KR101212251B1 - 돼지의 장내 미생물 진단용 ｄｎａ 칩, 칩을 포함하는 키트 및 키트를 이용한 진단방법 - Google Patents

돼지의 장내 미생물 진단용 ｄｎａ 칩, 칩을 포함하는 키트 및 키트를 이용한 진단방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 돼지 장내 미생물 진단용 DNA 칩, 칩을 포함하는 키트 및 키트를 이용한 진단방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 돼지의 장내 미생물 분석용 DNA 칩을 통해 돼지의 질병을 예측하고, 항생제, 생균제, 항생제 대체제와 같은 사료 첨가제의 효과를 정확히 분석할 수 있다.

Description

돼지의 장내 미생물 진단용 ＤＮＡ 칩, 칩을 포함하는 키트 및 키트를 이용한 진단방법 {DNA chip for diagnosing microbiota of pig gut, kit comprising the chip and diagnostic method using the kit}
본 발명은 돼지 장내 미생물 진단용 DNA 칩, 칩을 포함하는 키트 및 키트를 이용한 진단방법에 관한 것이다.
한미자유무역협정(FTA) 체결로 우리나라 양돈산업은 글로벌 시대로 도약해야 하는 무한 경쟁의 본격적인 체제로 들어서게 되었다. 이에 따라 값싼 농축산물의 수입에 대응하기 위하여 새로운 기술 개발로 고품질, 고부가가치의 신제품을 개발하지 않고서는 국제 경쟁력을 확보할 수 없다. 또한, 국민소득의 증가와 문화 수준의 향상으로 건강에 대한 일반 소비자들의 관심이 증가되어 양돈 산업에 있어서도 무 항생제 친환경 돈육, 기능성 돈육을 생산하거나, 육질과 맛이 뛰어난 고품질, 위생적인 측면에서 차별화된 청정 돈육을 생산할 수 있다면 FTA 체제하에서 양돈농가의 국제 경쟁력을 크게 향상시킬 수 있을 것으로 판단된다.
돼지에서 가장 많이 발생되고 있는 이유후소모성설사(Post-weaning Multisystemic Wasting Syndrome; PMWS)와 소화기 질병의 43%를 차지하는 대장균성 설사 등의 장 관련 질병은 신생자돈부터 이유자돈에 이르기까지 광범위하게 발생하며, 특히 생체기능이나 방어능력이 완전하게 성숙하지 않은 분만 직후의 포유자돈의 경우 폐사율이 매우 높고, 회복이 되어도 대부분 위축돈이 되어 양돈 농가에 막대한 손실을 주는 원인이 되고 있다. 항생제는 질병방지와 성장촉진 등 다양한 목적으로 가축에 대하여 무절제한 사용과 투약기간의 미준수로 항생제 다제 내성균의 출현을 초래하게 되었고 또한 항생제의 축산물 내 잔류로 인하여 축산물을 통한 인체에 미치는 영향이 크게 우려되고 있다. 이와 같은 이유에 기인하여 사람에게 위해 요소인 항생제 내성균이 사람에게 전파되지 않는 안전축산물을 생산하면서 동물의 성장 촉진 기능을 수행하는 항생제 대체 생리활성 물질이나 생균제의 사용이 증가하는 추세이다. 그러나 항생제 대체 생리활성 물질과 생균제의 기능에 대한 과학적인 분석이 미흡한 실정이고, 일반 축산 농가에서는 개발된 대체제가 어떤 효능이 있는지를 정확하게 확인하지 못한 상태에서 제공받아 사용하고 있는 실태이다. 이와 같은 비과학적인 사용 실태를 개선하기 위해서는 항생제 대체 생리활성 물질이나 생균제의 성능을 정확히 측정할 수 있는 장내 미생물 진단 DNA 칩 기술 개발이 절실히 요구되고 있다.
최근까지 장내 미생물의 분포(culture independency)에 대한 분석이 어려웠기 때문에 돼지 장내 미생물 전체를 대상으로 하는 프로필 변화에 대한 연구가 미흡했다. 그러나 돼지 장내 미생물 프로필의 분석기술의 개발을 통해 양돈 사료에 첨가되고 있는 항생제, 생균제, 항생제 대체제와 같은 사료 첨가제의 효과를 정확히 분석할 수 있을 것으로 예상된다. 또한, 장 관련 질병을 예측, 예단하기 위한 돼지 장관에 공생하는 유익, 유해한 미생물 유전자가 집적되어 있는 DNA 칩은 국내외적으로 전무한 실정이다. 16S rDNA 유전자를 이용한 장내 미생물 진단 DNA 칩 기술 개발은 질병의 예측, 예단을 가능하게 함으로써 양돈 농가의 생산성 향상에 기여하고 나아가 상용 DNA 칩 생산을 위한 기반을 제공할 수 있을 것이다.
이와 같은 기술적 배경 하에서, 본 발명자들은 돼지의 장내 미생물을 분석하는 DNA 칩을 개발하기 위하여 예의 노력한 결과 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
결국, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 돼지의 장내 미생물을 분석하는 DNA 칩을 제공하는 데 있다.
본 발명이 이루고자 하는 또 다른 기술적 과제는 상기 DNA 칩을 포함하는 돼지의 장내 미생물 분석용 키트를 제공하는 데 있다.
본 발명이 이루고자 하는 또 다른 기술적 과제는 상기 DNA 칩을 이용한 돼지의 장내 미생물 분석방법을 제공하는 데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명에서는 서열번호 1 내지 747로 이루어지는 군에서 선택된 하나 이상의 프로브를 포함하는 가축의 장내 미생물 분석용 DNA 칩이 제공될 수 있다.
일 측면에 따르면, 상기 장(gut)은 맹장, 결장 또는 직장에서 선택되는 하나 이상일 수 있다.
본 발명의 다른 측면에 따르면, 서열번호 1 내지 747로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 프로브를 포함하는 돼지의 장내 미생물 분석용 조성물; 돼지로부터 추출된 시료 중의 폴리핵산을 증폭하는데 사용하는 포워드와 리버스 프라이머 쌍; 상기 조성물에 함유된 프로브와 돼지로부터 추출된 시료 중에 존재하는 폴리핵산 또는 이의 증폭된 산물 사이에 혼성화 반응을 유도하는 완충액; 및 상기 혼성화 반응에 의해 유도된 하이브리드를 세척하기 위한 용액을 포함하는 돼지의 장내 미생물 분석용 키트가 제공될 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 돼지의 장내에서 유래한 시료로부터 폴리핵산을 분리하는 단계; 상기 폴리핵산을 프라이머 쌍으로 증폭하는 단계; 상기 증폭된 DNA를 표지물질로 라벨링하면서 시험관 전사(in vitro transcription)하는 단계; 상기 표지물질로 라벨링된 전사체(transcript)를 서열번호 1 내지 747로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 프로브와 혼성화시키는 단계; 및 상기 혼성화된 하이브리드를 분석하는 단계를 포함하는 돼지의 장내 미생물 분석방법이 제공될 수 있다.
일 실시예에 따르면, 상기 하이브리드의 분석 결과 맹장에서 시겔라 플렉레리(Shigella flexneri ), 결장 및 직장에서 리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes)가 유의적으로 높게 검출되는 것을 정상인 상태로 판정할 수 있다.
일 실시예에 따르면, 상기 하이브리드의 분석 결과 맹장에서 패칼로박테리움 프로스니치(Faecalobacterium prausnitzii), 결장 및 직장에서 리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes)가 유의적으로 높게 검출되는 것을 설사구(diarrhea)로 판정할 수 있다.
일 실시예에 따르면, 상기 하이브리드의 분석 결과 아네로플라스마 아박토클라스티쿰(Anaeroplasma abactoclasticum), 클로스트리디움 쵸베이(Clostridium chauvoei), 클로스트리디움 렙텀(Clostridium leptum), 델프티아 아시도보란스( Delftia acidovorans ), 락토바실러스 안트리( Lactobacillus antri ), 무렐라 글리세리니( Moorella glycerini ), 필리팍터 알로시스(Filifactor alocis ) 및 슈도산토모나스 수워네시스( Pseudoxanthomonas suwonensis )로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상이 유의적으로 높게 검출되는 것을 정상인 상태로 판정할 수 있다.
일 실시예에 따르면, 상기 하이브리드의 분석 결과 클로스트리디움 쵸베이(Clostridium chauvoei ) 및 무렐라 글리세리니(Moorella glycerini)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상이 유의적으로 높게 검출되는 것을 설사구(diarrhea)로 판정할 수 있다.
일 실시예에 따르면, 상기 하이브리드의 분석 결과 상기 하이브리드의 분석 결과 락토바실러스(Lactobaccillus)의 혼성화 시그널이 직장에서 가장 높게 나타나고, 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) 또는 엔테로코커스 페시움(Enterococcus Faecium )이 유의적으로 맹장에서 가장 높게 나타나는 경우를 설사구(diarrhea)로 판정할 수 있다.
일 실시예에 따르면, 상기 하이브리드의 분석 결과 맹장에서 람프로페디아 히알리나(Lampropedia hyalina), 노스토콥시스 로바투스(Nostochopsis lobatus), 네오리케챠 리스티치(Neorickettsia risticii), 페니바실러스 아네리카누스( Paenibacillus anaericanus ), 테메로박터 나가사키엔시스( Thermaerobacter nagasakiensis ) 및 울바키아 피피엔티스(Wolbachia pipientis)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상이 유의적으로 대조구에 비해 증가한 경우 설사구로 판정할 수 있다.
일 실시예에 따르면, 상기 하이브리드의 분석 결과 맹장에서 그람음성균이면서 호기성인 균이 대조구에 비해 유의적으로 증가한 경우 설사구로 판정할 수 있다.
일 실시예에 따르면, 상기 하이브리드의 분석 결과 맹장에서 그람양성균이면서 혐기성인 균이 대조구에 비해 유의적으로 감소한 경우 설사구로 판정할 수 있다.
일 실시예에 따르면, 상기 하이브리드의 분석 결과 결장에서 바실러스 포르티스(Bacillus fortis ), 박테로이데스 프라길리스(Bacteroides fragilis ), 크리오박테리움 사이크로필럼( Cryobacterium psychrophilum ), 쿠르토박테리움 푸실럼(Curtobacterium pusillum), 프럭토바실러스 슈도피쿨뉴스(Fructobacillus pseudoficulneus), 할리스코메노박터 히드로시스(Haliscomenobacter hydrossis), 노카르디아 크라소스트리에(Nocardia crassostreae), 페니바실러스 아네리카누스( Paenibacillus anaericanus ), 라타이박터 톡시커스(Rathayibacter toxicus ) 및 테메로박터 나가사키엔시스( Thermaerobacter nagasakiensis)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상이 대조구에 비해 유의적으로 증가한 경우 설사구인 것으로 판정할 수 있다.
일 실시예 따르면, 상기 하이브리드의 분석 결과 결장에서 엔테로코커스 페시움(Enterococcus faecium), 락토바실러스 콜리노이데스(Lactobacillus collinoides), 페디오코커스 시아멘시스(Pediococcus siamensis), 스포로토마큘럼 신트로피쿰( Sporotomaculum syntrophicum ), 테메로박터 서브테라뉴스( Thermaerobacter subterraneus )로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상이 대조구에 비해 유의적으로 감소한 경우 설사구로 판정할 수 있다.
일 실시예 따르면, 상기 하이브리드의 분석 결과 직장에서 아그로미세스 얼미(Agromyces ulmi), 박테로이데스 아시디파시엔스(Bacteroides acidifaciens), 박테로이데스 스테르코리스( Bacteroides stercoris ), 비피도박테리움 유리날리스(Bifidobacterium urinalis), 브레분디모나스 인터메디아(Brevundimonas intermedia), 클로스트리디움 글리시리치니리티컴(Clostridium glycyrrhizinilyticum), 크리오박테리움 사이크로필럼(Cryobacterium psychrophilum), 컬토박테리움 푸실럼(Curtobacterium pusillum), 에게르텔라 렌타(Eggerthella lenta), 할리스코메노박터 히드로시스(Haliscomenobacter hydrossis), 락토바실러스 가스트리커스(Lactobacillus gastricus), 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum), 람프로페디아 히알리나(Lampropedia hyalina), 네오리케챠 리스티시( Neorickettsia risticii ), 노카르디아 크라소스트리에( Nocardia crassostreae ), 페니바실러스 아네리카누스( Paenibacillus anaericanus ), 팔루디박터 프로피오니시젠스( Paludibacter propionicigenes ), 프레보텔라 코프리(Prevotella copri ), 라타이박터 톡시커스( Rathayibacter toxicus ), 세라티아 마르세센스 마르세센스( Serratia marcescens subsp . marcescens ), 테메로박터 리토랄리스( Thermaerobacter litoralis ), 테메로박터 나가사키엔시스(Thermaerobacter nagasakiensis ) 및 볼바치아 피피엔티스(Wolbachia pipientis)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상이 대조구에 비해 유의적으로 증가한 경우 설사구로 판정할 수 있다.
일 실시예 따르면, 아시디필리움 오르가노보럼(Acidiphilium organovorum), 아그로미세스 랍피디스(Agromyces lapidis), 아네로필럼 아길레(Anaerofilum agile), 아쿠아박테리움 코뮤네(Aquabacterium commune), 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum), 카프노시토파 가긴비발리스(Capnocytopha gagingivalis), 클로스트리디움 글리콜리컴(Clostridium glycolicum), 클로스트리디움 렙텀(Clostridium leptum), 시아노세스 sp. 104(Cyanothece sp. 104), 데술포스포로시누스 메리디아이(Desulforosinus meridiei), 데술포로시누스 STP12(Desulfosporosinus sp. strain STP12), 플라비솔리박터 긴생기솔리(Flavisolibacter ginsengisoli), 플라비솔리박터 인셍기솔리(Flavisolibacter insengisoli), 겔리아 글루타미카(Gelria glutamica), 홀로파가 포에티다(Holophaga foetida), 이소바큘럼 멜리스(Isobaculum melis), 락토바실러스 스피체리(Lactobacillus spicheri), 락토바실러스 얼터넨시스(Lactobacillus ultunensis), 무렐라 글리세리니(Moorella glycerini), 페니바실러스 필로스페레(Paenibacillus phyllosphaerae), 페디오코커스 아시디락티치(Pediococcus acidilactici), 사이크로박터 페칼리스(Psychrobacter faecalis), 소포로토마큘럼 신트로피쿰(Sporotomaculum syntrophicum), 테피디박터 탈라시쿠스(Tepidibacter thalassicus), 테메로박터 서브테라뉴스(Thermaerobacter subterraneus) 및 테르무스 스코토덕터스(Thermus scotoductus)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상이 대조구에 비해 유의적으로 감소한 경우 설사구로 판정할 수 있다.
본 발명에 따른 가축의 장내 미생물 분석용 DNA 칩을 통해 돼지를 포함한 가축의 질병을 예측하고, 항생제, 생균제, 항생제 대체제와 같은 사료 첨가제의 효과를 정확히 분석할 수 있다.
도 1은 돼지 장내 미생물 분석을 위해 맹장, 결장, 직장으로부터의 샘플링 과정을 나타낸 사진이다.
도 2는 새로운 방식의 프로브 디자인을 위한 방법을 나타내고 있다.
도 3은 고어레이(Goarray) 소프트웨어의 알고리듬에 의한 프로브 제작과정을 보여주고 있다.
도 4는 4x2K 포맷 DNA 칩 제작 과정을 보여주고 있다. DNA 칩의 섹터(sector), 형태, 샘플 적재과정을 보여주고 있다.
도 5는 돼지 장내 미생물의 DNA 칩의 분석 결과이다. a는 대조구 맹장, b는 대조구 결장, c는 대조구 직장에서 분리한 미생물 균총으로 혼성화를 실시한 결과이다. R1-R4는 반복 실험의 결과를 나타내고 있다.
도 6은 DNA 칩을 이용한 혼성화 결과를 분석하기 위한 모식도이다.
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
본 발명에서 사용되는 용어 중 "프로브"는 본 발명에 기재된 각 미생물에 특이적인 염기서열로서, DNA 칩에 고정되어 미지의 샘플속에 존재하는 미생물의 종을 판별하는데 사용되는 폴리핵산을 의미한다. 본 발명에서는 고어레이 소프트웨어를 사용하여 디자인된 첨부의 서열목록 1 내지 747 이 표시하는 염기서열로 구성된 폴리핵산을 의미한다.
본 발명에서 사용되는 "프라이머"는 DNA칩에 고정된 상기 프로브에 혼성화시키기위한 목적으로 샘플의 DNA, 특히 본 발명에서는 미지의 미생물의 16s rDNA를 증폭하기 위한 PCR 반응에 사용되는 폴리핵산을 의미한다. 본 발명에서는 27F와 T7-1492R가 이러한 프라이머에 속한다.
본 발명에서 사용되는 "DNA칩"은 폴리핵산이 기판상에 배열된 마이크로어레이를 의미한다.
본 발명의 일 측면에 따르면, 서열번호 1 내지 747로 이루어지는 군에서 선택된 하나 이상의 프로브를 포함하는 돼지의 장(gut) 내 미생물 분석용 DNA 칩이 제공될 수 있다.
이 때, 상기 서열번호 1 내지 747은 도 2 및 도 3의 모식도와 같은 방법을 통해 디자인된 DNA 칩상의 프로브의 염기서열에 해당하는 것들이다.
DNA 칩의 분석을 위한 전체적인 개요도는 도 6에 나타나 있다. 총 2,240개의 프로브 sets에 대하여 음성대조군 프로브를 이용한 백그라운드 보정(BG correction)을 수행한 후 9개의 음성대조군 프로브를 제거하였으며, 총 738개의 프로브 세트에서 포화된(saturated) 프로브를 제외한 731개 프로브 세트에 대해 정규화(quantile normalization)를 실시하였다. 마지막으로 시그널 값이 1 이하이거나 또는 하위 5% 이하의 프로브 시그널을 가지는 미생물들은 분석 대상에서 제외하였으며 최종적으로 선별된 미생물 프로브 세트에 대해 one-way ANOVA와 Student's t-test의 통계분석을 실시하여 그 결과를 정리하였다.
일 실시예에 따르면, 상기 장(gut)은 맹장, 결장 또는 직장에서 선택되는 하나 이상일 수 있으며, 분석하고자 하는 미생물의 위치에 따라 어느 장기이든 미생물의 게놈(genomic) DNA를 추출할 수만 있으면 그 종류에 특별한 제한은 없다.
본 발명의 다른 측면에 따르면, 서열번호 1 내지 747로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 프로브를 포함하는 돼지의 장내 미생물 분석용 조성물, 돼지로부터 추출된 시료 중의 폴리핵산을 증폭하는데 사용하는 포워드와 리버스 프라이머 쌍, 상기 조성물에 함유된 프루부와 돼지로부터 추출된 시료 중에 존재하는 폴리핵산 또는 이의 증폭된 산물사이에 혼성화 반응을 유도하는 완충액 및 상기 혼성화 반응에 의해 유도된 하이브리드를 세척하기 위한 용액을 포함하는 돼지의 장내 미생물 분석용 키트가 제공될 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 돼지의 장내에서 유래한 시료로부터 폴리핵산을 분리하는 단계; 상기 폴리핵산을 프라이머 쌍으로 증폭하는 단계, 상기 증폭된 DNA를 표지물질로 라벨링하면서 시험관 전사(in vitro transcription)하는 단계, 상기 표지물질로 라벨링된 전사체(transcript)를 서열번호 1 내지 747로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 프로브와 혼성화시키는 단계 및 상기 혼성화된 하이브리드를 분석하는 단계를 포함하는 돼지의 장내 미생물 분석방법이 제공될 수 있다.
이 때, 상기 표지물질은 Cy5, Cy3, 바이오틴 결합물질, EDANS(5-(2'-아미노에틸)아미노-1-나프탈렌황산), 테트라메틸로다민(TMR), 테트라메틸로다민 이소티오시아네이트(TMRITC), x-로다민 또는 텍사스레드를 사용할 수 있으며, 특별한 제한은 없다.
일 실시예에 따르면, 상기 하이브리드의 분석 결과 맹장에서 시겔라 플렉레리(Shigella flexneri), 결장 및 직장에서 리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes )의 혼성화 시그널 (hybridization signal)이 유의적으로 높게 검출되는 것을 정상인 상태로 판정할 수 있다.
이 때, 유의적으로 높게 검출된다는 것은 반복실험을 통해 대조군에서 검출되지 않은 균주가 실험군에서 검출되는 빈도가 높다는 것을 의미한다. 본 발명에서는 이를 검증하기 위해 혼성화된 형광색소의 값을 형광색소 측정기로 분석하여 광학밀도(optical density)의 시그널 값이 1 이상인 경우 또는 one-way ANOVA와 Student's t-test의 통계분석을 수행하여 적어도 5% 이상의 확률인 경우를 유의적으로 높게 검출되는 것으로 판정하였다.
일 실시예에 따르면, 상기 하이브리드의 분석 결과 맹장에서 패칼로박테리움 프로스니치(Faecalobacterium prausnitzii), 결장 및 직장에서 리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes)의 혼성화 시그널이 유의적으로 높게 검출되는 것을 설사구(diarrhea)로 판정할 수 있다.
일 실시예에 따르면, 상기 하이브리드의 분석 결과 상기 하이브리드의 분석 결과 아네로플라스마 아박토클라스티쿰(Anaeroplasma abactoclasticum), 클로스트리디움 쵸베이(Clostridium chauvoei), 클로스트리디움 렙텀(Clostridium leptum), 델프티아 아시도보란스(Delftia acidovorans), 락토바실러스 안트리(Lactobacillus antri), 무렐라 글리세리니(Moorella glycerini), 필리팍터 알로시스(Filifactor alocis) 및 슈도산토모나스 수워네시스(Pseudoxanthomonas suwonensis)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상이 유의적으로 높게 검출(미생물을 탐지하는 프로브의 혼성화 시그널이 유의적으로 높게 검출)되는 것을 정상인 상태로 판정할 수 있다.
일 실시예에 따르면, 상기 하이브리드의 분석 결과 클로스트리디움 쵸베이(Clostridium chauvoei) 및 무렐라 글리세리니(Moorella glycerini)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상이 유의적으로 높게 검출되는 것을 설사구(diarrhea)로 판정할 수 있다.
일 실시예에 따르면, 상기 하이브리드의 분석 결과 락토바실러스(Lactobaccillus)의 혼성화 시그널이 직장에서 가장 높게 나타나고, 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum ) 또는 엔테로코커스 페시움(Enterococcus Faecium)이 유의적으로 맹장에서 가장 높게 나타나는 경우를 설사구(diarrhea)로 판정할 수 있다.
일 실시예에 따르면, 상기 하이브리드의 분석 결과 맹장에서 람프로페디아 히알리나(Lampropedia hyalina), 노스토콥시스 로바투스(Nostochopsis lobatus), 네오리케챠 리스티치(Neorickettsia risticii), 페니바실러스 아네리카누스( Paenibacillus anaericanus ), 테메로박터 나가사키엔시스( Thermaerobacter nagasakiensis ) 및 울바키아 피피엔티스( Wolbachia pipientis)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상이 유의적으로 대조구에 비해 증가한 경우 설사구로 판정할 수 있다.
일 실시예에 따르면, 상기 하이브리드의 분석 결과 맹장에서 그람음성균이면서 호기성인 균이 대조구에 비해 유의적으로 증가한 경우 설사구로 판정할 수 있다.
일 실시예에 따르면, 상기 하이브리드의 분석 결과 맹장에서 그람양성균이면서 혐기성인 균이 대조구에 비해 유의적으로 감소한 경우 설사구로 판정할 수 있다.
일 실시예에 따르면, 상기 하이브리드의 분석 결과 결장에서 바실러스 포르티스(Bacillus fortis), 박테로이데스 프라길리스(Bacteroides fragilis), 크리오박테리움 사이크로필럼(Cryobacterium psychrophilum), 쿠르토박테리움 푸실럼(Curtobacterium pusillum), 프럭토바실러스 슈도피쿨뉴스(Fructobacillus pseudoficulneus), 할리스코메노박터 히드로시스(Haliscomenobacter hydrossis), 노카르디아 크라소스트리에(Nocardia crassostreae), 페니바실러스 아네리카누스( Paenibacillus anaericanus ), 라타이박터 톡시커스(Rathayibacter toxicus ) 및 테메로박터 나가사키엔시스( Thermaerobacter nagasakiensis)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상이 대조구에 비해 유의적으로 증가한 경우 설사구인 것으로 판정할 수 있다.
일 실시예에 따르면, 상기 하이브리드의 분석 결과 결장에서 엔테로코커스 페시움(Enterococcus faecium), 락토바실러스 콜리노이데스( Lactobacillus collinoides ), 페디오코커스 시아멘시스( Pediococcus siamensis), 스포로토마큘럼 신트로피쿰( Sporotomaculum syntrophicum ), 테메로박터 서브테라뉴스( Thermaerobacter subterraneus)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상이 대조구에 비해 유의적으로 감소한 경우 설사구로 판정할 수 있다.
일 실시예에 따르면, 상기 하이브리드의 분석 결과 직장에서 아그로미세스 얼미(Agromyces ulmi ), 박테로이데스 아시디파시엔스(Bacteroides acidifaciens ), 박테로이데스 스테르코리스(Bacteroides stercoris), 비피도박테리움 유리날리스( Bifidobacterium urinalis ), 브레분디모나스 인터메디아( Brevundimonas intermedia ), 클로스트리디움 글리시리치니리티컴( Clostridium glycyrrhizinilyticum ), 크리오박테리움 사이크로필럼(Cryobacterium psychrophilum), 컬토박테리움 푸실럼( Curtobacterium pusillum ), 에게르텔라 렌타( Eggerthella lenta ), 할리스코메노박터 히드로시스( Haliscomenobacter hydrossis ), 락토바실러스 가스트리커스( Lactobacillus gastricus ), 락토바실러스 플란타럼( Lactobacillus plantarum ), 람프로페디아 히알리나( Lampropedia hyalina ), 네오리케챠 리스티시( Neorickettsia risticii ), 노카르디아 크라소스트리에( Nocardia crassostreae ), 페니바실러스 아네리카누스( Paenibacillus anaericanus ), 팔루디박터 프로피오니시젠스( Paludibacter propionicigenes ), 프레보텔라 코프리(Prevotella copri ), 라타이박터 톡시커스( Rathayibacter toxicus ), 세라티아 마르세센스 마르세센스( Serratia marcescens subsp . marcescens ), 테메로박터 리토랄리스( Thermaerobacter litoralis ), 테메로박터 나가사키엔시스(Thermaerobacter nagasakiensis ) 및 볼바치아 피피엔티스(Wolbachia pipientis)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상이 대조구에 비해 유의적으로 증가한 경우 설사구로 판정할 수 있다.
이하에서는 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 다만, 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다 할 것이다.
장( gut ) 내 미생물 genomic DNA 추출
다양한 조건에서 장내 미생물 변화를 분석하기 위해 대조구와 설사구로부터 맹장, 결장, 직장을 분리하고 장 내용물을 회수하였다(도 1 참조).
통계적 유의성을 위해 시료는 4번 반복하여 채취하였다. 회수한 장 내용물로부터 장내 미생물의 genomic DNA (gDNA)를 추출하기 위해 ZR Fecal DNA kit(Zymo Research)를 사용하였다. 150mg의 배설물 샘플(fecal sample)을 ZR BashingBead 용균 튜브(Lysis tube)에 넣고 5분간 와류(vortex)하여 용균(lysis)시킨 후 12,000 rpm에서 1분간 원심분리 하였다. 400μl의 상층액을 오랜지 캡(orange cap) Zymo-SpinIIC로 옮긴 후 7,000 rpm에서 1분간 원심분리하고 DNA 수거용(collecting) 튜브에 1,200μl의 Fecal DNA 결합용액(binding buffer)을 첨가하였다. 800μl의 용액을 Zymo-SpinIK 컬럼으로 옮긴 후 10,000 x g에서 1분간 원심분리 하였으며, 이를 두 번 반복하였다. 컬럼(Column)의 용액을 제거한 후 200μl의 DNA 전세척용액(pre-wash buffer)을 첨가하여 10,000 x g에서 1분간 원심분리하여 세척하였으며 DNA 세척용액(wash buffer) 500μl를 첨가하여 10,000 x g에서 1분간 원심분리 하였다. 컬럼을 새 튜브로 옮긴 후 추출용액(elution buffer) 40μl를 첨가하고 10,000 x g에서 30초간 원심분리 하였다. 마지막으로 추출된 DNA는 Zymo-Spin -HRC 스핀필터로 옮긴 후 8,000 x g에서 1분간 원심분리 하여 나노드롭(Nano drop)으로 DNA 농도를 측정한 후, 다음 실험에 사용할 때까지 -80℃에 보관하였다.
미생물 분석용 표지 DNA 증폭을 위한 PCR
상기 표지 DNA는 돼지의 장내 미생물의 종에 특이적인 16S rDNA를 말한다. 이들 미생물의 gDNA를 주형으로 하여 16S rDNA를 증폭할 수 있는 프라이머인 27F (5'-GAGTTTGATCMTGGCTCAG-3')와 T7-1492R (5'-TCTAATACGACTCACTATAGGGGGYTACCTTGTTA CGACTT-3'; 밑줄친 영역은 T7 프로모터 영역)을 이용하여 PCR을 수행하였다. PCR은 상기 추출된 gDNA 100 ng과 TaKaRa Ex Taq 효소를 사용해 95℃, 5분 변성(denaturation), 30 사이클 증폭 (30 s at 94℃, 30 s at 58℃, and 90 s at 72℃), 그리고 최종 신장은 72℃에서 5분간 수행하였다. PCR 산물은 1% 아가로즈 젤에 전기영동하여 1,500 bp를 확인하고, MinElute PCR 추출 키트(Qiagen Inc., Valencia CA, USA)를 사용하여 정제한 후 1% 아가로즈 젤을 통해 DNA 농도를 확인하였다(표 3).
시험관 전사( In vitro transcription )를 통한 라벨링 및 단편화( Fragmentation )
PCR 산물 200 ng으로 MEGAScript T7 시험관 전사 키트(in vitro transcription kit, Ambion, AustinTX, USA)와 바이오틴-11-CTP, 바이오틴-11-UTP을 사용하여 바이오틴이 라벨링된 인공 RNA(biotin-labeled artificial RNA (aRNA))를 만들고 MEGAclear 키트(Ambion)로 정제한 후 나노드롭(Nano Drop)으로 농도를 확인하였다. 혼성화(Hybridization)할 농도의 바이오틴 라벨링된 aRNA (1 ug)을 5X 단편화 용액(fragmentation buffer, Ambion)을 사용하여 95℃에서 20분간 반응한 후, 4℃에서 1분간 반응을 수행하였다.
장내 미생물 분석을 위한 DNA 칩 제작
고어레이 소프트웨어(Goarrays software, Rimour 등, Bioinformatics. 2005, 21(7): 1094-1103)를 이용하여 돼지 장내 미생물 3,027종, 김치 유래 유산균 등 발효 미생물 167종 그리고 병원성 미생물 64종의 16S rDNA 유전자의 총염기서열(full sequences)를 분석함으로써 각 미생물에 대한 특이적인 프로브(probe)를 디자인 하였다. 도 2 및 도 3에는 각 미생물에 대해 특이적인 프로브를 제조하는 모식도가 나타나 있다. 즉, 링크(Linker)를 프로브에 삽입함으로써, 표지 핵산분자의 보다 넓은 범위의 염기서열과 하이브리드를 형성할 수 있도록 프로브를 디자인하는 개념이 도 2 및 도 3에 나타나 있다. 본 발명의 프로브는 이와 같은 방식으로 제조되었다.
그 결과, 돼지 장내 미생물 576개, 유산균 및 기타 발효균주 105개, 병원성 미생물 45개 및 음성 대조군(gative control)을 포함한 기타 미생물 21개 프로브를 합하여 총 747개의 프로브를 디자인하였다(첨부의 서열목록 참조). 이렇게 디자인된 프로브를 이용하여 돼지 장내 미생물, 유산균 및 발효 미생물, 병원성 미생물에 대한 747개의 특이적인 프로브가 집적된 맞춤형 올리고뉴클레오티드 DNA 칩(customized oligonucleotide DNA 칩)을 개발하였다. 상기 칩에 사용된 4x2K 칩 format은 한 섹터(sector)당 2,240개의 프로브의 집적 가능하므로 747개의 프로브를 3 반복으로 집적하여 DNA 칩을 제작하였다. 도 4에는 이러한 과정을 거쳐 제조된 DNA칩의 사진이 나타나 있다.
마이크로어레이 혼성화( Microarray hybridization )
DNA 칩은 65℃에서 전가열(Pre-heat) 10분, 전혼성화 용액(Pre-hybridization solution (6X SSPE, 0.05% Tween-20, 20 mM EDTA, 5X Denhardt's solution, denatured salmon sperm DNA (100 ng/μl))과 0.05% 소듐 도데실 설페이트 (SDS)에서 30분간 반응시켰다. 혼성화는 1 ug의 단편화된 aRNA(fragmentation-aRNA)를 혼성화 용액 (6X SSPE, 0.05% Tween-20, 20 mM EDTA, 25% formamide, 100 ng/μl salmon sperm DNA, 0.04% SDS)에 녹인 후 95℃, 5분 변성(denaturation)한 후 45℃에서 16 시간 동안 혼성화하였다.
세척( Washing ) 및 염료 라벨링( Dye labeling )
6X SSPET solution (6X SSPE와 0.05% Tween-20)을 45℃에서 미리 전가열(pre-heat) 후 혼성화 오븐에서 5분, 3X SSPET 실온에서 1분, 0.5X SSPET 실온에서 1분, PBST (2X phosphate buffer, 0.1% Tween-20) 실온에서 1분간 세척하였다. Biotin Blocking Solution (2X PBS, 0.1% Tween-20, 1% Acetylated-BSA)에 실온에서 15분, 바이오틴 블로킹 용액(Blocking Solution)에 1 mg/ml Fluorolink Cy5-labeled-streptavidin을 1000:1로 희석한 후 실온에서 30분간 바이오틴 라벨링 하였다. PBST (2X phosphate buffer, 0.1% Tween-20)로 실온에서 1분씩 2번 세척한 후, PBS (2X phosphate buffer)로 실온에서 1분씩 2번 세척하였다.
스캔( Scan )
리프터슬립(LifterSlip)을 덮고 Axon Genepix 4200 A 마이크로 어레이 스캐너 (Axon Instruments, Inc., Union City CA, USA)로 PMT 200~300, 5mm 해상도(resolution)로 스캔하였다. 데이터는 CombiMatrix의 마이크로 어레이 이미져(imager)를 이용해 얻었다(도 5 참조).
DNA 칩 데이터 분석
DNA 칩 데이터 분석을 위한 전체적인 개요도는 도 6에 나타내었다. 총 2,240개의 프로브 세트에 대하여 음성대조군 프로브를 이용한 백그라운드 보정(BG correction)을 수행한 후 9개의 음성대조군 프로브를 제거하였다. 총 738개의 프로브 세트에서 포화(saturated) 프로브를 제외한 731개 프로브 세트에 대해 정규화(quantile normalization)을 실시하였다. 마지막으로 시그널 값이 1 이하이거나 또는 하위 5% 이하의 프로브 시그널을 가지는 미생물들은 분석 대상에서 제외하였으며 최종적으로 선별된 미생물 프로브 세트에 대해 one-way ANOVA와 Student's t-test의 통계분석을 실시하였다.
DNA 칩을 이용한 돼지 장내 미생물 분석 결과
본 연구에서 개발한 장내 미생물 진단 DNA 칩은 수백 종의 미생물을 한 번에 분석하려는 목적에 맞게 제작(customized)되었다. 장내 미생물 진단 DNA 칩을 이용하여 처리구 및 장 부위에 따라 혼성화 시그널(hybrdization signal)이 확인된 미생물의 수를 표 1에 나타내었다. 속(Genus)에 따른 돼지 장내 미생물의 다양성을 분석한 결과, 대조구(C)에 228-235개, 설사구(D)에는 235-242개의 속(genus)을 확인할 수 있었다. (표 1 참조)
C D
Speices(종)
맹장 475 476
결장 459 473
직장 454 470
Genus(속)
맹장 235 242
결장 231 235
직장 228 238
돼지 장내 미생물을 종(Species)에 따라 분석한 결과 대조구(C)의 경우 맹장에서 475종, 결장에서 459종, 직장에서 454종의 미생물을 확인할 수 있었다. 부위별로 가장 많이 존재하는 종은 시겔라 플렉레리(Shigella flexneri ) (맹장)와 리스테리아모노사이토제네스(Listeria monocytogenes) (결장, 직장)으로, 전체 혼성화 시그널의 6-8%에 해당하였다. 설사구(D)의 경우 맹장에서 476종, 결장에서 473종, 직장에서 470종의 미생물을 확인하였다. 이 중 패칼로박테리움 프로스니치(Faecalobacterium prausnitzii ) (맹장)와 리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes ) (결장, 직장)이 전체 혼성화 시그널의 6-7%를 차지하여 부위별로 가장 많이 존재하였다. Paliy 등(Appl. Environ. Microbiol. 2009, 75 (11): 3572-3579)이 개발한 인간 창자 미생물군 마이크로어레이(human intestinal microbiota microarray)가 227-232종의 미생물을 확인할 수 있었던 것에 비해 본 연구에서 개발한 DNA 칩은 약 454-491종의 미생물 확인이 가능하였다. 돼지의 장내 미생물이 풍부하다는 것은 사람에 비교하여 돼지가 다양한 기원의 영양원으로부터 더 다양한 소화기능을 가질 가능성을 보여주는 것으로 고려된다.
장 부위에 따른 미생물 분포
각 처리구의 장 부위(맹장, 결장, 직장)에 따른 미생물 분포에 대한 통계분석 결과는 표 2와 3에 나타내었고, 각 부위에 모두 존재하는 균주에 대해서만 표기하였다.
속명(Genus) 종명(Species) 맹장
(Caecum)		 결장
(Colon)		 직장
(Rectum)		 그람 염색 Aerobic/
Anaerobic
Acidiphilium Acidiphilium organovorum 6.84281) 8.6054 9.7229 - aerobic
Amphibacillus Amphibacillus xylanus 5.5028 6.4216 6.9895 + anaerobic
Anabaena (algae) Anabaena verrucosa A622 8.671 9.4743 9.8838
Anabaena circinalis 5.2454 4.6611 4.33
Anaeroplasma Anaeroplasma abactoclasticum 10.0458 10.302 10.3516 - anaerobic
Anaerostipes Anaerostipes caccae 10.0286 9.8004 8.949 +/- anaerobic
Aquabacterium Aquabacterium commune 4.3422 6.0057 7.1412 - aerobic
Arthrobacter Arthrobacter russicus 7.083 8.3747 9.5493 +/- aerobic
Chitinophaga Chitinophaga filiformis 3.0327 4.3855 5.4743 - aerobic
Clostridium Clostridium chauvoei 11.213 12.516 13.004 + anaerobic
Clostridium cocleatum 5.21 4.878 4.6377 + anaerobic
Clostridium leptum 10.4403 11.4371 12.1239 + anaerobic
Clostridium orbiscindens 9.4905 9.2398 8.5386 + anaerobic
Corynebacterium Corynebacterium variabile 6.6978 5.9148 5.8068 + anaerobic
Delftia Delftia acidovorans 12.6508 13.4647 14.1544 - aerobic
Desulfosporosinus Desulfosporosinus meridiei 6.1782 6.6487 7.1783 - anaerobic
Desulfuromusa Desulfuromusa bakii 7.0204 6.4534 6.1837 - anaerobic
Enhydrobacter Enhydrobacter aerosaccus 4.3665 4.8742 5.405 - aerobic
Eubacterium Eubacterium plautii 9.4142 9.2754 8.6174 + anaerobic
Gelria Gelria glutamica 7.4055 8.5336 9.2849 - anaerobic
Lactobacillus Lactobacillus ultunensis 6.7968 8.0876 9.0833 + anaerobic
Lactobacillus antri 10.369 10.9386 11.2555 + anaerobic
Lactococcus lactis 8.2927 9.0039 9.5844 + anaerobic
Mannheimia Mannheimia varigena 5.5387 3.3058 3.3717 + anaerobic
Moorella Moorella glycerini 11.8597 13.2006 13.8969 - aerobic
Moraxella Moraxella ( Moraxella ) osloensis 4.9872 5.5655 6.7008 + aerobic
Mycetocola Mycetocola tolaasinivorans 10.3703 9.4559 8.9111 - aerobic
Paenibacillus Paenibacillu sphyllosphaerae 6.6353 7.1627 7.9379 - aerobic
Pediococcus Pediococcus acidilactici 8.7559 10.6653 11.6061 +/- facultative anaerobic
Pelobacter Pelobacter acidigallici 8.1984 7.6186 7.5588 + anaerobic
Peptostreptococcaceae Filifactor alocis 10.0124 10.4668 10.5694 - anaerobic
Polaromonas Polaromonas hydrogenivorans 6.2835 6.8753 7.3959 - aerobic
Prevotella Prevotella multiformis 7.2595 8.3242 8.7519 - anaerobic
Pseudomonas Pseudomonas pictorum 8.6388 9.4212 10.1136 - aerobic
Pseudomonas cissicola 7.3466 8.0539 8.8914 - aerobic
Pseudoxanthomonas Pseudoxanthomonas suwonensis 10.4835 11.0443 11.3715 - aerobic
Rathayibacter Rathayibacter caricis 8.4903 7.3717 7.2793 + aerobic
Selenomonas Selenomonas noxia 6.8362 9.1781 10.1735 - anaerobic
Staphylococcus Staphylococcus auricularis 6.9938 6.3797 6.4083 + facultative anaerobic
Stenotrophomonas Stenotrophomonas maltophilia 8.8122 9.4883 9.9661 - aerobic
Stenotrophomonas Stenotrophomonas rhizophila 6.5127 7.3592 8.2984 - aerobic
Streptomyces Streptomyces speibonae 5.0824 5.848 5.8104 + aerobic
Sulfurospirillum Sulfurospirillum arcachonense 5.5533 6.9273 7.0911 - anaerobic
Synechococcus (algae) Synechococcus elongatus 6.6799 7.3266 7.8828
Thermaerobacter Thermaerobacter litoralis 7.1685 6.239 5.6723 +/- aerobic
Thermaerobacter Thermaerobacter nagasakiensis 8.3228 7.5227 7.0049 - aerobic
Thermincola Thermincola carboxydiphila 8.9374 9.1809 9.4588 + anaerobic
Thermoanaerobacterium Thermoanaerobacterium zeae 6.0605 6.7575 7.15 + anaerobic
Xanthomonas Xanthomonas vesicatoria 8.9267 9.8708 10.7011 - aerobic
Xanthomonas cynarae 6.1755 6.957 7.9342 - aerobic
Xanthomonas theicola 8.0554 8.742 9.4952 - aerobic
Xanthomonas hortorum 7.2864 8.0876 8.9385 - aerobic
속명(Genus) 종명(Species) 맹장
(Caecum)		 결장
(Colon)		 직장
(Rectum)		 그람
염색		 Aerobic/
Anaerobic
Acidiphilium Acidiphilium organovorum 6.7431 8.0822 8.292 - aerobic
Aquabacterium Aquabacterium commune 2.6952 4.8973 5.6631 - aerobic
Bifidobacteria Bifidobacterium longum 8.4398 7.8169 7.7638 + anaerobic
Chryseobacterium Chryseobacterium gleum 3.6153 4.6903 4.6329 - aerobic
Clostridium Clostridium chauvoei 11.1763 12.0666 12.3368 + anaerobic
Enterococcus Enterococcus faecium 7.3205 5.7941 5.5766 + facultative anaerobic
Herbaspirillum Herbaspirillum putei 6.1464 6.6 6.6917 - aerobic
Lactobacillus Lactobacillus larvae 3.2564 4.353 4.9468 + anaerobic
Lactobacillus ultunensis 5.8068 7.1837 7.5199 + anaerobic
Moorella Moorella glycerini 11.1196 12.2788 12.554 + aerobic
Moraxella Moraxella osloensis 4.5522 5.6745 5.8022 - aerobic
Paenibacillus Paenibacillus phyllosphaerae 5.6888 6.528 6.5752 +/- facultative anaerobic
Paracraurococcus Paracraurococcus ruber 6.3896 5.8681 5.8614 - aerobic
Pelobacter Pelobacter propionicus 6.0547 6.7197 6.7922 - anaerobic
Selenomonas Selenomonas noxia 6.7367 8.8704 9.4651 - anaerobic
Staphylococcus Staphylococcus auricularis 7.331 6.7078 6.7292 + facultative anaerobic
Sulfurospirillum Sulfurospirillum arcachonense 5.41 6.4499 6.4057 - anaerobic
Treponema Treponema bryantii 6.7774 8.8436 8.9501 - anaerobic
대조구(C)의 경우 총 53종의 미생물이 유의성이 있는 것으로 확인되었으며(P<0.05), 이 중 그람 음성균 27종, 그람 양성균 18종, 조류 3종과 그람염색이 불명확한 4종이 확인되었다(표 2 참조). A. 아박토클라스티쿰(A. abactoclasticum), C. 쵸베이(C. chauvoei ), C. 렙텀(C. leptum ), L. 아시도보란스(D. acidovorans ), L. 안트리(L. antri ), M. 글리세리니(M. glycerini ), F. 알로시스(F. alocis ), F. 수워네시스(P. suwonensis ) 등이 혼성화 시그널이 높은 것으로 나타났다(표 2의 굵은 글씨체 참고). 일반적으로 호기성균은 외부 공기와 직접적으로 접촉하고 있는 직장에서 대체적으로 증가하는 양상을 나타내었지만, 혐기성균의 경우 뚜렷한 분포도를 보이지 않았다. 각 부위별로 그람염색에 따른 균주의 분포도는 특이적인 양상을 나타내지 못했다. 유익한 역할을 하는 유산균인 락토바실러스(Lactobacillus)와 페디오코커스( Pediococcus ) 등의 경우 맹장, 결장, 직장 순으로 혼성화 시그널이 증가하는 것으로 나타나 직장에서 활동이 가장 활발할 것으로 추정된다. 클로스트리디움(Clostridium sp.)의 경우에서 C. 쵸베이(C. chauvoei)와 C. 렙텀(C. leptum)은 직장에서 가장 높은 혼성화 시그널을 나타낸 반면에, C. 코클레아툼(C. cocleatum)과 C. 오르비신덴스(C. orbiscindens)는 맹장에서 가장 높은 혼성화 시그널을 보여 같은 속내에서도 종에 따라 분포하는 주 위치가 달라지는 것을 확인할 수 있었다.
설사구(D)에서는 C. 쵸베이(C. chauvoei)와 M. 글리세리니(M. glycerini)의 혼성화 시그널이 높게 나타났다(표 3 굵은 글씨 참조). 설사구에서는 총 18종이 유의성이 있는 것으로 나타났으며, 호기성 미생물 7종, 혐기성 미생물 8종, 통성혐기성 미생물 3종으로 확인되었다. 그람 염색으로 분류한 결과 그람 양성균 7종, 그람 음성균 10종과 그람염색성이 불명확한 P. 필로스페레(P. phyllosphaerae)의 1종으로 확인되었다. 락토바실러스(Lactobacillus)는 직장에서 혼성화 시그널이 가장 높게 나타난 반면 B. 롱검(B. longum)과 E. 페시움(E. faecium)의 경우에는 맹장에서 혼성화 시그널이 가장 높은 것으로 나타났다.
대조구(C)와 설사구(D)의 장내 미생물 비교분석
대조구(C)에 비교하여 미생물 개체의 증감을 비교하기 위해 유의적인 수준으로 증감을 나타낼 수 있도록 비교분석을 시도했고, 그 결과를 표 4-9에 나타내었다.
속명 종명 C_mean1 ) D_mean D-C2 ) 그람 염색 Aerobic/
Anaerobic
Lampropedia Lampropedia hyalina 5.3532 6.7581 1.4049 - aerobic
Neorickettsia Neorickettsia risticii 3.9339 5.3046 1.3707 - aerobic
Nostochopsis Nostochopsis lobatus 92.1 5.8308 7.0294 1.1986 - aerobic
Paenibacillus Paenibacillus anaericanus 4.3912 5.7674 1.3762 - aerobic
Thermaerobacter Thermaerobacter nagasakiensis 8.3228 9.3467 1.0239 + aerobic
Wolbachia Wolbachia pipientis 7.3830 8.6243 1.2413 - aerobic
1) log2 transformation
2) ratio
맹장의 경우 L. 히알리나(L. hyalina ), N. 로바투스(N. lobatus ), N. 리스티치(N. risticii ), P. 아네리카누스(P. anaericanus ), T. 나가사키엔시스(T. nagasakiensis), W. 피피엔티스(W. pipientis ) 등이 증가한 것으로 확인되었으며 T. 나가사키엔시스(T. nagasakiensis )를 제외한 나머지 미생물은 그람 음성균이었고, 모두 호기성 균이었다(표 4 참조). 설사구의 맹장에서는 그람음성이면서 호기성인 균이 대조구에 비교하여 상대적으로 증가되는 것으로 나타났다. 반면 E. 페시움(E. faecium )을 포함하는 9종은 감소한 것으로 나타났으며 이 중 그람 양성균 5종, 그람 음성균 3종, 조류인 시아노세스(Cyanothece sp. 104)가 1종으로 확인되었다(표 5 참조).
속명 종명(미생물명) C_mean1 ) D_mean D-C2 ) 그람 염색 Aerobic/
Anaerobic
Aquabacterium Aquabacterium commune 4.8653 3.6215 -1.2438 - aerobic
Cyanothece (algae) Cyanothece sp . 104 4.3422 2.6952 -1.6471
Enterobacter Enterobacter cowanii 9.4965 7.3205 -2.1760 - facultative anaerobic
Enterococcus Enterococcus faecium 12.5538 9.3200 -3.2339 + facultative anaerobic
Holophaga Holophaga foetida 6.6067 5.2856 -1.3212 - anaerobic
Lactobacillus Lactobacillus coleohominis 7.3983 6.2369 -1.1614 + anaerobic
Lactobacillus hammesii 9.3707 7.8944 -1.4763 + anaerobic
Pediococcus Pediococcus siamensis 7.1371 4.8827 -2.2544 + anaerobic
Sporotomaculum Sporotomaculum syntrophicum 7.4365 5.9946 -1.4419 + anaerobic
1) log2 transformation
2) ratio
설사구의 맹장에서는 그람음성이면서 호기성인 균이 대조구에 비교하여 상대적으로 증가되는 반면에 그람양성, 혐기성 균의 양은 상대적으로 감소하는 것으로 관찰되었다.
결장에서는 N. 크라소스트리에(N. crassostreae)를 포함하는 10종의 미생물이 증가하였으며 이 중 6종이 호기성 미생물인 것으로 나타났다. 표 6에는 이러한 결과가 나타나 있다.
속명 종명 C_mean1 ) D_mean D-C2 ) 그람 염색 Aerobic/
Anaerobic
Bacillus Bacillus fortis 5.8791 7.4246 1.5455 + aerobic
Bacteroides Bacteroides fragilis 5.8663 7.1094 1.2431 - anaerobic
Cryobacterium Cryobacterium psychrophilum 2.6051 3.9261 1.3210 + aerobic
Curtobacterium Curtobacterium pusillum 4.5510 5.7254 1.1743 + aerobic
Fructobacillus Fructobacillus pseudoficulneus 4.1433 5.4836 1.3403 + aerobic
Haliscomenobacter Haliscomenobacter hydrossis 4.9291 6.0657 1.1365 - aerobic
Nocardia Nocardia crassostreae 11.1547 12.4534 1.2987 + aerobic
Paenibacillus Paenibacillus anaericanus 4.2493 5.5147 1.2654 - aerobic
Rathayibacter Rathayibacter toxicus 7.5227 8.7631 1.2405 + aerobic
Thermaerobacter Thermaerobacter nagasakiensis 6.6787 8.0796 1.4009 - anaerobic
1) log2 transformation
2) ratio
그람 염색 분류 결과 5종의 그람 양성균과 2종의 그람 음성균이 확인되었다. E. 페시움(E. faecium ), L. 콜리노이데스(L. collinoides ), P. 시아멘시스(P. siamensis), S. 신트로피쿰(S. syntrophicum ), T. 서브테라뉴스(T. subterraneus ) 등은 설사구 결장에서 감소하였으며 4종의 그람 양성균과 1종의 그람 음성균으로 확인되었다(표 7 참조).
속명 종명 C_mean1 ) D_mean D-C2 ) 그람 염색 Aerobic/
Anaerobic
Enterococcus Enterococcus faecium 8.0785 5.7941 -2.2843 + facultative anaerobic
Lactobacillus Lactobacillus collinoides 8.4755 7.2309 -1.2446 + anaerobic
Pediococcus Pediococcus siamensis 7.7564 4.6383 -3.1181 + anaerobic
Sporotomaculum Sporotomaculum syntrophicum 7.5260 5.9421 -1.5839 + anaerobic
Thermaerobacter Thermaerobacter subterraneus 6.1480 4.4861 -1.6619 - aerobic
1) log2 transformation
2) ratio
설사구의 결장에서는 그람염색성에 따라서는 그람양성균이 증감에 기여하는 것으로 나타났지만, 그람음성균은 특이성이 낮게 나타났다. 또한, 호기성 균은 대체적으로 증가하는 반면에 혐기성 균은 감소되는 경향을 보였다.
대조구(C)와 설사구(D)의 직장을 비교분석한 결과 N. 크라소스트리에(N. crassostreae)를 포함하는 23종의 미생물이 설사구에서 증가하는 양상을 보였다(표 8 참조).
속명 종명 C_mean1 ) D_mean D-C2 ) 그람 염색 Aerobic/
Anaerobic
Agromyces Agromyces ulmi 8.7506 10.5744 1.8238 + aerobic
Bacteroides Bacteroides acidifaciens 5.2425 6.7640 1.5215 - anaerobic
Bacteroides stercoris 7.4250 8.9760 1.5510 - anaerobic
Bifidobacterium Bifidobacterium urinalis 5.3436 6.6711 1.3276 + anaerobic
Brevundimonas Brevundimonas intermedia 4.8522 6.6025 1.7503 - anaerobic
Clostridium Clostridium glycyrrhizinilyticum 3.2742 4.9360 1.6618 + anaerobic
Cryobacterium Cryobacterium psychrophilum 4.742 6.6775 1.9355 + aerobic
Curtobacterium Curtobacterium pusillum 9.0191 10.1625 1.1434 + aerobic
Eggerthella Eggerthella lenta 5.652 7.0854 1.4334 + anaerobic
Haliscomenobacter Haliscomenobacter hydrossis 6.1192 7.5689 1.4497 - aerobic
Lactobacillus Lactobacillus gastricus 5.6723 6.9755 1.3031 + anaerobic
Lactobacillus plantarum 4.5882 5.9944 1.4063 + anaerobic
Lampropedia Lampropedia hyalina 3.7726 5.4540 1.6813 - aerobic
Neorickettsia Neorickettsia risticii 5.4781 6.5332 1.0551 - aerobic
Nocardia Nocardia crassostreae 9.3139 10.7199 1.4061 + aerobic
Paenibacillus Paenibacillus anaericanus 2.973 4.4656 1.4926 - aerobic
Papillibacter Paludibacter propionicigenes 3.1851 5.0958 1.9107 - anaerobic
Prevotella Prevotella copri 9.1177 11.0358 1.9182 - anaerobic
Rathayibacter Rathayibacter toxicus 3.861 5.4425 1.5815 + aerobic
Serratia Serratia marcescens subsp. marcescens 7.0049 8.6538 1.6489 - facultative anaerobic
Thermaerobacter Thermaerobacter litoralis 4.3527 5.3532 1.0005 +/- aerobic
Thermaerobacter nagasakiensis 6.8523 8.0282 1.1758 - anaerobic
Wolbachia Wolbachia pipientis 6.5178 7.9853 1.4674 - aerobic
1) log2 transformation
2) ratio
반면 A. 오르가노보럼(A. organovorum)을 포함하는 26종의 미생물은 설사구에서 감소하는 경향을 보였다(표 9 참조).
속명 종명 C_mean1) D_mean D-C2) 그람 염색 Aerobic/
Anaerobic
Acidiphilium Acidiphilium organovorum 13.8969 12.554 -1.3428 - aerobic
Agromyces Agromyces lapidis 6.077 4.8715 -1.2056 + aerobic
Anaerofilum Anaerofilum agile 6.9117 4.9374 -1.9743 + anaerobic
Aquabacterium Aquabacterium commune 5.2943 4.1066 -1.1877 - aerobic
Bifidobacterium Bifidobacterium longum 6.3411 5.0983 -1.2428 + anaerobic
Capnocytophaga Capnocytopha gagingivalis 5.1057 4.0414 -1.0643 - aerobic
Clostridium Clostridium glycolicum 9.7229 8.292 -1.4309 + anaerobic
Clostridium leptum 7.9379 6.5752 -1.3627 + anaerobic
Cyanothece (algae) Cyanothece sp . 104 7.1412 5.6631 -1.4780
Desulfosporosinus Desulfosporosinus meridiei 9.0833 7.5199 -1.5634 - anaerobic
Desulfosporosinus sp . strain STP12 4.4281 3.2669 -1.1611 - anaerobic

Flavisolibacter 		Flavisolibacter ginsengisoli 12.0056 10.4063 -1.0913 - aerobic
Flavisolibacter insengisoli 6.3287 5.2374 -1.5993 - aerobic
Gelria Gelria glutamica 9.2849 7.7155 -1.5694 + anaerobic
Holophaga Holophaga foetida 9.5509 7.96 -1.5908 - anaerobic
Isobaculum Isobaculum melis 6.8588 5.2681 -1.5908 + facultative anaerobic
Lactobacillus Lactobacillus spicheri 11.6061 9.7006 -1.9054 + anaerobic
Lactobacillus ultunensis 7.3081 5.8341 -1.4739 + anaerobic
Moorella Moorella glycerini 12.1239 11.0793 -1.0446 + aerobic
Paenibacillus Paenibacillus phyllosphaerae 6.3966 4.4708 -1.9257 +/- facultative anaerobic
Pediococcus Pediococcus acidilactici 4.9584 3.9153 -1.0431 + anaerobic
Psychrobacter Psychrobacter faecalis 5.3665 3.9794 -1.3871 - aerobic
Sporotomaculum Sporotomaculum syntrophicum 6.4842 5.1766 -1.3076 + anaerobic
Tepidibacter Tepidibacter thalassicus 9.9056 7.37 -2.5356 + anaerobic
Thermaerobacter Thermaerobacter subterraneus 7.1783 6.1017 -1.0766 - aerobic
Thermus Thermus scotoductus 8.1604 6.6608 -1.4996 - facultative anaerobic
1) log2 transformation
2) ratio
이 중 9종은 호기성 미생물이었으며 12종은 혐기성 미생물로 확인되었다. 26종의 미생물에 대해 그람 염색으로 분류한 결과 13종의 그람 양성균과 10종의 그람 음성균으로 확인되었다. 직장에서는 그람염색성과 산소에 따른 균의 특성에 대한 명확한 차이가 나타나지 않았다.
이상의 결과를 종합해 보면, 올리고뉴클레오타이드를 기반으로 한 DNA 칩은 돼지 장내 미생물을 분석하는 데 적합하고 그 양적인 관계를 정립할 수 있을 것으로 판단된다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항 들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
서열목록 전자파일 첨부

Claims (16)

  1. 돼지의 장(gut) 내 미생물의 16s rDNA에 특이적인 서열번호 1 내지 747로 표시되는 프로브를 포함하는 조성물을 이용하여, 돼지의 장 내에서 시겔라 플렉레리(Shigella flexneri), 리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes), 패칼로박테리움 프로스니치(Faecalobacterium prausnitzii), 리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes), 아네로플라스마 아박토클라스티쿰(Anaeroplasma abactoclasticum), 클로스트리디움 쵸베이(Clostridium chauvoei), 클로스트리디움 렙텀(Clostridium leptum), 델프티아 아시도보란스(Delftia acidovorans), 락토바실러스 안트리(Lactobacillus antri), 무렐라 글리세리니(Moorella glycerini), 필리팍터 알로시스(Filifactor alocis), 슈도산토모나스 수워네시스(Pseudoxanthomonas suwonensis), 클로스트리디움 쵸베이(Clostridium chauvoei), 무렐라 글리세리니(Moorella glycerini), 락토바실러스(Lactobaccillus), 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum), 엔테로코커스 페시움(Enterococcus Faecium), 람프로페디아 히알리나(Lampropedia hyalina), 노스토콥시스 로바투스(Nostochopsis lobatus), 네오리케챠 리스티치(Neorickettsia risticii), 페니바실러스 아네리카누스(Paenibacillus anaericanus), 테메로박터 나가사키엔시스(Thermaerobacter nagasakiensis) 및 울바키아 피피엔티스(Wolbachia pipientis)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 미생물을 검출하는 것을 특징으로 하는 진단방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 장(gut)은 맹장, 결장 또는 직장에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 진단방법.
  3. 삭제
  4. 제1항에 있어서, 상기 검출은
    돼지의 장내에서 유래한 시료로부터 폴리핵산을 분리하는 단계;
    상기 폴리핵산을 프라이머 쌍으로 증폭하는 단계;
    상기 증폭된 DNA를 표지물질로 라벨링하면서 시험관 전사(in vitro transcription)하는 단계;
    상기 표지물질로 라벨링된 전사체(transcript)를 서열번호 1 내지 747로 표시되는 프로브를 포함하는 조성물과 혼성화시키는 단계; 및
    상기 혼성화된 하이브리드를 분석하는 단계를 포함하는 것인 진단방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 검출 결과 맹장에서 시겔라 플렉레리(Shigella flexneri), 결장 및 직장에서 리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes)가 유의적으로 높게 검출되는 것을 정상인 상태로 판정하는 것을 특징으로 하는 진단방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 검출 결과 맹장에서 패칼로박테리움 프로스니치(Faecalobacterium prausnitzii), 결장 및 직장에서 리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes)가 유의적으로 높게 검출되는 것을 설사구(diarrhea)로 판정하는 것을 특징으로 하는 진단방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 검출 결과 아네로플라스마 아박토클라스티쿰(Anaeroplasma abactoclasticum), 클로스트리디움 쵸베이(Clostridium chauvoei), 클로스트리디움 렙텀(Clostridium leptum), 델프티아 아시도보란스(Delftia acidovorans), 락토바실러스 안트리(Lactobacillus antri), 무렐라 글리세리니(Moorella glycerini), 필리팍터 알로시스(Filifactor alocis) 및 슈도산토모나스 수워네시스(Pseudoxanthomonas suwonensis)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상이 유의적으로 높게 검출되는 것을 정상인 상태로 판정하는 것을 특징으로 하는 진단방법.
  8. 제1항에 있어서, 상기 검출 결과 클로스트리디움 쵸베이(Clostridium chauvoei) 및 무렐라 글리세리니(Moorella glycerini)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상이 유의적으로 높게 검출되는 것을 설사구(diarrhea)로 판정하는 것을 특징으로 하는 진단방법.
  9. 제1항에 있어서, 상기 검출 결과 락토바실러스(Lactobaccillus)의 혼성화 시그널이 직장에서 가장 높게 나타나고, 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) 또는 엔테로코커스 페시움(Enterococcus Faecium)이 유의적으로 맹장에서 가장 높게 나타나는 경우를 설사구(diarrhea)로 판정하는 것을 특징으로 하는 진단방법.
  10. 제1항에 있어서, 상기 검출 결과 맹장에서 람프로페디아 히알리나(Lampropedia hyalina), 노스토콥시스 로바투스(Nostochopsis lobatus), 네오리케챠 리스티치(Neorickettsia risticii), 페니바실러스 아네리카누스(Paenibacillus anaericanus), 테메로박터 나가사키엔시스(Thermaerobacter nagasakiensis) 및 울바키아 피피엔티스(Wolbachia pipientis)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상이 유의적으로 대조구에 비해 증가한 경우 설사구로 판정하는 것을 특징으로 하는 진단방법.
  11. 제1항에 있어서, 상기 검출 결과 맹장에서 그람음성균이면서 호기성인 균이 대조구에 비해 유의적으로 증가한 경우 설사구로 판정하는 것을 특징으로 하는 진단방법.
  12. 제1항에 있어서, 상기 검출 결과 맹장에서 그람양성균이면서 혐기성인 균이 대조구에 비해 유의적으로 감소한 경우 설사구로 판정하는 것을 특징으로 하는 진단방법.
  13. 제1항에 있어서, 상기 검출 결과 결장에서 바실러스 포르티스(Bacillus fortis), 박테로이데스 프라길리스(Bacteroides fragilis), 크리오박테리움 사이크로필럼(Cryobacterium psychrophilum), 쿠르토박테리움 푸실럼(Curtobacterium pusillum), 프럭토바실러스 슈도피쿨뉴스(Fructobacillus pseudoficulneus), 할리스코메노박터 히드로시스(Haliscomenobacter hydrossis), 노카르디아 크라소스트리에(Nocardia crassostreae), 페니바실러스 아네리카누스(Paenibacillus anaericanus), 라타이박터 톡시커스(Rathayibacter toxicus) 및 테메로박터 나가사키엔시스(Thermaerobacter nagasakiensis)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상이 대조구에 비해 유의적으로 증가한 경우 설사구인 것으로 판정하는 것을 특징으로 하는 진단방법.
  14. 제1항에 있어서, 상기 검출 결과 결장에서 엔테로코커스 페시움(Enterococcus faecium), 락토바실러스 콜리노이데스(Lactobacillus collinoides), 페디오코커스 시아멘시스(Pediococcus siamensis), 스포로토마큘럼 신트로피쿰(Sporotomaculum syntrophicum), 테메로박터 서브테라뉴스(Thermaerobacter subterraneus )로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상이 대조구에 비해 유의적으로 감소한 경우 설사구로 판정하는 것을 특징으로 하는 진단방법.
  15. 제1항에 있어서, 상기 검출 결과 직장에서 아그로미세스 얼미(Agromyces ulmi), 박테로이데스 아시디파시엔스(Bacteroides acidifaciens), 박테로이데스 스테르코리스(Bacteroides stercoris), 비피도박테리움 유리날리스(Bifidobacterium urinalis), 브레분디모나스 인터메디아(Brevundimonas intermedia), 클로스트리디움 글리시리치니리티컴(Clostridium glycyrrhizinilyticum), 크리오박테리움 사이크로필럼(Cryobacterium psychrophilum), 컬토박테리움 푸실럼(Curtobacterium pusillum), 에게르텔라 렌타(Eggerthella lenta), 할리스코메노박터 히드로시스(Haliscomenobacter hydrossis), 락토바실러스 가스트리커스(Lactobacillus gastricus), 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum), 람프로페디아 히알리나(Lampropedia hyalina), 네오리케챠 리스티시(Neorickettsia risticii), 노카르디아 크라소스트리에(Nocardia crassostreae), 페니바실러스 아네리카누스(Paenibacillus anaericanus), 팔루디박터 프로피오니시젠스(Paludibacter propionicigenes), 프레보텔라 코프리(Prevotella copri), 라타이박터 톡시커스(Rathayibacter toxicus), 세라티아 마르세센스 마르세센스(Serratia marcescens subsp. marcescens), 테메로박터 리토랄리스(Thermaerobacter litoralis), 테메로박터 나가사키엔시스(Thermaerobacter nagasakiensis) 및 볼바치아 피피엔티스(Wolbachia pipientis) 중 하나 이상이 대조구에 비해 유의적으로 증가한 경우 설사구로 판정하는 것을 특징으로 하는 진단방법.
  16. 제1항에 있어서, 상기 검출 결과 직장에서 아시디필리움 오르가노보럼(Acidiphilium organovorum), 아그로미세스 랍피디스(Agromyces lapidis), 아네로필럼 아길레(Anaerofilum agile), 아쿠아박테리움 코뮤네(Aquabacterium commune), 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum), 카프노시토파 가긴비발리스(Capnocytopha gagingivalis), 클로스트리디움 글리콜리컴(Clostridium glycolicum), 클로스트리디움 렙텀(Clostridium leptum), 시아노세스 sp. 104(Cyanothece sp. 104), 데술포스포로시누스 메리디아이(Desulforosinus meridiei), 데술포로시누스 STP12(Desulfosporosinus sp. strain STP12), 플라비솔리박터 긴생기솔리(Flavisolibacter ginsengisoli), 플라비솔리박터 인셍기솔리(Flavisolibacter insengisoli), 겔리아 글루타미카(Gelria glutamica), 홀로파가 포에티다(Holophaga foetida), 이소바큘럼 멜리스(Isobaculum melis), 락토바실러스 스피체리(Lactobacillus spicheri), 락토바실러스 얼터넨시스(Lactobacillus ultunensis), 무렐라 글리세리니(Moorella glycerini), 페니바실러스 필로스페레(Paenibacillus phyllosphaerae), 페디오코커스 아시디락티치(Pediococcus acidilactici), 사이크로박터 페칼리스(Psychrobacter faecalis), 소포로토마큘럼 신트로피쿰(Sporotomaculum syntrophicum), 테피디박터 탈라시쿠스(Tepidibacter thalassicus), 테메로박터 서브테라뉴스(Thermaerobacter subterraneus) 및 테르무스 스코토덕터스(Thermus scotoductus)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상이 대조구에 비해 유의적으로 감소한 경우 설사구로 판정하는 것을 특징으로 하는 진단방법.
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