KR101351587B1 - 재조합 아데노바이러스 벡터를 이용한 Ｐｒｎｐ 유전자를 유효성분으로 함유하는 프리온 질병의 예방 또는 치료용 약학 조성물 - Google Patents

재조합 아데노바이러스 벡터를 이용한 Ｐｒｎｐ 유전자를 유효성분으로 함유하는 프리온 질병의 예방 또는 치료용 약학 조성물 Download PDF

Info

Publication number
KR101351587B1
KR101351587B1 KR1020110096542A KR20110096542A KR101351587B1 KR 101351587 B1 KR101351587 B1 KR 101351587B1 KR 1020110096542 A KR1020110096542 A KR 1020110096542A KR 20110096542 A KR20110096542 A KR 20110096542A KR 101351587 B1 KR101351587 B1 KR 101351587B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
prp
adenovirus vector
recombinant adenovirus
disease
gene
Prior art date
Application number
KR1020110096542A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20130032758A (ko
Inventor
정재교
문명희
이유진
설재원
박상열
Original Assignee
전북대학교산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 전북대학교산학협력단 filed Critical 전북대학교산학협력단
Priority to KR1020110096542A priority Critical patent/KR101351587B1/ko
Priority to PCT/KR2011/010340 priority patent/WO2013042833A1/ko
Publication of KR20130032758A publication Critical patent/KR20130032758A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101351587B1 publication Critical patent/KR101351587B1/ko

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C12N15/861—Adenoviral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10341—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/10343—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

본 발명은 재조합 아데노바이러스 벡터를 이용한 Ｐｒｎｐ 유전자를 유효성분으로 함유하는 프리온 질병의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 재조합 아데노바이러스 벡터를 이용하여 Ｐｒｎｐ 유전자를 Prnp 유전자가 녹-아웃된 마우스 신경세포주(Zpl 3-4)에 형질감염한 시스템은 정상 산소 상태에서 PrPC를 과발현시키고, 아넥신 V (+) 세포, 즉 아폽토시스가 일어난 세포의 비율과 LDH의 활성을 발현 카세트가 없는 재조합 아데노바이러스 벡터(Ad-lacZ)로 형질감염된 Zpl 3-4 세포에서보다 유의하게 감소시킨다. 따라서, 본 발명에 따른 재조합 아데노바이러스 벡터를 이용한 Ｐｒｎｐ 유전자의 형질감염 시스템은 PrPSc-매개 신경세포사를 억제하여 신경세포를 보호하므로, 프리온 질병의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

재조합 아데노바이러스 벡터를 이용한 Ｐｒｎｐ 유전자를 유효성분으로 함유하는 프리온 질병의 예방 또는 치료용 약학 조성물{Pharmaceutical composition comprising Prnp gene using recombinant adenovirus vector for preventing or treating prion disease}
본 발명은 재조합 아데노바이러스 벡터를 이용한 Ｐｒｎｐ 유전자를 유효성분으로 함유하는 프리온 질병의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
프리온(Prion)은 박테리아, 바이러스, 곰팡이, 기생충과 같은 기존의 병원체와는 전혀 다른 종류의 질병 감염인자로서, 보통의 바이러스보다 훨씬 작고, 유전물질인 핵산이 배제된 감염성 질환을 일으키는 특징을 가진다. 프리온이 사람을 포함하여 동물에 감염되면 뇌에서 스펀지 형태의 공포가 형성되어 신경세포사를 일으켜 퇴행성 신경질환을 유발한다.
프리온 질병은 현재까지도 정확한 발생기전이 밝혀져 있지 않으며, 많은 과학자들은 프리온 질병의 발생이 정상적인 프리온 단백질(PrPC)과 연관이 있을 것으로 추정하고 있다. PrPC는 세포막에 존재하는 당단백질로서 주로 대부분이 뇌에서 발현되며, 생체 내 기능에 대해서는 많이 밝혀져 있지 않으나 세포성장 및 부분적인 신호전달 기능을 갖는 것으로 알려져 있다. 특정 상황에서 PrPC는 비정상적인 형태를 취하는데, 이를 변형 프리온 단백질(PrPSc)이라고 한다. PrPSc는 PrPC와 달리 서로 응집하는 경향이 있고, 이러한 PrPSc의 응집체가 전염성 해면상 뇌증 (tansmissible spongiform encephalopathy; TSE)의 전염성을 일으킨다고 추정하고 있다. PrPC는 3개의 나선구조(α helix)와 2개의 병풍구조(β sheet)로 이루어져 있으며, 현재까지 잘 알려지지 않은 기전을 통해 PrPSc로 전환된다. PrPSc는 PrPC보다 병풍구조가 더 많으며, 서로 응집하여 수불용성(insoluble)이 되고, 단백분해효소 K(proteinase K)에 의해 완전히 분해되지 않는다. 또한, PrPSc는 PrPC와 입체구조가 전혀 다름에도 불구하고, 생체의 면역시스템은 PrPSc를 외부물질로 인식하지 못하고 있다.
모든 전염성 해면상 뇌증 질환에 있어서 발병 기전은 신경세포사를 유도함으로써 뇌에 스폰지 형태의 공동과 같은 병변을 일으켜 뇌의 손상을 야기하는 것으로 알려져 있다. 그러나, 현재까지도 이러한 병변들이 PrPSc의 단독 작용에 의한 것인지 PrPC도 일부 관여를 하는지는 밝혀져 있지 않다. PrPSc는 다양한 포유류에서 진행성 신경질환을 일으키며, 그 치사율은 100%에 이른다.
대표적인 프리온 질병으로는 인간의 CJD(Creutzfeldt-Jakob disease), 소의 BSE(bovine spongiform encephalopathy), 양의 스크래피(scrapie), 사슴의 CWD (chronic wasting disease), 밍크의 TME(transmissible mink encephalopathy) 등이 알려져 있다. 일반적으로, 프리온 질병은 동종 내에서 전파되지만 이종으로 전이되었을 때 더 큰 문제를 야기한다. 이의 가장 대표적인 예로는, 소의 BSE로부터 전이되어 발병한 인간의 vCJD를 들 수 있다.
현재 알려져 있는 모든 프리온 질병들에 대한 예방 또는 치료제는 연구 및 개발 단계에 있어서 아직 실용화되어 있지 않다. 항프리온 효과를 갖는 물질로는 퀴나크린, 퀴놀린, RNA 앱타머 및 항 PrP 항체 등이 알려져 있으나, 이들 물질들은 세포 및 동물 실험단계에 머물러 있을 뿐 만족할 만한 효과를 얻지 못하여, 아직까지 이에 대한 연구 결과는 미미한 실정이다.
본 발명자들은 항프리온 효과를 갖는 물질에 대해 계속 연구하던 중, 저산소 상태에서 발현이 증가되는 단백질에 의해 PrPSc-매개 신경세포사가 효과적으로 억제되고, PrPC의 mRNA 및 단백질의 발현이 증가하는 것을 확인하였다. 그러나, 정상 산소 상태에서는 PrPC의 mRNA 및 단백질이 발현되지 않았다. 또한, Prnp 유전자의 과발현 시스템은 허혈성에서 산화 스트레스를 조절할 수 있다고 보고되어 있으나 프리온 질병에 대한 적용 및 효과에 대해서는 아직까지 보고된 바가 없다.
따라서, 정상 산소 상태에서도 PrPC의 mRNA 및 단백질의 발현을 증가시키면 PrPSc-매개 신경세포사를 억제할 수 있어 프리온 질병의 예방 또는 치료에 유용할 것으로 생각된다.
따라서, 정상 산소 상태에서도 PrPC의 mRNA 및 단백질을 과발현시킬 수 있는 물질에 대한 연구의 필요성이 절실히 요구되고 있다.
본 발명자들은 정상 산소 상태에서도 PrPC의 mRNA 및 단백질을 과발현시킬 수 있는 물질에 대해 연구하던 중, 재조합 아데노바이러스 벡터를 이용하여 Ｐｒｎｐ 유전자를 Prnp 유전자가 녹-아웃된 마우스 신경세포주(Zpl 3-4)에 형질감염한 시스템이 정상 산소 상태에서 PrPC을 과발현시키고, PrPSc-매개 신경세포사를 억제하여 신경세포를 보호함을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명은 아데노바이러스 벡터 시스템을 이용한 Ｐｒｎｐ 유전자를 유효성분으로 함유하는 프리온 질병의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하고자 한다.
본 발명은 재조합 아데노바이러스 벡터를 이용한 Ｐｒｎｐ 유전자를 유효성분으로 함유하는 프리온 질병의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
이하, 본 발명에 대해 상세히 설명한다.
본 발명에 따른 재조합 아데노바이러스 벡터를 이용하여 Ｐｒｎｐ 유전자를 Prnp 유전자가 녹-아웃된 마우스 신경세포주(Zpl 3-4)에 형질감염한 시스템은 정상 산소 상태에서 PrPC를 과발현시키고, 아넥신 V (+) 세포, 즉 아폽토시스가 일어난 세포의 비율과 LDH의 활성을 발현 카세트가 없는 재조합 아데노바이러스 벡터(Ad-lacZ)로 형질감염된 Zpl 3-4 세포에서보다 유의하게 감소시킨다. 따라서, 본 발명에 따른 아데노바이러스 벡터를 이용한 Ｐｒｎｐ 유전자의 형질감염 시스템은 PrPSc-매개 신경세포사를 억제하여 신경세포를 보호함을 알 수 있다.
따라서, 본 발명에 따른 아데노바이러스 벡터를 이용한 Ｐｒｎｐ 유전자의 형질감염 시스템은 프리온 질병의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
상기 프리온 질병은 PrPSc-매개 신경세포의 아폽토시스와 관련된 신경질환을 모두 포함할 수 있으며, 구체적으로는 인간의 크로이츠펠트-야코프병 (Creutzfeldt-Jakob disease), 쿠루병(Kuru disease), 게르스트만-슈트로이슬러-샤인커병(Gerstmann-Strsyndrome), 치명적 가족성 불면증(fatal familial insomnia); 소의 BSE(bovine spongiform encephalopathy); 양의 스크래피(scrapie); 사슴의 CWD(chronic wasting disease); 또는 밍크의 TME(transmissible mink encephalopathy) 등을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 조성물은 재조합 아데노바이러스 벡터를 이용한 Ｐｒｎｐ 유전자와 함께 프리온 질병의 예방 또는 치료 효과를 갖는 공지의 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다.
본 발명의 조성물은, 투여를 위해서 상기 기재한 유효성분 이외에 추가로 약학적으로 허용가능한 담체를 1종 이상 포함하여 제조할 수 있다. 약학적으로 허용가능한 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로오스 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 더 나아가 당분야의 적정한 방법으로 또는 Remington's Pharmaceutical Science(최근판), Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.
본 발명의 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구 투여(예를 들어, 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)할 수 있으며, 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다. 상기 재조합 아데노바이러스 벡터를 이용한 Ｐｒｎｐ 유전자의 일일 투여량은 약 1~1000 MOI(multiplicity of infection), 바람직하게는 약 50~500 MOI 이나 임상실험결과에 따라 가감될 수 있으며, 하루 일회 내지 수회에 나누어 투여하는 것이 바람직하다.
본 발명의 조성물은 프리온 질병의 예방 또는 치료 효과를 위하여 단독으로, 또는 수술, 호르몬 치료, 약물 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.
본 발명에 따른 재조합 아데노바이러스 벡터를 이용하여 Ｐｒｎｐ 유전자를 Prnp 유전자가 녹-아웃된 마우스 신경세포주(Zpl 3-4)에 형질감염한 시스템은 정상 산소 상태에서 PrPC를 과발현시키고, 아넥신 V (+) 세포, 즉 아폽토시스가 일어난 세포의 비율과 LDH의 활성을 발현 카세트가 없는 재조합 아데노바이러스 벡터(Ad-lacZ)로 형질감염된 Zpl 3-4 세포에서보다 유의하게 감소시킨다. 따라서, 본 발명에 따른 아데노바이러스 벡터를 이용한 Ｐｒｎｐ 유전자의 형질감염 시스템은 PrPSc-매개 신경세포사를 억제하여 신경세포를 보호하는 효과가 있다.
도 1은 정상 산소 상태에서 Prnp 유전자를 발현하는 재조합 아데노바이러스 벡터(Ad-Prnp)로 형질감염된 마우스 신경세포주(Zpl 3-4)에서 PrPC가 과발현되는지 웨스턴 블롯으로 확인한 도이다.
도 2는 재조합 아데노바이러스 벡터를 이용한 Ｐｒｎｐ 유전자의 형질감염 시스템이 PrPSc-매개 신경세포사에 미치는 영향을 세포 생존율로 확인한 도이다.
도 3은 재조합 아데노바이러스 벡터를 이용한 Ｐｒｎｐ 유전자의 형질감염 시스템이 PrPSc-매개 신경세포사에 미치는 영향을 LDH 활성으로 확인한 도이다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
실시예 1 : 정상 산소 상태에서 아데노바이러스 벡터를 이용한 Ｐｒｎｐ 유전자로 형질감염된 신경세포에서 PrP C 가 과발현되는지 확인 실험
1. 세포배양
마우스 신경세포주(Zpl 3-4)는 Zurich I Prnp -/- 마우스의 해마 부위로부터 규명하였으며, 한림대학교 김용선 교수님으로부터 제공받았다. 상기 Zpl 3-4 세포는 10% 우태아 혈청(Invitrogen-Gibco, Grand Island, NY, USA) 및 겐타마이신이 함유된 DMEM(Hyclone Laboratories) 배지에서 37℃, 5% CO2로 유지된 습식 배양기에서 배양하였다.
2. 프리온 단백질 펩티드( PrP (106-126))의 제조
PrP(106-126)는 펩트론(Seoul, Korea)에서 합성한 것을 사용하였으며, 그 서열은 Lys-Thr-Asn-Met-Lys-His-Met-Ala-Gly-Ala-Ala-Ala-Ala-Gly-Ala-Val-Val-Gly-Gly-Leu-Gly 이다. 상기 PrP(106-126)를 무균의 DMSO에 12.5mM의 농도로 용해시키고, -80℃에서 저장하였다.
상기 PrP(106-126)는 정상 프리온 단백질에 존재하는 106~126번의 아미노산 서열을 가진 펩티드로서, 상기 서열을 갖는 PrP 단백질은 변형 프리온의 특성을 가지고 있어 PrPSc(변형 프리온 단백질)의 병인을 연구하기 위해 많이 사용되고 있다. 또한, PrP(106-126)은 신경세포에서 근모 축적(fibril accumulation)을 일으키고 직접적인 신경세포사를 유도한다는 연구결과가 보고되어 있다[Marella M. and Chabry J. Neurons and astrocytes respond to prion infection by inducing microglia recruitment. J. Neurosci. 2004. 24, 620627].
3. 재조합 아데노바이러스 벡터의 제조
인간 전장 Prnp 유전자(NCBI Accession No. NM_000311, version NM_000311.3)를 발현하는 재조합 아데노바이러스 벡터(Ad-Prnp)는 (주)제넨메드(서울, 한국)로부터 제공받았으며, 대조군으로는 발현 카세트가 없는 재조합 아데노바이러스 벡터(Ad-lacZ)를 사용하였다. 상기 재조합 아데노바이러스 벡터 (Ad-Prnp, Ad-lacZ)를 리포펙타민 2000을 이용하여 Prnp 유전자가 녹-아웃된 마우스 신경세포주(Zpl 3-4)에 형질감염시키고, 이를 FBS가 없는 MEM 배지에서 24시간 동안 배양하였다. 배양 후 무균의 PBS 완충액으로 세척하고, 2% FBS를 포함한 MEM 배지를 가하였다.
4. 웨스턴 블롯
정상 산소 상태에서 재조합 아데노바이러스 벡터를 이용한 Ｐｒｎｐ 유전자로 형질감염된 세포에서 PrPC가 과발현되는지 확인하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다. 구체적으로는, 재조합 아데노바이러스 벡터(Ad-Prnp, Ad-lacZ)로 형질감염된 Zpl 3-4 세포를 용해 완충액(25mM HEPES; pH 7.4, 100mM NaCl, 1mM EDTA, 5mM MgCl2, 0.1mM DTT 및 프로테아제 저해 혼합물)에 용해시켰다. 단백질을 10~15% SDS(sodium dodecyl sulfate) 겔 위에서 전기영동으로 분리하고, 공지된 방법으로 면역 블롯팅을 수행하였다. 즉, 단백질 용해물의 동일 양을 10~15% SDS-폴리아크릴아미드 겔 위에 용해시키고, 니트로셀룰로오스 막으로 전기영동 전이시켰다. 그 다음, HRP(horseradish peroxidase)-결합된 2차 항체와 ECL(enhanced chemiluminoscent) 시약으로 순차 반응시켜 면역반응성을 확인하였다. 면역블롯팅에 사용된 항체는 PrPC(Millipore, Billerica, MA, USA), 생쥐 PrP(김용선 교수님으로부터 제공받음) 및 β-actin(Santa Cruz Biotechnology) 이다.
결과는 도 1에 나타내었다.
도 1에 나타난 바와 같이, 정상 산소 상태에서 Prnp 유전자를 발현하는 재조합 아데노바이러스 벡터(Ad-Prnp)로 형질감염된 Zpl 3-4 세포에서 PrPC가 과발현되었으나, 발현 카세트가 없는 재조합 아데노바이러스 벡터(Ad-lacZ)로 형질감염된 Zpl 3-4 세포에서는 PrPC가 거의 발현되지 않았다.
실시예 2 : 아데노바이러스 벡터를 이용한 Ｐｒｎｐ 유전자의 형질감염 시스템이 PrP Sc -매개 신경세포사에 미치는 영향
본 발명의 아데노바이러스 벡터를 이용한 Ｐｒｎｐ 유전자의 형질감염 시스템이 PrPSc-매개 신경세포사에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.
1. 세포 생존율 측정 - 아넥신 V 어세이
재조합 아데노바이러스 벡터(Ad-Prnp, Ad-lacZ)로 형질감염된 Zpl 3-4 세포 (100 MOI(multiplicity of infection), 500 MOI)를 300μM PrP(106-126)로 처리하거나 또는 처리하지 않고 24시간 동안 배양하였다. 그 다음, 아폽토시스를 제조자의 프로토콜에 따라 아넥신 V 어세이 키트(sanracruz biotechnology)를 이용하여 평가하였다. Guava EasyCyte HT(Millipore)를 이용하여 488㎚(여기) 및 525~530㎚ (방출)에서 형광을 측정하여 세포 생존율을 확인하였다.
결과는 도 2에 나타내었다.
도 2에 나타난 바와 같이, Prnp 유전자를 발현하는 재조합 아데노바이러스 벡터(Ad-Prnp)로 형질감염된 Zpl 3-4 세포에서 아넥신 V (+) 세포, 즉 아폽토시스가 일어난 세포의 비율이 발현 카세트가 없는 재조합 아데노바이러스 벡터(Ad-lacZ)로 형질감염된 Zpl 3-4 세포에서보다 현저히 유의하게 감소함을 확인하였다 (** P<0.01). 따라서, 본 발명에 따른 Prnp 유전자를 발현하는 재조합 아데노바이러스 벡터(Ad-Prnp)로 형질감염된 시스템은 PrP(106-126)-매개 신경세포사를 억제하여 신경세포를 보호함을 알 수 있다.
2. LDH ( lactate dehydrogenase ) 활성 측정
재조합 아데노바이러스 벡터(Ad-Prnp, Ad-lacZ)로 형질감염된 Zpl 3-4 세포 (100 MOI, 500 MOI)를 300μM PrP(106-126)로 처리하거나 또는 처리하지 않고 24시간 동안 배양하였다. 그 다음, 세포독성을 LDH Cytotoxicity Detection kit(Takara Bio Inc., Tokyo, Japan)를 이용하여 세포 배양 상청액 배지에서 LDH 어세이로 측정하였다. LDH 활성은 490㎚에서 흡광도를 측정하여 결정하였다.
결과는 도 3에 나타내었다.
도 3에 나타난 바와 같이, Prnp 유전자를 발현하는 재조합 아데노바이러스 벡터(Ad-Prnp)로 형질감염된 Zpl 3-4 세포에서 LDH의 활성이 발현 카세트가 없는 재조합 아데노바이러스 벡터(Ad-lacZ)로 형질감염된 Zpl 3-4 세포에서보다 유의하게 감소함을 확인하였다(** P<0.01). 따라서, 본 발명에 따른 Prnp 유전자를 발현하는 재조합 아데노바이러스 벡터(Ad-Prnp)로 형질감염된 시스템은 PrP(106-126)-매개 신경세포사를 억제하여 신경세포를 보호함을 알 수 있다.

Claims (3)

  1. 재조합 아데노바이러스 벡터에 삽입된, 하기 염기서열로 표시되는 Ｐｒｎｐ 유전자(NCBI Accession No. NM_000311, version NM_000311.3)를 유효성분으로 함유하며, 상기 재조합 아데노바이러스 벡터에 삽입된 Ｐｒｎｐ 유전자는 정상 산소 상태에서 PrPC의 mRNA 및 단백질의 발현을 증가시키는 것을 특징으로 하는, 인간의 크로이츠펠트-야코프병 (Creutzfeldt-Jakob disease), 쿠루병(Kuru disease), 게르스트만-슈트로이슬러-샤인커병(Gerstmann-Strsyndrome), 치명적 가족성 불면증(fatal familial insomnia), 소의 BSE(bovine spongiform encephalopathy), 양의 스크래피 (scrapie), 사슴의 CWD(chronic wasting disease), 및 밍크의 TME(transmissible mink encephalopathy)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종의 이상의 프리온 질병의 예방 또는 치료용 약학 조성물:
    Figure 112013074213500-pat00004
  2. 제 1항에 있어서, 상기 프리온 질병은 PrPSc-매개 신경세포의 아폽토시스와 관련된 신경질환인 것을 특징으로 하는 프리온 질병의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  3. 삭제
KR1020110096542A 2011-09-23 2011-09-23 재조합 아데노바이러스 벡터를 이용한 Ｐｒｎｐ 유전자를 유효성분으로 함유하는 프리온 질병의 예방 또는 치료용 약학 조성물 KR101351587B1 (ko)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020110096542A KR101351587B1 (ko) 2011-09-23 2011-09-23 재조합 아데노바이러스 벡터를 이용한 Ｐｒｎｐ 유전자를 유효성분으로 함유하는 프리온 질병의 예방 또는 치료용 약학 조성물
PCT/KR2011/010340 WO2013042833A1 (ko) 2011-09-23 2011-12-29 재조합 아데노바이러스 벡터를 이용한 Ｐｒｎｐ 유전자를 유효성분으로 함유하는 프리온 질병의 예방 또는 치료용 약학 조성물

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020110096542A KR101351587B1 (ko) 2011-09-23 2011-09-23 재조합 아데노바이러스 벡터를 이용한 Ｐｒｎｐ 유전자를 유효성분으로 함유하는 프리온 질병의 예방 또는 치료용 약학 조성물

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20130032758A KR20130032758A (ko) 2013-04-02
KR101351587B1 true KR101351587B1 (ko) 2014-01-16

Family

ID=47914574

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020110096542A KR101351587B1 (ko) 2011-09-23 2011-09-23 재조합 아데노바이러스 벡터를 이용한 Ｐｒｎｐ 유전자를 유효성분으로 함유하는 프리온 질병의 예방 또는 치료용 약학 조성물

Country Status (2)

Country Link
KR (1) KR101351587B1 (ko)
WO (1) WO2013042833A1 (ko)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102050296B1 (ko) * 2018-05-04 2019-12-02 (주)지뉴인텍 유전자 전달용 재조합 벡터 및 이를 이용한 퇴행성 뇌질환 예방 또는 치료용 조성물

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101207213B1 (ko) * 2009-11-25 2012-12-13 대한민국 전염성해면상뇌증 감수성 세포의 제조방법 및 전염성해면상뇌증 지속감염세포

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Woei-Cherng Shyu et al., Journal of neuroscience, Vol. 25(39): pages 8967-8977 (2005.9.28. 공개) *

Also Published As

Publication number Publication date
WO2013042833A1 (ko) 2013-03-28
KR20130032758A (ko) 2013-04-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Kurtishi et al. Cellular proteostasis in neurodegeneration
Sharma et al. The senolytic drug navitoclax (ABT-263) causes trabecular bone loss and impaired osteoprogenitor function in aged mice
Hu et al. Peroxiredoxin-2 protects against 6-hydroxydopamine-induced dopaminergic neurodegeneration via attenuation of the apoptosis signal-regulating kinase (ASK1) signaling cascade
Ciechanover et al. Protein quality control by molecular chaperones in neurodegeneration
Perier et al. Mitochondrial biology and Parkinson's disease
May et al. Inner ear supporting cells protect hair cells by secreting HSP70
Salganik et al. The loss of glucose-regulated protein 78 (GRP78) during normal aging or from siRNA knockdown augments human alpha-synuclein (α-syn) toxicity to rat nigral neurons
Jin et al. Neuroprotective effects of PPAR‐γ agonist rosiglitazone in N171‐82Q mouse model of Huntington's disease
Roy et al. Villin-1 and gelsolin regulate changes in actin dynamics that affect cell survival signaling pathways and intestinal inflammation
Ma et al. Transcription Factor EB activation rescues advanced αB‐crystallin mutation‐induced cardiomyopathy by normalizing desmin localization
Wang et al. Declines in Drp1 and parkin expression underlie DNA damage-induced changes in mitochondrial length and neuronal death
Wang et al. Neuroinflammation in Alzheimer’s disease: microglia, molecular participants and therapeutic choices
US20100119525A1 (en) Method for extending longevity using npc1l1 antagonists
Landeck et al. Toxic effects of human and rodent variants of alpha‐synuclein in vivo
Sun et al. Overexpression of Rcan1-1L inhibits hypoxia-induced cell apoptosis through induction of mitophagy
Skinner et al. Treatment of prion disease with heterologous prion proteins
Tran et al. The voltage‐gated calcium channel blocker lomerizine is neuroprotective in motor neurons expressing mutant SOD 1, but not TDP‐43
de la Fuente et al. Calpain inhibition increases SMN protein in spinal cord motoneurons and ameliorates the spinal muscular atrophy phenotype in mice
Liu et al. A novel human S10F‐Hsp20 mutation induces lethal peripartum cardiomyopathy
Zhu et al. Effects of thymosin β4 on wound healing of rat palatal mucosa
Maor et al. α-Synuclein Promotes Neuronal Dysfunction and Death by Disrupting the Binding of Ankyrin to β-Spectrin
KR101351587B1 (ko) 재조합 아데노바이러스 벡터를 이용한 Ｐｒｎｐ 유전자를 유효성분으로 함유하는 프리온 질병의 예방 또는 치료용 약학 조성물
Qi et al. Dexmedetomidine suppresses oxidative stress and inflammation of nucleus pulposus cells by activating the PI3K/Akt signaling pathway
Chen et al. Pterostilbene prevents tunicamycin-induced intestinal barrier damage by targeting endoplasmic reticulum stress, oxidative stress, autophagy, and gut microbiota
Tiwari et al. UBA52 attunes VDAC1-mediated mitochondrial dysfunction and dopaminergic neuronal death

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20161229

Year of fee payment: 4

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20171220

Year of fee payment: 5

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20181226

Year of fee payment: 6