KR101207126B1 - 발광다이오드 광원 조사에 의한 어류의 절식 스트레스 억제를 이용한 양식방법 및 장치 - Google Patents
발광다이오드 광원 조사에 의한 어류의 절식 스트레스 억제를 이용한 양식방법 및 장치 Download PDFInfo
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Abstract
어류를 절식시킴에 따라 어류가 받는 산화 스트레스를 LED의 특정 광원으로 조절시킬 수 있는 가능성을 확인하기 위해 어류를 3종류의 단파장(적색, 녹색, blue)의 조명 조건하에서 절식시키면서 각각의 LED 파장별 실험어에서 항산화 효소인 SOD, CAT, GPX mRNA 발현 및 활성의 변화 및 간에서 CAT 단백질 발현량의 변화를 관찰하는 한편, 활성산소 종인 H2O2농도와 지질 과산화(lipid peroxidation) 정도 및 면역 측정 지표인 라이소자임(lysozyme) 활성, 간 손상 지표인 AspAT, AlaAT의 농도 변화를 조사한 결과 녹색과 청색파장이 절식 시 어류의 체내에서 유도된 산화 스트레스를 억제하여, 유해한 활성산소로부터 체내를 보호하는 역할을 수행한 것으로 확인됨으로서, 이와 같은 결과들은 최근 개발이 시도되고 있는 고밀도 빌딩양식 등에 필요한 양식기법의 완성을 위한 주요 기술서의 산업적 이용이 가능하다.
Description
어류를 절식시킴에 따라 어류가 받는 산화 스트레스를 LED의 특정 광원으로 조절시킬 수 있는 가능성을 확인하기 위해 어류를 3종류의 단파장(적색, 녹색, blue)의 조명 아래에서 절식시키면서 각각의 LED 파장별 실험어에서 항산화 효소인 SOD, CAT, GPX mRNA 발현 및 활성의 변화 및 간에서 CAT 단백질 발현량의 변화를 관찰하는 한편, 활성산소 종인 H2O2농도와 지질 과산화(lipid peroxidation; LPO) 정도 및 면역 측정 지표인 라이소자임(lysozyme) 활성, 간 손상 지표인 AspAT, AlaAT의 농도 변화를 조사함으로서 LED 광원 조사에 의한 어류의 절식 스트레스 억제를 어류 양식에 이용하기 위한 방법에 관한 것이다.
절식(starvation)은 노화, 빈혈, 화학적 독성 및 질병을 유발시키며, 이는 체내에서 활성산소를 발생시켜 산화 스트레스를 유도한다. 또한, 절식시 체내에 저장되어 있는 항산화 물질을 고갈시켜 활성산소의 발생을 유의적으로 증가시킨다.
이러한 활성산소 종(reactive oxygen species; ROS)은 체내에서 산소 대사 과정 중에서 자연적으로 생성되며, 그 종류로는 superoxide (O2 -), hydrogenperoxide(H2O2), hydroxylradical(HO-)과 singlet oxygen (1O2)등이 있다. 외부의 환경 스트레스에 의해 체내에서 ROS가 과잉 생성되면 세포 내 핵산 및 단백질의 구조 변성과 기능 손실을 야기시켜 질병 저항성 감소, 생식능력 저하 등 많은 생리학적 장애를 유발시킬 뿐만 아니라, 지질 과산화를 일으켜 세포막 손상과 효소를 비활성화시켜 결국 세포 생존에 악영향을 끼친다. 또한, 이러한 ROS는 산화 스트레스를 유발시킬 뿐만 아니라 라이소자임(lysozyme) 활성을 저하시켜 면역 기능에도 악영향을 미치는 것으로 알려져 있다.
따라서, 생물체는 체내에서 생성되는 이러한 ROS에 의한 산화 스트레스로부터 자신을 보호하고, 체내 항상성을 유지하기 위하여 항산화 방어기작을 발전시켜 왔다. 이러한 항산화 방어기작은 크게 superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT) 및 glutathione peroxidase (GPX) 등과 같은 항산화 효소 작용에 의해 이루어진다. 이와 같은 항산화 효소는 주로 생물체의 간과 신장에 존재하면서 항산화 작용을 하는 것으로 알려져 있다. 또한, 이러한 항산화 효소뿐만 아니라 생체 리듬을 조절하는 대표적인 호르몬으로 알려져 있는 멜라토닌은 유리 라디칼 소거, 면역능 향상 및 생체분자 산화 저해와 같은 다양한 생리적인 기능을 수행하고 있다. 멜라토닌은 유리 라디칼을 중화시킬 때 항산화 물질로 일반적으로 알려져 있는 glutathione보다 더 강력하고, 다른 항산화 물질 보다 산화적 손상으로부터 세포막을 보호할 수 있는 효과적인 물질이다.
본 발명자들은 선행 발명에서 흰동가리(yellowtail clownfish, Amphiprion clarkii)를 이용하여 녹색과 청색LED 단파장이 산화 스트레스에 대응하기 위한 항산화 물질의 증가에 효과적이라는 결과를 출원하였다. 또한 적색 LED 파장은 어류의 생리적 기능에 영향을 미쳐 흰동가리의 경우 산화 스트레스를 유도하였다는 연구 결과를 토대로 선행발명을 출원하였다. 이러한 발광다이오드(light emitting diodes; LED)는 다양한 형태의 빛 중 새로운 형태의 빛의 기술이며, 특정 파장의 빛을 방출할 수 있는 장점을 가지고 있는 신개념의 광학 기술로 인해 만들어졌다. LED는 협대역(narrow bandwidth)의 특징을 가지고 있으며, 다양한 수중 환경 및 종에 선택적으로 적용할 수 있다. 이러한 LED를 활용한 연구 결과를 토대로 어류의 다양한 서식 환경요인 중, 광 환경 요인으로 LED의 적용이 가능할 수 있을 것이다. 어종 및 수중 환경에 따라 특정 파장은 달리 적용될 수 있으며, 파장마다 수중에서 빛의 구성이 각각 달라지며 수심이 깊어질수록 빛의 투과성이 약해진다.
현재까지 환경적 요인에 의한 어류의 성장 및 번식에 관한 많은 연구가 이루어져 왔다. 많은 환경적 요인들 중 빛은 대부분의 식물 및 동물들의 생활에 있어 필수적인 요소이며, 몇몇 종들은 깊은 바다(aphotic zone)나 동굴 내부에서 빛이 없어도 살 수 있긴 하지만, 일반적으로 빛은 생체 리듬을 조절하는 중요한 인자 중 하나로 24 시간 일주기내 일어나는 생리학적 및 행동학적 변화를 조절하는 요인이다.
이러한 광 환경은 수많은 어류의 생존 및 성장에 영향을 미치는 것으로 알려져 있다. 특히, 광 환경 조건에서 어류를 포함한 생물체의 성장은 매우 필수적인 생물학적 과정으로, 어류의 먹이 섭취능, 항상성 유지능, 대사 조절능 및 환경 스트레스에 의한 영향을 파악할 수 있는 지표가 될 수 있다. 그러나 아직까지 빛의 파장과 어류의 스트레스 반응에 대한 연구는 매우 제한적이다.
본 발명에서는 어류를 절식시킴에 따라 어류가 받는 산화 스트레스를 LED의 특정 광원으로 조절시킬 수 있는 가능성을 확인하고자 하였다. 어류에게 서로 다른 단파장의 조명 아래에서 일정기간 동안 절식시키면서 각각의 LED 파장별 실험구의 실험어에서 항산화 효소인 발현 및 활성의 변화를 분석하고, 이를 토대로 LED 광원 조사에 의한 어류의 절식 스트레스 억제를 어류 양식방법으로 이용하기 위한 기술제공을 목적으로 한다.
본 발명에서는 어류를 절식시킴에 따라 어류가 받는 산화 스트레스를 LED의 특정 광원으로 조절시킬 수 있는 가능성을 확인하고자 고가의 해수 관상어로 널리 알려져 있는 시나몬 클라운 피쉬(cinnamon clownfish)를 이용하여 3가지 파장(적색, 녹색, blue)의 조명 아래에서 총 12일 동안 절식시키면서 각각의 LED 파장별 실험구의 실험어에서 항산화 효소인 SOD, CAT, GPX mRNA 발현 및 활성의 변화를 분석하였으며, CAT western blotting을 통하여 간에서 CAT 단백질 발현량의 변화를 관찰하였다.
또한, 직접적으로 어류가 감지하는 산화 스트레스를 확인하기 위하여 대표적인 활성산소 종인 H2O2농도와 지질 과산화(lipid peroxidation; LPO) 정도를 측정하였으며, LED 파장별 실험어의 면역 기능의 변화를 확인하기 위하여 면역 측정 지표인 라이소자임(lysozyme) 활성, 간 손상 지표인 AspAT, AlaAT의 농도 변화를 조사하였다.
1.
실험어
실험어 시나몬 클라운 피쉬(cinnamon clownfish; n = 200; 길이 = 6.2 ± 0.5 cm; 무게 = 5.2 ± 1.1 g)은 한국 해수 관상어 센터(CCORA)로부터 제공받았으며, 실험실의 300-l 수조에서 순치시켰다.
실험어는 2주 동안 자연 광주기에서 안정화시켰다. 대조구인 형광등(27 W)은 표층에서 0.96 W/m2의 세기를 가지고 있으며, 수온 27 ± 1℃ 와 광주기 12-h light:12-h dark (07:00 - 19:00)를 유지시켰다. 사료공급은 하루에 2번 공급하였다. 대조구는 형광등에 머물게 하면서 하루에 2번씩(오전 9시, 오후 5시) 사료를 공급하였다. 실험구는 청색(450 nm), 녹색(530 nm), 적색(630 nm) LED 광원(Daesin LED Co. Kyunggi, Korea, 표층, 0.9 W/m2 기준)으로 노출시키면서 12일 동안 절식시켰다.
LED 등은 표층에서부터 50 cm 떨어져 있으며, 표층의 광원은 0.96 W/m2로 유지하였다. 혈액은 헤파린 처리된 3-ml 주사기를 사용하여 얻었으며, 얻어진 혈액은 4 ℃, 10,000 x g, 5 분 원심분리후 혈장을 분리한 뒤, -80℃에 보관하였다. 각 어류는 절식기간 동안 3일 간격으로 3, 6, 9, 12일에 간 조직을 채취하였다.
2. 샘플링
절식기간 동안 5그룹(먹이공급-형광등, 절식-형광등, 적색, 녹색, 청색 LED 실험구)에서 간을 채취하였다. 조직을 채취한 후 곧바로 액체 질소에 넣은 후, total RNA 추출 시까지 -80℃의 초저온 냉동고에 보관하였다. 혈액은 헤파린 처리된 3-ml 주사기를 사용하여 얻었으며, 얻어진 혈액은 4℃, 10,000 x g, 5 분 원심분리후 혈장을 분리한 뒤, 분석전까지 -80℃에 보관하였다.
3. Quantitative PCR (QPCR)
절식기간동안의 항산화 효소 유전자인 SOD ( JQ906787 )와 CAT ( JQ906788 ) 및 GPX ( GU799604 ) mRNA의 발현량 변화를 시나몬클라운피쉬 간에서 얻어진 RNA를 사용하여하여 각각의 quantitative real-time PCR (QPCR)을 이용하여 분석하였다. QPCR의 수행을 위한 primer는 이미 알고 있는 타종의 염기배열을 기초로 하여 다음과 같이 설계하였다.
SOD forward primer (5'-GTT GCC AAG ATA GAC ATC AC-3'),
SOD reverse primer (5'-TTA GAC TCT CCT CGT TGC-3'),
CAT forward primer (5'-GCA ACT ACC AGC GTG ATG-3'),
CAT reverse primer (5'-CAG ACA CCT TGA ACT TGG A-3'),
GPX forward primer (5'-CAG GAG AAC GGC AAG AAT-3'),
GPX reverse primer (5'-TTC CAT TCA CAT CCA CCT T-3'),
β-actin forward primer (5'-GCA AGA GAG GTA TCC TGA CC-3'),
β-actin reverse primer (5'-CTC AGC TCG TTG TAG AAG G-3').
QPCR은 BIO-RAD iCycler iQ Multicolor Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad, USA)과 iQTM Sybr 녹색 Supermix (Bio-Rad, USA)를 이용하여 95℃에서 5분간 초기 열변성 1회, 95℃에서 20초간 열변성, 55℃에서 20초간 primer 결합을 총 40회 실시하였다. 내부표준 유전자로는 β-actin을 사용하여 PCR이 진행됨에 따라 calculated threshold cycle (Ct) 값을 결정하여 β-actin에 대한 발현량을 정량화하였다.
ΔΔCt= 2^-(ΔCt항산화 유전자 - ΔCt내부표준 유전자).
4. 통계처리
각 실험 결과로부터 얻어진 자료 값 사이의 유의 차 유무는 SPSS 통계처리 프로그램(version 10.0; SPSS Inc., USA)에 의한 One-way ANOVA 및 Tukey's post hoc test를 실시하여 절식 후 실험기간동의 변화와 각각의 파장별의 수치를 평균간의 유의성(P<0.05)을 검정하였다. 이로부터 어류를 절식시킨 경우 어류가 받는 산화 스트레스를 LED의 특정 광원으로 조절시킬 수 있는 가능성을 확인하고, 이를 이용한 양식방법으로 도출하였다.
어류를 절식시킨 경우 어류가 받는 산화 스트레스를 LED의 특정 광원으로 조절시킬 수 있는 가능성을 확인한 결과, 항산화 효소 mRNA 발현 및 활성은 녹색과 청색LED 실험구에서 유의적으로 낮은 값이 관찰되었다. 이 결과는 단파장인 녹색과 청색파장이 절식 시 어류의 체내에서 유도된 산화 스트레스를 억제하여, 유해한 활성산소로부터 체내를 보호하는 역할을 수행한 것으로 녹색과 청색파장은 이러한 산화 스트레스의 억제뿐만 아니라 면역 기능의 증진에도 효과적인 것으로 나타났다.
도 1은 본 발명의 기술적 특징을 나타내는 모식도이다.
도 2는 본 연구에 사용된 청색(B), 녹색(G) 및 적색(R) LED 파장 및 이를 이용한 광원 조사 기구를 나타낸 사진이다.
도 3은 적색 (R), 녹색 (G), 청색(B) LEDs 및 자연 광주기(simulated natural photoperiod; SNP) 조명 하에 절식 시 시나몬 클라운피쉬의 간에서 SOD, CAT 및 GPX mRNA 발현 변화를 조사한 결과를 나타낸다.
도 4는 Microplate reader기를 이용하여 적색 (R), 녹색 (G), 청색(B) LEDs 및 자연 광주기 (simulated natural photoperiod; SNP) 조명 하에 절식 시 시나몬클라운피쉬의 간에서 SOD (A), CAT (B) 및 GPX (C) 활성도 변화를 조사한 결과를 나타낸다.
도 5는 Microplate reader기를 이용하여 적색 (R), 녹색 (G), 청색(B) LEDs 및 자연 광주기 (simulated natural photoperiod; SNP) 조명 하에 절식 시 시나몬클라운피쉬의 근육에서 LPO (A) 및 혈장 H2O2(B)농도 변화를 조사한 결과를 나타낸다.
도 6은 Biochemistry autoanalyzer 기를 이용하여 적색 (R), 녹색 (G), 청색(B) LEDs 및 자연 광주기 (simulated natural photoperiod; SNP) 조명 하에 절식 시 시나몬클라운피쉬의 혈장 glucose (A), AlaAT (B) 및 AspAT (C) 농도 변화를 조사한 결과를 나타낸다.
도 7은 Microplate reader기를 이용하여 적색 (R), 녹색 (G), 청색(B) LEDs 및 자연 광주기 (simulated natural photoperiod; SNP) 조명 하에 절식 시 시나몬클라운피쉬의 혈장 라이소자임(lysozyme) 활성 변화를 조사한 결과를 나타낸다.
도 8은 Microplate reader기를 이용하여 적색 (R), 녹색 (G), 청색(B) LEDs 및 자연 광주기 (simulated natural photoperiod; SNP) 조명 하에 절식 시 시나몬클라운피쉬의 혈장 멜라토닌 농도 변화를 조사한 결과를 나타낸다.
도 9는 본 발명의 결과를 이용한 광 제어를 이용한 사육수조를 나타낸 것이다.
도 2는 본 연구에 사용된 청색(B), 녹색(G) 및 적색(R) LED 파장 및 이를 이용한 광원 조사 기구를 나타낸 사진이다.
도 3은 적색 (R), 녹색 (G), 청색(B) LEDs 및 자연 광주기(simulated natural photoperiod; SNP) 조명 하에 절식 시 시나몬 클라운피쉬의 간에서 SOD, CAT 및 GPX mRNA 발현 변화를 조사한 결과를 나타낸다.
도 4는 Microplate reader기를 이용하여 적색 (R), 녹색 (G), 청색(B) LEDs 및 자연 광주기 (simulated natural photoperiod; SNP) 조명 하에 절식 시 시나몬클라운피쉬의 간에서 SOD (A), CAT (B) 및 GPX (C) 활성도 변화를 조사한 결과를 나타낸다.
도 5는 Microplate reader기를 이용하여 적색 (R), 녹색 (G), 청색(B) LEDs 및 자연 광주기 (simulated natural photoperiod; SNP) 조명 하에 절식 시 시나몬클라운피쉬의 근육에서 LPO (A) 및 혈장 H2O2(B)농도 변화를 조사한 결과를 나타낸다.
도 6은 Biochemistry autoanalyzer 기를 이용하여 적색 (R), 녹색 (G), 청색(B) LEDs 및 자연 광주기 (simulated natural photoperiod; SNP) 조명 하에 절식 시 시나몬클라운피쉬의 혈장 glucose (A), AlaAT (B) 및 AspAT (C) 농도 변화를 조사한 결과를 나타낸다.
도 7은 Microplate reader기를 이용하여 적색 (R), 녹색 (G), 청색(B) LEDs 및 자연 광주기 (simulated natural photoperiod; SNP) 조명 하에 절식 시 시나몬클라운피쉬의 혈장 라이소자임(lysozyme) 활성 변화를 조사한 결과를 나타낸다.
도 8은 Microplate reader기를 이용하여 적색 (R), 녹색 (G), 청색(B) LEDs 및 자연 광주기 (simulated natural photoperiod; SNP) 조명 하에 절식 시 시나몬클라운피쉬의 혈장 멜라토닌 농도 변화를 조사한 결과를 나타낸다.
도 9는 본 발명의 결과를 이용한 광 제어를 이용한 사육수조를 나타낸 것이다.
본 발명의 목적을 달성하기 위한 LED 광원 조사에 의한 어류의 절식 스트레스 억제를 이용한 양식방법은 어류에게 먹이공급을 중지시켜 절식시킨 후, 자연광을 배제한 광 환경조건에서 LED 광원을 어류에게 일정시간 동안 조사함으로서, 어체 내의 항산화 효소유전자 발현 및 활성 정도를 억제시키는 방법으로 이루어진다.
또한, LED 광원은 파장이 녹색(520-580nm) 또는 청색(430-490nm) 중에서 선택되는 어느 하나 이상이고, 일정 조사 시간은 1-12일인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 목적을 달성하기 위한 또 다른 방법으로는 어류를 수조에서 사육하는 단계; 어류의 먹이공급을 중지시켜 절식시키는 단계; 자연광을 차단시킨 광 환경에서 LED 광원을 조사하면서 일정기간 동안 사육하여 어체 내의 항산화 효소 유전자 발현 및 활성 정도를 억제시키는 단계; 상기 어류를 출하하는 단계를 포함하는 것으로 이루어질 수 있다.
특히 상기 수조는 자연광이 차단된 일정 공간; 상기 공간의 일부에 어류를 사육할 수 있는 수조; 사육수를 여과할 수 있는 여과장치와 산소공급기가 수조와 연결 설치되고, 상기 수조의 일부에는 녹색(520-580nm) 또는 청색(430-490nm) 중에서 선택되는 어느 한 종류 이상의 LED 광원이 복수개 설치된 것으로 이루어질 수 있고, 일정기간은 1-12일인 것을 특징으로 한다.
한편 LED 광원 조사에 의한 어류의 절식 스트레스 억제를 이용한 양식장치로는 자연광이 차단된 일정 공간; 상기 공간에는 어류를 수용할 수 있는 수조; 수조에는 사육수를 여과할 수 있는 여과장치와 산소공급기가 연결 설치되고, 상기 수조의 일부에는 녹색(520-580 nm) 또는 청색(430-490 nm) 중에서 선택되는 어느 한 종류 이상의 LED 광원이 복수개 설치되어 광 조사함으로서 어체 내의 항산화 효소 유전자 발현 및 활성 정도를 억제시킬 수 있는 것을 특징으로 하는 장치가 제공되며, 이와 같은 양식장치는 어류 이동용 활어차 또는 활어 운송용 컨테이너로서 적절히 변형 가능하다.
본 발명의 목적을 효과적으로 달성하기 위한 양식방법의 단계로서
a) 어류 양식용 종묘를 준비하는 단계;
b) 자연광이 차단된 수조에 a) 단계의 종묘(치어)를 입식시키는 단계;
c) 수조에 파장 600-650 nm의 LED 광원을 조사하여 1-3일간 사육하여 어류의 체내에서 초기에 일시적으로 산화 스트레스를 유발시킴으로서, 어체 내에서 멜라토닌의 분비를 촉진시켜 안정화시키는 단계;
d) c) 단계의 수조에서 사육된 종묘를 청색 (430-490 nm) 또는 녹색 (520-580 nm) LED 광원을 일정시간 조사하여 어류 체내의 뇌하수체 자극을 유발시킴으로서 성장호르몬의 분비를 촉진시켜 성장시키는 단계;
e) 성장된 어류에게 먹이공급을 중단시켜 절식시키는 단계;
f) 자연광을 차단시킨 광 환경에서 녹색(520-580 nm) 또는 청색(430-490 nm) 중에서 선택되는 어느 하나 이상의 LED 광원을 조사하면서 일정기간 동안 사육하여 어체 내의 항산화 효소 유전자 발현 및 활성 정도를 억제시키는 단계;
g) f) 단계의 어류를 출하하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 LED 광원 조사에 의한 어류의 절식 스트레스 억제를 이용한 양식방법으로 구성될 수 있다.
이하 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 상기의 전체적인 구성을 실시 예와 함께 자세히 설명하면 다음과 같다.
도 1은 본 발명의 기술적 특징을 나타내는 모식도이고, 도 2는 본 연구에 사용된 청색(B), 녹색(G) 및 적색(R) LED 파장 및 이를 이용한 광원 조사 기구를 나타낸 사진이다.
I.
LED
광원 조사에 의한 어류의 절식 스트레스 억제 효과 실험
1.
Western
blot
분석
절식기간 동안 시나몬 클라운 피쉬의 간으로부터 분리된 단백질은 protein extraction buffer [5.6 mM Tris, 0.55 mM EDTA, 0.55 mM EGTA, 0.1% SDS, 0.15 mg/ml phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF), 0.15 mg/ml leupeptin]를 이용하여 추출하였으며, Bradford 방법(Bio-Rad)을 이용하여 농도를 측정하였다. 단백질은 4% acrylamide stacking gel 층과 12% acrylamide resolving gel 층으로 이루어진 겔에 영동을 하였으며, 단백질 마커(Fermentas)를 사용하여 크기를 확인하였다.
전기영동은 stacking gel 영동을 위해 80 V, resolving gel 영동을 위해, 150 V 를 사용하였으며, 겔 마지막까지 영동하였다. 전기영동된 gel은 즉시 olyvinylidene diflouride (PVDF) membrane (Bio-Rad)로 옮겨서 4ㅊC 에서 1.5 시간동안 85 V로 옮겼다. 단백질이 옮겨진 membrane은 5% milk가 포함된 Tris-buffe적색 saline (TBS) (pH 7.4)에 45분 동안 흔들어주면서 blocking 하였으며, TBS로 세척하였다. Blocking된 Membranes은 1차 항체 catalase (sc-58332, 1/2,000 dilution, Santa Cruze Biotechnology, USA)와 2차 항체 horseradish peroxidase conjugated anti-mouse IgG secondary antibody (dilution 1:2,000, Bio-Rad)를 2시간, 1시간씩 차례로 반응시켰다.
또한, 내재적 표준을 위해서 1차 항체 β-tubulin (dilution 1:5000, ab6046, abcam, UK)와 horseradish peroxidase-conjugated anti-rabbit IgG secondary antibody (1:5,000; Bio-Rad), 또한 차례로 2시간, 1시간 씩 순서대로 반응시켰다. 단백질 밴드는 standard ECL 방법과 ECL systems (ECL Advance; GE Life Sciences, Sweden)을 사용하여 반응하였으며, film에 2분 동안 노출시켜 확인하였다.
2.
SOD
,
CAT
및
GPX
활성 분석
간 조직은 1 mM EDTA가 포함된 0.1 M phosphatebuffe적색 saline (PBS, pH 7.4)으로 homogenize한 후, 10,000 x g, 4℃에서 15분간 원심분리하여 상층액을 제거하고 하층부를 분석 샘플로 사용하였다. SOD와 CAT 활성은 Cayman Chemical (USA)를 이용하여 분석하였고, 효소 단위는 U/ml (SOD)과 nmol/min/ml (CAT, GPX)을 사용하였다.
Cu/Zn-SOD 활성분석은 xanthine 유도체와 hypoxanthine를 이용하여 superoxide radical의 분리를 하였으며, tetrazolium salt를 이용하였다. Cu/Zn-SOD의 하나의 단위는 superoxide radical의 50% dismutation을 위한 필요한 효소양을 나타내었다. 450nm 흡광도를 사용하며, 효소단위는 U/ml를 사용하였다. CAT 활성 분석은 H2O2optimal농도의 양에서 메탄올과 반응하는 효소의 양을 기초로 하였다.
Formaldehyde는 chromogen과 같은 4-amino-3-hydrazino-5-mercapto-1,2,4-triazole (Purpald)과 함께 spectrophotometrically를 측정하였다. Purpald는 특이적으로 aldehydes와 함께 bicyclic hetero cycle를 형성하며, 보라색이 사라지는 것으로부터 산화정도가 변한다. 흡광도는 540 nm를 사용하며, 효소단위는 nmol/min/ml를 사용하였다. GPX 활성은 glutathione 환원효소와 반응을 간접적으로 측정하는 방법을 이용하였다. 산화된 glutathione은 GPX에 의해 만들어진 hydroperxide의 자극에 생성을 촉진되며, 이것은 glutathione 환원효소와 NADPH에 의해 감소된다.
NADPH 가 NADP+ 로 산화되는 것은 Spectrophotometer의 340 nm에서 감소되는 것이 측정되며, 산화되면서 일어나는 흡광도의 감소에 의해서 (간접적으로) GPx의 활성을 측정할 수 있는 것입니다. GPX 활성 단위는 n mol/min/ml를 사용하였다.
도 3은 적색 (R), 녹색 (G), 청색(B) LEDs 및 자연 광주기 (simulated natural photoperiod; SNP) 조명 하에 절식 시, 시나몬 클라운피쉬의 간에서 SOD, CAT 및 GPX mRNA 발현 변화를 조사한 결과를 나타낸다. 도 3의 (A)는 절식 기간 동안 western blot을 통한 CAT (64 kDa) 단백질 발현을 분석한 것으로, 대조구로 55-kDa의 β-tubulin을 사용하였다. SOD (B), CAT (C), 및 GPX (D) mRNA 발현은 QPCR을 이용하여 β-actin mRNA 발현량과 비교 분석하여 나타내었다. 실험어의 명암주기를 12:12로 설정하여 사육하였으며, 총 간 RNA (2.5 μg)는 역전사하여 증폭시켰으며, 결과는 같은 샘플 내 β-actin양에 비례하여 표준화된 발현량으로 나타났다. 각각 다른 알파벳 문자는 동일한 파장 내 절식 기간 사이의 유의적인 차이를 나타내며 (P < 0.05), 십자표시(†)는 동일한 절식 기간 내 파장별로 유의적인 차이를 나타낸다 (P < 0.05). 모든 수치들은 평균 ± SD (n = 5)로 표현하였다.
도 4는 Microplate reader기를 이용하여 적색 (R), 녹색 (G), 청색(B) LEDs 및 자연 광주기 (simulated natural photoperiod; SNP) 조명 하에 절식 시 시나몬클라운피쉬의 간에서 SOD (A), CAT (B) 및 GPX (C) 활성도 변화를 조사한 결과로서 실험어는 명암주기를 12:12로 설정하여 사육하였다. 각각 다른 알파벳 문자는 동일한 파장 내 절식 기간 사이의 유의적인 차이를 나타내며 (P < 0.05), 십자표시(†)는 동일한 절식 기간 내 파장별로 유의적인 차이를 나타낸다 (P < 0.05). 모든 수치들은 평균 ± SD (n = 5)로 표현하였다.
QPCR을 이용하여 절식 기간 동안 파장별 간에서 항산화 유전자 mRNA ( SOD , CAT 및 GPX ) 발현 및 활성을 조사한 결과에 의하면(도 3, 도 4), 모든 실험구에서 항산화 효소 mRNA 발현 및 활성도는 절식 6일째 유의적으로 높은 결과값을 보였으며, 그 이후 점차 감소하는 경향을 보였다. 반면, 항산화 효소 mRNA 발현 및 활성은 녹색과 청색LED 실험구에서 유의적으로 낮은 값이 관찰되었다(도 3, 4). Western blot 분석을 통하여 CAT 단백질을 분석한 결과 예상 단백질 크기인 64 kDa으로 확인되었다. 단백질 발현 변화는 시나몬클라운피쉬 간에서 CAT mRNA 변화와 유사하게 관찰되었다 (도 3A).
3. LPO 및 혈장 H 2 O 2 분석
도 5는 Microplate reader기를 이용하여 적색 (R), 녹색 (G), 청색(B) LEDs 및 자연 광주기 (simulated natural photoperiod; SNP) 조명 하에 절식 시 시나몬클라운피쉬의 근육에서 LPO (A) 및 혈장 H2O2(B)농도 변화를 조사한 결과를 나타낸다. 실험어의 명암주기는 12:12로 설정하여 사육하였으며, 각각 다른 알파벳 문자는 동일한 파장 내 절식 기간 사이의 유의적인 차이를 나타내며 (P < 0.05), 십자표시(†)는 동일한 절식 기간 내 파장별로 유의적인 차이를 나타낸다 (P < 0.05). 모든 수치들은 평균 ± SD (n = 5)로 표현하였다.
LPO는 polyunsaturated fatty acid (PUFA) hydroperoxides (Esterbauer et al., 1991)의 분해된 산물인 malondialdehyde (MDA)와 4-hydroxynonenal (4-HNE)의 양을 측정하여 지질과산화 정도를 파악하는데(Esterbauer et al., 1991), 본 연구에서는 Lipid Hydroperoxide Assay Kit (Cayman Chemical)를 사용하여 측정하였다. 조직을 10 ml의 HPLC-grad water에 분쇄한 뒤, 유리 glass tube에 500㎕의 분쇄된 조직을 넣는다. 분쇄된 조직이 담긴 유리 glass tube에 Chloroform을 500㎕ 첨가하고, 450 ㎕의 chloroform-methanol과 50 ㎕의 ferric thiocyanide solution (FTS) reagent 1 과 FTS reagent 2 mixtures (Cayman chemical)를 첨가한 뒤, 섞어준다. 실온에 5분 동안 방치한 뒤, 96 well plate에 300㎕ 씩 분주하였다. 500 nm 흡광도에서 측정하였으며, MDA and 4-HNE/g protein (nM/g)로 나타내었다.
혈중 H2O2농도는 Nouroozzadeh et al. (1994)의 실험 방법과 Peroxide Detect kit (Sigma, USA)를 이용하여 측정하였다. 혈장 20㎕를 96-well microtitre plate에 각각 분주한 뒤, 20 분간 실온에서 항체와 반응시켰다. Color regent를 200㎕ 첨가한 뒤, 실온에서 1시간 동안 반응시킨다. 560 nm 흡광도에서 측정하였다. 농도는 nM/ml로 나타내었다.
Plate reader기를 이용하여 절식 기간 동안 파장별 LPO 및 혈장 H2O2농도를 분석결과(도 5)에 의하면 모든 실험구에서 LPO는 절식 3일째 유의적으로 증가되었으나 녹색 및 청색LED 실험구에서 다른 파장에 비해 유의적으로 낮은 값이 관찰되었다 (도 5A). 특히, 혈장 H2O2농도는 절식 12일째 형광등 및 적색 LED 실험구에서 유의적으로 증가하였으나, 녹색 및 청색LED 실험구에서는 6일째 증가하다 점차 감소하는 경향을 보였으며 다른 파장에 비해 유의적으로 낮은 값이 관찰되었다 (도 5B).
4. 혈장 분석
혈장은 원심분리(4℃, 10,000 x g, 5분)하여 분리하였으며, 얻어진 혈장은 혈중 glucose와 AspAT 및 AlaAT을 분석하기 위해 dry multiplayer analytic slide 방법과 biochemistry autoanalyzer (Fuji Dri-Chem 4000, Fujifilm, Japan)를 이용하여 분석하였다.
도 6은 Biochemistry autoanalyzer 기를 이용하여 적색 (R), 녹색 (G), 청색(B) LEDs 및 자연 광주기 (simulated natural photoperiod; SNP) 조명 하에 절식 시 시나몬클라운피쉬의 혈장 glucose (A), AlaAT (B) 및 AspAT (C) 농도 변화를 조사하였다. 실험어의 명암주기를 12:12로 설정하여 사육하였다. 각각 다른 알파벳 문자는 동일한 파장 내 절식 기간 사이의 유의적인 차이를 나타내며 (P < 0.05), 십자표시(†)는 동일한 절식 기간 내 파장별로 유의적인 차이를 나타낸다 (P < 0.05). 모든 수치들은 평균±SD (n = 5)로 표현하였다.
본 발명에서 biochemistry autoanalyzer를 이용하여 절식 기간 동안 혈장 glucose, AlaAT 및 AspAT 농도를 분석한 결과(도 5), 모든 실험구에서 혈장 glucose 농도는 절식 6일째 유의적으로 증가 (starved-SNP; 88±4.4 mMol/l, starved-적색 LED; 100±5 mMol/l)하였으며 점차 감소하는 경향을 보였다. 그러나 녹색 및 청색 LED 실험구에서는 glucose 농도가 유의적으로 다른 파장에 비해 낮은 값이 관찰되었다 (도 6A).
더욱이, 혈장 AlaAT 및 AspAT 농도는 모든 실험구에서 절식 3일째 유의적으로 증가한 후 [AlaAT (starved-SNP; 1932±96.6 IU/l, starved-적색 LED; 2217±110.85 IU/l), AspAT (starved-SNP; 426±21.3 IU/l, starved-적색 LED; 556±27.8 IU/l)] 점차 감소하는 경향을 보였으나 녹색 및 청색LED 실험구에서 다른 파장에 비해 유의적으로 낮은 값을 보였다 (도 6B, C).
5. 라이소자임(lysozyme) 활성 측정
라이소자임(lysozyme) 활성은 혈장을 이용하여 Santarem et al. (1994) 의 방법을 이용하였다. 혈장은 780 x g에서 10분 동안 원심분리하여 분리하였으며, 분석전까지는 -80℃에 보관하였다. 96-well plate를 사용하여 190 ㎕의 0.15 % suspension of Micrococcus lysodeikticus (Sigma)가 포함된 66 mM phosphate buffer (pH 6.2)를 분주한 뒤, 각각에 10 ㎕의 혈장을 섞어준다. 450 nm 흡광도를 이용하여 20℃에서 5분 동안 측정하였다. 1분마다 감소되는 흡광도를 이용하여 효소 농도를 측정하였으며, 결과는 ㎍ lysozyme/mg protein로 나타내었다.
도 7는 Microplate reader기를 이용하여 적색 (R), 녹색 (G), 청색(B) LEDs 및 자연 광주기 (simulated natural photoperiod; SNP) 조명 하에 절식 시 시나몬클라운피쉬의 혈장 라이소자임(lysozyme) 활성 변화를 조사하였다. 실험어의 명암주기를 12:12로 설정하여 사육하였다. 각각 다른 알파벳 문자는 동일한 파장 내 절식 기간 사이의 유의적인 차이를 나타내며 (P < 0.05), 십자표시(†)는 동일한 절식 기간 내 파장별로 유의적인 차이를 나타낸다 (P < 0.05). 모든 수치들은 평균 ± SD (n = 5)로 표현하였다.
plate reader기를 이용하여 면역 지표로 알려져 있는 라이소자임(lysozyme) 활성도를 절식 기간 동안 분석한 결과(도 7), 모든 실험구에서 라이소자임(lysozyme) 활성도는 유의적으로 절식 3일째 감소하였으며 그 이후 점차 증가하는 경향을 보였다. 반면, 녹색 및 청색 LED 실험구에서는 다른 파장에 비하여 유의적으로 높은 수치가 관찰되었다.
6. 혈장 멜라토닌 농도 측정
혈중 멜라토닌 농도는 immunoenzymoassay 분석 방법과 enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) kit (IBL, Hamburg, Germany)를 이용하여 측정하였다. 혈장은 원심분리 후 즉시 얻었으며, 얻어진 혈장 50 ㎕를 ELISA plate에 각각 분주하였다. 멜라토닌-biotin과 4℃에서 15 시간 동안 반응시킨 후, 3번 세척 후, enzyme-labeled solution (anti-biotin-alkaline phosphatase in Tris buffer with stabilizers)로 실온에서 2시간 반응시킨다. Plate 세척 후, a p-nitro-phenyl phosphate solution로 30분 반응 시킨 후, 50 ㎕의 stop solution (1 N NaOH with 0.25 M ethylene diamine tetraacetic acid)으로 반응을 정지시켜 405 nm 흡광도에서 측정하였다.
도 8은 Microplate reader기를 이용하여 적색 (R), 녹색 (G), 청색(B) LEDs 및 자연 광주기 (simulated natural photoperiod; SNP) 조명 하에 절식 시 시나몬클라운피쉬의 혈장 멜라토닌 농도 변화를 조사하였다. 실험어의 명암주기를 12:12로 설정하여 사육하였다. 각각 다른 알파벳 문자는 동일한 파장 내 절식 기간 사이의 유의적인 차이를 나타내며 (P < 0.05), 십자표시(†)는 동일한 절식 기간 내 파장별로 유의적인 차이를 나타낸다 (P < 0.05). 모든 수치들은 평균 ± SD (n = 5)로 표현하였다.
혈장 멜라토닌 농도는 ELISA 분석 방법을 통하여 절식 기간 동안 파장별로 분석한 결과를 도 6에 나타내었다. 도 7은 실험어의 명암주기를 12:12로 설정하여 사육한 것으로 각각 다른 알파벳 문자는 동일한 파장 내 절식 기간 사이의 유의적인 차이를 나타내며 (P < 0.05), 십자표시(†)는 동일한 절식 기간 내 파장별로 유의적인 차이를 나타낸다 (P < 0.05). 모든 수치들은 평균 ± SD (n = 5)로 표현하였다. 절식 6일째, 형광등 및 적색 LED 실험구에서는 초기 수준에 비하여(11.2±2.5 pg/ml) 유의적으로 증가하였으며 (starved-SNP; 48.8±1.9 pg/ml, starved-적색 LED; 60±3.9 pg/ml) 실험 시간이 종료될 때까지 (12일째) 수치가 (starved-SNP; 48.8±1.9 pg/ml, starved-적색 LED; 60±3.9 pg/ml) 유지되었다. 또한, 녹색 및 청색LED 실험구에서 절식 6일째 멜라토닌 농도값이 유의적으로 증가하였으나 다른 실험구에 비하여 낮은 농도값 (32.8±1.9 pg/ml and 25.8±1.9 pg/ml, respectively)이 관찰되었다.
II
.
LED
광원의 조사에 의한 어류의 절식스트레스 억제를 이용한 양식방법
1. LED 광원의 조사에 의한 어류의 절식스트레스 억제 효과 기작
본 발명의 실험에서는 절식에 의하여 어류가 받는 산화 스트레스를 LED의 특정 광원으로만 조절할 수 있는지를 확인하기 위하여, 적색, 녹색, 청색LEDs 파장의 조명을 각각 설치한 실험구의 시나몬클라운피쉬를 총 12일 동안 절식시키고, 절식 경과 시간대별로 항산화 효소인 SOD, CAT 및 GPX mRNA 발현 및 활성을 확인하였다. 또한, 산화 스트레스 지표로 사용되는 지질 과산화(LPO), 활성산소인 H2O2의 농도 측정 및 면역 기능과의 관련성을 파악하였을 뿐만 아니라 항산화 물질로도 잘 알려져 있는 혈장 내 멜라토닌 농도를 측정하여 특정의 LEDs 파장이 절식 시 어류 체내에 미치는 분자적 및 생리학적 영향을 조사하였다.
시나몬클라운피쉬를 12일 동안 절식시키면서 3일 간격으로 항산화 효소인 SOD, CAT 및 GPX mRNA와 활성, 그리고 CAT 단백질량의 발현 변화를 분석한 결과, 절식 기간 동안 전체적으로 모든 파장에서 증가하다 감소하는 경향을 보였다. 그러나 파장별로 비교해 보았을 때 적색 LED 조명시 대조구엔 형광등에 비하여 유의적으로 높은 발현량 및 활성도가 관찰되었다(도 3, 4). 절식으로 인하여 체내에서 산화 스트레스가 유발되었음을 확인할 수 있었다.
더욱이, 본 발명의 실험에서는 녹색 및 청색LED 실험구를 대조구(Fed-SNP)와 비교해 볼 때, 절식 기간 동안 녹색, 청색LED 실험구에서 항산화 효소인 SOD, CAT mRNA 및 활성이 낮게 관찰되었고 이들 값의 유의적인 차이가 관찰되지 않은 사실로부터 단파장인 녹색 및 청색파장이 절식에 의한 산화 스트레스를 억제시키는데 효과적이라고 사료된다.
또한, 절식 일수가 늘어남에 따라 LPO와 혈장 내 활성산소인 H2O2농도가 전반적으로 증가하는 경향을 나타내었으나, 녹색 및 청색LED 파장의 실험구에서는 다른 파장의 실험구에 비하여 상대적으로 낮은 값이 관찰되었다(도 5). 이는 절식으로 인하여 발생된 활성산소가 조직을 손상케 함으로써 지질 과산화 물질이 증대되고 있는 현상이 보여지나, 절식으로 인하여 발생되는 산화 스트레스를 단파장인 녹색과 청색LED 파장이 억제하고 있음을 시사하고 있다. 이와 같은 결과는 본 발명자들의 선행발명에서 흰동가리에 적색, 녹색, 청색LED 파장을 조명 후 LPO와 H2O2농도를 측정한 결과, 녹색과 청색LED 실험구에서 다른 파장의 실험구에 비하여 상대적으로 LPO와 H2O2농도가 낮은 수치 값을 보인 것과도 맥을 같이 한다.
LED 광원별 어류의 면역 기능의 차이를 파악하고자 면역 기능 지표로 사용되는 라이소자임(lysozyme) 활성을 측정한 결과, 절식 기간 동안 전반적으로 낮은 수치를 나타내었으나 녹색과 청색LED 실험구는 3일째 감소하다 6일째부터 유의적으로 증가하는 경향을 보였다(도 7). 이는 단파장이 면역력을 증진시키는 역할을 하고 있을 가능성이 제기된다. 이와 관련된 어류를 대상으로 한 연구 결과는 아직 보고되어 있지 않다.
어류가 산화 스트레스를 받게 되면 체내 항산화 효소뿐만 아니라 체내에서는 항산화 물질도 분비되게 되며, 체내에서 분비되는 항산화 물질 중에는 멜라토닌도 포함되는데, 멜라토닌은 체내에서 발생된 활성산소를 직접 제거하는 강력한 항산화 물질이며, 산화적 손상으로부터 세포막을 효과적으로 보호할 수 있는 것으로 알려져 있다.
본 발명의 실험 결과에서도 절식기간 동안 녹색과 청색LED 실험구의 어류에서 다른 실험구의 어류에 비해 낮은 멜라토닌 농도가 관찰되었다(도 8). 이는 앞서 언급한 활성산소인 H2O2농도 (도 5B)와 부합하는 결과로, 녹색과 청색LED 실험구에서 활성산소가 다른 파장의 실험구에 비해 적게 발생되었기 때문에 이러한 활성산소를 제거할 수 있는 항산화 물질인 멜라토닌 또한 낮게 나타난 것으로 보인다. 반면에 형광등 및 적색 LED 실험구에서는 상대적으로 높은 멜라토닌 농도 값이 검출된 것은 높은 농도의 활성산소가 발생되었기 때문에, 이를 제거하기 위하여 멜라토닌이 다량으로 분비된 것으로 사료된다.
본 발명자들에 의한 선행발명에서도 흰동가리를 이용하여 적색, 녹색, 청색LED 조명 시 체내에서 발생된 활성산소가 항산화제인 멜라토닌에 의해 소거되었으며, 녹색과 청색LED 실험구에서는 다른 실험구에 비해 유의적으로 적은 수치의 멜라토닌을 관찰하였다. 이들 결과를 종합하면 단파장인 녹색과 청색LED 실험구의 어류가 절식에 의한 산화 스트레스를 상대적으로 덜 받았음을 의미한다.
2. 어류의 절식스트레스 억제를 이용한 양식방법 및 장치
어류의 양식은 산업성 및 경제성을 담보로 이루어지는 것이므로, 단위시간 동안의 어류생장 효율은 양식업의 산업적 가치를 결정짓는 중요한 요소이므로, 양식을 위한 종묘의 입식에서 종묘의 초기생존율을 높여야한다. 이러한 목적을 달성하기 위해 본 발명자는 어류가 외부 환경 요인에 의한 스트레스에 대하여 체내에서 자가 내분비 조절에 의하여 자기방어 물질을 분비하게 하여 체내에서 초기에 일시적으로 산화 스트레스를 유발시켜, 어체 내에서 강력한 항산화 물질인 멜라토닌의 분비를 촉진시키는 계기를 만들어 주는 어류의 스트레스 제어 방법을 이용한 양식방법으로의 이용을 제안하였다(출원번호 10-2012-0061201).
또한 본 양식에 있어서 단기간에 어류를 성장시키는 것은 양식 산업의 경제적 이윤 추구 면에서 중요한 의의를 갖는다. 이러한 목적을 달성하기 위한 발명으로 녹색 및 청색 파장은 어체 내에서 GH 분비를 자극시킴으로써 어류의 성장을 촉진시키는 역할을 수행한 것을 확인하고 어류의 성장을 효과적으로 증진시킬 수 있는 어류 사육을 위한 인공적인 광원 시스템의 설계의 활용 및 수조에서 사육된 종묘를 청색 (430-490 nm) 또는 녹색 (520-580 nm) LED 광원을 일정시간 조사하여 어류 체내의 뇌하수체 자극을 유발시킴으로서 성장호르몬의 분비를 촉진시키는 것을 특징으로 하는 LED 광원 조사에 의한 어류의 성장 제어를 이용한 양식방법을 제안하였다.
이러한 제안된 방법은 양식 어류의 종묘를 입식하는 경우, LED 광원을 점등함으로서 치어가 외부로부터 스트레스를 받는 환경 스트레스를 내분비 작용효과로 극복하면서 초기 사망률을 낮추는 효과를 갖고, 또한, 녹색과 청색의 LED광원을 점등하여 일정기간 사육함으로서 그렇지 않은 경우보다 단기간에 어류를 성장시켜 어류 양식의 경제성을 높이는 효과를 갖게 한다(출원번호 10-2012-66215).
한편, 성장한 어류의 경우, 소비자 등을 위한 판매지로의 출하 및 수출을 앞두고 어류에게 일정기간 사료를 급이하지 않도록 하는 인위적인 절식을 하고 있다. 즉 어류를 활어로 수송할 때에 미리 물고기를 절식상태로 함으로서 수송 중 어류의 배설물에 의한 물의 오염을 막음과 동시에 어류의 대사를 제어하여, 산소소비량을 저하시켜 안전히 목적지에 수송하기 위한 것이다. 또한, 양식 중 어류의 폐사가 계속될 때, 어류를 절식시키면 폐사 마리수 경감에도 효과가 있다.
다만, 어류를 포함한 모든 생물체는 절식 시 스트레스를 받을 뿐만 아니라 절식으로부터 유도된 다른 negative 요인들이 면역 기능에까지도 영향을 미친다고 알려져 있다. 즉, 절식은 어류 체내에서 스트레스를 유도하는데, 이 때 체내에서는 스트레스로 인해 에너지가 소모되는 만큼 보상 차원에서 에너지 요구량이 늘어나게 되어 체내에서는 glucose 농도가 증가하게 되며, 또한, 스트레스로 인하여 간 손상 지표로 알려져 있는 AlaAT 및 AspAT 농도도 증가하게 된다. 이와 같이 어류의 절식은 양식과정에서 필요한 수단으로 이루어지고 있고, 어류의 받는 절식에 따른 스트레스를 경감시킴으로서 양식된 어류의 상품으로서의 가치를 높여야할 필요가 있다.
본 발명의 실험에서 단파장인 녹색과 청색파장은 절식시 시나몬 클라운피쉬 체내에서 유도된 산화 스트레스를 억제하여, 유해한 활성산소로부터 체내를 보호하는 역할을 수행한 것으로 사료된다. 또한, 녹색과 청색파장은 이러한 산화 스트레스의 억제뿐만 아니라 면역 기능의 증진에도 효과적인 것으로 나타났다.
즉 절식 기간 동안 녹색과 청색LED 파장 실험구에서는 다른 파장의 실험구에 비하여 유의적으로 낮은 glucose, AlaAT 및 AspAT 값이 관찰되었다. 이러한 광 파장에 따른 호르몬 양의 변화는 뇌하수체-간신축에 영향을 미치게 되어 결국 광파장이 생물학적 시스템에 영향을 미치는 것으로 보인다.
이와 같은 실험 결과 등을 종합함으로서 어류에게 먹이공급을 중지시켜 절식시킨 후, 자연광을 배제한 광 환경조건에서 파장이 녹색(520-580nm) 또는 청색(430-490nm) 중에서 선택되는 어느 하나 이상인 LED 광원을 어류에게 일정시간 동안 조사함으로서, 어체 내의 항산화 효소 유전자 발현 및 활성 정도를 억제시키는 LED 광원 조사에 의한 어류의 절식 스트레스 억제를 이용한 양식방법으로의 제공이 가능하다.
본 발명자에 의한 선행출원들과 본 발명을 종합하면, 종묘의 입식, 성장 및 출하 과정을 포함한 폐쇄된 양식시설에서의 어류에게 스트레스를 주지 않고, 종묘를 입식시키고 본 양식에서 단기간에 성장시킬 수 있는 양식방법으로의 확립이 가능하며, 최근 개발이 시도되고 있는 고밀도 빌딩양식 등에 필요한 양식기법에 필요한 주요기술로서 활용이 가능하다.
또한, 어류 운송용 활어차에 LED 광원을 장비하고 활어 운송시에 절식된 어류에게 특정의 단파장을 조사함으로서 활어 운송 중 절식에 따른 스트레스를 억제할 수 있으며, 고가의 관상어를 외국으로 수출하는 경우, 수출용 컨테이너에 의해 운송되는 것이 일반적으로, 이러한 컨테이너 내부에 자연광이 차단된 일정 공간; 상기 공간에는 어류를 수용할 수 있는 수조; 수조에는 사육수를 여과할 수 있는 여과장치와 산소공급기가 연결 설치되고, 상기 수조의 일부에는 녹색(520-580nm) 또는 청색(430-490nm) 중에서 선택되는 어느 한 종류 이상의 LED 광원이 복수개 설치하여 특정의 광을 조사함으로서 어체 내의 항산화 효소 유전자 발현 및 활성 정도를 억제시킬 수 있도록 하는 것도 가능하다.
어류를 절식시킨 경우 어류가 받는 산화 스트레스를 LED의 특정 광원으로 조절시킬 수 있는 가능성을 확인한 결과, 항산화 효소 mRNA 발현 및 활성은 녹색과 청색LED 실험구에서 유의적으로 낮은 값이 관찰됨으로서 단파장인 녹색과 청색파장이 절식 시 어류의 체내에서 유도된 산화 스트레스를 억제하여, 유해한 활성산소로부터 체내를 보호하는 역할을 수행한 것으로 녹색과 청색파장은 이러한 산화 스트레스의 억제뿐만 아니라 면역 기능의 증진에도 효과적인 것으로 나타났다. 이와같은 결과들은 최근 개발이 시도되고 있는 고밀도 빌딩양식 등에 필요한 양식기법의 완성을 위한 주요 기술서의 산업적 이용이 가능하다.
Claims (7)
- a) 자연광이 차단된 일정 공간, 상기 공간의 일부에 어류를 사육할 수 있는 수조, 사육수를 여과할 수 있는 여과장치와 산소공급기가 수조와 연결 설치되고, 상기 수조의 일부에는 파장 520-580nm 또는 파장 430-490nm 중에서 선택되는 어느 한 종류 이상의 LED 광원이 복수개 설치된 수조에서 어류를 사육하는 단계;
b) 어류에게 먹이공급을 중지시켜 절식시킨 상태에서 자연광을 차단시키고 파장 520-580nm 또는 파장 430-490nm 중에서 선택되는 어느 한 종류 이상의 LED 광원을 명암주기 12:12로 조사하면서 1-12일 동안 사육하여 어체 내의 항산화 효소 유전자 발현 및 활성 정도를 억제시키는 단계;
c) b) 단계의 어류를 출하하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 LED 광원 조사에 의한 어류의 절식 스트레스 억제를 이용한 양식방법
- a) 어류 양식용 치어 종묘를 준비하는 단계
b) 자연광이 차단된 수조에 a) 단계의 치어 종묘를 입식시키는 단계
c) 수조에 파장 600-650 nm의 LED 광원을 조사하여 1-3일간 사육하여 어류의 체내에서 초기에 일시적으로 산화 스트레스를 유발시킴으로서, 어체 내에서 멜라토닌의 분비를 촉진시켜 안정화시키는 단계;
d) c) 단계의 수조에서 사육된 종묘를 파장430-490 nm 또는 파장 520-580 nm LED 광원을 일정시간 조사하여 어류 체내의 뇌하수체 자극을 유발시킴으로서 성장호르몬의 분비를 촉진시켜 성장시키는 단계;
e) 성장된 어류에게 먹이공급을 중단시켜 절식시키는 단계;
f) 자연광을 차단시킨 광 환경에서 절식시킨 채로 파장 520-580 nm 또는 파장 430-490 nm중에서 선택되는 어느 하나 이상의 LED 광원을 조사하면서 일정기간 동안 사육하여 어체 내의 항산화 효소 유전자 발현 및 활성 정도를 억제시키는 단계;
g) f) 단계의 어류를 출하하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 LED 광원 조사에 의한 어류의 절식 스트레스 억제를 이용한 양식방법 - 삭제
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| KR20210028359A (ko) * | 2019-09-04 | 2021-03-12 | 한국해양대학교 산학협력단 | 적색 led를 이용한 갑각류의 성 성숙 촉진 및 유도 방법 |
Citations (2)
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|---|---|---|---|---|
| JP2009072138A (ja) * | 2007-09-21 | 2009-04-09 | Iwate Prefecture | カレイ目魚類の養殖方法及び装置 |
| JP2012065625A (ja) * | 2010-09-27 | 2012-04-05 | Kinki Univ | 魚類仔魚の光波長制御飼育方法 |
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| KR102323857B1 (ko) | 2019-09-04 | 2021-11-08 | 한국해양대학교 산학협력단 | 적색 led를 이용한 갑각류의 성 성숙 촉진 및 유도 방법 |
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