KR101210803B1 - 발광다이오드 광원의 조사에 의한 어류의 내분비 스트레스 제어를 이용한 양식방법 및 장치 - Google Patents
발광다이오드 광원의 조사에 의한 어류의 내분비 스트레스 제어를 이용한 양식방법 및 장치 Download PDFInfo
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Abstract
다양한 파장을 갖는 LED 광원을 설치한 실험 장치에 입식된 어류에서 멜라토닌을 합성하는 전구체인 AANAT2 mRNA 발현과 항산화 효소인 SOD, CAT 발현 및 활성, 활성산소인 H2O2 농도 및 혈장 내 멜라토닌 농도를 측정하여 특정의 LED 파장이 어류에 미치는 산화 스트레스 및 항산화 반응 메커니즘을 파악한 결과, 적색 파장이 흰동가리의 체내에서 산화 스트레스를 유발시켜, 이 때 발생된 활성산소를 제거하기 위하여 멜라토닌이 다른 파장에 비하여 더 많이 분비된 것으로 나타났다. 적색 파장은 어류에 산화 스트레스를 유발시키는 요인으로 작용함으로써 산화 스트레스를 경감시키기 위하여 어체 내의 내분비 작용으로 멜라토닌을 발생시켜 강력한 항산화 역할을 수행하는 어류의 스트레스 제어로 연결되는 것으로 확인됨에 따라 어류의 사육장 변경 또는 종묘의 단, 장거리 이동에 따른 스트레스를 자연광을 배제한 환경에서 특정의 LED 광원만을 일정시간 동안 조사하여 흰동가리에 일시적으로 초기 산화 스트레스를 유발시켜, 어체 내에서 강력한 항산화 물질인 멜라토닌의 분비를 촉진시키는 계기를 만들어 주는 어류의 스트레스 제어 방법을 이용한 양식방법으로의 이용이 가능하다.
Description
특정의 LED 파장이 어류에게 산화 스트레스를 유발시키는 요인으로 작용하기 때문에, 어체 내에서는 발생된 산화 스트레스를 경감시키기 위하여 어체 내에서는 내분비 작용을 가동시켜 멜라토닌을 생성시킴으로써 강력한 항산화 작용을 수행한다. 이러한 어류의 스트레스 제어로 연결되는 실험결과로부터 어류의 사육장 변경 또는 종묘의 단, 장거리 수송에 따른 스트레스를 자연광을 배제한 환경에서 특정의 LED 광원을 일정시간 동안 조사하여 흰동가리의 체내에서 초기에 일시적으로 산화 스트레스를 유발시켜, 어체 내에서 멜라토닌의 분비를 촉진시키는 계기를 만들어 주는 어류의 스트레스 제어 방법을 이용한 양식방법에 관한 것이다.
빛은 생체리듬을 조절하는 중요한 인자 중 하나로, 24 시간 일주기 동안 발생하게 되는 생리학 및 행동학적 변화를 조절하는 요인이다. 낮과 밤의 광주기는 모든 유기체들이 자연에서 생존하기 위한 중요한 환경적 변화로 어류를 포함한 대부분의 동물들은 빛에 민감한 생체시계를 진화시켜 왔다. 광주기는 리드믹한 합성과 시간에 제한적인 호르몬(예, 멜라토닌) 분비를 위해 내부적 동기화를 제공하며, 이러한 신호는 어류의 생리학적 기능에 영향을 미친다.
생체 내에서 일어나는 수많은 작용은 외부 환경적 요인의 변화에 따라 다양하게 변화된다. 외부의 환경적 요인 중 광주기는 가장 널리 알려져 있는 요인으로, 내분비계에 영향을 미치는 환경 촉진제로서 멜라토닌의 양에 따라 생체리듬이 조절된다. 멜라토닌은 주로 송과체에서 분비되는 호르몬으로 밤에 증가하고 낮에 감소하면서 일주기성 및 계절성 생체리듬 조절에 밀접한 신경내분비적 신호로 작용한다. 또한, 멜라토닌은 생체리듬의 조절뿐만 아니라 유리 라디칼의 소거, 면역 능력의 향상 및 생체분자의 산화 저해와 같은 다양한 생리적인 기능을 수행하고 있다. 특히, 항산화 작용 시 멜라토닌은 cyclic 3-hydroxylmelatonin, N 1-acetyl-N 2-formyl-5- methoxykynuramine 및 N 1-acetyl-5-methoxykynuramine과 같은 항산화 물질로 전환됨으로써 항산화 작용을 수행한다고 알려져 있다.
따라서 멜라토닌은 넓은 범위에서 항산화 물질로 작용하고 있으며, 멜라토닌은 유리 라디칼을 중화시킬 때 필요한 항산화 물질로 일반적으로 알려져 있는 glutathione보다도 더 강력하고, 일반적으로 알려져 있는 항산화 물질보다 더 효과적으로 산화적 손상으로부터 세포막을 보호할 수 있는 물질이다.
이러한 멜라토닌과 관련한 효소로서, 본 연구에서 사용된 Arylalkylamine N-acetyltransferase (AANAT) 효소는 멜라토닌의 생합성에 관여하는 멜라토닌의 전구체로 잘 알려져 있다. 또한, AANAT는 효소의 활성이 매일 반복되기 때문에 rate-limiting enzyme으로도 알려져 있다. AANAT의 합성은 송과체와 망막의 특정 enzyme에 의해 이루어지며, 빛의 노출로 인한 신호와 내재적 생체시계에 의해 생성된다.
발광다이오드(Light emitting diodes ; LED)는 새로운 형태의 빛의 기술이며 특정의 파장의 빛을 방출할 수 있는 장점을 가지고 있는 신개념의 광학 기술로 인해 만들어 졌다. 또한, LED는 최근 양식 산업에 이용되는 빛으로 협대역(narrow bandwidth)의 특징을 가지고 있으며 다양한 환경 및 종에 적용할 수 있다.
이러한 연구 결과를 토대로 어류의 다양한 서식 환경요인 중, 광(빛) 환경 요인 측면에서는 LED의 적용이 가능할 것으로 판단된다. 특정 파장은 어종 및 수중 환경에 따라 달리 적용될 수 있으며, 파장마다 수중에서 빛의 구성이 각각 달라지며 수심이 깊어질수록 빛의 투과성이 약해진다. 청색과 같은 단파장의 빛은 깊은 수심까지 통과하나 적색과 같은 장파장의 빛은 얕은 수심에서만 통과가 가능하다. 더욱이 LED는 낮은 소비 전력과 고효율의 측면뿐만 아니라, 일반 메탈할라이드 광원보다 긴 수명을 갖는 장점을 가지고 있다.
이러한 LED의 긍정적인 결과의 이면에는 파장에 따라 활성산소종(ROS)의 생성을 증가시켜, 생성된 ROS에 의해 세포의 산화적 손상이 발생하여 어체 내에서는 스트레스를 유발시킬 수 있는 부정적 요소도 존재하는 것으로 알려져 있다. 이러한 외부 스트레스에 의해 생성된 ROS는 체내에서 산화 스트레스를 발생시켜 세포 내의 핵산 및 단백질의 구조 변성과 기능의 손실을 야기시키며, 결국 질병에 대한 저항성의 감소 및 생식능력의 저하 등 많은 생리학적 장애를 유발시킨다. 또한, 지질 과산화를 일으켜 세포막의 손상을 야기시킬 뿐만 아니라 효소를 비활성화시켜 세포의 생존에까지 악영향을 미치게 된다.
한편, 체내에서는 이러한 외부의 환경 변화에 적응하기 위하여 즉, 생성된 ROS에 의한 산화 스트레스로부터 자신을 보호하고, 체내 항상성을 유지하기 위하여 항산화 방어기작을 작동시키게 된다. 이러한 항산화 방어기작은 크게 superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT) 및 glutathione peroxidase (GPX) 등과 같은 항산화 효소와 멜라토닌, metallothionein 및 vitamin E (α-tocopherol) 등과 같은 항산화제의 작용에 의해 이루어진다. 이 중 멜라토닌은 라디칼을 소거하는 역할을 수행함으로써 항산화 방어 기작에 따른 항산화제로 강력한 항산화 능력을 가지고 있는 물질로 알려져 있다. 그리고 라디칼을 제거하는 역할을 수행하는 것으로는 항산화제뿐만 아니라 항산화 효소도 존재하는데, 이는 주로 생물체의 간과 신장에 존재하면서 다음과 같이 항산화 작용을 하는 것으로 알려져 있다.
가장 대표적인 항산화 효소인 SOD와 CAT는 ROS를 직접 제거하는 것으로 알려져 있는데, 먼저 SOD는 O2 -를 O2와 H2O2로 전환시켜 일차적으로 활성산소를 소거하는 역할을 수행하며(2O2 -H+→H2O2+O2), SOD에 의해 생성된 활성산소의 일종인 H2O2는 CAT에 의해 무독성의 H2O와 O2로 전환되는 과정(2H2O2→2H2O+O2)을 거치게 된다.
이와 같이 파장에 따라 어체 내에서 스트레스를 유발시킬 수도 있다는 보고가 있음에도 불구하고, 지금까지의 LED 광원에 대한 연구의 대부분은 광주기 및 빛의 강도에 관련된 연구만이 이루어지고 있는 실정이다. 또한, 어류가 여러 가지 파장에 반응한다는 연구결과가 있음에도 불구하고, 아직까지 빛의 파장과 어류의 스트레스 반응에 대한 연구는 매우 제한적이다.
특정의 LED 파장을 실험수조에 조사시켜, 각각의 실험수조의 어류에서 일주기에 따른 멜라토닌을 합성하는 전구체인 AANAT2 mRNA 발현량의 변화를 조사함으로서 항산화 효소인 SOD, CAT의 발현 및 활성, 활성산소인 H2O2의 농도 및 혈장 내 멜라토닌의 농도를 측정하여 특정한 파장이 어류에 미치는 산화 스트레스의 정도 및 항산화 반응 메커니즘을 파악함으로서 어류 내분비 기관의 스트레스 제어를 이용한 양식방법을 제공하고자 한다.
상기 과제를 달성하기 위하여, 고가의 해수 관상어로 널리 알려져 있는 흰동가리(Yellowtail clownfish), 파랑돔(blue damsel) 및 넙치를 이용하여 실험수조에 LED 파장의 빛을 조사시킨 후, 각각의 실험구별 어류에서 일주기에 따른 멜라토닌을 합성하는 전구체인 AANAT2 mRNA의 발현량의 변화를 조사하였을 뿐만 아니라, 항산화 효소인 SOD, CAT의 발현 및 활성, 활성산소인 H2O2의 농도 및 혈장 내 멜라토닌 농도를 측정하여 특정의 파장이 어류에 미치는 산화 스트레스 및 항산화 반응 메커니즘을 파악하였다.
1. 실험어와 조건
실험어인 흰동가리(n=300; 전장=5.2±0.5 cm; 중량=2.1±0.5 g)는 한국해수관상어센터(CCORA)로부터 제공받아 실험실의 300 l 수조에서 순치하였으며, 실험어는 자연 광주기 아래서 2주 동안 안정화시켰다.
대조구인 형광등(9 W)은 표층 기준 0.32 W/m2의 강도였으며, 수온 27±1℃와 광주기는 주간 12 시간 야간 12 시간(07:00-19:00)을 유지시켰다. 사료는 하루에 2회 공급하였다. 실험구는 청색(최대 파장 450 nm), 녹색(최대 파장 530 nm), 적색(최대 파장 630 nm) LED 조절기(Daesin LED Co. Kyunggi, Korea, 표층, 0.9 W/m2 기준)를 사용하여 연구를 진행하였다. 실험구별 실험어를 4시간 간격으로 샘플링하면서 총 28시간 동안 관찰하였으며, 멜라토닌의 항산화 역할을 확인하기 위해 흰동가리에 멜라토닌을 주입한 실험을 병행하였다. 실험어는 200 ppm의 tricaine methan sulphonate (MS-222, Sigma, USA)로 마취하여 척추를 절단, 폐사시킨 후 각각의 조직을 채취하였다. 조직을 채취한 후 곧바로 액체 질소에 넣은 후, total RNA 추출 시까지 -80℃의 초저온 냉동고에 보관하였다.
2. Quantitative PCR (QPCR)
AANAT2와 SOD 및 CAT mRNA 발현량의 변화는 흰동가리의 송과체와 간에서 실시간 정량 유전자 증폭기(quantitative real-time PCR, QPCR)을 이용하여 분석하였다. QPCR의 수행을 위한 primer는 이미 보고되어 있는 타종의 염기배열을 기초로 하여 설계하였다.
- AANAT2 forward primer (5′-CAT TCG TCT CTG TGT CTG G-3′)
- AANAT2 reverse primer (5′-AAA GCC TCT CCT TGT CCC-3′)
- SOD forward primer (5′-CAC GAG AAG GCT GAT GAC-3′)
- SOD reverse primer (5′-GAT ACC AAT GAC TCC ACA GG-3′)
- CAT forward primer (5′- GGG CAA ATT GGT CCT CAA-3′)
- CAT reverse primer (5′- CGA TGT GTG TCT GGG TAG-3′)
- β-actin forward primer (5′-CCA ACA GGG AGA AGA TGA C-3′)
- β-actin reverse primer (5′-TAC GAC CAG AGG CAT ACA-3′)
QPCR은 BIO-RAD iCycler iQ Multicolor Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad, USA)과 iQTM Sybr green Supermix (Bio-Rad, USA)를 이용하여 95℃에서 5분간 초기 열변성 1회, 95℃에서 20초간 열변성, 55℃에서 20초간 프라이머 결합을 총 40회 실시하였다. 내부표준 유전자로는 β-actin을 사용하여 PCR이 진행됨에 따라 calculated threshold cycle (Ct) 값을 결정하여 β-actin에 대한 발현량을 정량화하였다.
3. 통계분석
실험 결과로부터 얻어진 자료 값 사이의 유의차 유무는 SPSS statistical package (version 10.0; SPSS Inc., USA)에 의한 One-way ANOVA 및 Tukey's post hoc test를 실시하여 일주기 동안 평균간의 유의성(P<0.05)을 검정하였다.
이로부터 자연광을 배제한 인공 광 환경에서 LED 광원을 일정시간 동안 조사하여, 흰동가리, 넙치 및 파랑돔의 체내에서 산화 스트레스를 유발시켜, 궁극적으로는 어류의 체내에서 강력한 항산화 물질인 멜라토닌의 분비를 촉진시키는 것을 특징으로 하는 LED 광원의 조사에 의한 어류의 스트레스 제어를 이용한 양식방법을 도출한다.
특정 LED 파장은 어류에 산화 스트레스를 유발시키는 요인으로 작용하여 산화 스트레스를 경감시키기 위하여 어류의 내분비 작용으로 멜라토닌의 분비를 촉진시켜 강력한 항산화 역할을 수행하는 어류의 스트레스 제어로 연결되는 것이 확인되었다. 어류의 사육장 변경 또는 종묘를 단, 장거리 수송하는 경우뿐만 아니라, 수온, 염분 등의 환경 변화에 따라 어류가 받을 수 있는 환경 스트레스를 일정기간 동안 자연광을 배제하고 특정의 LED 광원을 조사한다.
특정의 LED 광원의 조사로 넙치, 파랑돔 및 흰동가리등의 어류 체내에서 산화 스트레스를 유발시킬 수 있는 원리를 이용하게 되면, 어체 내에서는 멜라토닌의 분비가 촉진되어 강력한 항산화 작용을 유도하게 됨으로써 외부의 환경으로부터 받을 수 있는 스트레스를 내분비 제어로서 저감시킬 수 있는 어류 스트레스 제어를 이용한 양식방법이 가능하다. 이로부터 종묘를 성어로 양성하기 위해 사육수조로 입식시키는 경우, 어류의 생리활성도가 높아지게 되어, 초기 사망률을 줄일 수 있어 안정적이고 효율적인 어류 양식이 가능할 것이다.
도 1은 본 발명의 기술적 특징을 나타내는 모식도이다.
도 2는 본 발명에서 사용된 청색 (B), 녹색 (G) 및 적색 (R) LEDs 파장을 그래프로 나타내었다.
도 3은 실시간 정량 유전자 증폭기(quantitative real-time PCR, QPCR)를 이용하여 적색 (R), 녹색 (G), 청색 (B) LED 및 자연 광주기 (simulated natural photoperiod; SNP) 조명을 조사한 흰동가리의 송과체 (in vivo) (A), 멜라토닌 주입한 흰동가리의 송과체 (in vivo) (B)에서 AANAT2 mRNA 발현량의 변화를 관찰한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 실시간 정량 유전자 증폭기(quantitative real-time PCR, QPCR)를 이용하여 적색 (R), 녹색 (G), 청색 (B) LED 및 자연 광주기 (simulated natural photoperiod; SNP) 조명을 조사하면서 배양한 흰동가리의 송과체 (in vitro) (C) 및 멜라토닌을 처리하여 배양한 송과체에 (in vitro) (D)에서 AANAT2 mRNA 발현량의 변화를 관찰한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 실시간 정량 유전자 증폭기(quantitative real-time PCR, QPCR)를 이용하여 적색 (R), 녹색 (G), 청색 (B) LED 및 자연 광주기 (simulated natural photoperiod; SNP) 조명을 조사한 흰동가리의 간에서 SOD (A) 및 CAT mRNA 발현량의 변화 (B)를 관찰한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 실시간 정량 유전자 증폭기(quantitative real-time PCR, QPCR)를 이용하여 적색 (R), 녹색 (G), 청색 (B) LED 및 자연 광주기 (simulated natural photoperiod; SNP) 조명을 조사한 흰동가리에 멜라토닌을 주입한 후, 간에서 SOD (C) 및 CAT (D) mRNA 발현량의 변화를 관찰한 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 마이크로플레이트 리더기를 이용하여 적색 (R), 녹색 (G), 청색 (B) LED 및 자연 광주기 (simulated natural photoperiod; SNP) 조명을 조사한 흰동가리의 간에서 SOD (A) 및 CAT (B) 활성의 변화를 관찰한 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 마이크로플레이트 리더기를 이용하여 적색 (R), 녹색 (G), 청색 (B) LED 및 자연 광주기 (simulated natural photoperiod; SNP) 조명을 조사한 흰동가리에 멜라토닌을 주입한 후, 간에서 SOD (C) 및 CAT (D) 활성의 변화를 관찰한 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 마이크로플레이트 리더기를 이용하여 적색 (R), 녹색 (G), 청색 (B) LED 및 자연 광주기 (simulated natural photoperiod; SNP) 조명을 조사한 흰동가리의 혈장에서 H2O2 농도 (A) 및 멜라토닌을 주입한 흰동가리의 혈장에서 H2O2 농도 (B)의 변화를 관찰한 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 마이크로플레이트 리더기를 이용하여 적색 (R), 녹색 (G), 청색 (B) LED 및 자연 광주기 (simulated natural photoperiod; SNP) 조명을 조사한 흰동가리의 근육에서 malondialdehyde (MDA)와 4-hydroxy nonenal (4-HNE) 정도 (A) 및 멜라토닌을 주입했을 때 MDA와 4-HNE의 농도 (B) 변화를 관찰한 결과를 나타낸 것이다.
도 11은 마이크로플레이트 리더기를 이용하여 적색 (R), 녹색 (G), 청색 (B) LED 및 자연 광주기 (simulated natural photoperiod; SNP) 조명을 조사한 흰동가리의 혈장에서 멜라토닌의 농도 (A) 및 멜라토닌을 주입한 흰동가리의 혈장에서 멜라토닌의 농도 (B) 변화를 관찰한 결과를 나타낸 것이다.
도 12 은 본 발명의 결과를 이용한 어류 입식을 위한 사육수조를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명에서 사용된 청색 (B), 녹색 (G) 및 적색 (R) LEDs 파장을 그래프로 나타내었다.
도 3은 실시간 정량 유전자 증폭기(quantitative real-time PCR, QPCR)를 이용하여 적색 (R), 녹색 (G), 청색 (B) LED 및 자연 광주기 (simulated natural photoperiod; SNP) 조명을 조사한 흰동가리의 송과체 (in vivo) (A), 멜라토닌 주입한 흰동가리의 송과체 (in vivo) (B)에서 AANAT2 mRNA 발현량의 변화를 관찰한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 실시간 정량 유전자 증폭기(quantitative real-time PCR, QPCR)를 이용하여 적색 (R), 녹색 (G), 청색 (B) LED 및 자연 광주기 (simulated natural photoperiod; SNP) 조명을 조사하면서 배양한 흰동가리의 송과체 (in vitro) (C) 및 멜라토닌을 처리하여 배양한 송과체에 (in vitro) (D)에서 AANAT2 mRNA 발현량의 변화를 관찰한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 실시간 정량 유전자 증폭기(quantitative real-time PCR, QPCR)를 이용하여 적색 (R), 녹색 (G), 청색 (B) LED 및 자연 광주기 (simulated natural photoperiod; SNP) 조명을 조사한 흰동가리의 간에서 SOD (A) 및 CAT mRNA 발현량의 변화 (B)를 관찰한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 실시간 정량 유전자 증폭기(quantitative real-time PCR, QPCR)를 이용하여 적색 (R), 녹색 (G), 청색 (B) LED 및 자연 광주기 (simulated natural photoperiod; SNP) 조명을 조사한 흰동가리에 멜라토닌을 주입한 후, 간에서 SOD (C) 및 CAT (D) mRNA 발현량의 변화를 관찰한 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 마이크로플레이트 리더기를 이용하여 적색 (R), 녹색 (G), 청색 (B) LED 및 자연 광주기 (simulated natural photoperiod; SNP) 조명을 조사한 흰동가리의 간에서 SOD (A) 및 CAT (B) 활성의 변화를 관찰한 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 마이크로플레이트 리더기를 이용하여 적색 (R), 녹색 (G), 청색 (B) LED 및 자연 광주기 (simulated natural photoperiod; SNP) 조명을 조사한 흰동가리에 멜라토닌을 주입한 후, 간에서 SOD (C) 및 CAT (D) 활성의 변화를 관찰한 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 마이크로플레이트 리더기를 이용하여 적색 (R), 녹색 (G), 청색 (B) LED 및 자연 광주기 (simulated natural photoperiod; SNP) 조명을 조사한 흰동가리의 혈장에서 H2O2 농도 (A) 및 멜라토닌을 주입한 흰동가리의 혈장에서 H2O2 농도 (B)의 변화를 관찰한 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 마이크로플레이트 리더기를 이용하여 적색 (R), 녹색 (G), 청색 (B) LED 및 자연 광주기 (simulated natural photoperiod; SNP) 조명을 조사한 흰동가리의 근육에서 malondialdehyde (MDA)와 4-hydroxy nonenal (4-HNE) 정도 (A) 및 멜라토닌을 주입했을 때 MDA와 4-HNE의 농도 (B) 변화를 관찰한 결과를 나타낸 것이다.
도 11은 마이크로플레이트 리더기를 이용하여 적색 (R), 녹색 (G), 청색 (B) LED 및 자연 광주기 (simulated natural photoperiod; SNP) 조명을 조사한 흰동가리의 혈장에서 멜라토닌의 농도 (A) 및 멜라토닌을 주입한 흰동가리의 혈장에서 멜라토닌의 농도 (B) 변화를 관찰한 결과를 나타낸 것이다.
도 12 은 본 발명의 결과를 이용한 어류 입식을 위한 사육수조를 나타낸 것이다.
본 발명은 발명의 목적을 달성하기 위하여, LED 광원의 조사에 의한 어류의 스트레스 제어를 이용한 양식방법은 자연광을 배제하고, 인공 광 환경에서 LED 광원을 일정시간 동안 조사하여, 어류의 체내에서 초기에 일시적으로 산화 스트레스를 유발시켜, 어체 내에서 멜라토닌의 분비를 촉진시키는 방법으로 이루어진다.
또한, 상기 LED 광원의 파장은 600-650 nm이며, 일정 시간은 1-3일인 것을 특징으로 한다.
LED 광원의 조사에 의한 어류의 스트레스 제어를 이용한 양식방법은 어류 양식용 종묘를 준비하는 단계; 자연광이 차단된 입식수조에 종묘를 입식시키는 단계; 입식수조에 LED 광원을 조사하여 일정기간 사육하여 어류의 체내에서 산화 스트레스를 유발시킴으로서 어체 내 멜라토닌의 분비를 촉진시키는 단계; 및 입식수조에서 사육된 종묘를 사육수와 함께 사육수조로 이송하여 본 양식을 진행하는 단계로 이루어진 것으로 구성될 수 있다.
또한, 입식수조는 자연광이 차단된 일정 공간; 상기 공간의 일부에는 종묘를 입식할 수 있는 수조; 수조에는 사육수를 여과할 수 있는 여과기와 산소 공급기가 연결 설치되고 상기 수조 상부에는 파장 600-650 nm의 LED 광원이 복수개 설치되는 것을 특징으로 하는 LED 광원의 조사에 의한 어류의 스트레스 제어를 이용한 양식방법이 제공된다.
이하 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 상기의 전체적인 구성을 실시 예와 함께 자세히 설명하면 다음과 같다.
I. LED 광원의 조사에 의한 어류의 내분비 메커니즘
1. 송과체 배양과 멜라토닌 처리
마취시킨 어류에서 송과체를 분리한 후, ice-cold medium (pH 7.5) 내에 보관하였다. 이 medium은 150 mM NaCl, 3.5 mM KCl, 1.0 mM CaCl2?H2O, 1.0 mM MgCl2?6H2O, 0.7 mM NaH2PO4?2H2O, 7.0 mM NaHCO3, 2.8mM glucose, 1.0 mM MgCl2, 10 mM HEPES, 그리고 0.88 g/l Eagle's MEM (Sigma, USA) 및 항체(0.06 g/l penicillin and 0.1 g/l streptomycin; Penicillin-Streptomycin, Gibco, USA)를 포함하고 있다. Medium에 보관된 송과체는 1 ml의 medium이 담긴 24-well로 옮긴 후, 20±1℃에서 자연 광주기(주간 12 시간, 야간 12 시간, 오전 7시 빛)로 배양하였다.
광원은 송과체 배양 플레이트 표면에서 40 cm 높이에 위치하며, 낮 시간 동안에 형광등은 0.32 W/m2, LED는 0.9 W/m2으로 각각의 광원이 유지되었다. 송과체는 4시간 간격으로 샘플링 되었으며(ZT4-ZT28), 각각의 샘플은 20℃의 10,000xg에서 15초 동안 원심분리, 상층액을 제거한 후, RNA 추출까지 -80℃에 보관하였다.
멜라토닌(Sigma, USA)은 0.9 % 생리식염수에 용해하여, 배양액에 1/1000의 비율로 첨가하였으며, 4-28 시간 동안 샘플링하였으며, 각각의 샘플은 20℃의 10,000xg에서 15초 동안 원심분리, 상층액을 제거한 후, RNA 추출까지 -80℃에 보관하였다.
도 3과 4는 실시간 정량 유전자 증폭기(quantitative real-time PCR, QPCR)를 이용하여 적색 (R), 녹색 (G), 청색 (B) LED 및 자연 광주기 (simulated natural photoperiod; SNP) 조명을 조사한 흰동가리의 송과체(in vivo) (A), 멜라토닌을 주입한 흰동가리의 송과체(in vivo) (B), 배양된 송과체(in vitro) (C) 및 멜라토닌을 처리하여 배양된 송과체(in vitro) (D)에서 각각 AANAT2 mRNA 발현량의 변화를 관찰한 결과를 나타내었다.
실험어의 명암주기를 주간 12 시간, 야간 12 시간으로 설정하여 사육하였으며, 송과체의 total RNA (2.5 μg)를 역전사하여 증폭시켰다. 실험 결과는 같은 샘플 내의 β-actin 발현량에 비례하여 표준화된 발현량으로 나타내었다. 흰색 바는 주간(명기)를 나타낸 것이며, 검은 바는 야간(암기)를 나타낸 것이다. 각각 다른 알파벳 문자는 동일한 파장 내 Zeitgeber times (ZT) 간의 유의적인 차이를 나타내며 (P < 0.05), 별표(*)는 동일한 Zeitgeber times (ZT) 내 파장 별로 유의적인 차이를 나타낸다 (P < 0.05). 모든 수치들은 평균 값±SD (n= 5)로 표현하였다.
실시간 정량 유전자 증폭기(quantitative real-time PCR, QPCR)를 이용하여 각 파장별 흰동가리의 송과체에서 AANAT2 mRNA 발현량의 변화를 관찰한 결과, AANAT2 mRNA는 모든 파장별 실험구에서 낮 시간대에서보다 밤 시간대에서 유의적으로 높은 발현량을 보였으며, 다른 파장 실험구에 비하여 적색 LED 실험구에서 송과체(in vivo) 및 배양된 송과체(in vitro)에서 모두에서 유의적으로 높은 발현량을 나타내었다 (도 3-A 및 도 4-C).
2. 멜라토닌 주입
멜라토닌 (Sigma, USA)은 0.9% 생리식염수에 용해하였다. 마취시킨 흰동가리 (5.2±0.5 g)에 어체 중량당 200 μg 멜라토닌/g을 10 μl 주입하였다. 오전 7시에 주입한 후, 4 시간 간격으로 11:00, 15:00, 19:00, 23:00, 03:00 및 07:00에 흰동가리 5마리에서 각각 송과체, 뇌, 간 조직을 샘플링 하였으며, 전 실험기간 동안 실험어는 폐사하지 않았다.
또한, 흰동가리에 멜라토닌을 직접 주입(in vivo) 또는 송과체에 멜라토닌을 처리(in vitro)한 실험 결과, 일주기 동안 AANAT2 mRNA 발현량의 변화는 멜라토닌을 주입 또는 처리하지 않은 실험구와 비슷한 양상이 관찰되었으나, 발현량은 멜라토닌을 주입 또는 처리하지 않은 실험구에 비하여 유의적으로 낮은 발현량이 관찰되었다 (도 3-B 및 도 3-D).
3. SOD와 CAT 활성 분석
간 조직은 1 mM EDTA가 포함되어 있는 0.1 M phosphatebuffered saline (PBS, pH 7.4)으로 homogenize한 후, 4℃에서 10,000xg로 15분간 원심분리하여 상층액을 제거하고 하층부를 분석 샘플로 사용하였다. SOD와 CAT 활성은 Cayman Chemical (USA)를 이용하여 분석하였고, 효소 단위는 U/ml (SOD)과 nmol/min/ml (CAT)을 사용하였다.
SOD 활성 분석은 xanthine oxydase과 hypoxanthine를 이용하여 superoxide radical의 분리를 위한 tetrazolium salt를 이용하였다. SOD의 단위는 superoxide radical의 50% dismutation을 위한 필요한 효소의 양을 나타낸다. 450 nm 흡광도를 사용하며, 효소단위는 U/ml를 사용하였다.
CAT 활성 분석은 H2O2 optimal 농도의 양에서 methanol과 반응하는 효소의 양을 기초로 한다. Formaldehyde는 chromogen 같은 4-amino-3-hydrazino-5- mercapto-1,2,4-triazole (Purpald)과 함께 spectrophotometrically를 측정하였다. Purpald는 특이적으로 aldehydes와 함께 bicyclic hetero cycle를 형성하며, 보라색이 사라지는 것으로부터 산화 정도가 변한다. 흡광도는 540 nm를 사용하며, 효소단위는 nmol/min/ml를 사용한다.
도 5와 6은 실시간 정량 유전자 증폭기(quantitative real-time PCR, QPCR)를 이용하여 적색 (R), 녹색 (G), 청색 (B) LED 및 자연 광주기(simulated natural photoperiod; SNP) 조명을 조사한 흰동가리의 간 조직에서 SOD (A) 및 CAT (B) mRNA 발현량의 변화, 멜라토닌을 주입한 흰동가리의 간에서 SOD (C) 및 CAT (D) mRNA 발현량의 변화를 관찰한 결과를 나타내었다.
실험어의 명암 주기는 주간 12시간, 야간 12시간으로 설정하여 사육하였으며, 송과체의 total RNA (2.5 μg)는 역전사 효소를 사용하여 cDNA를 합성 후에 실험에 사용하였다. 실험 결과는 동일한 샘플 내의 β-actin의 발현량에 비례하여 표준화된 발현량으로 나타내었다. 흰색 바는 주간(명기)를 나타낸 것이며, 검은 바는 야간(암기)를 나타낸 것이다. 각각 다른 알파벳 문자는 동일한 파장 내 Zeitgeber times (ZT) 간의 유의적인 차이를 나타내며 (P < 0.05), 별표(*)는 동일한 Zeitgeber times (ZT) 내 파장 별로 유의적인 차이를 나타낸다 (P < 0.05). 모든 수치들은 평균 값±SD (n = 5)로 나타내었다.
실시간 정량 유전자 증폭기(quantitative real-time PCR, QPCR)를 이용하여 각 파장별 흰동가리의 간 조직에서 SOD 및 CAT mRNA 발현량의 변화를 관찰하였다 (도 5, 6). SOD 및 CAT mRNA는 모든 파장별 실험구에서 밤 시간대에서보다 낮 시간대에 유의적으로 높은 발현량을 나타내었으며, 다른 파장의 실험구에 비하여 적색 LED 실험구에서, 간 조직에서 모두 유의적으로 높은 발현량을 나타내었다 (도 5-A 및 6-C).
또한, 흰동가리에 멜라토닌을 직접 주입 (in vivo) 또는 흰동가리의 송과체에 멜라토닌을 처리(in vitro)한 실험 결과, 일주기 동안 SOD 및 CAT mRNA 발현량의 변화는 멜라토닌을 주입한 실험구와 주입하지 않은 실험구가 비슷한 양상으로 나타났으나, 멜라토닌을 주입한 실험구가 멜라토닌을 주입하지 않은 실험구에 비하여 발현량이 유의적으로 낮게 관찰되었다 (도 5-B 및 6-D).
4. 간 조직에서 SOD 및 CAT 활성 변화
도 7과 8은 마이크로플레이트 리더기를 이용하여 적색 (R), 녹색 (G), 청색 (B) LED 및 자연 광주기 (simulated natural photoperiod; SNP) 조명을 조사한 흰동가리의 간 조직에서 SOD (A) 및 CAT (B)의 활성도 변화, 그리고 멜라토닌을 주입한 흰동가리의 간 조직에서 SOD (C) 및 CAT (D)의 활성도 변화를 관찰한 결과를 나타내었다. 실험어의 명암주기는 주간 12시간, 야간 12시간으로 설정하여 실험하였다. 흰색 바는 명기를 나타낸 것이며, 검은 바는 암기를 나타낸 것이다. 각각 다른 알파벳 문자는 동일한 파장 내 Zeitgeber times (ZT) 간의 유의적인 차이를 나타내며 (P < 0.05), 별표는 동일한 Zeitgeber times (ZT) 내의 파장 별로 유의적인 차이를 나타내었다 (P < 0.05). 모든 수치들은 평균 값±SD (n=5)로 표현하였다.
본 발명에서는 마이크로플레이트 리더기를 이용하여 각각의 파장별로 흰동가리의 간 조직에서 SOD 및 CAT 활성도의 변화를 관찰하였다 (도 7, 8). SOD 및 CAT의 활성도는 모든 파장의 실험구에서 밤 시간대에서보다 낮 시간대에서 유의적으로 높은 활성도를 보였으며, 다른 파장 실험구에 비하여 적색 LED 실험구에서 모두 유의적으로 높은 활성도를 나타내었다 (도 7-A 및 8-C).
또한, 흰동가리에 멜라토닌을 직접 주입 (in vivo) 또는 흰동가리의 송과체에 멜리토닌을 처리 (in vitro)하여 실험한 결과, 일주기 동안 활성도 변화는 멜라토닌을 주입 또는 처리하지 않은 실험구와 비슷하게 나타났으나, 활성도는 멜라토닌을 주입 또는 처리하지 않은 실험구에 비하여 유의적으로 낮은 나타난 것을 관찰할 수 있었다 (도 7-B 및 8-D).
5. H2O2 농도 분석
혈중 H2O2 농도는 Nouroozzadeh et al. (1994)의 방법과 Peroxide Detect kit (Sigma, USA)를 이용하여 측정하였다. 혈장 20 ul를 96-well microtitre plate에 각각 분주한 후, 20 분간 실온에서 항체와 반응시켰다. Color regent를 200 ul첨가한 후, 실온에서 1시간 동안 반응시켜 560 nm의 흡광도에서 측정하였다. 농도의 단위는 nM/ml로 나타내었다.
도 9는 마이크로플레이트 리더기를 이용하여 적색 (R), 녹색 (G), 청색 (B) LED 및 자연 광주기 (simulated natural photoperiod; SNP) 조명을 조사한 흰동가리의 혈장에서 H2O2 농도(A) 및 멜라토닌을 직접 주입한 흰동가리의 혈장에서 H2O2 농도의 변화(B)를 관찰한 결과이다. 실험어의 명암주기는 주간 12시간, 야간 12시간으로 설정하여 사육하였다. 흰색 바는 명기를 나타낸 것이며, 검은 바는 암기를 나타낸 것이다. 각각 다른 알파벳 문자는 동일한 파장 내 Zeitgeber times (ZT) 간의 유의적인 차이를 나타내며 (P < 0.05), 별표(*)는 동일한 Zeitgeber times (ZT) 내 파장 별로 유의적인 차이를 나타내었다 (P < 0.05). 모든 수치들은 평균 값±SD (n = 5)로 표현하였다.
마이크로플레이트 리더기(microplate reader)를 이용하여 각 파장별로 혈장 H2O2농도의 변화를 관찰한 결과, 혈장 H2O2 농도는 모든 파장의 실험구에서 밤 시간대에서보다 낮 시간대에서 유의적으로 높은 농도 값을 보였으며, 다른 파장 실험구에 비하여 적색 LED 실험구에서, 간 조직에서 모두 유의적으로 높은 농도 값을 나타내었다 (도 9A 및 도 8-C).
도 10은 마이크로플레이트 리더기를 이용하여 적색 (R), 녹색 (G), 청색 (B) LED 및 자연 광주기(simulated natural photoperiod; SNP) 조명을 조사한 흰동가리의 근육에서 malondialdehyde (MDA)와 4-hydroxy nonenal (4-HNE) 정도(A) 및 멜라토닌을 흰동가리에 직접 주입했을 때 MDA와 4-HNE 농도의 변화(B)를 관찰한 결과를 나타내었다.
흰동가리에 멜라토닌을 직접 주입(in vivo)하여 실험한 결과, 일주기 동안 MDA와 4-HNE 농도의 변화는 멜라토닌을 주입하지 않은 실험구와 비슷한 수치를 나타냈으나, 멜라토닌을 주입하지 않은 실험구에 비하여 유의적으로 낮은 농도 값을 나타내었다 (도 10-A 및 10-B).
6. 멜라토닌 농도 측정
혈중 멜라토닌 농도는 immunoenzymoassay 분석 방법과 enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) kit (IBL, Hamburg, Germany)를 이용하여 측정하였다. 원심분리하여 얻어진 혈장 50 μl를 ELISA plate에 각각 분주하였다. 멜라토닌-biotin과 함께 4℃에서 15 시간 동안 반응시킨 후, 3회 세척 후, enzyme-labeled solution (anti-biotin-alkaline phosphatase in Tris buffer with stabilizers)으로 실온에서 2시간 반응시켰다. Plate를 세척한 후, p-nitro-phenyl phosphate solution으로 30분간 반응시킨 후, 50 μl의 stop solution (1 N NaOH with 0.25 M ethylene diamine tetraacetic acid)으로 반응을 정지시켜, 405 nm의 흡광도에서 측정하였다.
7. 혈장 멜라토닌 농도
도 11은 마이크로플레이트 리더기를 이용하여 적색 (R), 녹색 (G), 청색 (B) LED 및 자연 광주기 (simulated natural photoperiod; SNP) 조명만을 주사한 흰동가리의 혈장에서 멜라토닌 농도 (A) 및 멜라토닌을 주입한 흰동가리의 혈장에서 멜라토닌 농도의 변화(B)를 측정한 결과를 나타내었다. 실험어의 명암 주기는 주간 12시간, 야간 12시간으로 설정하여 사육하였다. 흰색 바는 명기를 나타낸 것이며, 검은색 바는 암기를 나타낸 것이다. 각각 다른 알파벳 문자는 동일한 파장 내 Zeitgeber times (ZT) 간의 유의적인 차이를 나타내며 (P < 0.05), 별표(*)는 동일한 Zeitgeber times (ZT) 내 파장 별로 유의적인 차이를 나타내었다 (P < 0.05). 모든 수치들은 평균 값±SD (n = 5)로 표현하였다.
마이크로플레이트 리더기를 이용하여 각 파장별로 혈장 멜라토닌 농도 변화를 측정한 결과, 혈장 멜라토닌의 농도는 모든 파장의 실험구에서 밤 시간대에서보다 낮 시간대에서 유의적으로 높은 농도 값을 보였으며, 다른 파장 실험구에 비하여 적색 LED 실험구에서 유의적으로 높은 농도 값을 보였다(도 11 A).
또한, 흰동가리에 멜라토닌을 직접 주사한 실험(in vivo) 결과, 일주기 동안 멜라토닌 농도의 변화 경향은 멜라토닌을 주입하지 않은 실험구와 비슷하게 나타났으나, 농도는 멜라토닌을 주입하지 않은 실험구에 비하여 유의적은 높은 수치가 관찰되었다(도 11 B).
II
.
LED
광원의 조사에 의한 어류의 내분비 스트레스 제어를 이용한 양식방법
1. LED 광원의 조사에 의한 어류의 내분비 스트레스 이용 기작
본 발명의 실험에서는 적색, 녹색, 청색의 LED 파장을 갖는 광원을 설치한 실험구의 흰동가리에서 멜라토닌을 합성하는 전구체인 AANAT2 mRNA의 발현과 항산화 효소인 SOD, CAT 발현 및 활성, 활성산소인 H2O2 농도 및 혈장 내 멜라토닌 농도를 측정한 결과, 특정의 LED 파장이 어류에 미치는 산화 스트레스 및 항산화 반응 메커니즘을 파악하였다. 또한, 멜라토닌의 항산화 능력을 확인해 보기 위하여 일주기 동안 흰동가리의 송과체에서 AANAT2 mRNA의 발현량과 간 조직에서 SOD/CAT mRNA의 발현량 및 활성도의 변화를 관찰하였다.
흰동가리의 송과체(in vivo) 및 송과체 배양 실험(in vitro)을 통하여 AANAT2 mRNA의 발현량을 분석한 결과, 적색 LED 조명의 경우, 형광등, 청색 및 녹색 LED 조명에 비하여 유의적으로 높은 AANAT2 mRNA의 발현량이 관찰되었고, SOD와 CAT mRNA의 발현량 및 활성을 측정한 결과, 적색 LED 파장에서 SOD와 CAT mRNA 발현량 및 활성도 또한 다른 파장에 비하여 유의적으로 높은 값을 나타내었다.
멜라토닌의 전구체인 AANAT2 mRNA 발현량이 적색 LED 파장 실험구에서 높게 나타난 것은 적색 파장(빛)이 다른 파장(빛)에 비하여 흰동가리에 산화 스트레스 요인으로 작용하여, 어체 내에서는 이러한 산화 스트레스에 대한 항산화 역할을 담당하는 물질인 멜라토닌을 합성하기 위하여 AANAT2 mRNA가 높게 발현된 것으로 사료된다.
따라서, 본 연구에서는 특정 파장의 LED 광원에 의한 산화 스트레스에 대하여 멜라토닌이 항산화 역할을 수행하고 있는지를 확인하기 위하여, 강력한 항산화 물질로 알려져 있는 멜라토닌을 직접 어체에 주입(in vivo) 및 어체에서 송과체를 분리한 후 배양(in vitro)하면서 AANAT2 mRNA 발현량의 변화 및 SOD/CAT mRNA 발현량 및 활성도를 분석한 결과, 멜라토닌을 주입 및 처리하지 않은 모든 파장의 실험구에 비하여 유의적으로 낮게 발현되었음이 관찰되었다.
이러한 결과는 멜라토닌이 산화 스트레스를 감소시키는 역할을 수행하기 위하여, 어체 내에서 발생된 활성산소가 주입 및 처리된 항산화제인 멜라토닌에 의해 소거됨으로써 활성산소 제거를 위한 체내 멜라토닌의 분비량이 급격히 감소된 것이라 사료된다. 따라서 멜라토닌을 합성하는 AANAT2 mRNA의 발현량 또한 감소된 것으로 판단된다.
적색, 녹색 및 청색 LED의 파장을 각각 조명한 후 흰동가리의 혈장 내에서 활성산소인 H2O2의 농도를 측정한 결과, 적색 LED 조명이 흰동가리에서 다른 파장을 조명한 흰동가리보다 활성산소인 H2O2의 농도가 높게 나타났고, 멜라토닌을 주입한 흰동가리에서는 멜라토닌을 주입하지 않은 흰동가리와 비교하여 볼 때, 약 2배 정도 낮은 수치가 나타났다.
이러한 실험결과는 적색 파장으로 인하여 어체 내에서는 산화 스트레스가 발생되었으며, 이로 인하여 어체 내에서 증가된 활성산소를 멜라토닌이 직접적으로 제거함으로써 강력한 항산화 역할을 수행하고 있다는 것을 의미한다.
본 발명에서 혈장 내 멜라토닌의 양(농도)을 측정한 결과, 모든 LED 파장에서 주간에는 낮은 값을 보이다가 야간에 증가하는 경향을 보였으나, 적색 LED 파장의 경우에는 다른 파장과 비교하여 볼 때, 전 시간대에 걸쳐서 유의적으로 높은 값을 나타내었다. 이러한 사실은 적색 파장이 흰동가리의 체내에서 산화 스트레스를 유발시켜, 이 때 발생된 활성산소를 제거하기 위하여 멜라토닌이 다른 파장에서보다 더 많이 분비된 것으로 보이며, 멜라토닌을 주입한 실험 결과 혈장 내 멜라토닌의 값이 급격히 높아졌음을 알 수 있었다. 이는 외부에서 다량의 멜라토닌이 체내로 유입됨으로써 일시적으로 수치가 상승한 결과로 사료된다.
이러한 실험결과를 종합해 보면, 적색 파장은 흰동가리에 산화 스트레스를 유발시키는 요인으로 작용하였으며, 산화 스트레스를 경감시키기 위하여 흰동가리의 체내에서는 멜라토닌이 강력한 항산화로서의 역할을 수행하고 있는 것으로 확인되었다.
또한, 흰동가리 뿐만 파랑돔 및 넙치를 대상으로 한 실험에서도 상기 기술한 결과와 동일, 유사한 실험 결과를 얻을 수 있었고 이로부터 이하 상술하는 어류의 내분비 스트레스 제어를 이용한 양식방법 및 장치로의 응용이 가능한 것으로 판단된다.
2. 어류의 내분비 스트레스 제어를 이용한 양식방법 및 장치
어류는 사육장이 변경되거나, 단, 장거리 이동 등 환경이 변하는 경우에는 외부로부터 스트레스를 받게 된다. 즉, 어류 종묘 양식장 등에서 생산된 치어 등을 성어로 사육하기 위해서 사육수조가 완비된 양식장으로 운반하여, 치어를 사육수조로 곧바로 입식하는 경우, 어체의 크기가 작은 치어는 수온 및 염분 등의 변화에 의한 외부 환경 스트레스를 받게 된다. 치어는 성어와는 달리 외부 스트레스 환경에 민감하고 새로운 환경에 대한 적응력이 낮기 때문에, 치어의 초기 사망률이 높아지게 된다. 결과적으로는 성어로 양성이 가능한 개체 수 자체가 감소하게 되어 어류 양식의 경제성을 하락시키는 결과를 초래하게 된다.
즉, 어류가 받는 외부환경에 의한 스트레스는 어류가 극복할 수 있는 요건은 아니며(특히, 치어의 경우에는 그 한계치를 극복하기 어렵다), 이를 개선하지 않을 경우 어류가 대량으로 폐사하는 상황에 처해지는 등 악 영향을 미치게 된다. 따라서 외부 환경 요인에 의한 스트레스에 대하여 어류가 체내에서 자가 내분비 조절에 의하여 자기방어 물질을 분비하게 된다면, 어류는 스트레스에 대한 생체 저항력이 높아지게 된다. 본 발명의 실험결과로부터 자연광을 배제한 환경에서 파장 600-650 nm인 특정의 적색 LED 광원을 일정시간(약 1-3일) 동안 조사하여 흰동가리의 체내에서 초기에 일시적으로 산화 스트레스를 유발시켜, 어체 내에서 강력한 항산화 물질인 멜라토닌의 분비를 촉진시키는 계기를 만들어 주는 어류의 스트레스 제어 방법을 이용한 양식방법으로의 이용이 가능하다.
도 12 은 본 발명의 결과, 어류의 스트레스 제어를 이용한 양식방법에서 사용되는 어류 입식을 위한 사육수조의 예를 나타내고 있다. 어류의 스트레스 제어를 이용한 양식에 사용되는 장치는 자연광이 차단된 일정 공간; 상기 공간의 일부에는 종묘를 입식할 수 있는 수조에 여과장치와 산소공급기가 연결 설치되고 상기 수조 상부에는 파장 600-650 nm의 LED 광원이 복수개 장착된 장치로 제공될 수 있다.
이와 같은 양식 장치를 이용함으로서, 입식을 위해 운반되어 온 어류 양식용 종묘(치어)를 준비하는 단계; 자연광이 차단된 입식수조에 준비된 종묘(치어)를 입식시키는 단계; 입식수조에 600-650 nm의 LED 광원을 조사하여 일정기간 사육하는 단계; 입식수조에서 사육된 종묘(치어)를 사육수조로 이송하여 본 양식을 진행하는 단계로 이루어진 것을 특징으로 LED 광원의 조사에 의한 어류의 스트레스 제어를 이용한 양식이 가능하다.
특정한 LED 파장이 어류에 미치는 산화 스트레스 및 항산화 반응 메커니즘을 파악한 결과, 혈장 내의 멜라토닌 농도(양)는 다른 파장과 비교하여 볼 때, 적색 LED 파장에서 전 시간대에 걸쳐서 유의적으로 높은 수치를 나타내었다. 적색 파장은 어류에게 산화 스트레스를 유발시키는 요인으로 작용함으로써, 어체 내에서는 산화 스트레스를 경감시키기 위한 내분비 작용으로 멜라토닌을 발생시켜 강력한 항산화 역할을 수행하는 어류의 스트레스 제어로 연결되는 것으로 확인됨에 따라, 어류의 사육장 변경 또는 종묘의 단,장거리 이동에 따른 스트레스를 자연광을 배제한 환경에서 특정의 LED 광원을 일정시간 동안 조사하여 흰동가리의 체내에서 초기에 일시적으로 산화 스트레스를 유발시킴으로서 어체 내 멜라토닌의 분비를 촉진시켜 어류의 스트레스 제어를 이용한 양식방법으로의 산업적 이용이 가능하다.
Claims (7)
- a) 어류양식용 치어 종묘를 준비하는 단계;
b) 자연광이 차단된 일정 공간, 상기 공간의 일부에 치어 종묘를 입식할 수 있는 입식 수조, 상기 입식 수조에는 사육수를 여과할 수 있는 여과장치와 산소공급기가 설치되고, 상기 입식 수조의 상부에는 파장 600-650nm의 LED 광원이 복수개 설치된 입식 수조에 a) 단계의 치어 종묘를 입식시키는 단계;
c) 자연광을 차단시킨 상태에서 파장 600-650nm의 LED 광원을 명암주기 12:12로 조사하면서 1-3일간 사육하여 어류의 체내에서 일시적으로 산화 스트레스를 유발시킴으로서, 어체 내에서 멜라토닌의 분비를 촉진시키는 단계;
d) c) 단계의 입식수조에서 사육된 종묘를 사육수와 함께 사육수조로 이송하여 성어로 성장시키는 본양식을 진행하는 단계로 이루어진 것을 특징으로 하는 LED 광원의 조사에 의한 어류의 스트레스 제어를 이용한 양식방법 - 삭제
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