KR101217669B1

KR101217669B1 - 키노미엄 글로버섬 유래 신규 자일라나아제 및 그 생산 방법

Info

Publication number: KR101217669B1
Application number: KR1020100104097A
Authority: KR
Inventors: 이정걸; 쿠마 씽 러우샨; 임명예
Original assignee: 건국대학교 산학협력단
Priority date: 2010-10-25
Filing date: 2010-10-25
Publication date: 2013-01-02
Also published as: KR20120042408A

Abstract

본 발명은 키토미엄 글로보섬 (Chaetomium globosum) 으로부터 유래된 신규 자일라나아제 (Xylanase)의 생산 방법에 관한 것으로, 이를 코딩하는 핵산 분자, 상기 핵산 분자를 포함하는 벡터, 상기 벡터를 포함하는 형질전환체 및 상기 자일라나아제의 생산 최적화를 통해 바이오에너지의 생산, 섬유산업, 제지산업, 세제산업, 사료산업 및 식품 산업 등 다양한 용도에 적용될 수 있다.

Description

키노미엄 글로버섬 유래 신규 자일라나아제 및 그 생산 방법 {A novel xylanase from Chaetomium globosum and a method thereof}

본 발명은 신규 자일라나아제 (Xylanase), 그 효소 생산방법 및 그 용도에 관한 것이다.

자일란(Xylan)은 식물의 세포벽을 구성하고 있는 헤미셀룰로스 (Hemicellulose)의 주요 구성성분으로서 농산 및 임산 폐기물의 20 ~ 35 %를 차지하는 주요 재생 가능 자원이다. 그러므로 이를 효율적으로 분해하는 효소의 대량 생산은 식량문제, 연료문제 그리고 환경문제의 해결에 큰 도움이 될 수 있을 것이다. 전 세계의 농산 및 임산 폐자원은 매년 30억 톤 이상이며, 아시아에서만 8억 톤 이상이 생산된다. 이는 주로 셀룰로스와 헤미셀룰로스로 이루어져있어 이들의 분해에 의한 단당류의 생산은 바이오에너지 자원의 중요한 원료 생산 기술이 된다.

자일라나아제(Xylanase)는 자일란을 자일로올리고당(Xylooligosaccha- ride)나 자일로스(Xylose)로 가수 분해하는데 주요한 역할을 하는 효소로서 바이오에너지, 식품, 섬유, 제지 및 펄프 산업에 주요하게 사용되고 있다. 그러나 효소의 농도 및 활성이 산업화를 충족시킬 만큼 충분하지 못하다는 문제점이 있었기 때문에 고활성의 균주 선발과 생산성 증대에 대한 많은 연구가 진행되고 있다.

한편, 식물체의 세포벽은 셀룰로스(불용성 β-1,4-글루칸 섬유), 헤미셀룰로스 (hemicellulose, 비셀룰로스계 다당류), 리그닌(lignin, 복잡한 폴리페놀 구조의 다당류)과 같은 중합체로 구성되어 있다. 구성성분 중 셀룰로스가 가장 많이 존재하고 그 다음으로 자일란(xylan)이 주성분인 헤미셀룰로스가 많이 존재하며 이들 두 성분이 전체 식물 바이오매스의 50% 이상을 차지한다. 자일란은 β-1,4-글리코시드 결합(glycosidic bond)으로 연결된 자일로스 골격에 아세테이트(acetate) 또는 아라비노오스 (arabinose), 글루쿠론산(glucuronic acid)이 가지를 이루고 있는 이종 중합체(heteropolymer)이다.

일반적으로 자일란을 가수분해하기 위해서는 엔도-β-1,4 자일라나아제(endo-β-1,4-xylanase) [EC 3. 2. 1. 8; endo-xylanase], 베타-자일로시다아제(β-xylosidase) [EC 3. 2. 1. 37] 2종류의 효소가 필요하다. 엔도-자일라나아제가 자일란을 분해하여 자일로스, 자일로비오스 (xylobiose), 그리고 자일로-올리고당(xylo-oligosaccharide)을 생성하고 이때 분해되지 않은 자일로비오스와 자일로-올리고당은 베타-자일로시다아제에 의해 자일로오스로 전환된다.

리그노셀룰로스로 구성된 목질계 및 초본계는 각기 설탕이나 전분으로 구성된 당질계 및 전분질계의 구조와 달리 글루코오스의 급원인 셀룰로오스가 헤미셀룰로오스 및 리그닌으로 보호받는 구조로 구성되어 있고 베타-1,4 결합으로 이어진 셀룰로스 자체도 전분보다 단단한 구조를 가지고 있어 일반적으로 셀룰라제를 통한 효소적 당화율도 이론적 글루코스 수율의 20% 정도 밖에 되지 않는다 (Kim KH, Hong J. 2001. Bioresource Technology 77(2):139-144; Ko JK, Bak JS, Jung MW, Lee HJ, Kim KH. 2009. Bioresource Technology In press.; Koullas DP, Christakopoulos PKD, Macris BJ, Koukios EG. 1992. Biotechnology and Bioengineering 39:113-116). 이러한 점 때문에 반드시 물리화학적 전처리를 거쳐야 하고 전처리된 리그노셀룰로스도 많은 양의 셀룰라제를 필요로 한다 (Bak JS, Ko JK, Han YH, Lee BC, Choi IG, Kim KH. 2009. Bioresource Technology 100(3):1285-1290; Kim KH, Hong J. 2001. Bioresource Technology 77(2):139-144; Lynd LR, Laser MS, Brandsby D, Dale BE, Davison B, Hamilton R, Himmel M, Keller M, McMillan JD, Sheehan J and others. 2008. Nature Biotechnology 26(2):169-172).

따라서 바이오에탄올 생산공정의 경제성을 높이거나 경제적인 당화를 위해서는 소요되는 셀룰라제의 양을 줄이기 위해 단위 단백질 당 셀룰라제 자체의 활성을 높이거나 헤미셀룰로스의 주된 다당류인 자일란의 분해를 통해 셀룰로스에 대한 효소의 접근성을 높이기 위해 보조 효소로 자일라나아제를 첨가하여 셀룰라제의 소요량을 줄이기 위한 연구가 진행되고 있다 (Berlin A, Maximenko V, Gilkes N, Saddler J. 2007. Biotechnology and Bioengineering 97(2):287-296; Lopez MJ, Vargas-Garcia MD, Suarez-Estrella F, Nichols NN, Dien BS, Moreno J. 2007. Enzyme and Microbial Technology 40(4):794-800; Merino ST, Cherry J. 2007. Progress and challenges in enzyme development for Biomass utilization. Biofuels 108:95-120).

리그노셀룰로스로부터 바이오에탄올을 위해서는 헤미셀룰로스에 포함된 자일란의 가수분해로부터 생성되는 자일로스도 발효에 이용하는 것이 유리하다. 이를 위해 알코올로 발효하여 에탄올 수율을 상승시켜 그에 따라 경제성을 향상시키는 연구가 많이 진행되고 있으며 (Ferrari MD, Neirotti E, Albornoz C, Saucedo E. 1992. Biotechnology and Bioengineering 40(7):753-759; Kumar A, Singh LK, Ghosh S. 2009. Bioresource Technology 100(13):3293-3297) 그 중간 산물인 자일리톨의 생산하는 것에 관한 연구가 활발하다 (Choi J-H, Moon K-H, Ryu Y-W, Seo JH. 2000. Biotechnology Letters 22:1625-1628; Latif F, Rajoka MI. 2001. Bioresource Technology 77(1):57-63; Parajo JC, Dominguez H, Dominguez JM. 1997. Xylitol production from Eucalyptus wood hydrolysates extracted with organic solvents. Process Biochemistry 32(7):599-604).

그리고 제지산업에서는 펄핑(pulping) 과정에서(Ates S, Atik C, Ni YH, Gumuskaya E. 2008. Turkish Journal of Agriculture and Forestry 32(6):561-570; Whitmire D, Maiti B. 2002. Chemical Engineering Communications 189(5):608-622), 또는 섬유산업에서 삼베나 린넨의 연화 과정에서 자일라나아제가 사용되고 있다(Csiszar E, Urbanszki K, Szakacs G. 2001. Journal of Molecular Catalysis B-Enzymatic 11(4-6):1065-1072; Polizeli M, Rizzatti ACS, Monti R, Terenzi HF, Jorge JA, Amorim DS. 2005. Applied Microbiology and Biotechnology 67(5):577-591).

자일란이 가수분해되어 생성되는 자일로올리고당(xylooligosaccharide)은 다른 올리고당보다 열이나 산에 대해 안정하고 가수분해 활성저하 효과를 가지고 있어서 식품의 부패방지 및 보존효과를 가지고 있으므로 여러 가지 식품의 가공에 널리 이용되고 있는데(Parajo JC, Garrote G, Cruz JM, Dominguez H. 2004. Trends in Food Science & Technology 15(3-4):115-120) 앞서서 자일리톨을 예로 들었듯이, 자일라나아제를 이러한 공정에 적용하기도 한다(Beg QK, Kapoor M, Mahajan L, Hoondal GS. 2001. Applied Microbiology and Biotechnology 56(3-4):326-338; Yang CH, Yang SF, Liu WH. 2007. Journal of Agricultural and Food Chemistry 55(10):3955-3959). 특히 알려진 기능성 올리고당 중 모든 면에서 자일로 올리고당이 가장 우수하다는 것이 알려져 있으며 고가에 거래되고 있다 (Gibson GR, Probert HM, Van Loo J, Rastall RA, Roberfroid MB. 2004. Nutrition Research Reviews 17(2):259-275; Gullon P, Moura P, Esteves MP, Gtrio FM, Dominguez H, Parajo JC. 2008. Journal of Agricultural and Food Chemistry 56(16):7482-7487).

자일란은 식물 세포벽을 이루는 중합체인 셀룰로오스와 리그닌과 공유 혹은 비공유결합으로 연결되어 있어 식물마다 그 함량은 다르지만 적게는 7-12%부터 많게는 15-30%의 함량을 지닌다 (Haltrich D, Nidetzky B, Kulbe KD, Steiner W, 1996. Bioresource Technology 58(2):137-161). 이렇듯 자일란은 다른 중합체와 연결하여 있는 형태이기 때문에 물질마다 다양한 상태로 존재한다. 경질목(hardwood)을 구성하는 헤미셀룰로오스의 70-80%를 구성하며 4-오-메틸 알파 디 글루쿠로노피라노실(4-O-methyl-α-D-glucuronopyranosyl)를 기본체로 갖는 오-아세틸-4-오-메틸글루쿠로노자일란의 경우, D-글루쿠로노실 단위는 4번째 곳이 메틸화 되어 2나 3의 베타 디 자일로피라노실기(β-D-xylopyranosyl)와 연결되며 이들 중 일부는 물에 용해성을 가진다 (Coughlan MP, Hazlewood GP. 1993. Biotechnology and Applied Biochemistry 17:259-289).

글루쿠로노아라비노자일란 (Glucuronoarabionoxylans)은 연질목에 4-오-메틸 알파 디 글루쿠로노피라노실(4-O-methyl-α-D-glucuronopyranosyl)기로 동일한 위와 기본체를 가지나 십 베타-디-자일로피라노실 단위 (ten β-D-xylopyranosyl)에 알파-엘-아라비노푸라노실(α-L-arabinofuranosyl)이 달린 형태이다. 이들은 경질목의 자일란처럼 아세틸화 되어있지는 않은데 푸라노사이드 구조 때문에 이미 산성화되어 있기 때문이다. 대표적인 이 둘을 자일란이라고 일컫고 있다.

종래에 자일라나아제의 생산을 위해서 바실러스 (Bacillus)속과 아스퍼질러스(Aspergillus)속의 미생물이 주로 연구되었다. 그러나 효소의 농도 및 활성이 산업화를 충족시킬 만큼 충분하지 못하다는 문제점이 있다. 그러므로 고활성 자일라나아제를 고농도로 생산하는 균주의 개발이 절실히 요구되고 있다.

본 발명은 상기의 문제점을 해결하고 상기의 필요성에 의하여 안출된 것으로서 본 발명의 첫 번째 목적은 고활성 자일라나아제를 유전자를 제공하는 것이다.

본 발명의 두 번째 목적은 상기 유전자로부터 발현된 자일라나아제를 제공하는 것이다.

본 발명의 세 번째 목적은 상기 자일라나아제의 유전자를 포함한 재조합 발현벡터를 제공하는 것이다.

본 발명의 네 번째 목적은 형질 전환된 재조합 대장균을 포함하는 모든 형질전환 균주를 제공하는 것이다.

본 발명의 다섯 번째 목적은 형질 전환된 재조합 대장균을 이용한 재조합 자일라나아제를 제공하는 것이다.

본 발명의 여섯 번째 목적은 재조합 자일라나아제의 생산 최적화방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 자일라나아제를 제공한다.

본 발명의 일 구체 예에 있어서, 상기 키토미엄 글로보섬는 키토미엄 글로보섬 (Chaetomium globosum) CBS 148.51인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

본 발명의 일 구체 예에 있어서, 상기 자일라나아제는 엔도-베타-1,4 자일라나아제인 것이 바람직하고, 상기 자일라나아제는 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열의 효소 단백질 뿐 아니라 이들 단백질에 하나 이상의 치환, 결손, 역위, 전위 등과 같은 돌연변이를 통하여 본 발명의 목적인 자일란 분해 활성을 가지는 모든 변이 단백질을 포함한다.

본 발명의 또 다른 일 구체예에 있어서, 상기 자일라나아제는 유전자 코드 디제러시를 고려하여 서열번호 2의 염기서열과 바람직하게는 80%, 더욱 바람직하게는 85%, 더더욱 바람직하게는 90%, 가장 바람직하게는 95% 상동성을 가지는 것이 바람직하다.

또, 본 발명에는 서열번호 1의 아미노산서열을 가진 자일라나아제를 코딩하는 자일라나아제 유전자가 포함되고, 그 유전자서열로서는 서열번호 2로 표시되는 것을 들 수 있다. 또, 이들 서열번호 2의 염기서열을 변이시켜서 얻게 되는 상기한 변이 자일라나아제를 코딩하는 변이 자일라나아제도 본 발명에 관한 자일라나아제 유전자에 포함된다.

또, 본 발명에는, 상기 자일라나아제 유전자를 함유하는 재조합벡터, 상기 재조합벡터에 의해서 형질전환된 형질전환체가 포함된다. 또한, 본 발명에는, 이 형질전환체를 배양하여, 얻게 되는 배양물로부터 자일라나아제를 분리하는 것을 특징으로 하는 자일라나아제의 제조방법이 포함된다.

또한 본 발명은 자일란 기질에 상기 본 발명의 효소를 처리하여 자일란을 당화하는 방법을 제공한다.

또 본 발명은 상기 본 발명의 효소를 유효성분으로 포함하는 자일란 당화용 조성물을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.

본 발명의 자일라나아제 유전자는 키토미엄 글로보섬의 균체로부터 분리된 것이다. 먼저, 자일라나아제 유전자를 가진 균주로부터 염색체 DNA를 취득한다.

다음에, 설계한 올리고뉴클레오타이드를 프라이머로 하고, 키토미엄 글로보섬 균주의 염색체 DNA를 주형으로 해서 폴리머라제 연쇄반응(PCR)을 행하여, L-람노오스 이성화효소 유전자를 부분적으로 증폭한다. 이와 같이 해서 얻게 된 PCR 증폭 단편은 키토미엄 글로보섬 균주의 자일라나아제 유전자에 100% 가까운 상동성을 가진 단편으로서, 콜로니하이브리디제이션을 행할 때의 프로브로서 높은 S/N비를 기대할 수 있는 동시에, 하이브리디제이션의 스트린전시(stringency)제어를 용이하게 한다. 상기의 PCR 증폭 단편을 적당한 시약을 사용해서 표지하고, 상기 염색체 DNA라이브러리에 대해서 콜로니 하이브리디제이션을 행하여, 자일라나아제 유전자를 선발한다.

상기의 방법에 의해 선발된 대장균으로부터 알칼리법(Current Protocols in Molecular Biology, 1권, 161페이지, 1994년)을 사용해서 플라스미드를 회수함으로써, 자일라나아제 유전자를 함유하는 DNA단편을 얻을 수 있다. 또한, 상기 방법에 의해 염기서열을 결정한 후에는, 상기 염기서열을 가진 DNA단편의 제한효소에 의한 분해에 의해 조제한 DNA단편을 프로브로 해서 하이브리다이즈함으로써 본 발명의 전체 유전자를 얻는 것이 가능하다. 서열번호 2에는 본 발명의 자일라나아제 유전자의 염기서열을 서열번호 1에는 상기 유전자가 코딩하는 아미노산 서열을 표시한다.

본 발명의 형질전환된 미생물은, 본 발명의 재조합벡터를, 상기 재조합벡터를 제작할 때에 사용한 발현벡터에 적합한 숙주 속에 도입함으로써 얻게 된다. 예를 들면 대장균 등의 세균을 숙주로서 사용하는 경우는, 본 발명에 관한 재조합벡터는, 그 자신이 숙주 속에서 자율복제 가능한 동시에, 프로모터, 자일라나아제 유전자를 함유하는 DNA 및 전사종결서열 등의 발현에 필요한 구성을 가진 것임이 바람직하다. 본 발명에 사용된 발현벡터로서는 pET28a 벡터를 사용하였으나 상기의 요건을 만족하는 발현벡터이면 어느 것이나 사용가능하다.

본 발명에 관한 자일라나아제의 제조는, 이것을 코딩하는 유전자를 가진 재조합벡터에 의해 숙주를 형질전환해서 얻은 형질전환체를 배양하고, 배양물(배양균체 또는 배양상청액)속에 유전자 산물인 자일라나아제를 생성 축적시켜, 배양물로부터 효소를 취득함으로써 행하여진다.

자일라나아제의 취득 및 정제는, 얻게 되는 배양물중으로부터, 균체 또는 상청액을 원심 회수하여, 균체파쇄, 친화성크로마토그래피, 양이온 또는 음이온교환크로마토그래피 등을 단독으로 또는 조합함으로써 행할 수 있다.

본 발명자는 높은 수율로 자일라나아제를 제조할 수 있는 효소를 개발하고자 키토미엄 글로보섬으로부터 자일라나아제의 유전자를 클로닝 하였다

전기 유전자를 삽입한 재조합 균주 의해 가수분해될 수 있는 대상의 구체적인 예로는 식물의 줄기, 잎, 짚, 속대, 겨, 손상된 곡류, 과일, 야채류 등과 가공 후의 껍질, 종자, 잎, 송이, 껍질, 착즙박 등이 포함된다. 보다 구체적으로 예를 들면, 한정되지는 않으나 옥수수 외피(corn hull), 옥수수 속대(corn cop),사탕수수 착즙박(sugarcane bagasse), 볏짚(rice straw) 쌀겨(rice husk) 및 미강(rice bran) 등이 있다. 상기 대상물을 본 발명의 효소로 가수분해함으로써 다양한 당류로 전환시킬 수 있다. 따라서 환경오염을 방지하면서 이들 농업 잔존물을 재활용할 수 있는 장점이 있다.

또한, 본 발명의 효소에 의해 가수분해될 수 있는 크라프트 펄프의 예로는 이에 한정되지는 않으나 사탕수수 착즙박 펄프, 유칼리투스 펄프 및 소나무 펄프 등이 있다. 상기 크라프트 펄프를 본 발명의 효소로 가수분해함으로써 크라프트 펄프 내 자일란의 함량을 감소시켜 펄프의 광도와 표백도를 향상시킬 수 있다.

이하, 본 발명을 보다 구체적으로 설명하고자 한다.

본 발명의 자일라나아제는 다음의 특징을 갖는다: (1) 최적 온도가 40℃; (2) 최적 pH가5.5; (3) 분자량이 약 24.6kDa; (4) Mn²⁺ 또는 Co²⁺ 존재 시 활성의 증가하며, 바람직하게는, 본 발명의 자일라나아제는 최적 온도가 35-45℃, 최적 pH가 4.5-7.0이고, 보다 바람직하게는 최적 온도가 40℃이고, 최적 pH가 약 5.5이다.

본 발명의 자일라나아제는 1mM Mn²⁺ 또는 Co²⁺ 존재 시 활성이 각각 1.46배, 1.30배 증가한다.

본 발명에서 얻어진 키토미엄 글로보섬 유래 자일라나아제의 K_m 값은 약 0.243 mMml^-1, V_max 값은 약 4529 molmin^-1, k _cat/K_m 값은 7638 s^-1이다.

본 발명에서 고활성 자일라나아제를 생산하므로 자일란 당화에 이용될 수 있고, 본 발명의 균주로부터 생산된 자일라나아제의 생산량을 증가시킴으로써 바이오에너지 생산, 섬유산업, 제지산업, 세제산업, 사료산업 및 식품 산업에 있어 저 칼로리 식품의 제조와 음식물 쓰레기의 발효 등 다양한 산업에 기여할 수 있다.

도 1은 키토미엄 글로보섬 균주로부터 유래된 자일라나아제 유전자를 포함하는 발현벡터의 제조방법을 나타내는 도이다.
도 2는 키토미엄 글로보섬균주로부터 유래된 자일라나아제의 SDS-PAGE 젤 사진이다.
도 3(a)는 키토미엄 글로보섬 균주로부터 유래된 자일라나아제의 온도에 따른 반응활성을 나타낸 그래프이다.
도 3(b)는 키토미엄 글로보섬 균주로부터 유래된 자일라나아제의 pH에 따른 반응활성을 나타낸 그래프이다.
도 4는 키토미엄 글로보섬 균주로부터 유래된 자일라나아제의 L-람노오스 기질 농도에 따른 효소 활성을 나타낸 그래프이다.

이하, 비한정적인 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명한다. 단 하기 실시예는 본 발명을 설명하기 위한 의도로 기재된 것으로서 본 발명의 범위는 하기 실시예에 의하여 제한되는 것으로 해석되지 아니한다.

실시예 1: 자일라나아제의 유전자 클로닝

키토미엄 글로보섬(KACC No. 41239)를 25℃에서 3일간 배양하고, 원심분리(8000g, 10분)하여 균체를 수득하였다. 전기 수득된 균체로부터 게놈 DNA를 분리하고, 키토미엄 글로보섬 자일라나아제를 암호화하는 유전자의 염기서열을 이용하여 프라이머1 F-5'GAA TTC TTC CCC TTC AAC GGG A-3'(서열번호 3)와 프라이머2 R-5'AAG CTT TTA CGA GAC GGT GAT GGA-3'(서열번호 4)를 제작하여 PCR을 행하였다. PCR 산물 즉, 키토미엄 글로보섬에서 증폭된 자일라나아제를 포함한 유전자를 pGEM T-easy 벡터에 삽입하여 염기서열을 분석하였다.

실시예 2: 재조합 발현 벡터 및 재조합 균주 제조

실시예 1에 따른 자일라나아제를 암호화하는 유전자를 이용하여, 자일라나아제를 대장균에서 대량으로 발현시키기 위하여, 발현 벡터 pET28a(Qiagen, USA)의 EcoR과 Hind III 부위에 상기 효소 유전자를 삽입한 후 대장균 BL21(DE3) (Novagen Madison, WI)에 형질 전환시켰다 (도 1).

실시예 3: 재조합자일라나아제의 발현 및 순수 분리

상기 실시예 2에서 재조된 재조합 균주를 LB 배지에 접종하고 37℃에서 24시간 동안 배양한 다음 SDS-PAGE 젤에서 발현된 단백질을 확인하였다 (도 2).

상기 실시예2의 방법으로 발현시킨 재조합 자일라나아제를 정제하기 위하여, 재조합 균주 배양액을 원심분리 (8000×g, 10분)하여 균체만을 모은 후, 초음파처리하여 대장균의 세포벽을 파쇄하고, 20,000×g에서 20분간 원심분리 하여 침전물(균체)을 제거하고 상등액을 수득하였다. 상등액을 수득한 후, 최종적으로 Ni-NTA 컬럼 (Qiagen, USA)을 이용한 컬럼 크로마토그래피를 수행하여, 재조합 자일라나아제를 순수 분리하였다 (도 2).

실시예 4: 자일라나아제의 특성 실험

상기 실시예 4에서 분리된 L-람노오스 이성화효소의 물리 화학적 특성을 조사하였으며, 기질로서 자일란(Sigma, St. Louis, MO)를 사용하였다.

실시예 4-1: 최적 온도

자일라나아제의 활성에 최적 온도을 측정하기 위하여, 자일라나아제를 50mM 말레이트 완충액 (pH 7)에서 1 시간 동안 35℃, 40℃, 45℃, 50℃, 55℃, 60℃ 또는 65℃에서 1 mM Mn²⁺ 존재 또는 부재 하에서 반응시키면서, 일정간격으로 시료를 채취하여 잔존 활성을 측정하였다. 효소의 잔존 활성은 시료를 채취하여 환원당을 이용한 DNS법으로 측정하였다. 본 발명의 자일라나아제는 40℃에서 최적온도가 형성되었다 (도 3a).

실시예 4-2: 최적 pH

최적 pH의 측정은 40℃에서 다음의 완충액 (50mM)을 사용하여 실시하였다: 소디움 아세테이트/아세트산 완충액 (pH 4.0-5.0), 말레이트 완충액 (pH 5.0-7.0) 및 Tris-HCl 완충액 (pH 7.0-10.0). 시료를 채취하여 실시예 4-1의 방법으로 효소 활성을 측정하였다. 도 3에서 확인할 수 있듯이, 자일라나아제의 최적 pH는 40℃에서 5.5 이었다.

실시예 4-3: 금속이온의 효과

순수 정제된 자일라나아제에 최종농도 10mM의 EDTA를 처리하여 24시간 이상 방치 후에 50mM 말레이트 완충액으로 투석한 후 본 실험을 위한 효소 용액으로 사용하였다. 최종농도 1mM의 MgCl₂, MnCl₂, CoCl₂, ZnCl₂, CaCl₂, FeSO₄, CuSO₄, KCl, HgCl₂, 또는 BaCl₂와 함께 5분 동안 50 mM 말레이트 완충액에서 효소를 전 배양한 후 효소의 잔존 활성을 측정하였다. 1mM 농도에서 다양한 금속의 자일라나아제 활성에 대한 영향은 표 1에 나타내었다. Mn²⁺ 또는 Co²⁺ 첨가는 대조군에 대하여 각각 1.46배 및 1.30배 활성을 증가시켰다.

표 1은 다양한 금속의 자일라나아제 활성에 대한 영향을 나타낸 표이다.

실시예 4-4: 자일라나아제의 동역학적 매개변수

다양한 농도의 자일란 (0 - 10%)를 기질로 하여 40℃, pH 5.5 (50mM 말레이트 완충액)에서 5분 동안 1mM Mn²⁺의 존재 하에서 효소를 반응시킨 후, 비선형 회귀분석을 통하여 동역학적 매개변수를 측정하였다 (도 4). 키토미엄 글로보섬으로부터 유래된 자일라나아제의 자일란에 대한 K_m 값은 0.243 mg min^-1, V_max 값은 4529mol min^-1, k _cat/K_m 값은 7638 S^-1로 결정되었다. 이는 현재까지 보고된 해당 효소 중 높은 자일라나아제의 전환속도 및 촉매 활성에 해당한다.

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자일란 기질에 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열을 가지는 자일라나아제를 40℃, pH 5.5에서 처리하여 자일란을 당화하는 방법.
제 7항에 있어서, 상기 방법은 1mM 망간 이온 존재하에서 수행하는 것을 특징으로 하는 자일란을 당화하는 방법.