KR101207213B1 - 전염성해면상뇌증 감수성 세포의 제조방법 및 전염성해면상뇌증 지속감염세포 - Google Patents

전염성해면상뇌증 감수성 세포의 제조방법 및 전염성해면상뇌증 지속감염세포 Download PDF

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Abstract

본 발명은 전염성해면상뇌증의 전염성해면상뇌증(TSE; transmissible spongiform encephalopathy) 감수성 세포의 제조방법 및 그 방법에 의해서 수득된 감수성 세포의 활용에 관한 것으로, 본 발명에 의해서 수득되는 전염성해면상뇌증 감수성 세포는 전염성해면상뇌증의 진단, 병인론 및 신약개발 등에 유리하게 활용될 수 있다.
전염성해면상뇌증(TSE), 렌티바이러스 발현시스템, 정상 프리온, 변형 프리온, 감수성 세포, 감염세포

Description

전염성해면상뇌증 감수성 세포의 제조방법 및 전염성해면상뇌증 지속감염세포{Method of Preparing Cells susceptible to Transmissible Spongiform Encephalopathy and persistent TSE - infected cell}
본 발명은 전염성해면상뇌증의 전염성해면상뇌증(TSE; transmissible spongiform encephalopathy) 감수성 세포의 제조방법 및 그 방법에 의해서 수득된 감수성 세포의 활용에 관한 것이다.
전염성해면상뇌증은 치명적인 신경의 퇴행성 질환을 일으키는 일종의 퇴행성 신경 질환으로, BSE(Bovine Spongiform Encephalopathy,소해면상뇌증(광우병)), 스크래피(Scrapie), 크로이츠펠트-야콥병(Creutzfeldt-Jacob Disease, CJD), 게르스트만-스트라우슬러-샤인커 신드롬(Gerstmann-Straussler-Scheinker Syndrome), 쿠루(Kuru), 전염성 밍크뇌증(Transmissible Mink Encephalopathy),사슴의 만성소모성질병(Chronic Wasting Disease), 고양이 해면상뇌증(Feline Spongiform Encephalopathies) 등 사람 및 동물에서 발병되며, 소해면상뇌증의 경우 종간 장벽(species barrier)을 넘어 사람에게도 발병되는 것으로 보고되고 있다.
전염성해면상뇌증의 원인체는 면역원성이 없고, 긴 잠복기를 갖는 특징이 있다. 소해면상뇌증, 즉 광우병에 감염된 소의 뇌의 사후 분석으로부터 신경세포의 파괴와 비정상 단백질 섬유의 침적으로 인하여 뇌에 스펀지(해면상) 형태의 특이한 패턴의 공포(空胞)가 형성되었음을 확인할 수 있다.
전염성해면상뇌증의 원인으로 여겨지는 병원체는 변형프리온(abnormal prion)이라 불리는 감염 단백질이다. 핵산을 필요로 하는 일반 바이러스의 경우와 달리, 변형프리온은 아무런 핵산을 포함하지 않고 단백질로만 이루어진 감염 입자이다. 전염성해면상뇌증은 정상프리온(PrPc)에 감염성 인자인 변형프리온(PrPsc)이 결합하게 되면 병원성프리온으로 전환되어 이러한 병원성프리온이 뇌에 축적되는 것으로 알려져 있다(Prusiner 1989). 중요한 것은 이러한 병원성프리온 즉 변형프리온(PrPsc)이 감염된 조직을 세포에 감염시키면 감염이 성립되고, 감염된 세포를 동물에 접종하면 프리온 질병이 유발되는 데 있다. 따라서 이러한 프리온 질병에 감수성이 있는 세포를 개발할 경우 항프리온 물질의 스크리닝, 병원성 프리온의 형성 및 억제, 진단을 위한 생물학적인 마커 등의 연구에 유리할 것이다.
그러나 이러한 연구 수행에 필수적인 전염성해면상뇌증에 대해서 감수성이 있는 세포의 개발이나 선별이 한정되어 있다. 현재까지 개발된 세포들은 주로 마우스 유래 세포 (Solassol et al., 2003)이며, 마우스 유래 세포 이외에는 RK-13세포를 이용하여 쥐, 양 등의 정상 프리온을 과발현시켜 주로 마우스 순화주에 대한 변형프리온의 감염여부를 확인한 바 있다(Courageot, 2008, Victoria, 2008). 그 러나 소의 BSE나 사람의 크로이츠펠트-야콥병(CJD)에 감염뇌 뇌시료를 직접 접종하여 증식시킨 예는 보고된 바 없으며, 사슴의 만성소모성질병(CWD) 역시 Raymond 등(2006)에 의해 확보된 세포 이외에는 추가적인 연구가 진행된 바 없다.
따라서, 광우병(BSE), 스크래피, 변형 CJD 및 그밖의 관련 전염성해면상 뇌증의 진단에 유리한 해면상뇌증에 감수성이 있는 세포의 개발이 절실하게 필요한 실정이다.
본 발명의 하나의 목적은 전염성해면상뇌증(TSE)의 감염에 감수성 있는 세포를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 두 번째 목적은 전염성해면상뇌증의 진단에 유용한 전염성해면상뇌증(TSE)의 감염에 감수성 있는 세포를 제공하는 것이다.
본 발명의 세 번째 목적은 상기 전염성해면상뇌증(TSE) 감수성 세포를 이용하여 TSE 감염세포를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 마지막 목적은 전염성해면상뇌증의 치료물질 선발 및 병인론 구명 등의 연구에 유용한 전염성해면상뇌증(TSE) 감염 세포를 제공하는 것이다.
상술한 목적을 달성하기 위한 본 발명의 하나의 양상은
전염성해면상뇌증 주감염 동물의 뇌세포로부터 정상 프리온 단백질 유전자를 분리하여 클로닝하는 단계;
전단계에서 클로닝된 정상 프리온 단백질 유전자를 렌티바이러스 트랜스퍼 벡터에 삽입하여 감염성 재조합 렌티바이러스를 제조하는 단계;
상기 감염성 재조합 렌티바이러스를 포유동물 세포주에 접종하여 정상 프리온 단백질을 발현하는 형질도입 세포를 제조하는 단계를 포함하는 전염성해면상뇌증(TSE; transmissible spongiform encephalopathy) 감수성 세포의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명의 다른 양상은 전염성해면상뇌증 주감염 동물의 뇌세포로부터 정상 프리온 단백질 유전자를 분리하여 클로닝하는 단계;
전단계에서 클로닝된 정상 프리온 단백질 유전자를 렌티바이러스 트랜스퍼 벡터에 삽입하여 감염성 재조합 렌티바이러스를 제조하는 단계;
상기 감염성 재조합 렌티바이러스를 비인간 포유동물 세포주에 접종하여 정상 프리온 단백질을 발현하는 형질도입 세포를 제조하는 단계;
상기 형질도입 세포 가운데 정상 프리온 단백질을 발현하는 형질도입 세포를 선별하는 단계;
선별된 정상 프리온 단백질을 발현하는 형질도입 세포에 전염성해면상뇌증에 감염된 조직을 접종하여 전염성해면상뇌증 감염세포를 스크리닝하는 단계; 및
감염 세포를 클로닝하여 전염성해면상뇌증 감염 세포주를 선별하는 단계를 포함하는 전염성해면상뇌증 감염 세포의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명은 여러 종류의 전염성해면상뇌증, 즉, BSE, CWD, 스크래피 및 CJD 등의 원인체의 실험실적 세포배양(ex vivo cell cultivation)을 가능하게 하는 것으로, 본 발명의 방법에 의해서 제조되는 전염성해면상뇌증 감수성 세포는 TSE 감염성 또는 TSE 감염세포는 TSE 진단, 병인론 및 신약개발 등에 유리하게 활용될 수 있다.
이하에서 첨부 도면을 참고하여 본 발명에 대하여 더욱 상세하게 설명한다.
본 발명의 실시예에서는 TSE 감염에 감수성 있는 세포의 생산을 위해 해당 TSE의 주 감염 동물의 정상 프리온 전체 유전자(소 및 사슴)를 클로닝하여 렌티바이러스 발현시스템(Lentivirus expression system)을 통해 정상 프리온단백질 (cellular prion protein: PrPc)의 유전자(the gene encoding PrP; PRNP)를 갖는 감염성 렌티바이러스 생산하고 이를 상용화 되어 있는 포유동물 유래 세포 즉 MDBK, Vero, N2a, RK-13 세포에 감염시켜, 지속적으로 소 또는 사슴의 정상 프리온 단백질을 발현하는 형질도입 세포를 만든다. 이렇게 만들어진 형질도입된 세포(transducted cell)와 PMA(phorbol 12-myristate 13-acetate)가 포함된 세포 배양액을 이용하여 BSE 또는 CWD에 감염 가능한 세포 및 감염된 세포를 제조할 수 있다.
본 발명의 방법에 의해서 TSE 감수성 세포를 제조하는 경우에는 먼저 소 또 는 사슴 등의 주 감염 동물의 뇌세포로부터 정상 프리온 단백질 유전자를 분리하여 임의의 적당한 전달 벡터에 클로닝한다. 이러한 전염성해면상뇌증 주감염 동물의 뇌로부터 정상 프리온 단백질 유전자를 확보하기 위해 특정 프라이머 세트를 이용하여 유전자를 증폭시킬 수 있다. 증폭된 유전자를 특정 전달 벡터(transfer vector)에 클로닝하고 정확한 정상 프리온 유전자의 클로닝 유무를 확인하기 위해서 유전자에 대한 염기서열 분석을 실시할 수 있다.
정상 프리온 유전자가 정확하게 클로닝된 전달 벡터를 렌티바이러스에 삽입하여 감염성 재조합 렌티바이러스를 제조한다. 재조합 렌티바이러스의 생산은 이전에 보고된 바 있다(Follensi et al., (2000) Nat. Genet. 25, 217-222, Dull et al., (1998) J. Virol. 72, 8463-8471 참조). 형질도입된 세포의 선별은 본 발명이 속하는 기술 분야에 알려진 일반적인 방법으로 행할 수 있다. 예를 들어, 형질도입된 세포를 선별하기 위하여 포유 동물 세포에 따라 특정 항생제(예컨대, 퓨로마이신)에 대한 내성을 이용하여 형질도입 세포를 선별해 낼 수 있다.
이어서 상기 감염성 재조합 렌티바이러스를 포유동물 세포주에 접종하여 정상 프리온 단백질을 발현하는 형질도입 세포를 제조한다. 형질도입된 세포에서의 소 및 사슴에 대한 프리온 단백질의 발현은 형광항체검사법 등을 이용해서 확인할 수 있다.
이렇게 해서 수득되는 세포는 전염성해면상뇌증(TSE; transmissible spongiform encephalopathy) 감수성이 있는 세포로, 각종 전염성해면상뇌증의 진단 및 병인 연구 등에 유리하게 이용될 수 있다.
본 발명은 렌티바이러스 발현 시스템 및 세포 배양 배지에 PMA를 첨가하는 배양 시스템에 기초한 감염성 프리온에 대한 ex vivo(시험관내) 복제 또는 증폭 시스템을 제공한다. 상기 시스템은 TSE 특히 BSE와 CWD에 대한 감수성 세포의 선별 및 감염세포를 확보할 수 있는 이점을 갖는다. 따라서 세포 배양에서 감염 프리온의 증식 또는 증폭은 상기의 세포에 감염 프리온의 감염 또는 침입이 확립되어, 이들 감염된 세포가 증식되어 감염이 확립된 세포가 수차례 이상의 계대 배양에서도 감염이 유지됨을 의미한다.
상기 목적을 위해, 본 발명에서는 일반적인 포유동물 세포주, 즉 MDBK, Vero, RK-13 및 N2a 세포에 사슴 및 소의 정상 프리온 유전자(PRNP)를 갖는 감염성 재조합 렌티바이러스를 접종하여, 이들 프리온이 발현되는 형질도입된 세포주를 생산한다. 이들 세포주를 바탕으로 하여 BSE 또는 CWD에 감염된 뇌조직을 세포에 접종하고, 세포 배양액에 PMA를 첨가하여 배양한다.
본 발명의 TSE 감염세포의 제조방법은 아래의 단계들을 포함한다.
먼저 소 또는 사슴과 같은 주 감염동물의 뇌세포로부터 정상 프리온 단백질 유전자를 분리하여 전달벡터에 클로닝한다. 클로닝된 정상 프리온 단백질 유전자를 렌티바이러스 트랜스퍼 벡터에 삽입하여 감염성 재조합 렌티바이러스를 제조한다. 이어서 상기 감염성 재조합 렌티바이러스를 포유동물 세포주에 접종하여 정상 프리온 단백질을 발현하는 형질도입 세포를 제조한 후, 상기 형질도입 세포 가운데 정상 프리온 단백질을 발현하는 형질도입 세포를 선별한다. 선별된 형질도입 세포에 전염성해면상뇌증에 감염된 조직을 접종하여 PMA 첨가 배지에서 배양한 후 감 염세포를 스크리닝한 후, 감염 세포를 클로닝하여 전염성해면상뇌증 감염 세포주를 확립한다.
상기 포유동물 세포주는 특별히 제한되지 않으나, 일례로 MDBK, Vero, RK-13 또는 N2a 등을 사용할 수 있다.
선별된 형질도입 세포에 전염성해면상뇌증에 감염된 조직을 접종하여 배양할 때, 배지에는 PMA(phorbol 12-myristate 13-acetate)를 첨가한다. 일례로 DMEM 세포배양액(PMA-phorbol 12-myristate 13-acetate, 소태아혈청, 페니실린, 스트렙토마이신, 비필수아미노산)을 이용하여 배양할 수 있다.
감염성 프리온의 세포내 감염 또는 증식 여부는 SSCA (standard scrapie cell assay, Klohn, P. C., Stoltze, L., Flechsig, E., Enari, M. & Weissmann, C. A quantitative, highly sensitive cell-based infectivity assay for mouse scrapie prions. Proc Natl Acad Sci U S A 2003. 100, 11666-11671.), ELISA 및 WB을 통해 확인할 수 있다.
본 발명의 방법에 의해서 수득되는 전염성해면상뇌증 감염 세포는 항프리온 물질의 스크리닝, 변형 프리온의 형성 및 억제, 전염성해면상뇌증의 진단을 위한 생물학적 마커의 개발 등에 이용할 수 있다.
이하에서 실시 예를 들어 본 발명에 대하여 상세하게 설명할 것이나, 이들은 단지 예시를 위한 것으로, 본 발명이 이들에 의해 제한되는 것으로 해석되어서는 안 된다.
[실시예 1] 소 및 사슴의 정상 프리온 유전자(PRNP) 확보 및 염기서열 분석
소 및 사슴의 정상 프리온 유전자를 획득하기 위해 전체 유전자를 증폭할 수 있는 하기 표 1의 프라이머 세트를 합성하였다. 프라이머 염기서열은 소의 유전자(GenBank: AJ298878)를 이용하여 설계하였으며, 유전자 클로닝을 위하여 순방향 (forward primer) 및 역방향 프라이머(reverse primer)에 각각 NotI과 XhoI 제한효소 부위를 첨가하였다. 이 프라이머 세트를 이용하여 소(한우) 및 사슴(엘크)의 뇌세포로부터 소 및 사슴의 전체 프리온유전자(PRNP)를 표1의 PCR 조건으로 증폭하였다. 도 2의 A에 나타낸 것과 같이 소 및 엘크의 PRNP가 증폭된 것을 확인하였으며, 이렇게 증폭된 유전자는 도 2의 pGEM-T Easy(Promega)에 삽입시킨 다음 플라스미드(plasmid)내 제한효소인 EcoRI으로 처리하였다. 그 결과 플라스미드내 목적유전자가 삽입되어있음을 확인(도2의 B)하였고, 보다 정확하게 소 및 사슴의 PRNP 유전자 클로닝 유무를 확인하기 위하여 해당 유전자에 대한 염기서열 분석을 실시하였다. 소 및 사슴의 유전자 염기서열의 분석은 유전자은행(GenBank)에 등록된 AJ298878, EU224471(소) 및 EU082291(American elk) 유전자와 각각 비교하였으며, 목적 유전자가 클로닝 되었음을 확인하였다 (도 3 내지 도 4 참조).
종합적으로 살펴보면 도2는 소 및 사슴의 전체 프리온 유전자를 클로닝하고 확인하는 단계를 도시한 것이다. 도 2에서 A는 소 및 엘크의 PRNP PCR 산물이고, B는 PRNP PCR 산물을 pGEM-T Easy vector에 삽입한 다음 플라스미드 내부 제한효소로 처리하여 1%(w/v) 아가로스겔(Agarose gel)에 전기영동한 결과를 나타낸 것이다. 도 3은 본 발명에 사용한 소의 전체 프리온 유전자 염기서열과 동 염기서열을 유전자은행에 등록된 유전자(AJ298878 및 EU224471)들과 비교한 결과를 나타낸 것이다. 도 4는 본 발명에 사용한 사슴(엘크)의 전체 프리온 유전자 염기서열과 동 염기서열을 유전자은행에 등록된 유전자(EU082291)와 비교한 결과를 나타낸 것이다.
Figure 112009072317317-pat00001
[실시예2] 재조합 렌티바이러스 생산 및 확인
우선 도 5에 도시된 바와 같이, Prnp 유전자를 포함하는 클론을 pLEX MCS 트랜스퍼 벡터 (Open Biosystems)에 Prnp를 제한효소 NotI과 XhoI을 이용하여 삽입한 다음 클로닝하였으며, 정확하게 트랜스퍼 백터에 삽입되었는 지 여부를 역시 제한효소 NotI과 XhoI을 이용하여 Prnp를 처리한 다음 아가로스겔에서 전기영동하여 확인하였다. 이렇게 클로닝된 트랜스퍼 벡터와 엔벨로프 글리코프로테인 발현 벡터(envelope glycoprotein expression vector) 및 패키징 벡터를 1:1:1 몰 비율로 혼합한 다음 Lipofectamine Plus (Invitrogen, USA)를 이용하여 293T 세포에 트랜스펙션(transfection)시켰다. 트랜스펙션한지 48시간에 재조합렌티바이러스가 포함된 세포 배양 상청액을 회수하고, 이를 0.45 ㎛ 막 필터 (Nalgene, USA)로 여과한 다음 -70℃에 즉시 보관하였다. 재조합렌티바이러스의 역가는 HeLa cell에서 측정하였다. 형광현미경을 이용하여 형질도입 세포(transduced cell)에서 GFP 발현을 관찰하였으며, 역가는 ml 당 약 106 ~ 107 transduction unit (TU)였다 (도 6).
재조합렌티바이러스의 세포에서의 발현량을 간접적으로 측정하기 위해 웨스턴블롯법으로 HIV-1 p24 발현수준을 확인하였다. 간략하게 실험과정을 설명하면 바이러스 배양 상청액 30ul를 5배 샘플버퍼를 이용 세포를 용해시킨 다음 12% SDS 폴리아크릴아미드 겔에서 전기영동을 실시하였다. 이후 멤브레인으로 전기영동하여 분획된 바이러스 단백질을 옮긴 다음 일차 항 p-24 단클론항체(희석배수 1:1,000)와 실온에서 5시간 반응시켰다. 반응을 일으킨 면역복합체(immune complex)는 ECL 시스템(Santacruz)과 BioRad ChemiDoc XRS 시스템을 이용하여 이미지를 분석한 결과를 도 6에 나타내었다.
[실시예 3] 재조합 렌티바이러스 세포감염 및 형질도입 세포 선별
재조합렌티바이러스 이용한 형질도입된 세포의 생산 및 선별을 위해 선택약제로 Puromycin을 사용하였다. 따라서 MDBK 등 포유동물세포에 따라 퓨로마이신 0 ~ 10ug/ml를 첨가한 다음 3~4일을 기준으로 세포가 죽는 농도를 최적농도로 정하였다(도 7). 최종적으로 퓨로마이신 1.5 ~ 2.5 ug/ml을 최적농도로 설정하여 형질도입 세포를 선별하는 데 사용하였다.
형질도입세포를 생산하는 과정을 좀 더 자세히 살펴보면 다음과 같다. 재조합 렌티바이러스 감염 하루 전, MDBK를 비롯한 포유동물 유래 세포주를 접종당일 60~70% 자라도록 해당 세포를 12웰 조직배양용 플레이트에 펼쳤다. 접종시 배양 상청액을 제거한 다음 재조합 렌티바이러스 0.5ml을 접종하고, 재조합바이러스 1 ml당 polybrene(SIGMA H9268, Hexodimethrine bromide)을 8 ug의 농도로 첨가한 후 플레이트를 조심스럽게 상하 좌우로 흔들어 섞었다. 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 밤새 (15~16시간) 반응시킨 후 새로운 세포배양배지로 교체하고, 다음날 최적농도의 퓨로마이신을 첨가하여 계속 세포를 배양하면서 형질도입 세포를 선별하였다. 도 8은 대표적으로 형질도입된 MDBK 세포를 나타낸 도면이다.
[실시예 4] 형질도입된 세포에서의 프리온 단백질 발현확인
형질도입된 세포에서의 소 및 사슴에 대한 프리온 단백질의 발현을 확인하고자 형광항체검사법을 실시하였다. 형질도입 또는 정상세포를 배양한 다음 세포막에 프리온단백질이 발현되는 지의 유무를 확인하기 위해 4% 파라포름알데하이드(PFA)로 30분간 고정한 후 건조시켰다. 1차 항체인 6H4 항체(Prionics, 1:100 희석)를 고정된 세포에 첨가한 다음 60분간 반응시켰고, 이 후 PBS로 3회 세척하고 2차 항체인 항-마우스 IgG FITC 컨쥬게이트(1:200)를 첨가한 다음 60분간 반응시켰다. 인산완충용액(PBS)으로 6회 세척하고, 세포위에 마운팅 버퍼를 올리고 커버 슬라이드를 덮은 다음 형광현미경으로 관찰하였다. 형질도입 세포(Full length form, C1-2F)(도 9의 우측)의 표면에서 대조 세포(MDBK control)(도 9의 좌측)와는 달리 프리온 단백질이 발현되고 있음을 확인할 수 있었다.
SDS-PAGE 및 웨스턴블롯팅을 이용하여 프리온단백질의 발현을 재차 확인하기 위하여 형질도입 또는 정상 MDBK로부터 다음과 같은 절차에 따라 검사하였다. 배양된 세포를 PBS로 1회 세척하고, 세척액을 버린 다음 새로운 PBS를 첨가한다. 이후 스크레퍼(scraper)를 이용하여 조직배양 플라스크에 부착되어 있는 세포를 긁어 원심튜브에 모은다. 1,200rpm에서 5분간 원심분리하여 세포를 가라앉힌 다음, 상청액은 제거하고 펠렛된 세포를 쳐서 부유시키고 리시스 버포(lysis buffer) (0.5% Triton X-100, 0.5% sodium deoxycholate, 10mM Tris-HCl[pH7.5], 150mM NaCl, 5mM EDTA)를 첨가한 후 얼음(Ice)에서 30분간 반응시켰다. 반응 후 1,200rpm 5분 동안 냉장 원심하고 상청액을 새로운 에펜도르프 튜브에 옮겨 담는다. 상청액은 자기 비드(Dynabeads M-280 Sheep anti-mouse IgG)를 이용하여 부분 정제(semi-purification)한 다음 SDS-PAGE 상에서 전기영동을 실시하였다. 전기영동은 200V로 35분간 시행하고 단백질 시료들을 PVDF(polyvinylidene difluoride) 막을 이용하여 전기적으로 150V로 1시간 트랜스퍼시킨다.
PVDF 막을 30분간 트리스 완충식염수(TBS; Tris buffered saline)에 0.02% I-block (Tropix 사)녹여 준비한 블록킹 완충액으로 블록킹한 후, 6H4 단클론항체를 1시간 실온에서 반응시킨다. TBST(TBS에 0.05%(V/V) tween 20 포함액)로 5분간 3회 세척한 후, 2차 항체, 쥐 IgG에 대한 알칼리성 포스파타아제-컨쥬게이티드 염소 항체를 1:3000으로 TBST에 희석하여 실온에서 1시간동안 반응시킨다. 마지막 단계로 TBST를 이용하여 5분간 3회 세척한 후 발색제로 chemiluminescence인 CDP star를 사용하여 LAS 4000(Kodak,Japan)으로 프리온 단백질의 발현 유무를 확인하였다. 도 10에 나타난 바와 같이 형질도입된 MDBK 세포가 정상 MDBK 세포 및 pLEX 벡터만 발현시킨 대조세포들에 비해 발현량이 더 많음을 밴드를 통해 확인할 수 있었다. 좀더 자세하게 도 10을 설명하면 레인 1은 분자 마커이고, 레인 2 는 MDBK 세포, 레인 3은 MDBK 세포에 소의 프리온유전자를 포함하지 않고 트렌스퍼벡터만 포함된 재조합 렌티바이러스가 감염된 세포(MDBK pLEX vector)이며, 마지막 레인 4는 MDBK 세포에 소의 프리온유전자(PRNP)를 모두 포함한 재조합 렌티바이러스가 감염되어 소의 정상 세포 프리온단백질이 발현된 세포(MDBK C1-2F)이다. 이들 3종류의 세포는 모두 마그네틱 비즈(magnetic beads)를 이용하여 부분 정제한 것으로 전기영동한 다음 웨스턴블롯하였다. 이때 3종 세포에서의 프리온 단백질발현 정도는 세포내 존재하는 정상 단백질인 GAPGH의 량을 비교함으로 간접적으로 비교할 수 있었다. 즉 도10에서 보는 바와 같이 GAPDH의 량이 비슷한 상태에서 MDBK C1-2F 세포에서 가장 많은 프리온단백질이 발현되고 있음을 확인할 수 있었다.
[실시예 5] 형질도입된 세포에 BSE 감염 소의 뇌 접종 및 세포내 BSE 감염확인
형질도입된 세포에서의 PrPsc의 감염성립 유무를 확인하기 위하여 다음과 같이 BSE 감염 소의 뇌 유제액을 세포에 접종하였다. 우선 BSE 감염소 뇌 유제액을 0.25~0.5%가 되도록 DMEM 세포배양액(PMA-phorbol 12-myristate 13-acetate, 소태아혈청, 페니실린, 스트렙토마이신, 비필수아미노산이 첨가된 DMEM)으로 희석한 다음 60~70% 정도 세포가 자란 96공 조직배양 플레이트에 100ul를 접종하였다. 이후 4~6일 간격으로 24공 조직배양 플레이트, 조직배양 25㎠ 플라스크 및 75㎠ 플라스크로 옮겨 가면서 배양하였다.
세포에 BSE 감염여부는 75㎠ 플라스크에 배양된 세포 대상으로 ELISA(IDEXX HerdCheck)를 이용하여 확인하였다. 도 11에서와 같이 정상 MDBK 세포의 경우 BSE 감염소 뇌 유제액을 접종한 것과 접종하지 않은 세포를 비교한 결과 ELISA의 흡광도 비는 1.07(접종/비접종 세포=0.041/0.038)인 반면 형질도입된 세포의 경우 2.4(접종/비접종 세포=0.047/0.113)로 감염이 성립되었음을 확인할 수 있었다. 감염이 확인된 형질도입 세포를 96공 플레이트에서 제한 희석(limiting dilution)을 실시하였다. 이와 같은 제한 희석을 통해 순수 클로닝된 감염세포를 확보하였다. 클로닝된 세포 중 감염된 세포의 선별을 위해 SSCA(Klohn, P. C., Stoltze, L., Flechsig, E., Enari, M. & Weissmann, C. (2003). A quantitative, highly sensitive cell-based infectivity assay for mouse scrapie prions. Proc Natl Acad Sci U S A 100, 11666-1167)를 이용하였다. 실험결과 도 12에 나타낸 바와 같이 강한 양성반응을 나타내는 감염세포 클론을 확인함으로써 재조합렌티바이러스를 이용한 형질도입 세포가 감염성 변형프리온에 감수성이 있음이 증명되었다.
[실시예 6] BSE 감염세포의 지속감염능 확인
BSE 감염이 확인된 형질도입세포 클론에 대해 재클로닝을 실시하여 PrPBSE가 지속감염된 세포주를 확보하기 위하여 96공 플레이트의 구멍당 세포가 0.5개 정도 들어가도록 세포 수를 조절하면서 세포 클로닝 실험을 수행하였다. 그 결과 도 13에 나타낸 바와 같이 클로닝이 되지않은 세포(uncloned(PK+)cell)의 경우 연속적으로 세포를 계대하여 20대 계대 이전에 감염된 세포가 사라져버린 반면, 클로닝이 완료된 세포 (cloned (PK+) cell)는 연속 계대후 26대 계대 이상에서도 BSE의 세포내 감염력이 연속적으로 유지되고 있음을 웨스턴블롯을 통해 확인하였다. 또한 변형프리온 단백질의 특징중의 하나인 단백질분해효소(PK;proteinase K)에 저항성을 나타내는 특성을 이번 웨스턴블롯을 통해서도 증명이 되었다. 즉 세포대조의 경우 PK 처리에 의해 모든 세포내 프리온 단백질이 분해되어 PK에 저항성을 갖는 프리온단백질 밴드가 없는 반면(도 13의 2번째 레인) 지속적으로 변형프리온에 감염된 세포에서는 PK 처리에 저항성을 갖는 특징적인 3개의 밴드를 분명하게 증명할 수 있었다(도 13의 3,4,7,8그리고 9번째 레인). 상기와 같은 특성을 갖는 세포주를 M2B 세포라 명명하고, 한국생명공학연구원 생물자원센터(Korean Collection for Type Cultures (KCTC), Biological Resource Center (BRC))에 해당 세포주를 기탁하였다(기탁번호: KCTC 11594BP ).
[실시예 8] MDBK 이외 세포에서의 BSE 감염단계
이 발명의 M2B세포의 예를 통해 재조합 렌티바이러스를 이용한 형질도입세포에 대표적인 프리온 질병인 BSE의 PrPBSE가 감염될 수 있다는 것이 증명됨에 따라 MDBK 세포이외에 Vero, N2a, RK-13 세포에 소의 세포 프리온 단백질을 MDBK에서와 같은 재조합렌티바이러스 발현 시스템을 이용해서 각각의 세포에서 발현시켰다. 이후 세포선택약제인 puromycin을 이용하여 형질도입세포를 선발하였다. 이렇게 선발된 형질도입세포를 96웰 세포배양 플레이트에 배양한 다음 0.25% BSE 감염소의 뇌 유제액을 접종하고, 세포가 완전히 자라서 세포를 계대 배양할 싯점에서 SSCA를 실시하여 BSE 감염여부를 확인하였으며, SSCA를 통해 양성이 확인된 세포는 연속적인 계대배양을 실시하였다. 실험결과 BSE 감염된 소의 뇌를 감염시킨 모든 형질도입세포에서 감염세포를 확인할 수 있었다(도 14 및 도 16).
도 14는 형질도입 Vero 세포에서의 PrPBSE 감염을 보여주는 SSCA 결과이고, 도 15는 형질도입 N2a 세포에서의 PrPBSE 감염을 보여주는 SSCA 결과이며, 도 16은 형질도입 RK-13 세포에서의 PrPBSE 감염을 보여주는 SSCA 결과이다.
[실시예 9] BSE 이외에 CWD 감염 사슴뇌를 이용한 형질도입세포에서의 감염단계
BSE 감염 세포를 제조하는 방법과 동일한 방법으로 다른 축종의 프리온질병에 대해서도 세포내 변형프리온의 감염이 가능한 지에 대해 연구를 수행하였다. 우선 사슴의 프리온질병인 사슴만성소모성질병(CWD: chronic wasting disease)에 대한 감수성 세포를 생산하기 위해서 먼저 사슴의 뇌세포로부터 사슴의 PRNP를 PCR을 통해 증폭시켰고, 증폭된 PCR 산물을 pGEM-T Easy plasmid vector에 클로닝하였다(도2). 정확하게 사슴의 유전자가 클로닝되었는 지는 유전자 염기서열을 분석하여 확인하였다(도4). 확인된 사슴 프리온유전자를 pLEX MCS 벡터에 클로닝하고 아가로스겔을 이용한 전기영동을 통해 유전자를 다시 확인하였다(도 5). 이후 재조합렌티바이러스를 생산하는 과정은 [실시예 2~4] 항과 동일하게 수행하였다. 결론적으로 사슴의 정상 프리온단백질을 RK-13, Vero 및 N2a 세포에서 발현시켰으며, 발현이 확인된 형질도입세포에 0.25%의 CWD 감염 엘크의 뇌 유제액을 세포에 접종하고, 실시예 8과 동일한 방법으로 세포를 계대배양하면서 SSCA 및 웨스턴블롯을 이용하여 CWD 감염 여부를 확인하였다.
도 17은 형질도입 RK-13 세포에서의 사슴만성소모성질병의 변형프리온(PrPCWD)이 감염됨을 보여주는 SSCA 결과이고, 도 18은 형질도입 N2a 세포에서의 PrPCWD 감염을 보여주는 SSCA 결과이며, 도 19는 형질도입 Vero 세포에서의 PrPCWD 감염을 보여주는 SSCA 결과이다. 도 17 내지 도 19에서 확인되는 바와 같이, CWD 감염시킨 모든 형질도입세포에서 SSCA를 이용하여 감염세포를 확인할 수 있었다.
특히 CWD 감염시킨 RK-13 및 N2a 세포에서는 웨스턴블롯을 통해서도 감염되었음을 확인할 수 있었다(도 20-도 21). 도 20은 형질도입 RK-13 세포에서의 PrPCWD 감염을 보여주는 웨스턴블롯팅 결과이고, 도 21은 형질도입 N2a 세포에서의 PrPCWD 감염을 보여주는 웨스턴블롯팅 결과이다.
이상에서, 본 발명의 실시예를 통하여 보다 구체적으로 설명하였으나, 본 발명이 이에 의해 한정되는 것은 아니고, 본 발명의 아이디어 및 구성 내에서 많은 변형 및 변경이 이루어질 수 있다.
도 1은 본 발명의 일실시예에 의한 전염성해면상뇌증 감수성 및 감염세포의 제조방법의 흐름도이다.
도 2는 소 및 사슴의 전체 프리온 유전자를 클로닝하고 확인하는 단계를 도시한 것이다.
도 3은 본 발명에 사용한 소의 전체 프리온 유전자 염기서열(서열 1)을 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명에 사용한 사슴(엘크)의 전체 프리온 유전자 염기서열(서열 2)을 나타낸 것이다.
도 5는 pLEX MCS 트랜스퍼 벡터에 소 및 엘크 Prnp 클로닝한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 감염성 렌티바이러스 확인 및 역가 측정을 나타낸 것이다.
도 7은 형질도입 MDBK 세포 선별을 위한 적정 퓨로마이신 농도 결정과정을 나타낸 도면이다.
도 8은 감염성 렌티바이러스 접종 3일째 대조 및 감염 MDBK 세포(형질도입세포) 를 나타낸 것이다.
도 9는 형질도입된 MDBK 세포에서의 형광항체검사법에 의한 재조합 프리온 단백질의 발현을 확인한 도면이다.
도 10은 형질도입된 MDBK 세포에서의 재조합 프리온 단백질 발현을 웨스턴브롯팅법을 이용하여 확인한 도면이다.
도 11은 형질도입 MDBK 세포에서의 BSE(PrPBSE)감염을 보여주는 효소면역항체검사법(ELISA) 결과이다.
도 12는 형질도입 MDBK 세포에서의 PrPBSE 감염을 보여주는 SSCA 결과이다.
도 13은 형질도입 MDBK 세포에서의 PrPBSE 지속 감염을 보여주는 웨스턴블롯팅 결과이다.
도 14는 형질도입 Vero 세포에서의 PrPBSE 감염을 보여주는 SSCA 결과이다.
도 15는 형질도입 N2a 세포에서의 PrPBSE 감염을 보여주는 SSCA 결과이다.
도 16는 형질도입 RK-13 세포에서의 PrPBSE 감염을 보여주는 SSCA 결과이다.
도 17은 형질도입 RK-13 세포에서의 사슴만성소모성질병의 변형프리온(PrPCWD)이 감염됨을 보여주는 SSCA 결과이다.
도 18은 형질도입 N2a 세포에서의 PrPCWD 감염을 보여주는 SSCA 결과이다.
도 19는 형질도입 Vero 세포에서의 PrPCWD 감염을 보여주는 SSCA 결과이다.
도 20은 형질도입 RK-13 세포에서의 PrPCWD 감염을 보여주는 웨스턴블롯팅 결과이다.
도 21은 형질도입 N2a 세포에서의 PrPCWD 감염을 보여주는 웨스턴블롯팅 결과이다.
<110> ABC <120> TSE <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 795 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Prion gene sequence of Cow <400> 1 atggtgaaaa gccacatagg cagttggatc ctggttctct ttgtggccat gtggagtgac 60 gtgggcctct gcaagaagcg accaaaacct ggaggaggat ggaacactgg ggggagccga 120 tacccaggac agggcagtcc tggaggcaac cgttatccac ctcagggagg gggtggctgg 180 ggtcagcccc atggaggtgg ctggggccag cctcatggag gtggctgggg ccagcctcat 240 ggaggtggct ggggtcagcc ccatggtggt ggctggggac agccacatgg tggtggaggc 300 tggggtcaag gtggtaccca cggtcaatgg aacaaaccca gtaagccaaa aaccaacatg 360 aagcatgtgg caggagctgc tgcagctgga gcagtggtag ggggccttgg tggctacatg 420 ctgggaagtg ccatgagcag gcctcttata cattttggca gtgactatga ggaccgttac 480 tatcgtgaaa acatgcaccg ttaccccaac caagtgtact acaggccagt ggatcagtat 540 agtaaccaga acaactttgt gcatgactgt gtcaacatca cagtcaagga acacacagtc 600 accaccacca ccaaggggga gaacttcacc gaaactgaca tcaagatgat ggagcgagtg 660 gtggagcaaa tgtgcattac ccagtaccag agagaatccc aggcttatta ccaacgaggg 720 gcaagtgtga tcctcttctc ttcccctcct gtgatcctcc tcatctcttt cctcattttt 780 ctcatagtag gatag 795 <210> 2 <211> 771 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Prion Gene sequence of elk <400> 2 atggtgaaaa gccacatagg cagctggatc ctagttctct ttgtggccat gtggagtgac 60 gtcggcctct gcaagaagcg accaaaacct ggaggaggat ggaacactgg ggggagccga 120 tacccgggac agggaagtcc tggaggcaac cgctatccac ctcagggagg gggtggctgg 180 ggtcagcccc atggaggtgg ctggggccaa cctcatggag gtggctgggg tcagccccat 240 ggtggtggct ggggacagcc acatggtggt ggaggctggg gtcaaggtgg tacccacagt 300 cagtggaaca agcccagtaa accaaaaacc aacatgaagc atgtggcagg agctgctgca 360 gctggagcag tggtaggggg cctcggtggc tacatgctgg gaagtgccat gagcaggcct 420 cttatacatt ttggcaatga ctatgaggac cgttactatc gtgaaaacat gtaccgttac 480 cccaaccaag tgtactacag gccagtggat cagtataata accagaacac ctttgtgcat 540 gactgtgtca acatcacagt caagcaacac acagtcacca ccaccaccaa gggggagaac 600 ttcaccgaaa ctgacatcaa gatgatggag cgagttgtgg agcaaatgtg catcacccag 660 taccagagag aatccgaggc ttattaccaa agaggggcaa gtgtgatcct cttctcctcc 720 cctcctgtga tcctcctcat ctctttcctc atttttctca tagtaggata g 771

Claims (6)

  1. 소 또는 사슴의 뇌세포로부터 정상 프리온 단백질 유전자를 분리하여 클로닝하는 단계;
    전단계에서 클로닝된 정상 프리온 단백질 유전자를 pLEX MCS 렌티바이러스 트랜스퍼 벡터에 삽입하여 감염성 재조합 렌티바이러스를 제조하는 단계;
    상기 감염성 재조합 렌티바이러스를 MDBK, Vero, RK-13 및 N2a로 이루어진 군으로부터 선택되는 포유동물 세포주에 접종하여 정상 프리온 단백질을 발현하는 형질도입 세포를 제조하는 단계;
    상기 형질도입 세포 가운데 정상 프리온 단백질을 발현하는 형질도입 세포를 선별하는 단계;
    선별된 정상 프리온 단백질을 발현하는 형질도입 세포에 소해면상뇌증 또는 사슴의 만성소모성질병에 감염된 조직을 접종한 후 PMA(phorbol 12-myristate 13-acetate)를 포함하는 배지에서 배양하여 감염세포를 스크리닝하는 단계; 및
    소해면상뇌증 또는 사슴의 만성소모성질병에 감염된 세포를 클로닝하여 세포주를 확립하는 단계를 포함하는 소해면상뇌증 또는 사슴의 만성소모성질병 지속감염 세포의 제조방법.
  2. 청구항 1의 방법에 의해서 수득된 소해면상뇌증 또는 사슴의 만성소모성질병 지속감염 세포.
  3. 청구항 2에 있어서,
    소의 정상 프리온 단백질 유전자를 포함하는 pLEX MCS 렌티바이러스 벡터가 형질도입된 MDBK 세포주를 이용하여 제조되는 기탁번호 KCTC 11594BP의 소해면상뇌증 지속감염 세포.
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 삭제
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