KR101192923B1

KR101192923B1 - 각화 이상 피부질환의 진단방법

Info

Publication number: KR101192923B1
Application number: KR1020120098405A
Authority: KR
Inventors: 김수정; 황재성; 이증훈; 김창덕
Original assignee: (주)아모레퍼시픽
Priority date: 2012-09-05
Filing date: 2012-09-05
Publication date: 2012-10-18
Also published as: KR20120103537A

Abstract

본 발명은 각화 이상 피부질환의 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법에 관한 것으로서, 구체적으로는, 각질형성세포 분화에 따라 발현 패턴이 변화되는 유전자를 확인하여 그 정보를 표피 분화 이상의 진단에 사용하기 위하여, 상기 유전자 서열의 폴리뉴클레오티드와 혼성화하는 프로브로서 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드; 상기 유전자 서열의 폴리뉴클레오티드의 프라이머 쌍; 또는 상기 유전자에 의하여 코딩되는 폴리펩티드에 대한 하나 이상의 모노클로날 항체를 포함하는 각화 이상 피부질환의 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따르면 각질형성세포 분화 과정에 따라 발현이 증가되는 76종의 유전자 및 발현이 감소되는 92종의 유전자, 이들 유전자의 프로모터 영역에 존재하는 전사인자 결합 부위로부터 생물정보학 기술을 이용해 추출한 전사 조절인자 31종을 각화 이상 피부질환의 진단 마커 유전자로 이용하여 각화 이상 피부질환을 빠르게 진단할 수 있다. 또한 이들 유전자를 각화 이상 피부 질환 치료제를 개발하는 유전자 타겟으로 활용하고, 개발된 각화 이상 피부 질환 치료제를 평가하는 방법으로 활용할 수 있다.

Description

각화 이상 피부질환의 진단방법 {Method for diagnosis of abnormal keratinization}

본 발명은 각화 이상 피부질환의 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법에 관한 것으로서, 구체적으로는, 각질형성세포 분화에 따라 발현 패턴이 변화되는 유전자를 확인하여 그 정보를 표피 분화 이상의 진단에 사용하기 위하여, 상기 유전자 서열의 폴리뉴클레오티드와 혼성화하는 프로브로서 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드; 상기 유전자 서열의 폴리뉴클레오티드의 프라이머 쌍; 또는 상기 유전자에 의하여 코딩되는 폴리펩티드에 대한 하나 이상의 모노클로날 항체를 포함하는 각화 이상 피부질환의 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다.

사람의 전 표면을 덮고 있는 표피는 인체의 최 외곽에 위치하여 외부로부터의 세균의 침입, 견인력, 장력 및 기계적 자극을 차단하여 사람 신체를 보호한다. 또한 체액 증발을 막는 역할을 통해 인체의 항상성을 유지해 준다. 이런 기능은 주로 표피를 구성하는 각질형성세포가 여러 단계의 분화 과정을 거쳐서 최종적으로 핵이 없으며, 아주 단단하고, 침투가 어려운 각질세포를 형성하여 이루어진다. 특히 각질세포에는 수분을 유지하는 자연 보습제 (natural moisturizing factor, NMF)로 인해 다량의 수분이 함유되어 있어 피부의 탄력성과 장벽 기능을 수행하는데 결정적 역할을 담당한다. NMF는 여러 종류의 아미노산, 유기물, 요소 및 비유기물산 등으로 구성되어 있지만 그 구성 성분이 모두 밝혀진 것은 아니고, 어떤 성분이 더욱 효과적으로 수분을 유지하는지에 대해서도 분명하게 밝혀지지 않았다. NMF의 구성성분들은 각질형성세포가 분화하는 과정에서 형성되는 것이며, 각질형성세포의 분화 기전에 이상이 생길 경우 건선, 아토피 등과 같은 난치성 피부질환을 유발하게 된다.

종래에는 이러한 피부질환의 치료나 예방에 있어서 메토트렉세이트 (methotrexate) 등과 같은 항암제, 사이클로스포린 에이 (cyclosporine A) 등과 같은 면역억제제, 프레드니소론 (prednisolone) 등과 같은 스테로이드 제제, 또는 세라마이드 (ceramide), 글리세롤 (glycerol), 천연보습제 등을 함유한 로션이나 크림 등이 사용 되어 왔으나, 간독성이나 신장독성 또는 피부 아트로피(atrophy) 등과 같은 부작용의 문제가 있거나 작용 기전에 대한 명확한 실험적 증거에 기반하지 않은 대중 치료 요법으로 사용 되고 있는 실정이다.

한편, 현재까지 각질형성세포 분화에 대한 기전이 명확히 밝혀져 있지 않으나, 각질형성세포의 분화 과정은 시, 공간적으로 수많은 유전자가 정교하게 발현 조절 되며 복합적인 유전자 상호작용에 의해 나타나는 현상으로 생각되고 있다. 현재 구미의 선진 연구 기관 및 대학 연구 기관 등에서 각질형성세포 분화에 관여하는 유전자의 동정 및 기능, 그리고 이를 이용한 각질형성세포 이상 관련 피부질환의 치료 및 예방 방법에 대한 연구가 폭 넓게 진행되고는 있으나, 아직 피부각질형성세포 분화에 관여하는 모든 유전자의 프로파일이 확립되어 있지는 않다.

현재까지, 피부조직으로부터 각질형성세포를 분리하고 이를 시험관에서 배양하면서 칼슘을 처리할 경우 각질형성세포 분화가 생체 내(in vivo) 상황과 유사하게 유도됨이 알려져 있다 (Hennings et al. (1980) Cell 19:245-254, Yuspa et al. (1989) J. Cell Biol. 109:1207-1217). 즉, 각질형성세포를 0.03 mM 이하의 칼슘 농도에서 배양하면 기저막에 부착되어 있는 기저층 각질형성세포(keratinocytes in basal layer)와 형태적으로 유사하게 자라며 왕성히 분열이 유도 된다. 또한, 세포배양 배지에 칼슘의 농도를 0.1 mM 이상으로 올려주면 유극층 (spinous layer) 또는 과립층 (granular layer)에 존재하는 각질형성세포와 형태적, 기능적으로 유사한 각질형성세포로 분화가 일어나게 된다.

최근에는 세포 내 mRNA를 이용하여 유전자 발현의 차이를 알아내는 기법이 이용되고 있으며, 이는 각질형성세포의 분화 과정에서 발현에 차이를 나타내는 유전자를 동정하기 위한 기초적 실험법으로 사용될 수 있다. 이 중 cDNA 마이크로어레이 (microarray) 기법은 한 번의 실험으로 세포 내에서 수백 또는 수천 개의 유전자 발현 변화를 동시에 관찰할 수 있는 방법으로서, 현재 다양한 종류의 DNA 마이크로어레이 또는 cDNA 마이크로어레이 등이 여러 용도로 개발되어 널리 사용되며, 임상적으로는 암 등 질병의 진단, 약제 개발, 약독성 실험, 또는 세포에 화학적 또는 물리적 처치 후 세포 내 유전자 발현의 변화를 확인하는데 사용되고 있다. 또한 2차원적 전기영동장치 (two dimensional electrophoresis) 기법에 의해 새롭게 발현되는 단백질을 정제, 분리하여 아미노산 서열을 알아낼 수 있는데, 이 결과를 DNA 마이크로어레이, cDNA 라이브러리(library) 및 생물정보학 (bioinformatics) 에서 얻은 정보와 비교함으로써 원하는 새로운 유전자를 찾을 수 있다.

Hennings et al. (1980) Cell 19:245-254

이에 본 발명자는 각질형성세포의 분화 과정 중 발현에 변화를 보이는 유전자를 cDNA 마이크로어레이 기법으로 동정하여 이를 각화 이상 피부질환 진단 마커로 사용할 수 있다는 사실을 밝혀내었다. 따라서 본 발명은 각질형성세포 분화 과정 중 발현에 변화를 보이는 유전자를 찾아내어, 이를 이용하여 각질형성세포 이상을 판단하는 진단마커 및 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다. 또한 본 발명은 상기 동정된 유전자의 프로모터 염기 서열을 생물정보학 기술을 이용하여 분석함으로써 분화 과정을 조절하는 전사인자를 규명하여, 상기 전사 인자 유전자를 이용하여 알려진 약물 또는 새로 개발된 약물이 각질형성세포 이상에 대한 효과를 나타내는지를 판정하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 각질형성세포 이상 분화 방지제를스크리닝하는 방법으로서,

(a) Nrf-2 유전자 및 유니버설(universal) 프로모터를 포함하는 플라스미드, 및 상기 유전자에 의해 코딩되는 전사인자가 결합하는 DNA 서열 및 리포터 유전자를 포함하는 플라스미드를 세포에 트랜스펙션시키는 단계;

(b) 상기 세포에 시험 화합물을 처리하는 단계; 및

(c) 상기 시험 화합물이 상기 리포터 유전자의 발현을 촉진하는지 여부를 확인하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 각질형성세포 이상 분화 방지제 스크리닝 방법을 제공한다.

본 발명에 따르면 각질형성세포 분화 과정에 따라 발현이 증가되는 76종의 유전자 및 발현이 감소되는 92종의 유전자, 이들 유전자의 프로모터 영역에 존재하는 전사인자 결합 부위로부터 생물정보학 기술을 이용해 추출한 전사 조절인자 31종을 피부 각화의 진단 마커 유전자로 이용하여 각화 이상 피부질환을 빠르게 진단하고 각질형성세포 이상 분화 방지제를 스크리닝할 수 있다. 또한 이들 유전자를 각화 이상 피부 질환 치료제를 개발하는 유전자 타겟으로 활용하고, 개발된 각화 이상 피부 질환 치료제를 평가하는 방법으로 활용할 수 있다.

도 1은 칼슘에 의한 각질형성세포분화 과정에서의 유전자 발현 패턴을 알아보기 위하여 수행한 마이크로어레이에서의 혼성화 반응 결과를 나타내는 사진이다.
도 2는 각질형성세포의 분화 과정 중 발현이 감소하는 유전자의 시간 경과에 따른 유전자 발현 패턴을 나타내는 그래프이다.
도 3은 각질형성세포의 분화 과정 중 발현이 증가하는 유전자의 시간 경과에 따른 유전자 발현 패턴을 나타내는 그래프이다.
도 4는 각질형성세포의 분화 과정 중 발현이 감소하는 유전자와 그 프로모터에 과다 관찰되는 전사인자와의 상관 관계 매트릭스(도 4a) 및 네트워크(도 4b)를 도시한 것이다.
도 5는 각질형성세포의 분화 과정 중 발현이 증가하는 유전자와 그 프로모터에 과다 관찰되는 전사인자와의 상관 관계 매트릭스(도 5a) 및 네트워크(도 5b)를 도시한 것이다.
도 6은 각질형성세포의 분화 과정에서 발현 변화를 나타내는 유전자를 조절하는 전사 인자의 유전자 발현 패턴을 확인하기 위해서 수행한 RT-PCR 결과를 나타내는 사진이다.
도 7은 각질형성세포 분화 과정 동안 발현이 증가하는 것으로 밝혀진 HSPB1 (HSP27) 유전자의 발현 변화를 검증한 결과로서, (7a) 칼슘에 따른HSPB1 mRNA의 발현 변화, (7b) 정상 표피에서의 HSPB1 (1-a)및 인과 화합된(phosphorated) HSPB1 (1-b)단백질의 발현 양상, (7c) 여러 피부 질환에서의 HSPB1 (1-a)및 phosphorated HSPB1 (1-b) 단백질의 발현 양상을 나타내는 그래프 및 사진이다.
도 8은 각질형성세포 분화 과정 동안 발현이 증가하는 것으로 밝혀진 SOX9 유전자의 발현 변화를 검증한 결과로서, 정상 모낭, 정상 피부, 건선, 아토피 피부염, 기저세포암 및 극세포암 환자의 피부에서 관찰되는 발현 변화를 나타내는 사진이다.
도 9는 각질형성세포의 분화 과정 중에 발현의 변화를 보이는 유전자들의 발현 조절을 담당하는 전사조절 인자인 (9a) Nrf-2, (9b) PAX-6, (9c) Nkx2.5가 정상 피부, 건선 및 아토피 피부염 환자의 피부에서 발현되는 양상을 나타내는 사진이다.

이하 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다.

피부의 각질형성세포는 피부장벽 기능을 획득하기 위해 기저막으로부터 상층부로 이동하면서 각질형성세포 분화과정을 거친다. 본 발명자들은 그 과정에서 나타나는 유전자 발현 변화를 관찰한 결과, 분화과정에서 발현이 증가되는 76종의 유전자 및 발현이 감소되는 92종의 유전자, 이들 유전자의 프로모터 영역에 존재하는 전사인자 결합 부위로부터 생물정보학 기술을 이용해 추출한 전사 조절인자 31종을 찾아내었다. 상기 찾아낸 유전자 중 각질형성세포와 관련이 있는 것으로 아직 밝혀지지 않은 유전자 및 발현 정보가 없는 유전자의 경우, 5'RACE와 3'RACE 또는 cDNA 라이브러리 스크리닝 (library screening)을 통해 각 유전자의 전장 cDNA의 서열을 확인할 수 있다.

본 발명은 상기 유전자를 각화 이상 피부질환의 진단 마커 유전자로 이용하여, 각화 이상 피부질환을 빠르게 진단할 수 있는 진단 방법을 제공하고자 한다.

본 발명의 진단 키트에서 프로브로 사용되는 폴리뉴클레오티드는 발현이 증가하거나 감소하는 분화 마커 유전자의 전장(full length) 또는 그의 단편을 포함한다. 단편의 길이는 10개 이상의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 것이 바람직한데, 이는 프로브의 길이가 10bps이하이면 비특이적으로 결합되기 때문이다.

본 발명의 진단 키트에서 프라이머로 사용되는 폴리뉴클레오티드는 그 길이가 18-22개인 것이 바람직하다. 이는 프라이머의 길이가 18bps미만이면 비특이적으로 결합되고, 22bps를 초과하면 프라이머끼리 자체 결합하여 효율성이 떨어지며, 제작시에도 비용과 기술적인 면에서 비생산적이기 때문이다.

본 발명의 진단 키트에 포함된, 분화 마커 유전자에 의하여 코딩되는 폴리펩티드에 대한 모노클로날 항체는 일반적인 모노클로날 항체 제조방법으로 제조된다.

또한 상기 발현 패턴이 변화하는 유전자들의 프로모터에서 과다 관찰되는 전사인자 결합 부위로부터 생물정보학 기술을 이용해 추출한 전사인자인 Nrf-2, Nkx-2.5, AP-1, MEIS1A/HOXA9, MEIS1B/HOXA9, CREB, ISRE-BP, Hand1/E47, Pax-6, c-Myb, v-Maf, Elk-1, E47, CRE-BP1, IRF-1, IRF-2, c-Rel, c-Ets-1(p54), USF, VBP, Hox-1.3, Brn-2, COMP1-factor, CDP_CR1, CP2 또는 NF-kB (p50) 의 활성을 측정하여 각질형성세포 이상 분화 방지제를 스크리닝하는 리포터 유전자 분석(assay)법은 일반적인 분자생물학 기법에 의해 제조된 리포터 유전자 벡터를 이용한다. 구체적으로는 일반적인 배양 조건에서도 발현되는 유니버설(universal) 프로모터에 Nrf-2, Nkx-2.5, AP-1, MEIS1A/HOXA9, MEIS1B/HOXA9, CREB, ISRE-BP, Hand1/E47, Pax-6, c-Myb, v-Maf, Elk-1, E47, CRE-BP1, IRF-1, IRF-2, c-Rel, c-Ets-1(p54), USF, VBP, Hox-1.3, Brn-2, COMP1-factor, CDP_CR1, CP2 또는 NF-kB (p50) 유전자가 결합된 플라스미드(플라스미드 1), 및 상기 전사인자들이 결합하여 전사를 활성화시킬 수 있는 DNA 서열인 TRE (Transcription Response Element)를 가지는 프로모터에 리포터 역할을 하는 반딧불(firefly) 루시퍼라제(luciferase) 유전자가 결합된 플라스미드(플라스미드 2)를 사용한다. 플라스미드 2의 TRE 부분은, MatInspector (Quandt et al., 1995) 및 Transfac (Knuppel et al., 1994)과 같은, 모티프(motif)를 예측, 발견, 분석하는프로그램에 대상 유전자들의 accession ID를 입력하여 TRE 서열을 검색한 후 검색된 서열에 따라 올리고뉴클레오타이드 합성법으로 합성하여 준비한다. 플라스미드 1의 전사인자 유전자 부분은, 미국 NCBI 데이터베이스에 저장된 cDNA 서열을 참고하여, 인간 cDNA 라이브러리로부터 PCR 기법으로 증폭하여 준비한다. COS7 세포에 상기 전사인자 유전자를 지닌 플라스미드 1과 해당 TRE 프로모터-리포터 플라스미드 2를 동시에 트랜스펙션시킨 후 24시간 경과 시점에 각질형성세포 이상 분화 방지제 후보 약물을 처리하고 세포를 수확하여 루시퍼라제 활성을 측정하면, 각질형성세포 이상 분화 방지제 후보 약물이 상기 전사인자의 활성에 미치는 영향을 확인할 수 있다.

이하 본 발명을 하기 실시예에 의거하여 더욱 상세하게 설명하는 바, 이들 실시예로 본 발명의 기술적 범위가 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1. 피부 각질형성세포로부터 총 RNA 분리>

사람의 피부조직을 0.1% 디스페이즈 (dispase, GIBCO) 용액에 침적 시키고 4℃ 에서 12-16 시간 정도 처리한 후 표피와 진피를 미세한 핀셋을 이용하여 분리 하였다. 표피 층 만을 회수 하여 0.2% 트립신 (trypsin, GIBCO) 용액에 침적하여 5분간 처리한 후 피페팅 (pipetting)을 이용하여 단일세포로 분리하였다. 이를 5분간 1,500 rpm에서 원심분리하고 상청액을 제거한 후 각질형성세포 배양배지(keratinocyte growth medium, GIBCO)를 이용하여 부유시킨 후 배양접시에 접종하였다. 칼슘을 최종농도 1.2 mM이 되도록 처리하고 시간 별로 세포를 회수한 후 Easy blue (Intron) 용액을 이용하여 총RNA를 분리 하였다.

< 실시예2 . cDNA 마이크로어레이를 이용한 각질형성세포 분화 관련 유전자의 동정>

본 발명에서는 Genomic tree 사의 2.7 K cDNA마이크로어레이를 사용하였다. 우선, 100 μg의 상기 총RNA를 Cy3및 Cy5 형광물질 존재 하에서 역전사 하는데, GIBCO사에서 구매한Superscript cDNA system을 이용하였다. 총 RNA 로는 각질형성세포 분화를 시간경과에 따라 분석하기 위하여 칼슘 미처리군 (0일), 칼슘처리 후 1일, 3일, 7일, 14일에 회수한 총RNA를 사용 하였다. 대조군으로 0일차의 총RNA는 Cy3(초록색) 형광물질 하에서 역전사하여 프로브를 만들었으며, 각각 1일, 3일, 7일, 14일차에 추출한 총RNA는 Cy5(빨간색) 형광물질 하에서 역전사 하여 프로브를 만들었다.

그 후, 유전자 차등발현을 확인하기 위하여 혼성화를 수행하였으며, 이때 동량의 Cy3 및Cy5로 표지된 상기 역전사 반응물(프로브)에 40 μl의 혼성화 (hybridization) 용액 (5×SSC 0.1% SDS 20 μg 의 Cot-1 DNA (Gibco BRL, Rockville, MD) 20 μg 의 poly A RNA (Promega, Madison, WI) 20 μg 의 이스트 tRNA (Gibco BRL, Rockville, MD))을 첨가하여 녹인 후 95℃에서 3분간 반응시켜 이중가닥 DNA를 단일가닥으로 분리하고 마이크로어레이 슬라이드 위에서 혼성화 반응을 수행하였다. 혼성화 조건은 42℃에서 16시간 수행하였으며, 반응 후 슬라이드를 0.1% SSC, 0.1% SDS로 3회 세척하고, 최종적으로 증류수로 1회 더 세척 후 건조시키고 데이터 분석을 위해 스캐닝을 실시하였다. 재현성 평가 및 더욱 정확한 각질형성세포분화 관련 유전자의 동정을 위하여 실험은 각기 다른 배치 (batch)의 각질형성세포를 사용하여 3회 반복 하였다.

< 실시예 3. 각질형성세포 분화관련 유전자의 발현양상 분석>

상기 마이크로어레이에서의 혼성화 반응 결과는 도 1에 나타나 있다. 상기 마이크로어레이 결과 데이터를 GenePix 4000B (Axon) 스캐너로 스캐닝하고 GenePix pro 3.0 software (Axon)을 이용하여 분석하였는데, 혼성화 시그날이 50 이하로 나온 실험군은 데이터 분석 전에 모두 제거 하였다. 그리고 각각의 혼성화 스폿 (hybridization spot)에 대하여 백그라운드 값을 빼고 global median normalization 방법 (Yang et al, Nucleic Acids Res 2002;30:e15)으로 평준화 하였다. Cy5와 Cy3 사이의 강도 비율에 따라 유전자 발현값(gene expression value, GEV)을 할당하였고 유전자 발현의 증감은 폴드비 (fold ratio)로 표시하였다. 통계 결과 유의미한 발현 변화를 보인 199 개 유전자를 대상으로 히어라키알 클러스터링 (hierachial clustering)을 수행하고, 이러한 분석 결과, 총 4개의 시간 포인트 (1일, 3일, 7일, 14일) 중 한 번의 시간 포인트에서라도 유전자 발현 변화가 2배 이상 증가 또는 감소하는 유전자를 선별하였으며, 동정된 각질형성세포분화 관련 유전자의 시간경과에 따른 발현 변화를 도 2 및 도 3에 나타내었다. 하기 표 1 에는 각질형성세포의 분화 과정 동안 발현이 감소하는 유전자 리스트, 표 2에는 각질형성세포의 분화 과정 동안 발현이 증가하는 유전자 리스트를 나타내었다. GBAcc는 NCBI의 genebank accession ID를 의미하고, symbol은 공식 유전자 심볼을 의미한다.

GBAcc	Symbol	유전자 이름
AA449107	SEC24D	SEC24 related gene family, member D (S. cerevisiae)
R56096	WASF1	WAS protein family, member 1
AA459109	MTFR1	Mitochondrial fission regulator 1
R68805	STT3A	STT3, subunit of the oligosaccharyltransferase complex, homolog A (S. cerevisiae)
AA284072	CDKN3	Cyclin-dependent kinase inhibitor 3 (CDK2-associated dual specificity phosphatase)
W58368	EIF2B3	Eukaryotic translation initiation factor 2B, subunit 3 gamma, 58kDa
AA476461	PTPRZ1	Protein tyrosine phosphatase, receptor-type, Z polypeptide 1
AA875957	TRIM37	Tripartite motif-containing 37
W72437	GTF2H2	General transcription factor IIH, polypeptide 2, 44kDa
AA016254	ATM	Ataxia telangiectasia mutated (includes complementation groups A, C and D)
AI214697	FST	Follistatin
AA701860	FST	Follistatin
AW058594	G3BP2	GTPase activating protein (SH3 domain) binding protein 2
AA291773	TETRAN	Tetracycline transporter-like protein
AI769827	MDFIC	MyoD family inhibitor domain containing
AA962236	ALG14	Asparagine-linked glycosylation 14 homolog (S. cerevisiae)
AW005693	RPS7	Ribosomal protein S7
AW005795	OLFM1	Olfactomedin 1
AA598676	RCN2	Reticulocalbin 2, EF-hand calcium binding domain
AI002566	IGSF3	Immunoglobulin superfamily, member 3
T55714	HS3ST1	Heparan sulfate (glucosamine) 3-O-sulfotransferase 1
N74700	ERLIN1	ER lipid raft associated 1
AA936768	IL1A	Interleukin 1, alpha
R51912	SST	Somatostatin
AA455925	FHL1	Four and a half LIM domains 1
AA644211	PTGS2	Prostaglandin-endoperoxide synthase 2 (prostaglandin G/H synthase and cyclooxygenase)
AA865590	BCAT1	Branched chain aminotransferase 1, cytosolic
AA504844	DNAJC10	DnaJ (Hsp40) homolog, subfamily C, member 10
AI140997	IBTK	Inhibitor of Bruton agammaglobulinemia tyrosine kinase
AA461467	ODC1	Ornithine decarboxylase 1
AA974112	OR7E38P	Olfactory receptor, family 7, subfamily E, member 38 pseudogene
AA708446	TIMM17A	Translocase of inner mitochondrial membrane 17 homolog A (yeast)
N67702	PLDN	Pallidin homolog (mouse)
AA448001	TBPL1	TBP-like 1
AI651080	PFAS	Phosphoribosylformylglycinamidine synthase (FGAR amidotransferase)
AI580306	TTTY15	Testis-specific transcript, Y-linked 15
AI273738	FAM91A1	Family with sequence similarity 91, member A1
AA133577	SNRPG	Small nuclear ribonucleoprotein polypeptide G
AA521249	SNRPB2	Small nuclear ribonucleoprotein polypeptide B''
AA488433	SLMO2	Slowmo homolog 2 (Drosophila)
AA027992	SCFD1	Sec1 family domain containing 1
AI261566	ATP11C	ATPase, Class VI, type 11C
R52654	CYCS	Cytochrome c, somatic
AA412053	CD9	CD9 molecule
AA459292	CKS1B	CDC28 protein kinase regulatory subunit 1B
AA004759	DPM1	Dolichyl-phosphate mannosyltransferase polypeptide 1, catalytic subunit
AA133191	UQCRQ	Ubiquinol-cytochrome c reductase, complex III subunit VII, 9.5kDa
N69466	CPSF2	Cleavage and polyadenylation specific factor 2, 100kDa
AI299601	RNF41	Ring finger protein 41
AA878635	PDE4D	Phosphodiesterase 4D, cAMP-specific (phosphodiesterase E3 dunce homolog, Drosophila)
AA158396	HLA-DOB	Major histocompatibility complex, class II, DO beta
AA398116	CSNK1G3	Casein kinase 1, gamma 3
AA902494	LYSMD3	LysM, putative peptidoglycan-binding, domain containing 3
AA055350	ADORA2B	Adenosine A2b receptor
AA450360	SSR1	Signal sequence receptor, alpha (translocon-associated protein alpha)
AI887515	GALK2	Galactokinase 2
AA460838	GTF2H3	General transcription factor IIH, polypeptide 3, 34kDa
R40324	ZNF410	Zinc finger protein 410
H17927	TXNL2	Thioredoxin-like 2
AA287318	NUS1	Nuclear undecaprenyl pyrophosphate synthase 1 homolog (S. cerevisiae)
AA282537	MEF2B	Myocyte enhancer factor 2B
AA005219	GPD2	Glycerol-3-phosphate dehydrogenase 2 (mitochondrial)
AI299421	AMMECR1L	AMME chromosomal region gene 1-like
AA630794	SLC3A2	Solute carrier family 3 (activators of dibasic and neutral amino acid transport), member 2
AI652019	MAD2L2	MAD2 mitotic arrest deficient-like 2 (yeast)
AA858059	MGAT1	Mannosyl (alpha-1,3-)-glycoprotein beta-1,2-N-acetylglucosaminyltransferase
AA700688	ATP5E	ATP synthase, H+ transporting, mitochondrial F1 complex, epsilon subunit
AA253413	FXN	Frataxin
AA063580	TAF7	TAF7 RNA polymerase II, TATA box binding protein (TBP)-associated factor, 55kDa
AA448685	DCK	Deoxycytidine kinase
AA489785	NCOA1	Nuclear receptor coactivator 1
AA678308	AKAP8L	A kinase (PRKA) anchor protein 8-like
AA700811	CA14	Carbonic anhydrase XIV
AA490614	CRSP8	Cofactor required for Sp1 transcriptional activation, subunit 8, 34kDa
AI004316	C7orf30	Chromosome 7 open reading frame 30
AA863470	FAM126A	Family with sequence similarity 126, member A
AA634360	SEC23B	Sec23 homolog B (S. cerevisiae)
W35203	CTBS	Chitobiase, di-N-acetyl-
AI241210	BBS12	Bardet-Biedl syndrome 12
AA055504	TRIM32	Tripartite motif-containing 32
AI380028	SCFD1	Sec1 family domain containing 1
AA504128	RAE1	RAE1 RNA export 1 homolog (S. pombe)
AA489629	PBEF1	Pre-B-cell colony enhancing factor 1
AA190825	TNFAIP8	Tumor necrosis factor, alpha-induced protein 8
AA465533	C10orf104	Chromosome 10 open reading frame 104
AA490971	PPP2R1B	Protein phosphatase 2 (formerly 2A), regulatory subunit A, beta isoform
AA455970	RNF139	Ring finger protein 139
AA598874	PRDX6	Peroxiredoxin 6
AA948055	CBX5	Chromobox homolog 5 (HP1 alpha homolog, Drosophila)
H17612	ARG2	Arginase, type II
W81371	HOXD8	Homeobox D8
AA478298	C10orf116	Chromosome 10 open reading frame 116

GBAcc	Symbol	유전자 이름
AI001010	ADAMTS7	ADAM metallopeptidase with thrombospondin type 1 motif, 7
AA663102	AHCYL1	S-adenosylhomocysteine hydrolase-like 1
AI858088	ALOX15B	Arachidonate 15-lipoxygenase, type B
AI474406	ALOX15B	Arachidonate 15-lipoxygenase, type B
AA968829	ANKHD1	Ankyrin repeat and KH domain containing 1
AA490209	ARPC1A	Actin related protein 2/3 complex, subunit 1A, 41kDa
AI368479	ATP8B1	ATPase, Class I, type 8B, member 1
AI371684	BAG3	BCL2-associated athanogene 3
AI358915	C22orf25	Chromosome 22 open reading frame 25
AA280846	CBR1	Carbonyl reductase 1
T54121	CCNE1	Cyclin E1
AI828088	CDKN1C	Cyclin-dependent kinase inhibitor 1C (p57, Kip2)
H39187	CELSR2	Cadherin, EGF LAG seven-pass G-type receptor 2 (flamingo homolog, Drosophila)
AA459010	CEPT1	Choline/ethanolamine phosphotransferase 1
AI937385	CLN3	Ceroid-lipofuscinosis, neuronal 3, juvenile (Batten, Spielmeyer-Vogt disease)
N71160	COX6B1	Cytochrome c oxidase subunit Vib polypeptide 1 (ubiquitous)
AA872391	COX6B1	Cytochrome c oxidase subunit Vib polypeptide 1 (ubiquitous)
T71991	CREG1	Cellular repressor of E1A-stimulated genes 1
W72207	CSTA	Cystatin A (stefin A)
H22919	CSTB	Cystatin B (stefin B)
AA873089	CYP3A5	Cytochrome P450, family 3, subfamily A, polypeptide 5
H93121	DDX24	DEAD (Asp-Glu-Ala-Asp) box polypeptide 24
AA190339	DUSP3	Dual specificity phosphatase 3 (vaccinia virus phosphatase VH1-related)
N79484	ECM1	Extracellular matrix protein 1
N47717	FABP5	Fatty acid binding protein 5 (psoriasis-associated)
H10939	FAT2	FAT tumor suppressor homolog 2 (Drosophila)
AA069372	FOXD1	Forkhead box D1
AA291163	GLRX	Glutaredoxin (thioltransferase)
AW075163	GRN	Granulin
H72028	GSN	Gelsolin (amyloidosis, Finnish type)
AA454563	HCFC1R1	Host cell factor C1 regulator 1 (XPO1 dependent)
AA017043	HTATIP	HIV-1 Tat interacting protein, 60kDa
AA482119	ID3	Inhibitor of DNA binding 3, dominant negative helix-loop-helix protein
AA043343	IRF6	Interferon regulatory factor 6
AA035637	JUP	Junction plakoglobin
H27912	KDELR1	KDEL (Lys-Asp-Glu-Leu) endoplasmic reticulum protein retention receptor 1
AA459401	KLK10	Kallikrein-related peptidase 10
W73140	KLK5	Kallikrein-related peptidase 5
AI139437	KLK7	Kallikrein-related peptidase 7
AI963941	KLK8	Kallikrein-related peptidase 8
AA400973	LCN2	Lipocalin 2 (oncogene 24p3)
AA927761	LOC128977	Hypothetical protein LOC128977
AI359037	LOC728641	Similar to Fatty acid-binding protein, epidermal (E-FABP) (Psoriasis-associated fatty acid-binding protein homolog) (PA-FABP)
AW008721	LOH11CR2A	Loss of heterozygosity, 11, chromosomal region 2, gene A
AA402447	MAP3K4	Mitogen-activated protein kinase kinase kinase 4
AA669451	MKRN1	Makorin, ring finger protein, 1
AA487434	MMD	Monocyte to macrophage differentiation-associated
H23197	MOBP	Myelin-associated oligodendrocyte basic protein
H40681	MYD88	Myeloid differentiation primary response gene (88)
AA401883	NEU1	Sialidase 1 (lysosomal sialidase)
AI369277	PARD3	Par-3 partitioning defective 3 homolog (C. elegans)
AI582329	PI3	Peptidase inhibitor 3, skin-derived (SKALP)
AA699876	PIK3C2B	Phosphoinositide-3-kinase, class 2, beta polypeptide
R55490	PLCD1	Phospholipase C, delta 1
AA679414	PRPF8	PRP8 pre-mRNA processing factor 8 homolog (S. cerevisiae)
AA424782	PSD4	Pleckstrin and Sec7 domain containing 4
AI420820	RAB11FIP1	RAB11 family interacting protein 1 (class I)
R06712	RAB5B	RAB5B, member RAS oncogene family
AI371743	RAI16	Retinoic acid induced 16
AI927131	SEMG1	Semenogelin I
AA989257	SH3KBP1	SH3-domain kinase binding protein 1
AI970057	SLPI	Secretory leukocyte peptidase inhibitor
AI418200	SMAP1L	Stromal membrane-associated protein 1-like
AA481026	SMARCA2	SWI/SNF related, matrix associated, actin dependent regulator of chromatin, subfamily a, member 2
AI923984	SPRR1A	Small proline-rich protein 1A
AA053886	SREBF2	Sterol regulatory element binding transcription factor 2
AI628353	TBC1D9	TBC1 domain family, member 9 (with GRAM domain)
AI652954	TGM1	Transglutaminase 1 (K polypeptide epidermal type I, protein-glutamine-gamma-glutamyltransferase)
AW005791	TIMP2	TIMP metallopeptidase inhibitor 2
AA917374	TIMP2	TIMP metallopeptidase inhibitor 2
AA455505	ULK1	Unc-51-like kinase 1 (C. elegans)
T71990	WBP2	WW domain binding protein 2
AI277125	WRN	Werner syndrome
AA903218	YPEL2	Yippee-like 2 (Drosophila)
AA400464	Sox9	SRY (sex determining region Y)-box 9 (campomelic dysplasia, autosomal sex-reversal)
AA954353 .1	HSPB1	heat shock 27kDa protein 1

< 실시예 4. 각질형성세포분화 관련 유전자의 프로모터 서열 분석 및 조절인 자 규명>

각질형성세포의 분화 과정 중에 발현의 변화를 보이는 유전자들의 발현 조절을 담당하는 전사조절 인자를 파악하고자 하였다. NCBI Accession No 기준으로 변화된 유전자의 프로모터 서열을 수집하였다. 업스트림(Upstream) 유전자 서열을 Ensembl genome database 로부터 확보한 후 전사 개시 사이트(transcription start site)로부터 2000 bp 업스트림 영역을 포함하는 게놈 서열을 확보하였다.

MatInspector (Quandt et al., 1995)와 Transfac (Knuppel et al., 1994)같은 motif를 예측, 발견, 분석하는 프로그램을 이용해 전사인자 결합 부위 (transcription factor binding site, TFBS)를 검색하고, 하이퍼지오메트리 통계 방법으로 과다 출현 혹은 과소출현하는 전사인자 결합 부위를 선별하였다. 하기 표 3 및 표 4는 발현 변화를 보이는 유전자의 5' upstream 2000 bp 까지를 조사한 결과 이들 유전자의 발현을 조절할 것으로 추정되는 전사조절 인자를 표시한 것이다. 표 3은 분화 과정에 따라 발현이 감소하는 유전자의 프로모터에서 과다 관찰되는 전사인자, 표 4는 분화 과정에 따라 발현이 증가하는 유전자의 프로모터에서 과다 관찰되는 전사인자를 표시한 것이다. GBAcc는 NCBI의 genebank accession ID를 의미한다.

그리고 발현 변화를 보이는 유전자 클러스터와 그 유전자 클러스터를 조절한 것으로 예측되는 전사인자 간의 조절 네트워크의 연결 고리를 추출하여, 히트맵과 그래프로 시각화한 것을 도 4 및 도 5에 나타내었다. 도 4는 각질형성세포의 분화 과정 중 발현이 감소하는 유전자와 그 프로모터에 과다 관찰되는 전사인자와의 상관 관계 매트릭스(도 4a) 및 네트워크(도 4b)를 도시한 것이고, 도 5는 각질형성세포의 분화 과정 중 발현이증가하는 유전자와 그 프로모터에 과다 관찰되는 전사인자와의 상관 관계 매트릭스(도 5a) 및 네트워크(도 5b)를 도시한 것이다. 상기 상관 관계 매트릭스에 의하면, 발현 변화를 보이는 상기 유전자 클러스터 (세로 변)와 그 유전자 클러스터를 조절한 것으로 예측되는 전사인자(가로 변) 간의 조절 네트워크 연결 고리를 확인할 수 있다.

GBAcc	전사인자와 그 결합 부위	p- value
AB209047	Elk-1/V$ELK1_02	0.00095
BC107698	CRE-BP1/c-Jun/V$CREBP1CJUN_01	0.00357
AB209624	IRF-1/V$IRF1_01	0.00429
NM_134442	CREB/V$CREB_01	0.01069
BX648934	IRF-2/V$IRF2_01	0.0167
NM_002908	c-Rel/V$CREL_01	0.02214
NM_005238	c-Ets-1(p54)/V$CETS1P54_01	0.02441
AL832119	USF/V$USF_Q6	0.02546
AB051442	VBP/V$VBP_01	0.03133
BM920882	Hox-1.3/V$HOX13_01	0.03855
BC107698	CRE-BP1/V$CREBP1_01	0.05147
NM_005604	Brn-2/V$BRN2_01	0.05505
AJ606319	c-Myb/V$CMYB_01	0.05912
	COMP1/V$COMP1_01	0.06532
NM_181552.2	CDP CR1/V$CDPCR1_01	0.06739
U03494	CP2/V$CP2_01	0.06746
NM_003998	NF-kappaB (p50)/V$NFKAPPAB50_01	0.08087
NM_002228	AP-1/V$AP1_Q4	0.08218

GBAcc	전사인자와 그 결합 부위	p-value
NM_002228	AP-1/V$AP1_Q2	0.00623
NM_002398.2	MEIS1A/HOXA9/V$MEIS1A/HOXA9_01	0.01833
NM_152739	MEIS1B/HOXA9/V$MEIS1B/HOXA9_01	0.02459
NM_134442	CREB/V$CREB_02	0.03014
NM_006084 NM_001571	ISRE-binding proteins/V$ISRE_01	0.03014
BC011558	Nrf-2/V$NRF2_01	0.04696
BC025711	Nkx2-5/V$NKX25_02	0.04796
AF061756	Hand1/E47/V$HAND1E47_01	0.05753
AB209177	Pax-6/V$PAX6_01	0.07635
AJ606319	c-Myb/V$CMYB_01	0.08264
NM_001031804	v-Maf/V$VMAF_01	0.08657
AB209047	Elk-1/V$ELK1_02	0.09131
NM_003200.1	E47/V$E47_01	0.09696

< 실시예 5. 규명된 전사인자의 발현 변화 양상 확인>

상기 규명된 전사 인자의 발현 변화 양상을 확인하기 위해서 각질형성세포 분화에 따른 전사 인자의 발현 변화를 RT-PCR로 확인하고 그 결과를 도 6에 나타내었다. 우선 각질형성세포 분화를 시간경과에 따라 분석하기 위하여 칼슘 미처리군(0일), 칼슘처리 후 1일, 3일, 7일, 10일에 회수한 총RNA를 각각 사용하였다. 총RNA 각 1 ㎍을 올리고-dT프라이머(24 mer) 100 pmol (Bioneer)과 함께 70℃에서 10분(총용량 20 ㎕) 반응시켰다. 그 후, 5x제1쇄 반응 버퍼 4 ㎕, 0.1M DTT 2 ㎕, 2.5 mMdNTP 믹스 4 ㎕, SuperscriptII 1 ㎕(전부 invitrogen)를 첨가하여 42℃에서 1시간 반응시켰다. 마지막으로 70℃에서 10분 반응시켜 신장시키고, cDNA 템플릿을 조제하였다. rTaq용 10×버퍼 5 ㎕, 25 mM MgCl2 3 ㎕, 2.0 mM dNTP 믹스 5㎕, rTaq 0.5 ㎕(전부 Bioneer사), ddH2 0 33.5 ㎕, cDNA 템플릿 각 1 ㎕, 하기 표 5의 프라이머 센스 및 안티센스 각 20 mM 1 ㎕(총용량 50 ㎕)를 전부 첨가하여 PCR 반응[94℃ 2분, (94℃ 30초, 55℃ 30초, 72℃ 1분)을 30사이클, 72℃ 10분]을 행하였다.

유전자 기호	프라이머 종류	프라이머 서열
Nrf-2	센스(서열번호1)	GAGAGCCCAGTCTTCATTGC
	안티센스(서열번호2)	CTGTCAACTGGTTGGGGTCT
Ets-1	센스(서열번호3)	GTTAATGGAGTCAACCCAGC
	안티센스(서열번호4)	GGGTGACGACTTCTTGTTTG
PAX-6	센스(서열번호5)	CCGGCAGAAGATTGTAGAGC
	안티센스(서열번호6)	CTAGCCAGGTTGCGAAGAAC
Nkx-2.5	센스(서열번호7)	ACGCCCTTCTCAGTCAAAGA
	안티센스(서열번호8)	TTTTCGGCTCTAGGGTCCTT

도 6에서 확인되는 바와 같이, 일부 인자는 시간에 따라 일정한 방식으로 발현 변화를 보이는 것을 확인하였다. 예를 들어, 칼슘 첨가로 인한 각질형성세포의 분화 이전에는 주로 Nrf-2 전사인자가 발현되다가 분화가 시작된 후 초기에는 Ets-1, 다음에는 Pax6, 마지막으로 Nkx-2.5가 발현되어 각질형성세포의 분화를 최종적으로 조절한다.

도 7 내지 9는 표 1 내지 2의 유전자, 및 표 3 내지 4의 전사조절 인자 유전자들 중 대표적인 유전자에 대한 발현 변화를 실제로 검증한 결과이다.

도 7은 각질형성세포 분화 과정 동안 발현이 증가하는 것으로 밝혀진 HSPB1(HSP27) 유전자의 발현 변화를 검증한 결과로서, (7a) 칼슘에 따른 HSPB1(HSP27) mRNA의 발현 변화 (7b) 정상 표피에서의 HSPB1(HSP27)(1-a) 및 인과 화합된(phosphorated) HSPB1(HSP27)(1-b) 단백질의 발현 양상 및 (7c) 여러 피부 질환에서의 HSPB1(HSP27) 및 phosphorated HSPB1 (HSP27)단백질의 발현 양상을 나타낸다. 도 7b에 의하면, 정상 조직에서 HSPB1 (HSP27)은 주로 상부 가시층(upper spinous layer) 및 각질층(stratum corneum)에서 발현되고, HSPB1 (HSP27)의 활성화 형태인 phosphorated-HSPB1 (HSP27)은 상부 가시층(upper spinous layer) 및 과립층에서 발현되므로, 표피 분화 지표로서 사용하기에는 인과 화합된(phosphorated) HSPB1이 더욱 적절하다. 도 7c에 의하면, 건선(psoriasis), 아토피, 편평태선(lichen planus), 비강진(pityriasis), 기저세포암(basal cell carcinoma), 편평상피세포암(squamous cell carcinoma), 악성흑색종(malignant melanoma), 각질극세포종 (keratoacanthoma) 등의 피부질환에 걸린 표피에서 HSPB1 (HSP27) 및 phosphorated-HSPB1 (HSP27)이 발현된 것을 확인할 수 있다. 특히, HSPB1 (HSP27)의 발현은 표피의 여러 세포층에 넓게 분포되어 있고 phosphorated-HSPB1 (HSP27)의 발현은 특정 세포층인 상부 가시층(upper spinous layer) 및 과립층에 편재되어 있었다.

도 8은 각질형성세포 분화 과정동안 발현이 증가하는 것으로 확인된 SOX9 유전자의 발현 변화를 검증한 결과로서, 정상 모낭, 정상 피부, 건선, 아토피 피부염, 기저세포암 및 극세포암 환자의 피부에서 관찰되는 발현 변화를 나타낸다. Sox9는 모발의 외모근초(outer root sheath, ORS)와 피지선(sebaceous gland) 세포의 핵 내에서 발현되는 유전자이다. 정상 표피의 핵 내에서는 거의 발현되지 않았지만 극세포층의 세포질 내에서 주로 발현되었고, 특이하게도 아토피 피부염과는 달리 건선 조직의 대부분 세포의 핵 내에서 발현되었다. 또한 여러 피부암, 기저세포암과 극세포암에서도 발현이 증가된 것으로 나타난 것을 보아 Sox9은 건선, 피부암 진단의 마커로 활용될 수 있을 것이다.

도 9는 각질형성세포의 분화 과정 중에 발현의 변화를 보이는 유전자들의 발현 조절을 담당하는 전사조절 인자인 (9a) Nrf-2 (9b) PAX-6 및 (9c) Nkx2.5가 정상 피부, 건선 및 아토피 피부염 환자의 피부에서 발현되는 양상을 나타낸다. Nrf-2 의 발현은 정상 피부의 기저층(basal layer)과 상부기저층(supra basal layer)에서 관찰되었으며, 주로 세포질 내에서 발현되었다. 건선과 아토피 피부염에서는 기저층부터 중부 가시층(mid-spinous layer)까지 넓게 발현되었지만 발현양은 정상보다 적었다. PAX-6는 면역 염색에서는 정상 피부에서 거의 발현되지 않았으나, 건선의 경우 표피 가시층(spinous layer)에서 세포질에 발현이 증가된 양상을 보였다. 한편 아토피 피부염에서는 발현되지 않았다. 따라서 PAX-6는 건선 발병과 연관 있는 것으로 보이므로 건선 치료제 개발의 표적이나 건선 진단을 위한 지표로활용될 수 있을 것이다. Nkx2.5 는 정상 피부에서는 기저층의 세포질과 핵에서 발현되다가 극세포 위층으로 갈수록 핵에서만 발현되었다. 건선에서는 표피(epidermis) 전 층에 걸쳐 발현을 보이면서, 특히상부 가시층(upper spinous layer) 및 과립층(granular layer)에서는 핵이 강하게 염색되었다. 한편 아토피 피부염에서는 발현을 나타내지 않은 것으로 보아, 건선 치료의 표적 및 진단 마커로 활용될 수 있을 것이다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims

각질형성세포 이상 분화 방지제를 스크리닝하는 방법으로서,
(a) Nrf-2 유전자 및 유니버설(universal) 프로모터를 포함하는 플라스미드, 및 상기 유전자에 의해 코딩되는 전사인자가 결합하는 DNA 서열 및 리포터 유전자를 포함하는 플라스미드를 세포에 트랜스펙션시키는 단계;
(b) 상기 세포에 시험 화합물을 처리하는 단계; 및
(c) 상기 시험 화합물이 상기 리포터 유전자의 발현을 촉진하는지 여부를 확인하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 각질형성세포 이상 분화 방지제 스크리닝 방법.
제1항에 있어서,
상기 방법의 (a) 단계는
Nrf-2 유전자 및 유니버설(universal) 프로모터를 포함하는 플라스미드, 및 상기 유전자에 의해 코딩되는 전사인자가 결합하는 DNA 서열 및 리포터 유전자를 포함하는 플라스미드; 및
Nkx-2.5, AP-1, MEIS1A/HOXA9, MEIS1B/HOXA9, CREB, ISRE-BP, Hand1/E47, Pax-6, c-Myb, v-Maf, Elk-1, E47, CRE-BP1, IRF-1, IRF-2, c-Rel, c-Ets-1(p54), USF, VBP, Hox-1.3, Brn-2, COMP1-factor, CDP_CR1, CP2 및 NF-kB (p50) 로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자 및 유니버설(universal) 프로모터를 더 포함하는 플라스미드, 및 상기 선택된 유전자에 의해 코딩되는 전사인자가 결합하는 DNA서열 및 리포터 유전자를 포함하는 플라스미드를 세포에 트랜스펙션시키는 단계인, 각질형성세포 이상 분화 방지제 스크리닝 방법.
제2항에 있어서,
상기 선택된 유전자는 Pax-6 또는 Nkx-2.5이고,
상기 각질형성세포 이상 분화방지제는 건선 치료제인 것을 특징으로 하는 각질형성세포 이상 분화 방지제 스크리닝 방법.