 폐암세포인 것을 특징으로 한다. 또한 본 발명은 가열 처리한 산왕거미에 물, C₁ 내지 C₄의 저급알코올 또는 이들의 혼합용매 가용 추출물을 유효성분으로 포함하는 간염 바이러스 증식 억제용 식품 조성물을 제공한다. 상세하게는 상기 조성물이 간염 바이러스 증식과 관련된 유전자 발현을 억제하는 것을 특징으로 한다. 보다 상세하게는 간염 바이러스는 B형 간염 바이러스인 것을 특징으로 한다.

산왕거미, 면역세포증가, 암세포 전이 억제, 간염 바이러스

Description

야베스 추출물을 포함하는 면역세포증가용 약학적 조성물{Pharmaceutical compositions containing the extracts of Araneus ventricosus for increasing immune cell number}

본 발명은 산왕거미 추출물을 유효성분으로 포함하는 면역세포증가 또는 암세포 전이 억제 또는 간염 바이러스 증식 억제용 약학적 조성물에 관한 것이다.

면역의 초기개념은 단지 어떤 전염성 환자의 재감염에 대한 보호기능으로 인식되었지만 오늘날에 와서는 외부로부터 침입하는 미생물, 동종의 조직이나 체내에서 불필요한 산물 등을 비자기적인 항원으로 오인하여 이 항원에 대하여 특이적으로 반응하는 항체를 만들어 이들 비자기적인 항원을 제거함으로써 그 개체의 항상성을 유지하는 현상을 정의하였다. 이러한 자연저항성과 취득저항성을 포함한 생체방어기전의 개념은 더욱 확대되어 최근에는 면역방법의 하나인 종양면역의 개념으로 발전하였다. 이 개념에서는 암의 생성을 1950년대에 Gross와 Foley가 밝힌 종양특이 이식항원(tumor specific transplantation antigen; TSTA)에 대해 1960년대의 Thomas와 Burnet은 TSTA가 면역감시기능의 통제를 벗어나 체내의 면역계에서 이상 세포를 비자기로 인식하지 못하고 초기에는 보호하여 암 성장을 돕게 되어 결국암세포의 확산을 초기에 면역기능이 인식하지 못한다고 주장함으로써 이에 면역학적 치료는 주로 T 임파구에 의한 세포성면역반응과 NK 세포에 의한 비 특이적 자연살상 세포반응에 의해 암세포를 표적항원으로 인식하고, 암세포를 파괴시키는 방법으로 발전하고 있다.

간염은 주로 바이러스에 감염되어 발병되는데 간염을 일으키는 바이러스는 A형, B형, C형, D형, E형의 다섯 종류가 보고되어 있다. 그러나 이중 A형과 E형 간염 바이러스는 급성 간염을 유발하며 만성 간질환은 일으키지 않으므로 임상적으로 크게 문제가 되지는 않는다. 그러나 우리나라에서 발생되는 만성 바이러스성 간질환의 대부분의 원인은 B형 및 C형 간염 바이러스이며, 특히 B형 간염 바이러스 양성자는 전체 인구의 약 5-10%이며, 전체 바이러스성 만성 간질환 환자의 70-80%를 차지하고 있다. B형 간염은 감염된 환자의 약 30%가 간경화로 진행되고, 5~10%가 간암으로 악화돼 환자의 고통은 물론 경제적·사회적으로 큰 손실을 주기 때문이다. B형 간염 바이러스는 DNA 바이러스로 B형 간염은 주로 혈액을 통해 감염되기 때문에 혈청형 간염이라고도 불리며, 물을 통해 감염되는 감염성 간염인 A형 간염과 구별된다. 그 밖에 B형 간염은 혈액과 침, 정액, 모유, 복수, 위액, 소변 등에서 발견된다.

B형 간염 바이러스(HBV)는 헤파드나바이러스(hepadnavirus)에 속하며 부분적으로 이중가닥 DNA를 가진 막을 가진 바이러스로 직경이 42nm이다. HBV는 내부에 게놈을 함유하는 코어(core)와 외부에 B형 간염 표면항원(HBsAg)이 있는 리포 단백 질막으로 구성되어 있다. HBV 게놈은 4개의 오픈 리딩 프레임(open reading frame) 또는 유전자를 포함하고 있는데 코어(core) 유전자는 HBV의 뉴클레오켑시드를, pol(P) 유전자는 DNA 중합효소를, 표면(surface; S) 유전자는 막단백질의 생산에 관여한다. S 유전자에는 pre-S1, pre-S2, S가 있으며 그 밖에 X 유전자가 있다. X 유전자의 기능은 정확히 정의할 수 없으나 B형 간염 바이러스의 증식을 증가시키고 세포 유전자와 바이러스 유전자의 전사를 활성화시켜서 간암의 발생에 관여한다.

한편 동양의학에서는 항암효능을 보이는 생약과 한방처방을 이용하여 주로 T cell, NK cell 및 마크로파지(macrophage) 등의 활성도를 살펴보는 연구가 활발히 진행되고 있다. 생약을 이용한 항암활성 보고는 수종의 약물 중 감초만이 유의성이 인정되었고, ICR계 생쥐를 실험동물로 하여 감초, 인삼 및 숙지황은 세포성 및 체액성 면역을 증강시키고, 오가피는 체액성면역을 증강시키나 특히 감초만이 NK cell의 활성도를 증강시킨다고 보고되고 있다.

이와 같이 생약과 한방처방 등의 천연물을 이용한 항암, 면역 조절제 및 간염 억제제의 개발이 활발히 이루어지고 있으며 이들 물질에 대한 많은 탐색이 진행되고 있다.

구운감초, 오배자, 제비꽃, 장생도라지, 산삼, 옻나무 등의 천연추출물을 포함하는 암세포 전이 억제용 조성물은 다수 출원 되었다(참조: 한국등록특허 684194호 "구운 감초 추출물을 포함하는 골질환 예방 및 치료용 약학적 조성물"; 한국등록특허 612087호 "제비꽃으로부 항암물질을 추출하는 방법"; 한국등록특허 603495 호 "암세포의 증식억제 활성을 가지는 등나무 추출물 및 이를 함유하는 조성물"; 한국등록특허 588470호 "암세포 전이를 억제하는 오배자 추출물"; 한국등록특허 550465호 "혈관신생 억제 효과를 갖는 장생도라지 추출물"; 한국등록특허 456089호 "항암활성을 갖는 산삼 추출정제액을 정제하는 방법 및 이를 함유하는 조성물"; 한국등록특허 257448호 "항암 기관분화유도 암세포전이 혈관형성억제, 항산화 및 숙취해소 작용을 하는 옻나무 추출물, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 조성물").

또한 미타리과 식물, 필란두스속 식물, 정향 등의 천연추출물을 포함하는 간염 억제용 조성물도 다수 출원되었다(참조: 한국등록특허 328467호 "마타리과 식물의 추출물을 함유하는 간기능 개선 및 간염 치료용 의약조성물"; 한국등록특허 149986호 "필란두스속 식물의 추출물을 포함하는 비형 간염치료제"; 한국등록특허 331174호 "정향 추출물을 유효성분으로 하는 Ｂ형 간염 치료제")

그러나 산왕거미로부터 면역세포 증가제 또는 암세포 전이 억제제 또는 간염 억제제를 제조하는 방법에 대한 언급은 없다.

본 발명자는 산왕거미 추출물이 면역 세포를 증가시키며, 암세포의 전이를 억제하고 B형 간염 바이러스 증식을 억제하는 것을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 산왕거미 추출물을 유효성분으로 포함하는 면역세포 증가 또는 암세포 전이 억제용 식품 또는 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

또한 본 발명의 목적은 산왕거미 추출물을 유효성분으로 포함하는 B형 간염 바이러스 증식 억제용 식품 또는 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명은 가열 처리한 산왕거미에 물, C₁ 내지 C₄의 저급알코올 또는 이들의 혼합용매 가용 추출물을 유효성분으로 포함하는 면역세포증가 또는 암세포 전이 억제용 약학적 조성물을 제공한다. 상세하게는 상기 조성물이 면역세포를 증가시키거나 암세포의 전이를 억제시키는 것을 특징으로 한다. 보다 상세하게는 상기 면역세포는 NK 세포이고, 상기 암세포는 폐암세포인 것을 특징으로 한다.

본 발명은 가열 처리한 산왕거미에 물, C₁ 내지 C₄의 저급알코올 또는 이들의 혼합용매 가용 추출물을 유효성분으로 포함하는 면역세포증가 또는 암세포 전이 억제용 식품 조성물을 제공한다. 상세하게는 상기 조성물이 면역세포를 증가시키는 거나 암세포 전이 억제시키는 것을 특징으로 한다. 보다 상세하게는 상기 면역세포는 NK 세포이고, 상기 암세포는 폐암세포인 것을 특징으로 한다.

또한 본 발명은 가열 처리한 산왕거미에 물, C₁ 내지 C₄의 저급알코올 또는 이들의 혼합용매 가용 추출물을 유효성분으로 포함하는 간염 바이러스 증식 억제용 약학적 조성물을 제공한다. 상세하게는 상기 조성물이 간염 바이러스 증식과 관련된 유전자 발현을 억제하는 것을 특징으로 하고, 상기 간염 바이러스 증식과 관련된 유전자는 간염 바이러스 DNA 중합효소(Pol) 유전자 또는 간염 바이러스 표면 단백질(SAg) 유전자 또는 간염 바이러스 X 유전자인 것을 특징으로 한다. 보다 상세하게는 상기 간염 바이러스는 B형 간염 바이러스인 것을 특징으로 한다.

또한 본 발명은 가열 처리한 산왕거미에 물, C₁ 내지 C₄의 저급알코올 또는 이들의 혼합용매 가용 추출물을 유효성분으로 포함하는 간염 바이러스 증식 억제용 식품 조성물을 제공한다. 상세하게는 상기 조성물이 간염 바이러스 증식과 관련된 유전자 발현을 억제하는 것을 특징으로 하고, 상기 간염 바이러스 증식과 관련된 유전자는 간염 바이러스 DNA 중합효소(Pol) 유전자 또는 간염 바이러스 표면 단백질(SAg) 유전자 또는 간염 바이러스 X 유전자인 것을 특징으로 한다. 보다 상세하게는 간염 바이러스는 B형 간염 바이러스인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 제1의 양태는 가열 처리한 산왕거미에 물, C₁ 내지 C₄의 저급알코올 또는 이들의 혼합용매 가용 추출물을 유효성분으로 포함하는 면역세포증가 또는 암세포 전이 억제용 약학적 조성물을 제공한다. 상세하게는 상기 조성물이 면역세포를 증가시키거나 암세포의 전이를 억제시키는 것을 특징으로 한다. 보다 상세하게는 상기 면역세포는 NK 세포이고, 상기 암세포는 폐암세포인 것을 특징으로 한 다.

본 발명에서 산왕거미는 거미목 왕거미과의 절지동물로서, 몸길이가 암컷이 20-30mm이고 수컷이 15-20mm이다. 몸 전체가 회갈색인 대형 거미이다. 머리 부분에 흰털이 밀생한다. 복부는 난형으로 위쪽 양어깨가 다소 융기되어 있다. 복부 양어깨와 등면에 나뭇잎 무늬가 있으며 검은색 선이 이 무늬의 둘레를 분명하게 경계를 지어준다. 다리는 매우 강하고 회갈색으로 더욱 짙은 회갈색의 고리무늬가 있다. 색채나 무늬에 변화가 많다. 집 부근에서부터 산에 이르기까지 광범위하게 서식하는 거미로서 눈에 잘 띄는 종류이다. 분포지역은 한국, 일본, 중국, 타이완이다. 밤에는 큰 수직의 둥근 그물을 치고 그물 중심에 머리를 위로하고 매달려 있고 낮에는 그물의 한쪽 끝의 나뭇잎이나 처마 밑에 숨어 있다. 8-9월경에는 나무껍질이나 집 주변에 어두운 색의 알주머니를 만든다.

상기 추출물은 물, 메탄올, 에탄올 등과 같은 극성용매 및 이들의 혼합용매에 가용한 추출물인 약학적 조성물을 포함한다.

이하 산왕거미 추출물을 수득하는 방법을 상세히 설명한다.

살아있는 산왕거미를 찜통에 넣고 90 내지 100℃에서 30분 내지 10시간, 바람직하게는 1시간~2시간 찐 후 상온에서 완전히 건조시킨 후 분쇄기로 간다. 상기 분쇄된 산왕거미 분쇄물을 100 내지 170℃, 바람직하게는 120~140℃에서 5분 내지 1시간, 바람직하게는 10~30분 볶는다. 30 내지 120℃에서, 상기 볶아진 산왕거미 분쇄시료 무게(g)의 2배 내지 20배, 바람직하게는 3배의 물, C₁ 내지 C₄의 저급알코올 또는 이들의 혼합용매, 바람직하게는 증류수를 부은 후, 약탕기 또는 보온통에 1시간 내지 10시간 바람직하게는 4~6시간 추출한다. 상기 추출은 약탕기에서 100 내지 120℃에서 고온추출하거나, 보온병에서 40 내지 60℃에서 저온 추출할 수 있다. 상기 산왕거미 추출물을 와트만(Whattman) 여과지로 거른 후 동결건조하여 보관한다.

본 발명의 제2의 양태는 가열 처리한 산왕거미에 물, C₁ 내지 C₄의 저급알코올 또는 이들의 혼합용매 가용 추출물을 유효성분으로 포함하는 간염 바이러스 증식 억제용 약학적 조성물을 제공한다. 상세하게는 상기 조성물이 간염 바이러스 증식과 관련된 유전자 발현을 억제하는 것을 특징으로 하고, 상기 간염 바이러스 증식과 관련된 유전자는 간염 바이러스 DNA 중합효소(Pol) 유전자 또는 간염 바이러스 표면 단백질(SAg) 유전자 또는 간염 바이러스 X 유전자인 것을 특징으로 한다. 보다 상세하게는 상기 간염 바이러스는 B형 간염 바이러스인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 약학적 조성물은 산왕거미 추출물을 0.001% ~ 99.999% 함유하는 것이 바람직하고, 0.1% 내지 90% 함유하는 것이 더욱 바람직하다. 그러나 상기와 같은 조성은 반드시 이에 한정되는 것은 아니고, 환자의 상태 및 질환의 종류 및 진행 정도에 따라 달라질 수 있다.

본 발명의 산왕거미 추출물을 포함하는 약학적 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화 되어 사용될 수 있다. 또한, 상기 산왕거미 추출물의 유효성분외에 담체, 부형제 및 희석제로 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오즈, 미정질 셀룰로오즈, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 상기 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌 글리 콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 추출물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 추출물은 1일 0.01 mg/kg 내지 10 g/kg으로, 바람직하게는 1 mg/kg 내지 1 g/kg으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수 있다. 따라서, 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내 (intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 추출물의 약학적 투여 형태는 이들의 약학적 허용 가능한 염의 형태로도 사용될 수 있고, 또한 단독으로 또는 타 약학적 활성 화합물과 결합뿐만 아니라 적당한 집합으로 사용될 수 있다.

본 발명의 제3의 양태는가열 처리한 산왕거미에 물, C₁ 내지 C₄의 저급알코올 또는 이들의 혼합용매 가용 추출물을 유효성분으로 포함하는 면역세포증가 또는 암세포 전이 억제용 식품 조성물을 제공한다. 상세하게는 상기 조성물이 면역세포 를 증가시키는 거나 암세포 전이 억제시키는 것을 특징으로 한다. 보다 상세하게는 상기 면역세포는 NK 세포이고, 상기 암세포는 폐암세포인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 제4의 양태는 가열 처리한 산왕거미에 물, C₁ 내지 C₄의 저급알코올 또는 이들의 혼합용매 가용 추출물을 유효성분으로 포함하는 간염 바이러스 증식 억제용 식품 조성물을 제공한다. 상세하게는 상기 조성물이 간염 바이러스 증식과 관련된 유전자 발현을 억제하는 것을 특징으로 하고, 상기 간염 바이러스 증식과 관련된 유전자는 간염 바이러스 DNA 중합효소(Pol) 유전자 또는 간염 바이러스 표면 단백질(SAg) 유전자 또는 간염 바이러스 X 유전자인 것을 특징으로 한다. 보다 상세하게는 간염 바이러스는 B형 간염 바이러스인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 추출물을 포함하는 조성물은 자양강장 또는 암세포 전이 억제를 위한 약제, 식품 및 음료 등에 다양하게 이용될 수 있다. 본 발명의 산왕거미 추출물을 첨가할 수 있는 식품으로는, 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강보조 식품류 등이 있고, 분말, 과립, 정제, 캡슐 또는 음료인 형태로 사용할 수 있다.

본 발명의 산왕거미 추출물 자체는 독성 및 부작용은 거의 없으므로 예방 목적으로 장기간 복용 시에도 안심하고 사용할 수 있는 약제이다.

본 발명의 상기 추출물은 자양강장 또는 암세포 전이 억제를 목적으로 식품 또는 음료에 첨가될 수 있다. 이때, 식품 또는 음료 중의 상기 추출물의 양은 일반적으로 본 발명의 건강식품 조성물은 전체 식품 중량의 0.01 내지 15 중량%로 가할 수 있으며, 건강 음료 조성물은 100 ㎖를 기준으로 0.02 내지 30 g, 바람직하게는 0.3 내지 10 g의 비율로 가할 수 있다.

본 발명의 건강 음료 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 추출물을 함유하는 것 외에 액체성분에는 특별한 제한점은 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등의 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등의 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 ㎖당 일반적으로 약 1 내지 20g, 바람직하게는 약 5 내지 12g이다.

상기 외에 본 발명의 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 조성물들은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합 하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

이하, 실시예에 의하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1 > 산왕거미(Araneus ventricosus)로부터 조성물 추출

(1) 살아있는 산왕거미를 찜통에 넣고 100℃ 정도에 1시간~2시간 정도로 찐 후 완전 건조시킨다.

(2) 찐 산왕거미를 분쇄기에 간다.

(3) 산왕거미를 120~140℃에서 10~30분 정도 볶는다.

(4) 증류수를 40~60℃ 정도로 끓여 증류수:산왕거미 = 3:1의 비율로 보온통에 4~6시간 밀봉 상태로 담궈둔다.

(5) 증류수에 담궈 두었던 산왕거미 추출물을 여과지로 거른다.

(6) 여과지로 거른 산왕거미 추출물을 동결건조하여 보관한다.

(7) 실험을 수행하기 위하여 동결건조 된 산왕거미 추출물을 3차 증류수에 녹인 후 0.45μm 멤브레인 필터(membrane filter)로 투과시켜 투과된 수용액을 실험에 사용하였다.

< 실시예 2 > 비장( Spleen ) 및 흉선( thymus )의 림프구( lymphocyte population)에서 면역세포의 변화

(1) 재료 및 방법

1) 암세포 및 배양

실험에 사용된 암주는 전이성이 매우 강한 쥐 멜라닌세포(mouse melanocyte)인 B16(F10)를 사용하였다. 배양액은 3차 증류수에 L-글루타민(glutamine)이 포함된 RPMI 1640 파우더(GIBCO) 한봉지 (1리터용, 10.4g), 우태아혈청(fetal bovine serum; FBS, Flow Laboratories inc., Mclen, VA) 100㎖, NAHCO₃ 2g 및 페니실린(penicilin) 10만 단위, 스트렙토마이신(streptomycin) 100㎎을 넣어 용해시킨 후 0.1N 염산으로 pH를 7.2로 조절하여 전체를 1리터가 되게 한 다음 여과하여 제조하였고, 냉장고 (4-6℃)에 보관하면서 사용하였다.

2) 형광활성세포분리(Fluoresence Activated Cell Sorter; FACS)에 의한 비장(Spleen) 및 흉선(Thymus)에서의 면역세포 변화 측정

채혈이 끝난 C57/BL6 마우스를 경추 골절(cervical dislocation)로 치사시킨 후 비장(spleen) 및 흉선(thymus)을 적출하여 RPMI 1640 프리 배지에 넣은 후 주사기 피스톤 뒷부분으로 가볍게 문질러 조직을 분쇄하였다. 100 메쉬(mesh) (sigma)에 여과하여 15㎖ 코니컬 튜브(conical tube, Becton dickinson)에 옮겨 0.83 % NH₄Cl 용액을 넣고 5분간 배양시켜 적혈구를 용혈시켰다. RPMI 프리 배지로 2회 세척하고 트리판 블루(trypan blue)로 염색하여 살아있는 세포(cell)수가 1×10⁶cells/㎖가 되도록 RPMI 1640 - 2% FBS(Sigma)로 조정한 후 5㎖ FACS 튜브 (Becton Dickinson, U.S.A)에 넣고 원심분리하여 상층액을 제거하였다. 0.3㎖의 0.2% 보바인 알부민(bovine abumin) 용액을 넣고 혼합한 후 원심분리(1300rpm, 5min)한 다음 각각의 1차 항체를 5㎖ FACS 튜브에 넣고 혼합한 후 40분간 얼음에서 반응시켰다. 원심분리하여 상층액을 제거한 다음 0.5ml의 0.2% 보바인 알부민(bovine albumin) 용액을 넣고 항체를 세척한다. 원심분리한 후 0.5ml의 0.2% 보바인 알부민(bovine albumin) 용액을 넣고 혼합한 후 FACS Calibur (Becton Dickinson, U.S.A)으로 분석하여 전체 비장세포와 작은 림프구(small lymphocyte) 영역 및 림프모구(lymphoblast) 영역을 구분하여 그 중의 T cell, B cell, natural killer cell의 비율 (gated,%)을 산출한다. 이때 사용한 항체는 CD8 (cytotoxic T cell), CD19 (B cell), NK1.1 (natural killer cell)를 사용하였다.

(2) 결과

산왕거미 추출물의 면역학적 효능을 검사하기 위하여 우선적으로 산왕거미 추출물에 의한 면역세포의 개체(population) 변화량을 조사하였다. 증류수에 녹인 후 0.45μm 멤브레인 필터(membrane filter)로 투과시켜 미생물의 오염을 최소화한 검체를 C57/BL6 마우스에 경구 투여 후 2주일 간 C57/BL6 마우스의 이상여부를 관찰하였다. 산왕거미 추출물을 투여 한 시험군은 산왕거미 추출물 투여 하지 않은 대조군 C57/BL6 마우스와 비교하여 육안 상 어떠한 이상 증상을 보이지 않아 산왕거미 추출물에 의한 C57/BL6 마우스 독성은 없는 것으로 사료되었다. 또한 검체 투여 후 2주 후에 C57/BL6 마우스로부터 비장(spleen)과 흉선(thymus)을 적출하여 각 기관에서의 림프구(lymphocyte population)을 FACS Calibur(Becton Dickinson, U.S.A)으로 분석하였다(표 1). 표 1에서 보여지는 바와 같이 산왕거미 추출물은 전체적으로 림프구(lymphocyte)의 수 (비장(Spleen)의 경우 8.2%, 흉선(Thymus)의 경우 13.4%) 증가시켰다. 그중에서도 특히, NK 세포 수의 증가는 119%의 증가율을 보여 산왕거미 추출물의 효능이 T 세포 및 NK 세포의 증가를 유도하여 세포성 면역을 조절하는데 중요한 기능을 수행 할 수 있을 것이라 사료된다.

< 표 1 > 림프구(lymphocyte population)에서의 면역세포수

(단위: X 10⁶)

	비장(Spleen)		흉선(Thymus)
	대조구	처리구	대조구	처리구
Total cell No.	73 ± 1.5	79 ± 2.7	71 ± 1.9	80.5 ± 3.5
T cell No.	29 ± 0.5	31 ± 1.5	70.5 ± 3.5	81 ± 5.1
B cell No.	40 ± 2.8	42 ± 1.5	-	-
NK cell No.	2.1 ± 2.2	4.6 ± 1.5	-	-
NKT cell No.	1.1 ± 1.7	1.9 ± 1.5	-	-

산왕거미 추출물에 의한 세포성 면역의 조절은 바이러스 및 세균과 같은 미생물의 침입에 의한 염증을 조절하는데 매우 중요한 기능을 할 수 있을 것이라 여 겨지며 이와 더불어 NK 세포 수의 증가는 산왕거미 추출물이 암세포의 증식을 억제 할 수 있는 기능을 가질 수 있을 것이라 사료된다.

< 실시예 3 > 산왕거미 추출물에 의한 암세포 전이억제 효과

(1) 재료 및 방법

폐 전이 증식(Pulmonary colonization) 측정

B16(F10) 멜라노마(melanoma) 세포주를 이용하여 C57/BL6 마우스 당 1X 10⁵ cells을 PBS에 부유시켜 마우스의 꼬리 혈관에 주사를 하였다. 주사 후 3일 후와 6일 후에 각각 동결 건조된 산왕거미 추출액 1g을 증류수에 녹여 C57/BL6 마우스에 경구투여 하였다. 암 이식 14일 후에 마우스를 치사시킨 다음 개복하여 폐에 전이된 암세포 콜로니(colony)를 계산하였다.

(2) 결과

표 1의 결과로써 산왕거미 추출물이 세포성 면역에 관여하는 림프구(lymphocyte)의 조절을 통해 다양한 면역조절을 할 수 있을 것이라 생각되어 산왕거미 추출물에 의한 암세포의 전이억제 효과를 검사하였다. B16(F10) 멜라노마(melanoma) 세포는 C57/BL6 마우스의 폐에 전이하여 콜로니를 형성할 수 있는 매우 전이성이 높은 암세포주로 산왕거미 추출물을 투여한 C57/BL6 마우스에 1X 10⁵/ 마리의 B16(F10) 멜라노마(melanoma) 세포를 꼬리 혈관(tail-vein)에 투여하였다. B16(F10) 멜라노마(melanoma) 세포를 C57/BL6 마우스에 이식 후 3일 후와 6일 후에 산왕거미 추출액을 C57/BL6 마우스에 경구투여 하고 2주일 후에 C57/BL6 마우스로부터 폐를 적출하여 폐에 형성된 B16(F10) 멜라노마(melanoma) 세포의 콜로니의 수를 산왕거미 추출물을 투여하지 않은 C57/BL6 마우스의 폐에서 형성된 콜로니의 수와 비교하였다(도 1). 도 1에서 보이는 바와 같이 산왕거미 추출물은 암세포의 전이를 83.2% 억제하는 것으로 나타내었다. 이는 표 1에서 유추한 바와 같이 NK 세포의 증가와 매우 밀접한 연관성이 있는 것으로 생각되며 이는 산왕거미 추출액이 마우스의 면역능을 강화시켜 암세포의 전이를 억제 할 수 있을 뿐만 아니라 향후 항암제로의 기능을 수행 할 수 있을 것이라 생각된다.

< 실시예 4 > 산왕거미 추출물에 의한 B형 간염 바이러스 증식 억제 효과

(1) 실험 재료 및 시료의 제조

살아있는 산왕거미를 찜통에 넣고 찐 후 상온에서 완전히 건조시켜 분쇄기로 분쇄한 산왕거미 분쇄물을 120~140℃에서 10~30분 볶는다. 볶아진 산왕거미 분쇄시료 무게(g)의 3배의 증류수를 부은 후 4~6시간 추출하여 추출물을 와트만(Whattman) 여과지로 거른 후 동결 건조하였다.

실험을 수행하기 위하여 동결건조 된 산왕거미 추출물을 DMEM 배지에 녹인 후 0.45μm membrane filter로 투과시켜 투과된 수용액을 실험에 사용하였다.

(2) 세포 배양

실험에 사용된 세포는 인간 간암세포에 B형 간염 바이러스의 게놈을 삽입하여 계속적으로 B형 간염 바이러스를 생산할 수 있는 HepG 2.2.15세포를 이용하였다. HepG 2.2.15 세포를 배양하기 위해서는 3차 증류수에 DMEM 배지(GIBCO), 우태아혈청(fetal bovine serum; FBS, Hyclone) 100㎖, NAHCO3 2g 및 페니실린(penicilin) 10만 단위, 스트렙토마이신(streptomycin) 100㎎을 넣어 용해시킨 후, 냉장고(4-6℃)에 보관하면서 사용하였다.

(3) PCR

HepG 2.2.15세포에 산왕거미 추출물을 처리 후 3시간 간격으로 12시간까지 배양액 및 HepG 2.2.15 세포를 수득하였다. 수득된 배양액 및 HepG 2.2.15 세포를 30,000 rpm에서 2시간정도로 원심분리하여 세포밖으로 방출된 바이러스 및 세포를 수득하였다. 바이러스 및 세포에서 DNA를 분리한 후 B형 간염 바이러스 각각의 유전자를 증폭하기 위한 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다.

(4) B형간염 파티클(particle) 측정

세포 밖으로 방출된 바이러스 양을 측정하기 위하여 HepG 2.2.15세포에 산왕거미 추출물을 농도별로 6시간 처리 후 배양액을 수득하였다. 수득된 배양액에 포함된 B형 바이러스표면항원(HBsAg)의 양을 Anti-HBs ELISA 키트(녹십자)를 사용 하여 상대적인 B형 바이러스 양을 측정하였다.

(5) 결과

산왕거미 추출물이 B형 간염 바이러스의 증식에 미치는 영향을 조사하기 위하여 산왕거미 추출물을 2%가 되도록 HepG 2.2.15 세포 증식배지(DMEM 배지)로 희석 한 후, HepG2.2.15세포에 첨기 후 12시간 동안 배양하였다. 각 3시간 간격으로 배양액 및 HepG 2.2.15 세포를 수득 후 30,000 rpm에서 2시간정도로 원심분리하여 세포밖으로 방출된 바이러스 및 HepG 2.2.15세포를 수득하였다. 바이러스 및 세포에서 DNA를 분리한 후 B형 간염 바이러스 각각의 유전자를 증폭하기 위한 특이적 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다. 도 3에서 보여지는 바와 같이 산왕거미 추출물은 B형간염 바이러스 DNA 중합효소(Pol.)와 표면단백질(sAg)의 유전자 발현을 매우 효과적으로 억제하는 것으로 보여지며, 간암발생에 중요한 역할을 수행하는 X 유전자의 발현도 억제하는 것으로 보여진다.

도 3의 결과로써 산왕거미 추출물은 B형 간염바이러스의 유전자 발현을 효과적으로 억제할 수 있음을 알 수 있었다. 유전자 발현억제가 B형 간염 바이러스 생성을 감소시킬 수 있는지를 알아보기 위하여 도 4에서 보여지는 바와 같이 산왕거미 추출물을 농도별로 희석 후 HepG 2.2.15 세포에 6시간 처리하였다. 산왕거미 추출물을 HepG 2.2.15 세포에 6시간 처리하였을 때 바이러스 유전자의 발현을 급격히 감소시킬 수 있음을 도 3에서 알 수 있었다. 도 4의 결과로 알 수 있듯이 산왕거미 추출물은 2%의 농도에서 약 60% 정도의 바이러스 양이 감소하는 것으로 보여지며 농도가 높을수록 바이러스 양은 농도비례로 감소하는 것으로 보여진다.

이상의 결과로부터 산왕거미 추출물은 B형 간염 바이러스의 증식에 필요한 유전자를 억제하여 증식에 필요한 단백질의 합성을 감소시켜 B형 간염 바이러스의 증식을 효과적으로 억제 할 수 있음을 알 수 있었다. 이는 향후 B형 간염 치료제로써의 응용가능성을 알 수 있는 중요한 기초자료로 이용할 수 있다.

제제예 1. 주사제제의 제조

실시예 1의 산왕거미 추출물.........................10㎎

소디움 메타비설파이트..............................3.0㎎

메틸파라벤.........................................0.8㎎

프로필파라벤.......................................0.1mg

주사용 멸균증류수...................................적량

상기의 성분을 혼합하고 통상의 방법으로 2㎖로 한 후, 2㎖ 용량의 앰플에 충전하고 멸균하여 주사제를 제조한다.

제제예 2. 정제의 제조

실시예 1의 산왕거미 추출물..........................200㎎

유당................................................100㎎

전분................................................100㎎

스테아린산 마그네슘..................................적량

상기의 성분을 혼합하고 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다.

제제예 3. 캡슐제의 제조

실시예 1의 산왕거미 추출물.........................10㎎

유당................................................50㎎

전분................................................50㎎

탈크.................................................2㎎

스테아린산 마그네슘.................................적량

상기의 성분을 혼합하고 통상의 캡슐제의 제조방법에 따라서 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조한다.

제제예 4. 액제의 제조

실시예 1의 산왕거미 추출물..........................1000㎎

설탕..................................................20g

이성화당..............................................20g

레몬향................................................적량

정제수를 가하여 전체 1000㎖로 맞추었다. 통상의 액제의 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 갈색병에 충전하고 멸균시켜 액제를 제조한다.

상기 조성비는 비교적 기호음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 수요계층, 수요국가, 사용 용도 등 지역적, 민족적 기호도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.

제제예 5. 건강식품의 제조

실시예 1의 산왕거미 추출물...........................1000 ㎎

비타민 혼합물..........................................적량

비타민 A 아세테이트....................................70 ㎍

비타민 E..............................................1.0 ㎎

비타민 B1............................................0.13 ㎎

비타민 B2............................................0.15 ㎎

비타민 B6.............................................0.5 ㎎

비타민 B12............................................0.2 ㎍

비타민 C...............................................10 ㎎

비오틴.................................................10 ㎍

니코틴산아미드........................................1.7 ㎎

엽산...................................................50 ㎍

판토텐산 칼슘.........................................0.5 ㎎

무기질 혼합물...........................................적량

황산제1철............................................1.75 ㎎

산화아연.............................................0.82 ㎎

탄산마그네슘.........................................25.3 ㎎

제1인산칼륨............................................15 ㎎

제2인산칼슘............................................55 ㎎

구연산칼륨............................................90 ㎎

탄산칼슘.............................................100 ㎎

염화마그네슘........................................24.8 ㎎

상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 비교적 건강식품에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 건강식품 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 과립을 제조하고, 통상의 방법에 따라 건강식품 조성물 제조에 사용할 수 있다.

제제예 6. 건강음료의 제조

실시예 1의 산왕거미 추출물.........................1000 ㎎

구연산..............................................1000 ㎎

올리고당..............................................100 g

매실농축액..............................................2 g

타우린..................................................1 g

정제수를 가하여 전체.................................900 ㎖

통상의 건강음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간동안 85℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2ℓ용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 본 발명의 건강음료 조성물 제조에 사용한다.

상기 조성비는 비교적 기호음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 수요계층, 수요국가, 사용 용도 등 지역적, 민족적 기호도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.

본 발명은 산왕거미 추출물을 유효성분으로 포함하는 면역세포증가 또는 암세포 전이 억제 또는 간염 바이러스 증식 억제용 약학적 조성물에 관한 것으로서, 산왕거미 추출물은 NK 세포수를 119% 증가시켰으며, 쥐의 멜라노사이트(mouse melanocyte)의 전이를 83.2% 억제시켜 암세포의 전이 및 면역세포증가제로서 의약 및 건강보조식품으로 사용할 수 있다. 또한 B형간염 바이러스의 증식에 필요한 유전자를 억제하여 증식에 필요한 단백질의 합성을 감소시켜 B형 간염 바이러스의 증식을 효과적으로 억제함으로써 간암발생을 근본적으로 차단시키는데 매우 효과적일 뿐 아니라 간염의 발생을 막아 향후 간암 및 간염의 치료제로 매우 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 C57/BL6 마우스 폐조직의 B16(F10) 세포의 콜로니형성을 나타낸다. (A) B16(F10) 세포 무처리된 산왕거미 추출물 처리 쥐의 폐조직 (B) B16(F10) 세포 처리된 쥐의 폐조직 (C) B16(F10) 세포 처리된 산왕거미 추출물 처리 쥐의 폐조직.

도 2는 대조구와 산왕거미 추출물 처리구의 C57/BL6 마우스 폐조직의 B16(F10) 세포 콜로니 수.

도 3은 B형 간염 바이러스(HBV) 복제 동안 유전자 발현 패턴을 나타낸다. Pol : DNA 중합효소 유전자, sAG : 표면단백질 유전자, HBX : X 유전자, core : 코어 유전자, β-actin : β-액틴(actin) 유전자

도 4는 B형 간염 바이러스(HBV) 파티클(particle) 생산에 있어서 산왕거미 추출물에 대해 농도-의존적으로 억제받는 것을 나타낸다.

Claims (18)

1. 삭제
2. 가열 처리한 산왕거미에 물, C₁ 내지 C₄의 저급알코올 또는 이들의 혼합용매 가용 추출물을 유효성분으로 포함하여 면역세포를 증가시키는 것을 특징으로 하는 면역세포 증가용 약학적 조성물.
3. 제 2 항에 있어서, 상기 조성물이 NK세포를 증가시키는 것을 특징으로 하는 NK 면역세포 증가용 약학적 조성물.
4. 삭제
5. 삭제
6. 가열 처리한 산왕거미에 물, C₁ 내지 C₄의 저급알코올 또는 이들의 혼합용매 가용 추출물을 유효성분으로 포함하는 식품 조성물.
7. 제 6 항에 있어서, 상기 조성물이 면역세포를 증가시키는 것을 특징으로 하는 식품조성물.
8. 제 7 항에 있어서, 상기 조성물이 NK세포를 증가시키는 것을 특징으로 하는 식품조성물.
9. 제6에 있어서,

   가열 처리한 산왕거미에 물, C₁ 내지 C₄의 저급알코올 또는 이들의 혼합용매 가용 추출물은,

   살아있는 산왕거미를 찜통에 넣고 90~100℃로 30분~10시간 정도로 찐 후 완전 건조시키는 과정,

   상기 건조된 산왕거미를 분쇄기에 가는 과정,

   상기 분쇄된 산왕거미를 120~140℃에서 5분~1시간 정도 볶는 과정,

   상기 볶아진 산왕거미 분쇄시료를 물, C₁ 내지 C₄의 저급알코올 또는 이들의 혼합용매에서 추출하는 과정으로 수득된 것을 특징으로 하는 식품조성물.
10. 제6항에 있어서,

    가열처리된 산왕거미와 물, C₁ 내지 C₄의 저급알코올 또는 이들의 혼합용매의비는 1 : 2~20 인 것을 특징으로 하는 식품조성물.
11. 제2항 내지 제3항 중 어느 한 항의 약학적 조성물을 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸의 경구형 제형 또는 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액의 형태로 제형화한 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
12. 제2항 내지 제3항 중 어느 한 항의 약학적 조성물을 담체, 부형제 및 희석제와 혼합하여 제형화한 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
13. 제2항 내지 제3항 중 어느 한 항의 약학적 조성물을 희석제 또는 부형제를 혼합하여 제제화한 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
14. 제6항 내지 제10항 중 어느 한 항의 식품조성물을 분말, 과립, 정제, 캡슐 또는 음료의 형태로 한 식품조성물.
15. 제6항 내지 제10항 중 어느 한 항의 식품조성물을 향미제 또는 천연 탄수화물과 혼합하여 조성한 건강 음료 조성물.
16. 삭제
17. 삭제
18. 삭제

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