KR101190754B1 - Ｎａｄｈ를 이용한 광촉매 활성도 측정방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 광촉매의 광 활성도(photo-catalytic activity) 측정 방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 광촉매의 광 활성에 의한 NADH의 흡광도 또는 형광세기 변화를 이용하여 광촉매의 광 활성도를 손쉽게 측정하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 광촉매 활성도 측정방법에 의하면, 적은 양의 시료를 사용하여 단 시간 안에 광촉매의 광 활성도 측정이 가능하다는 장점이 있으며, 별도의 전처리 과정을 거치지 않고 광촉매와 NADH 혼합용액에서 형광세기를 측정하여 분석과정을 단순화함으로써 기존의 방법에 비해 측정의 속도와 정확도를 높일 수 있다. 또한 광촉매 존재 시 시간에 따른 NADH 형광세기 변화율을 측정하고 반응속도를 계산하여 광촉매의 광 활성도(photo-catalytic activity)를 정량화할 수 있기 때문에 객관적인 비교 자료로 활용이 가능하다는 장점이 있다.
Description
본 발명은 광촉매의 광 활성도(photo-catalytic activity) 측정 방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 분말형태의 광촉매 분산용액에서 광 활성에 의해 NADH의 흡광도 또는 형광세기가 변화하는 현상을 이용하여 광촉매의 광 활성도를 손쉽게 측정하는 방법에 관한 것이다.
광촉매는 빛의 조사(특히 자외선)에 의하여 여러 가지 물질의 화학변화를 유도할 수 있는 물질로서 TiO2, SiO2, WO3, ZnO 등 매우 다양하게 존재한다. 그 중에서도 최근에는 광활성이 높고 제조 단가가 매우 저렴한 TiO2 계열의 광촉매가 다양한 응용 분야에서 매우 각광을 받고 있다. 또한 이러한 광촉매는 그 제조법도 매우 다양하여 이미 다수의 특허들이 존재하고 있다. 그러나 이들 광촉매에 대하여 규정된 광활성 평가 방법이 없어 광촉매를 판매하거나 연구하는 사람들은 각자 별도의 활성 평가법을 사용하고 있는 실정이다.
종래의 광활성 평가 방법에는 일본공개공보 제2001-183359호에 따른 접촉각 측정법이 있는데, 이는 육안 또는 현미경을 사용하여 평가하는 것으로서, 물과 기재의 접촉각 변화를 매우 정밀하고 정량적으로 표현하기가 어려워 절대적 평가 기준이 되지 못하고 있다. 또한, 광촉매층, 유기층을 형성하여 자외선을 조사하는 단계를 거치므로 코팅층의 재질에 따라 상호 비교가 매우 까다롭다는 문제점이 있다.
또한, 일본공개공보 제2000-162129호에 광촉매를 기재에 코팅한 후, 이를 메틸렌 블루 염료를 착색하고 이를 다시 건조하여 흡광도를 측정하는 활성 평가법이 기재되어 있다. 그러나 이 방법은 광촉매를 기재에 코팅할 때, 무기물 코팅이므로 코팅면의 불균일성이 발생할 수 있고, 따라서 염료가 또한 불균일하게 착색될 수 있다. 이로 인하여 흡광도 값이 측정 부위에 따라 달라지게 되어 정확한 값을 측정할 수 없다. 또한 광촉매는 건조 시간 및 건조 온도에 따라 물성이 변화되어 흡광도가 달라지므로 역시 정확한 광활성을 측정할 수 없게 된다.
한국 국내등록실용신안 제20-230249호에는 FT-IR을 이용하여 광활성을 평가하는 키트에 관한 내용이 기재되어 있다. 그러나 이 기술 역시 고가의 장비가 있어야 사용할 수 있을 뿐만 아니라 키트의 밀폐와 사용하려는 오염 물질의 대상에 따라 다양한 활성을 나타내어 상대적 비교나 절대적 비교가 매우 어렵다는 문제점이 있다.
종래 Applied Catalysis B: Environmental 45, 23-38 (2003) 등에 나타난 광촉매 활성 측정방법의 경우 분석시약이 혼합된 광촉매 분산용액에 (용액부피 >100 mL) 자외선램프를 이용하여 빛을 조사하면서 일정시간 간격으로 일정량의 용액을 채취한 후 원심분리를 통해 광촉매를 제거하고 분석시약의 흡광도를 측정하는 방법을 사용하였으나, 이와 같은 분석방법의 경우 활성 측정에 필요한 시료가 다량으로(100 mL 이상) 필요하고 한 농도의 광촉매 활성을 분석하는데 1 시간 이상의 장시간이 걸린다는 문제점을 가지고 있다.
그 외의 광활성 평가법으로는 주로 코팅층에 오일류를 도포하고 시간에 따른 무게 감량을 측정하는 유지 감량법과 세균의 살균 능력을 살펴보는 세균 관찰법이 있다. 상기 유지 감량법은 광촉매 기능막의 표면에 샐러드유 등의 액체상의 유기 유지를 균일하게 얇게 도포하고, 자외선 조사 후 광분해에 의한 중량 감소를 측정하는 방법이나, 이 방법은 측정에 10 시간 이상의 장시간이 소요될 뿐만 아니라 1 mg 이하의 고감도의 중량 변화를 장시간에 걸쳐 측정하지 않으면 안되어 실제로 정확한 측정방법이라고 보기에는 곤란한 방법이다. 상기 세균 관찰법은 세균이 번식한 액체를 일정량 적하하고 시간과 함께 세균의 잔존수를 헤아리는 방법이다. 그러나 이 방법 역시 자외선에 의한 자체 살균 효과와 세균을 배양하여 사용해야하는 번거로움이 있으며, 세균 배양에 비교적 긴 시간이 소요되고 실험 후 육안으로 세균의 수를 헤아려야 하므로 매우 부정확한 결과를 야기할 수 있다.
따라서 다양한 조건과 재질에 크게 구애받지 않으면서 적은 시료의 양을 사용하여 단시간 안에 광촉매의 광 활성도를 분석할 수 있는 측정방법이 절실히 요구되고 있는 실정이다.
이에 본 발명자들은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위해 연구, 노력한 결과, NADH가 자외선 조사 시 광촉매에 의해 발생한 활성산소(reactive oxygen species; ROS)와 반응하여 산화되면서 형광세기가 변화하는 원리를 이용하여 광촉매의 광 활성도를 손쉽게 측정할 수 있음을 발견함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명은 NADH를 이용하여 분말형태 광촉매의 광 활성도를 수용액상에서 측정하는 방법을 제공하는데 그 목적이 있다.
본 발명은 (a) NADH 및 광촉매를 용기에 투입하고 광촉매의 광 활성 전 NADH의 형광세기를 측정하는 단계; (b) 이후 광촉매의 활성화를 위해 상기 용기에 자외선 광을 조사하여 광촉매를 광 활성화 시킨 후 NADH의 형광세기를 측정하는 단계; 및 (c) 상기와 같이 측정한 광촉매의 광 활성 전, 후 NADH의 형광세기 차이를 계산하여 광촉매의 광 활성도(photo-catalytic activity)를 측정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 광촉매 활성도 측정방법을 제공한다.
상기한 바와 같은 본 발명에서 제안하는 광촉매 활성도 측정방법에 의하면, 적은 양의 시료를 사용하여 단 시간 안에 광촉매의 광 활성도 측정이 가능하다는 장점이 있으며, 별도의 전처리 과정을 거치지 않고 광촉매와 NADH 혼합용액에서 형광세기를 측정하여 분석과정을 단순화함으로써 기존의 방법에 비해 측정의 속도와 정확도를 높일 수 있다. 또한 광촉매 존재 시 시간에 따른 NADH 형광세기 변화율을 측정하고 반응속도를 계산하여 광촉매의 광 활성도(photo-catalytic activity)를 정량화할 수 있기 때문에 객관적인 비교 자료로 활용이 가능하다는 장점이 있다.
도 1은 NADH가 광촉매에 의해 발생한 ROS와 반응한 결과 NAD+가 되는 반응식과 NADH의 흡광 및 형광스펙트럼과 NAD+의 흡광스펙트럼이다.
도 2는 광촉매의 표면에서 ROS가 형성되는 과정의 예시와 ROS와의 반응 결과로 NADH의 340 nm 흡수피크가 감소하는 경향을 보여준 스펙트럼이다.
도 3은 NADH 농도 증가에 따른 형광세기 증가를 측정하고 선형성을 가지는 구간을 설정하기 위해 도시한 그래프이다.
도 4는 TiO2의 존재여부에 따라 근자외선 광 조사에 의해 NADH의 형광세기가 시간에 따라 변화하는 양상이 달라짐을 나타낸 그래프이다.
도 5는 67 μg/mL 농도까지는 TiO2 농도 증가에 따라 NADH 반응속도가 선형적으로 증가한다는 것을 보여주는 그래프이다.
도 6은 TiO2 존재 시 근자외선 조사시간에 따라 측정한 NADH의 흡광도와 형광세기의 관계를 보여주는 그래프이다.
도 7은 NADH만 존재하는 각기 다른 pH 완충용액에 근자외선 광을 조사한 경우 시간에 따른 형광세기의 변화를 나타낸 그래프이다.
도 8은 NADH와 TiO2가 함께 존재하는 각기 다른 pH 완충용액에 자외선 광을 조사한 경우 시간에 따른 형광세기의 변화를 나타낸 그래프이다.
도 9는 반응용액의 pH에 따른 NADH의 반응속도의 변화를 나타낸 그래프이다.
도 2는 광촉매의 표면에서 ROS가 형성되는 과정의 예시와 ROS와의 반응 결과로 NADH의 340 nm 흡수피크가 감소하는 경향을 보여준 스펙트럼이다.
도 3은 NADH 농도 증가에 따른 형광세기 증가를 측정하고 선형성을 가지는 구간을 설정하기 위해 도시한 그래프이다.
도 4는 TiO2의 존재여부에 따라 근자외선 광 조사에 의해 NADH의 형광세기가 시간에 따라 변화하는 양상이 달라짐을 나타낸 그래프이다.
도 5는 67 μg/mL 농도까지는 TiO2 농도 증가에 따라 NADH 반응속도가 선형적으로 증가한다는 것을 보여주는 그래프이다.
도 6은 TiO2 존재 시 근자외선 조사시간에 따라 측정한 NADH의 흡광도와 형광세기의 관계를 보여주는 그래프이다.
도 7은 NADH만 존재하는 각기 다른 pH 완충용액에 근자외선 광을 조사한 경우 시간에 따른 형광세기의 변화를 나타낸 그래프이다.
도 8은 NADH와 TiO2가 함께 존재하는 각기 다른 pH 완충용액에 자외선 광을 조사한 경우 시간에 따른 형광세기의 변화를 나타낸 그래프이다.
도 9는 반응용액의 pH에 따른 NADH의 반응속도의 변화를 나타낸 그래프이다.
본 발명은 (a) NADH 및 광촉매를 용기에 투입하고 광촉매의 광 활성 전, NADH의 형광세기를 측정하는 단계; (b) 이후 광촉매의 활성화를 위해 상기 용기에 자외선 광을 조사하여 광촉매를 광 활성화 시킨 후, NADH의 형광세기를 측정하는 단계; 및 (c) 상기와 같이 측정대상 광촉매 존재 시 자외선 광 조사에 의해 유발되는 시간에 따른 NADH 형광세기 변화율로부터 반응속도를 계산하여 광촉매의 광 활성도(photo-catalytic activity)를 측정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 광촉매 활성도 측정방법에 관한 것이다.
이하, 본 발명에 대해 더욱 상세히 설명하면 다음과 같다.
첫 번째 단계는 NADH 및 광촉매를 용기에 투입하고 광촉매의 광 활성 전 NADH의 형광세기를 측정하는 단계이다. 상기 단계의 측정은 광촉매가 광에 의해 전혀 활성화되지 않은 상태에서 이루어지며, 이때 형광세기는 분광형광계(spectrofluorometer)를 이용하여 각각의 시료용액을 파장에 따라 측정하거나 형광 마이크로 플레이트 리더(fluorescence microplate reader)를 이용하여 미리 선정한 단일 파장에서 여러 개의 다른 시료용액을 측정함으로써 구할 수 있다.
먼저, 근자외선 영역에서 높은 흡광도를 나타내는 즉, 파장이 290에서 400 nm 범위에서 최대의 흡광도를 나타내는 NADH 용액을 용기에 투입한다. 상기 NADH 용액은 NADH를 용매에 용해하고 이의 흡광도를 측정하여 340 nm에서 흡광도 값이 0.75 내지 1.5가 되도록 탈이온수(deionized water) 등으로 희석하여 제조한다. 상기 NADH의 농도는 31 μM ~ 250 μM 범위로 유지하는 것이 바람직하다. 상기 NADH 용액은 예를 들어, NADH 33 mg을 용매 10 mL에 용해한 후 1/40에서 1/10 범위로 희석함으로써 제조할 수 있다. 상기 용매로는 예를 들어, 탈이온수 또는 pH 8 인산염 완충용액(phosphate buffer solution)과 같이 NADH가 잘 용해되는 용매를 사용할 수 있다.
상기에서 얻어진 NADH 용액을 측정 용기에 투입하고, 이 측정 용기에 광촉매를 투입한다. 상기 광촉매는 일반적으로 빛의 조사(특히 자외선)에 의하여 여러 가지 물질의 화학변화를 유도할 수 있는 물질은 어떠한 것도 사용할 수 있고, 예를 들어, TiO2, SiO2, WO3 또는 ZnO을 사용할 수 있으며, 상기 광촉매는 단독 또는 2종 이상을 혼합하여 사용할 수 있다. 또한, 상기 광촉매는 분말 타입 또는 졸 타입 등 어떠한 형태로도 사용 가능하나, 바람직하게는 작은 크기의 안정한 광촉매 분산용액(suspension)을 얻기 위해 광촉매 나노분말을 용매에 분산시켜 사용하는 것이 좋다. 이때 상기 광촉매 나노분말을 분산시키기 위한 용매로는 pH 8 수산화나트륨 수용액(aqueous NaOH solution) 또는 pH 8 인산염 완충용액(phosphate buffer solution) 등을 사용할 수 있다.
이때, 광촉매의 사용량은 조사하는 자외선 파장에서 1 cm 경로를 기준으로 흡광도가 0.3 내지 3.0인 것이 바람직하며, 상기 3.0 값을 초과하면, 측정에 의한 광 활성도가 광촉매의 양에 선형비례하지 않는 문제점이 있어 바람직하지 않다. 또한, 상기 0.3 값 보다 작을 경우에는 NADH의 형광변화가 매우 작아서 측정불확도가 높아지는 문제점이 있어 바람직하지 않다.
상기 이외에 용액의 pH에 따라 광촉매에 의한 ROS 생성률이 달라지는 문제를 배제하기 위해 적절한 완충용액을 공지된 방법에 의해 제조하여 함께 첨가할 수 있다. 예를 들어, pH 8 인산염 완충용액을 제조하기 위해서는 5 mM의 일염기 인산나트륨(sodium phosphate monobase) 수용액과 5 mM의 이염기 인산나트륨(sodium phosphate dibasic) 수용액을 약 94 : 6의 비율로 혼합하여 제조하되, 정확한 pH 조절을 위해 우선 삼각플라스크에 100 mL의 5 mM의 일염기 인산나트륨 수용액을 담고 자석막대(magnetic stirring bar)를 이용해서 용액을 지속적으로 저어줌과 동시에 pH 미터 전극을 이용해서 용액의 pH를 측정하면서 5 mM의 이염기 인산나트륨 수용액을 pH 8이 될 때까지 소량씩 첨가함으로써 제조하는 것이 바람직하다.
상기 측정에 있어 바람직하게는 상기 형광세기 측정 전에 광촉매 시편을 암실과 같이 빛이 차단된 조건에서 일정 시간(약 10 분) 이상 보관하여 광촉매가 활성을 상실하도록 전 처리하는 것이 좋다.
준비가 끝난 후 분광형광계를 측정하고자 하는 파장 영역에 맞도록 설정하고, 광촉매가 활성화되기 전의 NADH의 형광세기를 455에서 465 nm 범위에서 측정한다. 이때, 분광형광계의 검출 정확도에 따라 자료의 신뢰도가 좌우된다.
두 번째 단계는 이후 광촉매의 활성화를 위해 상기 용기에 자외선 광을 조사하여 광촉매를 광 활성화 시킨 후, 일정시간 간격으로 NADH의 형광세기를 측정하는 단계이다. 본 단계에서는 자외선 조사 시 광촉매에 의해 발생한 활성산소(ROS)가 NADH를 NAD+로 산화시키게 되고, 이에 의해 NADH 농도가 점차 감소하게 되므로 기존 460 nm에서 최대피크를 가지는 형광세기가 감소하게 되는 점을 이용한 것이다. 상기와 같은 감소 경향은 광촉매의 광 활성도 및 시간 등의 요인에 따라 크게 좌우된다.
상기 자외선 조사는 290 ~ 400 nm 범위의 자외선램프를 이용하여 실시하며, 측정 파장은 사용 NADH의 최대흡수파장 ± 10 nm 범위로 하는 것이 가장 빠른 속도로 정밀한 형광세기 값을 얻을 수 있어서 바람직하다. 상기 자외선 광 조사는 필요에 따라 조사 시간 및 조사 강도를 조절하여 수행할 수 있다.
마지막 단계는 상기와 같이 측정한 광촉매의 광 활성 전, 후 NADH의 형광세기 변화율로부터 반응속도를 계산하여 광촉매의 광 활성도(photo-catalytic activity)를 정량적 수치로 도출하는 단계이다. 측정된 형광세기를 하기 수학식 1과 2에 따라 계산하여 단위 무게당, 단위 시간당 광촉매 활성을 얻을 수 있다.
[수학식 1]
광촉매 활성 = (형광세기 변화율 X 초기 NADH 농도)/(투입된 광촉매 농도)
* 형광세기 변화율은 시간 대비 상대형광세기 그래프의 기울기이다.
[수학식 2]
상대형광세기 = (조사시간에 따른 NADH 형광세기)/(초기 NADH 형광세기)
상기한 바와 같이 본 발명에 따른 광촉매 활성의 측정방법을 이용하는 경우 광촉매의 광 활성도를 간단한 방법으로 짧은 시간 안에 정량적으로 평가하는 방법을 제공할 수 있으며, 이로 인하여 현재 다양하게 평가되고 있는 광촉매 활성을 상호 비교할 수 있어 광촉매 제품의 선정이나 관련 연구에 있어서 그 효율을 증가시킬 수 있다. 또한 광촉매 활성 측정에 사용되는 NADH는 그 자체로는 자외선에 의해 거의 분해되지 않고 광촉매와 함께 사용되는 경우에만 NAD+로 분해되는 특성을 나타내기 때문에 광촉매의 광 활성 측정에 있어 매우 유용하게 사용될 수 있다.
형광 측정 장치를 확보하지 못한 실험실에서는 NADH의 흡광도 변화를 관찰함으로써 광촉매의 활성 측정을 할 수 있으며, 실험 과정은 상기 형광세기 측정과 동일한 방법을 따르되, 혼합용액의 흡광도를 측정하기 전에 원심분리 등의 방법을 이용하여 광촉매를 혼합용액에서 제거한 상태에서 335 ~ 345 nm 범위에서 흡광도를 측정한다. 구체적인 실험방법은 실시예 2에 서술된 근자외선 조사시간에 따른 NADH 흡광도 변화측정 과정을 따른다. 자외선 조사시간에 따른 NADH 흡광도 변화를 측정하고 나면 하기 수학식 3에 따라 계산하여 단위 무게 당, 단위 시간당 광촉매 활성을 얻을 수 있다.
[수학식 3]
광촉매 활성 = (흡광도 변화율)/(흡광계수 X 흡광경로)/(투입된 광촉매 농도)
* 흡광도 변화율은 시간 대비 흡광도 그래프의 기울기이다.
이하, 본 발명을 실시예 및 비교예에 의거하여 상세하게 설명하는 바, 본 발명이 하기의 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
<
제조예
>
[
TiO
2
분산용액(
suspension
)의 제조]
NADH(nicotinamide adenine dinucleotide)를 이용한 나노입자의 광촉매 활성 측정을 위해 사용한 광촉매로 TiO2는 Degussa-P25 (Aeroxide, Evonic Co. LTD.)를 사용하였으며, 작은 크기의 안정한 TiO2 분산용액을 얻기 위해 20 mL 글라스 바이알(glass vial)에 40 mg의 TiO2 나노분말과 10 mL의 pH 10 수산화나트륨 수용액(aqueous NaOH solution)을 넣고(4 mg/mL) 자석막대(magnetic stirring bar)를 이용해서 900 rpm 으로 24 시간 동안 저어주었다. 이후 24 시간 동안 방치한 후 상등액 5 mL를 채취하였다. 채취한 상등액에는 직경이 160 ~ 190 nm인 TiO2 나노입자가 분산되어 있음을 DLS(dynamic light scattering)측정을 통해 확인하였다. DLS 측정을 위해서는 입자크기분석기(particle size analyzer, model ELS-Z, Otsuka electronics Co. Ltd.)를 사용하였다.
[
NADH
용액의 제조]
NADH(Cat. No. 43423 Fluka. Co. LTD.)용액은 Milli-Q Reference Water System Production Unit (Millipore Co.)에서 생성된 DIW (deionized water > 18 ㏁㎝)를 용매로 사용하여 제조하였다.
[완충용액(
buffer
solution
)의 제조]
pH 완충용액을 제조하기 위하여 다음의 시약을 사용하였다.
아세트산염 완충용액(acetate buffer)을 제조하기 위해서 5 mM 아세트산(acetic acid) 수용액과 5 mM 아세트산나트륨(sodium acetate) 수용액을 혼합하였다. 인산염 완충용액(phosphate buffer)을 제조하기 위해서는 5 mM의 일염기 인산나트륨(sodium phosphate monobase) 수용액과 5 mM의 이염기 인산나트륨(sodium phosphate dibasic) 수용액을 혼합하였으며, 탄산염 완충용액(sodium carbonate buffer)을 제조하기 위해서는 5 mM 탄산나트륨(sodium carbonate) 수용액과 5 mM 과탄산나트륨(sodium bicarbonate)수용액을 혼합하여 사용하였다. 완충용액을 제조하기 위해 사용한 시약은 모두 Sigma-Aldrich사에서 구입하였으며 순도는 ACS reagent grade이다.
<
실시예
1>
NADH
와
TiO
2
농도에 따른
광촉매
활성 측정
본 발명에서는 NADH의 형광세기를 측정함으로써 NADH의 농도를 정량하는 원리를 활용하고 있다. 이러한 원리를 활용하기 위해서는 NADH의 형광세기가 농도에 일차비례 하는 조건을 만족해야한다. 따라서 광촉매 활성 측정에 앞서 NADH의 형광세기와 농도의 관계를 관찰하였다. 이 결과를 하기 표 1과 도 3에 정리하였다.
| NADH 농도에 따른 형광세기 측정결과 | |
| NADH 농도 (μM) | 형광세기 (임의단위) |
| 0 | 99.4 |
| 31.25 | 332 |
| 62.5 | 551 |
| 125 | 948 |
| 250 | 1,544 |
| 500 | 2,358 |
| 1,000 | 3,080 |
| - 340 ± 5 nm excitation - 460 ± 5 nm emission |
|
상기 표 1 및 도 3에서 보는 바와 같이 NADH의 형광세기는 31 내지 250 μM 범위에서 농도에 일차선형 비례관계를 나타내고 있으며, 그 이상의 농도에서는 실시예의 주어진 광학정렬 조건에서 증가 양상이 일차선형 비례관계를 나타내지 않음을 관찰할 수 있다. 따라서 형광세기의 측정으로부터 NADH의 농도를 정량하는 원리를 바탕으로 광촉매 활성을 측정하는 실험을 수행할 때는 NADH의 농도를 250 μM 이하로 유지하는 것이 바람직하다.
광촉매 활성 측정에 적절한 NADH와 TiO2 농도를 알아보기 위하여 NADH 용액은 500 μM에서 62 μM 까지 1/2씩 순차적으로 희석한 4 가지 용액을 사용하고, TiO2는 4 mg/mL로부터 1/2씩 순차적으로 희석함으로써 62.5 μg/mL까지 7 가지 용액을 사용하였다. TiO2의 광촉매 활성에 의한 NADH의 산화반응을 유도하기 위해 위에 서술한 각 농도별 NADH/TiO2 혼합용액을 96 웰-플레이트(30096, SPL Co. LTD.)에 넣고, 312 nm 파장의 트랜스-일루미네이터(trans-illuminator, Wuv-M20, Daihan Scientific Co. LTD.)를 이용하여 자외선을 조사하였다. 혼합용액의 pH를 일정하게 유지하기 위해 104 μL 의 NADH와 91 μL의 5 mM pH 8 나트륨 인산염 완충용액을 넣고 TiO2 분산용액(suspension) 13 μL를 혼합하였다. 자외선을 10 분간 조사하면서 1 분 간격으로 NADH의 흡광도 또는 형광세기를 측정함으로써 시간에 따라 감소하는 NADH의 농도를 측정하였다. 시간대 별 NADH 형광세기를 측정하기 위해 형광 마이크로 플레이트 리더(Fluorescence microplate reader; Gemini EM, Molecular Devices Co. LTD.)를 이용하여 각 웰(well)별로 340 nm excitation / 460 nm emission top read mode로 관찰하였다.
상기 실험에 따른 결과를 하기 표 2, 3 및 도 4, 5에 나타내었다.
| 근자외선 조사시간에 따른 NADH 형광의 상대적 세기 | ||
| 자외선 조사시간 (분) | 상대형광세기 | |
| NADH only | NADH + TiO2 | |
| 0 | 1 | 1 |
| 1 | 0.968 | 0.908 |
| 2 | 0.966 | 0.777 |
| 3 | 0.932 | 0.522 |
| 4 | 0.931 | 0.347 |
| 5 | 0.926 | 0.231 |
| 6 | 0.934 | 0.0764 |
| 7 | 0.921 | 0.0252 |
| 8 | 0.938 | 0.0318 |
| - NADH 농도는 125 μM - TiO2 농도는 100μg/mL - pH 8 완충용액 사용 |
||
| NADH 및 TiO2 농도에 따른 반응속도 데이터 | ||||
| NADH 농도(μM) TiO2 농도(μg/mL) |
반응속도 (μM/min) | |||
| 31 | 62 | 125 | 250 | |
| 3.91 | 0.05 | 0.268 | 0.925 | 1.96 |
| 7.81 | 0.509 | 0.836 | 1.32 | 2.41 |
| 15.63 | 1.61 | 2.33 | 2.89 | 4.08 |
| 31.3 | 3.80 | 4.68 | 6.53 | 7.23 |
| 62.5 | 6.17 | 7.87 | 11.6 | 13.0 |
| 125 | 8.39 | 11.2 | 13.7 | 17.7 |
| 250 | 7.92 | 14.2 | 15.1 | 21.0 |
| - pH 8 완충용액 사용 | ||||
상기 표 2와 도 4는 NADH만 있는 수용액 또는 NADH와 TiO2가 공존하는 완충용액에 근자외선을 조사할 경우 시간에 따른 상대적 형광세기의 변화를 정리한 결과이다. 도 4에서 볼 수 있듯이 NADH만 존재하는 수용액에 근자외선을 조사하면 시간에 따른 형광세기의 변화가 거의 없고, NADH와 TiO2가 공존하는 완충용액에 근자외선을 조사할 경우 시간에 따른 형광세기가 일차 비례하여 감소하는 것을 관찰할 수 있다. 도 4에 나타난 바와 같이 NADH의 형광세기가 일차 비례하여 감소하는 양상을 선형회귀로 근사하면 광촉매에 의한 NADH 감소반응의 속도상수(kapp (μM/mim))를 구할 수 있다.
상기 표 3과 도 5는 NADH와 TiO2의 농도를 달리하면서 NADH 감소반응의 속도상수를 구하여 정리한 결과이다. 상기 표 3와 도 5에서 보는 바와 같이 NADH농도에 관계없이 TiO2 농도가 7.81 내지 62.5 μg/mL (312 nm에서의 1 cm 경로 흡광도가 0.3 내지 3.0)영역에 있을 때 반응속도가 TiO2 농도에 일차선형 비례관계를 보이고 그 이상의 농도에서는 TiO2에 의한 흡수나 산란 때문에 발생하는 자체필터링 효과(self filtering effect)로 인해 반응속도 증가가 선형비례관계를 보이지 않음을 관찰할 수 있다. 따라서 본 발명을 근거로 광촉매의 활성을 측정할 때에는 여기광원에서의 흡광도를 기준으로 광촉매의 농도를 0.3 내지 3.0 범위에서 실험을 수행해야 정확한 광촉매 활성을 구할 수 있다. 이것은 단지 본 발명의 적용에만 국한된 것은 아니며 어떠한 방법을 활용하더라도 광촉매의 농도와 반응시약의 변환속도가 일차선형비례 관계를 나타내는 영역의 광촉매를 이용해서 분석을 수행해야 한다.
<
실시예
2> 자외선 조사 시간에 따른 흡광도와
형광세기
감소경향 비교
자외선 조사 시간에 따른 NADH의 흡광도와 형광세기 감소를 측정 및 비교하기 위해 다음과 같은 실험을 수행하였다. 우선 웰 플레이트(well plate)의 36 개 웰(well)에 NADH(250 μM; 104 μL)와 TiO2(1.6 mg/mL; 13 μL) 및 pH 8의 인산염 완충용액(91 μL)을 혼합하고 312 nm 파장의 트랜스-일루미네이터를 이용하여 근자외선을 조사하면서 1 분 간격으로 3 개의 웰(well)에서 용액을 채취하였다. 채취한 3 웰(well)의 용액을 혼합한 후 6,000 rpm으로 20 분간 원심분리를 수행함으로써 TiO2를 가라앉히고 상등액만을 채취하여 335 ~ 345 nm 영역에서 흡광도를 측정하였다. 흡광도 측정 시에는 UV/Vis 분광광도계(UV-1700, Shimadzu Co. LTD.)를 사용하였다. 이 때 자외선의 영향을 받지 않은 초기의 NADH 농도를 확인하기 위해 자외선 조사 직전에 3개의 웰(well)에서 용액을 채취한 후 원심분리 및 상등액의 흡광도 측정을 수행했다. 또한 자외선 조사 시간에 따른 형광세기 변화를 흡광도 변화와 비교하기 위해 별도의 3 개 웰(well)을 대상으로 1 분 간격으로 형광세기를 분광형광계를 이용하여 측정하였다.
상기 실험에 따른 결과를 하기 표 4 및 도 6에 나타내었다.
| 근자외선 조사시간에 따른 NADH 흡광 및 형광의 상대적 세기 | ||
| 자외선 조사시간 (분) | 상대 세기 | |
| 상대흡광세기 | 상대형광세기 | |
| 0 | 1 | 1 |
| 1 | 0.816 | 0.908 |
| 2 | 0.694 | 0.777 |
| 3 | 0.417 | 0.522 |
| 4 | 0.271 | 0.347 |
| 5 | 0.186 | 0.231 |
| 6 | 0.0855 | 0.0764 |
| 7 | 0.0304 | 0.0252 |
| 8 | 0.0420 | 0.0318 |
| - NADH 농도는 125 μM - TiO2 농도는 100 μg/mL |
||
상기 결과를 통해, NADH의 흡광도와 형광세기는 상호연관되어 있다는 사실을 알 수 있으며, 이 결과는 NADH의 형광세기를 측정하는 것만으로 ROS에 의한 산화반응으로 NADH 농도가 감소하는 것을 관찰할 수 있음을 증명하는 것이다. 흡광도를 측정하기 위해서는 원심분리와 같은 시료 전처리 과정을 거쳐야 하는데, 특히 많은 종류의 시료를 동시에 측정하고자 할 때에는 전처리 과정으로 인해 많은 시간이 소요되고 처리과정에서 측정불확도가 높아지게 되는 반면, 형광세기만을 측정하는 방법은 전처리 과정 없이 다중 웰 플레이트(multiple well plate)에서 근자외선 조사와 형광측정을 반복적으로 다수의 시료에 대해 시행함으로써 광촉매의 광활성을 측정할 수 있다. 따라서 상기 실시예는 본 발명을 통해 얻어진 결과가 광촉매 활성측정의 정확성을 향상시키고 측정의 속도가 빠른 고속 스크리닝(high throughput screening) 방법으로 활용할 수 있음을 시사한다.
<
실시예
3>
pH
에 따른
광촉매
활성 측정
pH에 따른 TiO2 나노입자의 광촉매 활성 변화를 측정하기 위하여 동일한 농도의 NADH(250 μM; 100 μL)와 TiO2(4 mg/mL; 5 μL)를 혼합한 용액에 pH 5에서 11 까지 1 간격으로 pH를 증가시킨 완충용액(buffer)을 95 μL 첨가하여 반응용액을 제조함으로써 특정 pH에서의 자외선 조사에 따른 NADH의 농도감소를 관찰하였다. 여기서 사용한 pH 완충용액은 pH 5 범위에서는 아세트산나트륨(sodium acetate), pH 6 ~ 8 범위에서는 인산나트륨(sodium phosphate) 그리고 pH 9 ~ 11 범위에서는 탄산나트륨(sodium carbonate)을 사용하였다.
상기 실험에 따른 결과를 하기 표 5 ~ 7 및 도 6 ~ 8에 나타내었다.
| 다양한 pH 조건에서 근자외선 조사에 따른 NADH 형광감소 양상 | |||||||
| 시간(분) | pH 5 | pH 6 | pH 7 | pH 8 | pH 9 | pH 10 | pH 11 |
| 0 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 |
| 1 | 0.987 | 0.995 | 0.997 | 1.01 | 0.985 | 0.988 | 1.00 |
| 2 | 0.985 | 0.995 | 0.993 | 0.999 | 0.988 | 0.979 | 0.992 |
| 3 | 0.964 | 0.982 | 0.983 | 0.996 | 0.985 | 0.979 | 0.991 |
| 4 | 0.951 | 0.988 | 0.978 | 1.00 | 0.981 | 0.977 | 0.984 |
| 5 | 0.935 | 0.967 | 0.977 | 0.988 | 0.975 | 0.980 | 0.982 |
| 6 | 0.920 | 0.959 | 0.966 | 0.976 | 0.974 | 0.979 | 0.975 |
| 7 | 0.905 | 0.953 | 0.955 | 0.974 | 0.963 | 0.969 | 0.967 |
| 8 | 0.893 | 0.949 | 0.951 | 0.973 | 0.961 | 0.964 | 0.967 |
| 9 | 0.888 | 0.943 | 0.951 | 0.968 | 0.956 | 0.955 | 0.957 |
| 10 | 0.869 | 0.942 | 0.946 | 0.960 | 0.956 | 0.948 | 0.955 |
| - NADH 농도는 125 μM - pH 5 : 아세트산염 완충용액 사용 - pH 6 ~ pH 8 : 인산염 완충용액 사용 - pH 9 ~ pH 11 : 탄산염 완충용액 사용 |
|||||||
| 다양한 pH 조건에서 광촉매 활성에 의한 NADH 형광감소 양상 | |||||||
| 시간(분) | pH 5 | pH 6 | pH 7 | pH 8 | pH 9 | pH 10 | pH 11 |
| 0 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 |
| 1 | 0.653 | 0.878 | 0.935 | 0.915 | 0.868 | 0.872 | 0.805 |
| 2 | 0.440 | 0.768 | 0.845 | 0.812 | 0.719 | 0.729 | 0.574 |
| 3 | 0.296 | 0.647 | 0.750 | 0.701 | 0.572 | 0.578 | 0.372 |
| 4 | 0.193 | 0.540 | 0.653 | 0.583 | 0.426 | 0.438 | 0.218 |
| 5 | 0.125 | 0.443 | 0.555 | 0.476 | 0.303 | 0.325 | 0.123 |
| 6 | 0.0831 | 0.348 | 0.454 | 0.371 | 0.203 | 0.216 | 0.0648 |
| 7 | 0.0607 | 0.262 | 0.364 | 0.271 | 0.118 | 0.136 | 0.0462 |
| 8 | 0.0484 | 0.193 | 0.278 | 0.190 | 0.0700 | 0.0868 | 0.0418 |
| 9 | 0.0460 | 0.132 | 0.198 | 0.122 | 0.0486 | 0.0536 | 0.0445 |
| 10 | 0.0468 | 0.0867 | 0.130 | 0.0745 | 0.0440 | 0.0466 | 0.0449 |
| - NADH 농도는 125 μM - TiO2 농도는 80 μg/mL |
|||||||
| 다양한 pH 조건에서 광촉매 활성에 의한 NADH 형광감소 속도 | ||
| 완충용액 pH | 반응속도 (μM/min) | |
| NADH only | NADH + TiO2 | |
| 5 | 1.701 | 35.0 |
| 6 | 0.846 | 14.0 |
| 7 | 0.754 | 11.3 |
| 8 | 0.654 | 13.1 |
| 9 | 0.500 | 17.7 |
| 10 | 0.476 | 17.3 |
| 11 | 0.648 | 25.0 |
| - NADH 농도는 125 μM - TiO2 농도는 80 μg/mL |
||
상기 표 5, 6 및 도 7, 8에는 각기 다른 pH 완충용액 내에 NADH만 존재할 때와, NADH와 TiO2가 공존할 때 근자외선 광을 조사하면서 시간에 따른 상대적 형광세기를 측정한 결과를 정리하였다. 광촉매인 TiO2가 없을 때는 NADH의 산화반응이 거의 일어나지 않으므로 pH에 따른 반응속도가 거의 동일한 반면, TiO2가 존재할 때는 광촉매 활성에 의한 ROS 생성률이 pH에 따라 달라져서 NADH의 산화반응 속도가 다르게 나타남을 확인할 수 있다. 이와 같이 pH에 따라 변화하는 NADH의 산화반응 속도를 표 7과 도 9에 정리하였다.
상기 결과를 바탕으로 광촉매의 활성을 측정할 때에는 완충용액을 이용하여 광촉매 반응을 측정하는 용액의 pH를 일정하게 설정하고 유지하는 것이 필요하다는 사실을 알 수 있다.
Claims (5)
- (a) 광촉매와 31～250 μM 농도의 NADH를 용기에 투입하고 광촉매의 광 활성 전, NADH의 형광세기를 측정하는 단계;
(b) 이후 상기 용기에 자외선 광을 조사하여 광촉매를 광 활성화 시킨 후, NADH의 형광세기를 측정하는 단계; 및
(c) 상기 a, b 단계에서 측정한 광촉매의 광 활성 전후의 NADH 형광세기 차이를 계산하여 광촉매의 광 활성도(photo-catalytic activity)를 측정하는 단계
를 포함하는 것을 특징으로 하는 광촉매 활성도 측정방법.
- 제 1 항에 있어서, 상기 (a), (b) 및 (c) 단계에서 NADH의 형광세기 대신 NADH의 흡광도를 이용하는 것을 특징으로 하는 광촉매 활성도 측정방법.
- 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 광촉매는 TiO2, SiO2, WO3 및 ZnO로 이루어진 군에서 선택된 1종 또는 2종 이상인 것을 특징으로 하는 광촉매 활성도 측정방법.
- 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 자외선 광은 290 ~ 400 nm 파장 범위인 것을 특징으로 하는 광촉매 활성도 측정방법.
- 삭제
Priority Applications (2)
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|---|---|---|---|
| KR20100100036A KR101190754B1 (ko) | 2010-10-13 | 2010-10-13 | Ｎａｄｈ를 이용한 광촉매 활성도 측정방법 |
| PCT/KR2010/007910 WO2012050259A1 (en) | 2010-10-13 | 2010-11-10 | Application of nadh spectrum to the photocatalytic activity assay |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR20100100036A KR101190754B1 (ko) | 2010-10-13 | 2010-10-13 | Ｎａｄｈ를 이용한 광촉매 활성도 측정방법 |
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|---|---|
| KR20120038330A KR20120038330A (ko) | 2012-04-23 |
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|---|---|---|---|
| KR20100100036A KR101190754B1 (ko) | 2010-10-13 | 2010-10-13 | Ｎａｄｈ를 이용한 광촉매 활성도 측정방법 |
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| WO (1) | WO2012050259A1 (ko) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20170107686A (ko) * | 2016-03-16 | 2017-09-26 | 한국과학기술원 | 형광단 금속-유기 복합체를 이용한 전기화학적 촉매의 광학적 스크리닝 방법 |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2008501937A (ja) | 2004-06-03 | 2008-01-24 | フラウンホッファー−ゲゼルシャフト・ツァー・フォデラング・デル・アンゲワンテン・フォーシュング・エー．ファウ． | 蛍光分析を用いて有機染料の光触媒分解を測定する方法 |
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|---|---|---|---|---|
| KR100477936B1 (ko) * | 2001-12-22 | 2005-03-18 | 주식회사 이에스켐 | 광촉매의 광활성 평가 방법 |
| KR100916447B1 (ko) * | 2007-11-20 | 2009-09-07 | 현대자동차주식회사 | 광촉매의 광 활성도 및 광학적 밴드갭 측정 방법 |
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2010
- 2010-10-13 KR KR20100100036A patent/KR101190754B1/ko not_active IP Right Cessation
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| KR20170107686A (ko) * | 2016-03-16 | 2017-09-26 | 한국과학기술원 | 형광단 금속-유기 복합체를 이용한 전기화학적 촉매의 광학적 스크리닝 방법 |
| KR102414474B1 (ko) | 2016-03-16 | 2022-06-30 | 한국과학기술원 | 형광단 금속-유기 복합체를 이용한 전기화학적 촉매의 광학적 스크리닝 방법 |
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| KR20120038330A (ko) | 2012-04-23 |
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